CN102154126B

CN102154126B - 一种菌株与利用该菌株生产甘露醇的方法

Info

Publication number: CN102154126B
Application number: CN 201010550840
Authority: CN
Inventors: 陈海燕; 张雷; 王志滨; 林翠梧; 罗丽红; 李艳艳; 何熙璞; 付东兴; 方晓
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2010-11-19
Filing date: 2010-11-19
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2030-11-19
Also published as: CN102154126A

Abstract

一种菌株与利用该菌株生产甘露醇的方法，从罗汉果的块根中获得真菌尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)SG-76纯菌种，并利用该菌株生产甘露醇，其方法是将尖孢镰孢菌先后培养得菌丝体、接种体、菌丝体膜，再用甲醇或乙醇超声浸提菌丝体膜获取粗抽提物，浓缩后用不同极性的溶剂处理获得含粗甘露醇的粉末，重结晶纯化获得纯甘露醇，获得的产品约占总粗提物质量的70％。用本发明方法，菌株易于分离和培养，成本低，发酵易进行，次级代谢产物易分离，工艺简单，可在常温常压下并无需用催化剂制备纯甘露醇，甘露醇收率高，反应条件易控制，不副产山梨醇，是高产量、简便和节约获取甘露醇的一种方法。

Description

一种菌株与利用该菌株生产甘露醇的方法

技术领域

本发明涉及从天然植物中分离得到的一种菌株和利用该菌株生产甘露醇的方法。

背景技术

甘露醇(Mannitol)学名己六醇，又称D-甘露糖醇，是山梨醇的同分异构体，广泛存在于自然界的各种植物、藻类、真菌和一些细菌中。

甘露醇在糖及糖醇中的吸水性最小，并具有爽口的甜味，在食品方面常用于防粘或制成低热值低糖的甜味剂；在化工中可用于制松香酸酯、人造甘油树脂、炸药、雷管(硝化甘露醇)、聚氯乙烯的增塑剂、化妆品的保湿剂等；在化学分析中用于硼的测定；在生物检验上用作细菌培养剂。不过甘露醇主要用于医药工业，常作为降压剂、利尿剂、脱水剂使用。甘露醇进入体内后能提高血浆渗透压，使组织脱水，可降低颅内压和眼内压，用于治疗颅脑外伤、脑瘤、脑组织缺氧、大面积烧伤后引起的水肿，肾功能衰竭引起的腹水、青光眼，防治早期急性肾功能不全。甘露醇注射液(Injection Mannitol)作为高渗降压药，是临床抢救特别是脑部疾患抢救常用的一种药，具有降低颅内压药物所要求的降压快疗效准确的特点。

迄今为止，绝大部分甘露醇采用下列工艺路线生产：一种是以淀粉或蔗糖、葡萄糖为起始原料，经异构化、氢化后分离出结晶产品的化学转化法(“淀粉制备山梨醇和甘露醇”生物加工过程20086(5)：8-12王良东陈建文吴嘉麟)。美国卡吉尔公司、法国罗盖特公司等主要糖醇生产商均采用此法生产甘露醇。近年来化学转化法生产甘露醇的转化率有了突破，但是因为其设备投资过大、化学反应没有选择性，化学转化法难于广泛应用。而且在常用的糖类催化氢化法中，仍然使用氢气在高温、高压、以镍为催化剂的条件下对果糖和葡萄糖混合物制备甘露醇，产品中必然含有副产的山梨醇，更加大了生产成本(“甘露醇的工业生产现状与发展”.精细化工原料及中间体，2004(4)：20-23 赵磊)。

另一种是植物提取法，目前主要从海带中提取甘露醇。海带提取法的不足之处是生产流程长、提取率低、产品品质差、生产受季节影响、能源消耗高、污染严重、生产成本居高不下。

许多微生物(如乳酸菌、酵母、丝状真菌等)可以利用碳水化合物为底物合成甘露醇而不生成山梨醇。微生物发酵生产甘露醇，具有反应选择性、温和、能耗低、设备投资小，主要难点在于尚未获取高产量的菌株。近年来，国内外都在对微生物发酵制备甘露醇的技术进行研究。1966年，Foda等利用产黄青霉(Penicillium chrysogenum)发酵葡萄糖溶液合成出甘露醇(“合成法制备甘露醇的现状及进展”.淀粉与淀粉糖，1998(4)：15-19，于家波)。另外，从棉花叶片废物中分离出的真菌黑霉(Alternaria alternate)、多主枝孢霉(Cladosporium herbarum)、紫附球菌(Epicoccum purpurascens)、木兰假丝酵母(Candida magnoliae)，兽氏结合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)相继被报道有转化葡萄糖生产甘露醇的能力(“生物合成法生产D-甘露醇的研究进展”农产品加工·学刊2008(1)：36-39于冬梅，杜煜光)。尚未见有罗汉果内生真菌发酵生产甘露醇的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可用于生产甘露醇的菌株及利用该菌株可高效、简便、节约生产甘露醇的方法。

本发明以如下技术方案解决上述技术问题：

本发明可用于生产甘露醇的菌株是真菌尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)SG-76。保藏编号：CGMCC No.4178。

尖孢镰孢菌具有以下分类学特征：真菌菌落铺展，边缘放射状，中部絮状隆起，初期白色，后期略带浅紫色，菌落背面无色到棕黄色，菌丝无色；具有三个或多个隔膜的孢子，大型分生孢子纺锤形至镰型，顶端钩状，小型分生孢子卵形至椭圆形，且常有大量的厚垣孢子形成。经rDNA ITS序列分析，结合分类学鉴定结果，该菌株为尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)SG-76。

真菌尖孢镰孢菌是从天然植物罗汉果Siraitia grosvenorii的根部分离获得。

真菌尖孢镰孢菌的获得方法：

(1)采集罗汉果的块根；

(2)在无菌的蒸馏水中将块根漂洗干净，并用75％乙醇、5％NaClO、无菌水处理；表面水份干后将其置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养皿上，28～30℃恒温箱中倒置培养3～4天；

(3)在无菌条件下将单独的菌落挑出并将其转移到无菌的PDA培养皿内以获得尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)SG-76纯菌种。

利用本发明的菌株尖孢镰孢菌生产甘露醇的方法为：

(1)将尖孢镰孢菌纯菌种在培养基PDA斜面上培养约6～8天获得菌丝体；

(2)将菌丝体转移到种子培养基内，在28～30℃下将菌种培养约3～5天获得接种体；

(3)挑适量接种体保持温度在28～30℃范围之间发酵培养约18～20天获得菌丝体膜；

(4)反复使用甲醇或乙醇超声浸提菌丝体膜，获取粗抽提物；

(5)浓缩所得到的粗抽提物；

(6)用不同极性的溶剂处理所得到的已浓缩过的粗抽提物获得含有粗甘露醇的白色粉末；

(7)通过重结晶纯化所得到的粗甘露醇以获得纯甘露醇。

种子培养基各成分质量百分比为：葡萄糖2.0％蛋白胨0.1％酵母浸膏0.4％ pH6.8。

发酵培养基各成分质量百分比为：葡萄糖 5.0％～6.0％淀粉 0.4％～0.6％蛋白胨0.2％～0.4％酵母浸膏 0.4％～0.6％ K₂HPO₄ 0.05％～0.1％ KH₂PO₄ 0.01％～0.05％MgSO₄·7H₂O 0.02％～0.05％ pH 6.5～8.0。

浓缩的粗抽提物使用旋转蒸发器在30～40℃范围内进行。

不同极性的溶剂是石油醚，乙酸乙酯，和甲醇。

重结晶是在甲醇或乙醇∶水的体积比＝90～95∶10～5中进行。

本发明的菌株及利用该菌株生产甘露醇的方法，提供了甘露醇的一种新来源，菌株易于分离和培养，使用的发酵培养基成本低廉，发酵易于进行，次级代谢产物易于分离，使用标准的技术保存并可在需要时活化。提取甘露醇和纯化甘露醇的工艺简便经济，可在常温常压下并无需用催化剂制备甘露醇，其工艺简单、甘露醇收率高，反应条件容易控制，不副产山梨醇，且没有其他的多元醇杂质，只需使用甲醇水溶液或乙醇水溶液对白色粉末多次重结晶完成最终的纯化，是高产量提取甘露醇的一种比较简便和节约的方法。试验结果显示：用本发明的菌种和方法生产甘露醇，获得的甘露醇产品约占总粗提物质量的70％。因此可利用现有的微生物发酵通用设备进行大规模发酵生产甘露醇。

附图说明

图1是本发明的提取和纯化甘露醇的流程图；

图2是甘露醇标准品经显色后的紫外-可见吸收光谱(UV-VIS)；

图3是用本发明的方法生产的甘露醇经显色后的紫外-可见吸收光谱(UV-VIS)；

图4是用本发明的方法生产的甘露醇与甘露醇标准品的红外吸收光谱(IR)对照图；

图5是用本发明的方法生产的甘露醇的核磁共振(¹HNMR)谱图；

图6是用本发明的方法生产的甘露醇的核磁共振(¹³C NMR)谱图；

图7是用本发明的方法生产的甘露醇的核磁共振(DEPT 135)谱图。

本发明用于生产甘露醇的菌株是真菌尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)SG-76保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；简称：CGMCC；保藏日期：2010年9月25日；保藏编号：CGMCC No.4178。

具体实施方式

本发明根据微生物可以以碳水化合物为底物合成、生产甘露醇的机理，从天然植物罗汉果的块根中分离出真菌尖孢镰孢菌SG-76，它是生产甘露醇的一种新菌种，该真菌菌种栖息在罗汉果上，但对宿主不会造成明显的伤害；该真菌是从健康的块根中分离出来的，其中所述的健康的块根上看不出真菌感染的症状。

本真菌菌种被分离出来后，在特制的发酵培养基中生长以获得菌丝体膜。通过最少的提取和纯化步骤从菌丝体膜获得糖醇。将糖醇经熔点、UV-VIS、IR、NMR检测结构得到确定。利用这个新菌种制备提取和纯化甘露醇的方法是一种简便和节约的方法。

使用下列步骤从天然植物罗汉果的块根中分离获得真菌SG-76：

1.将具有健康组织的罗汉果块根收集在无菌的保鲜袋内；

2.罗汉果块根先用自来水和无菌水漂洗1～3次，再将块根切成边长为2～4cm的方块。在超净工作台中将切好的块根先置于75％乙醇消毒1～1.5min，再用5％NaClO消毒1.5～2min，75％乙醇消毒1～1.5min，最后用无菌水冲洗3次，并用无菌纸吸干表面水分，并将其置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养皿上，28～30℃恒温箱中倒置培养3～4天；

3.在无菌条件下将单独的菌落挑出并将其转移到无菌的PDA培养皿内以获得尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)SG-76纯菌种。

真菌的接种体通过下述步骤制备：

1.将纯的已被分离出来的真菌菌种在PDA斜面上培养6～8天；斜面培养基PDA中各成分的质量百分比为：马铃薯粉0.4％葡萄糖2％琼脂1.3％pH 6.5；

2在无菌条件下挑少许菌丝并将其转移到装液量100mL/250mL的经高压湿热灭菌的种子培养基内；种子培养基各成分质量百分比为：葡萄糖2.0％蛋白胨0.1％酵母浸膏0.4％ pH 6.8。

3 28℃和180rpm摇床中培养3～5天。

接种体在发酵培养基中的生长包括下列步骤：

1.将适量接种体在无菌条件下接入经高压湿热灭菌的发酵培养基内；发酵培养基各成分质量百分比为：葡萄糖5.0％～6.0％淀粉0.4％～0.6％蛋白胨0.2％～0.4％酵母浸膏0.4％～0.6％ K₂HPO₄ 0.05％～0.1％ KH₂PO₄ 0.01％～0.05％ MgSO₄·7H₂O 0.02％～0.05％pH 6.5～8.0。

2.28℃和180rpm摇床中培养18～20天。

获取粗提取物的步骤为：

1.将干的菌丝体薄膜超声并反复使用甲醇或乙醇浸提；

2.在30～40℃下通过旋转蒸发器浓缩经甲醇或乙醇浸提出来的粗提取物；

3.用不同极性的溶剂处理所得到的已浓缩过的粗抽提物获得到含有粗甘露醇的白色粉末。

使用甲醇或乙醇的水溶液作为溶剂对含有粗甘露醇的白色粉末进行重结晶，使之与任何可能的杂质分离。通过熔点、UV-VIS、IR、NMR和D-甘露醇(AR)标准品对照进行鉴定。

实施例1尖孢镰孢菌SG-76的分离

天然植物罗汉果的块根来自于中国广西永福县。将罗汉果的块根收集之后，将它们装入无菌的保鲜袋内转移到实验室。将块根用自来水和无菌水漂洗以去除所粘的杂质颗粒。块根切成边长约为3cm的方块备用，在超净工作台中将事先备好的根先置于75％乙醇消毒1min，再用5％ NaClO消毒2min，75％乙醇消毒1min，最后用无菌水冲洗3次，并用无菌纸吸干表面水分，然后用无菌刀剪去组织的边缘，之后置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养皿上。将培养皿置于28℃恒温箱中倒置培养。

同时按照表面消毒方法做严格的对照组试验。当在组织的断切面处有真菌菌丝长出时按无菌操作程序，用接种丝挑取菌落边缘菌丝做“之”字形划线接种在新的固体PDA上，待新的菌落长出后，再挑取菌落边缘菌丝进行菌丝尖端培养，如此反复操作即得到纯菌种。

被分离的菌种被鉴定为尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)SG-76。SG-76菌落生长快，真菌菌落铺展，边缘放射状，中部絮状隆起，初期白色，后期略带浅紫色，菌落背面无色到棕黄色，菌丝无色。孢子具有三个或更多个的隔膜，大型分生孢子纺锤形至镰型，顶端钩状，小型分生孢子卵形至椭圆形，且常有大量的厚垣孢子形成。

实施例2 发酵培养尖孢镰孢菌SG-76生产甘露醇

1.尖孢镰孢菌SG-76的发酵

斜面培养基(PDA)：0.4％马铃薯粉 2％葡萄糖 1.3％琼脂水1L，调pH为6.5。

种子培养基：葡萄糖2.0％蛋白胨0.1％酵母浸膏0.4％水1L，调pH为6.8。

发酵培养基：葡萄糖5.0％淀粉0.5％蛋白胨0.2％酵母浸膏0.4％ K₂HPO₄ 0.1％KH₂PO₄ 0.01％ MgSO₄·7H₂O 0.02％水1L，调pH为8.0；121℃高压湿热灭菌20分钟。

将保存在斜面培养基中的尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)SG-76接种到装有100mL的经高压湿热灭菌的种子培养基的250mL三角瓶内，28℃和180rpm摇床中培养3天。再从种子培养基挑适量接种体接种到装有200mL的经高压湿热灭菌的发酵培养基的500mL三角瓶内，培养6L，28℃和180rpm摇床中培养20天。

2.甘露醇的提取

取发酵液四层纱布过滤，菌体用少量自来水淋洗，除去残存的发酵液，菌体自然干燥。将干燥的菌体反复使用甲醇超声浸提，在35℃下通过旋转蒸发器浓缩经甲醇抽提出来的粗提取物；连续用不同极性溶剂石油醚、乙酸乙酯、甲醇处理粗提取物，得到白色粉末的糖醇。

3.甘露醇的纯化

将白色粉末的糖醇用适量甲醇∶水(95∶5)溶解，重结晶1次，得到占粗提取物质量的72％白色针状甘露醇。

实施例3 发酵培养尖孢镰孢菌SG-76生产甘露醇

1.尖孢镰孢菌SG-76的发酵

斜面培养基和种子培养基同实施例2

发酵培养基：葡萄糖 5.5％淀粉 0.4％蛋白胨 0.4％酵母浸膏 0.5％ K₂HPO₄ 0.05％KH₂PO₄ 0.03％ MgSO₄·7H₂O 0.05％水1L，调pH为6.5；121℃高压湿热灭菌20分钟。

将保存在斜面培养基中的尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)SG-76接种到装有100mL的经高压湿热灭菌的种子培养基的250mL三角瓶内，28℃和180rpm摇床中培养4天。再从种子培养基挑适量接种体接种到装有200mL的经高压湿热灭菌的发酵培养基的500mL三角瓶内，培养6L，28℃和180rpm摇床中培养18天。

2.甘露醇的提取同实施例2

3.甘露醇的纯化

将白色粉末的糖醇用适量甲醇∶水(90∶10)溶解，重结晶2次。得到占粗提取物质量的69.5％白色针状甘露醇。

实施例4 发酵培养尖孢镰孢菌SG-76生产甘露醇

1.尖孢镰孢菌SG-76的发酵

斜面培养基和种子培养基同实施例2

发酵培养基：葡萄糖 6.0％淀粉 0.6％蛋白胨 0.3％酵母浸膏 0.6％ K₂HPO₄ 0.07％KH₂PO₄ 0.05％ MgSO₄·7H₂O 0.03％水1L，调pH为7.2；121℃高压湿热灭菌20分钟。

将保存在斜面培养基中的尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)SG-76接种到装有100mL的经高压湿热灭菌的种子培养基的250mL三角瓶内，28℃和180rpm摇床中培养5天。再从种子培养基挑适量接种体接种到装有200mL的经高压湿热灭菌的发酵培养基的500mL三角瓶内，培养6L，28℃和180rpm摇床中培养19天。

2.甘露醇的提取同实施例2

3.甘露醇的纯化

将白色粉末的糖醇用适量甲醇∶水(92∶8)溶解，重结晶2次。得到占粗提取物质量的70％白色颗粒状甘露醇。

实施例5 发酵培养尖孢镰孢菌SG-76生产甘露醇

1.尖孢镰孢菌SG-76的发酵

斜面培养基和种子培养基同实施例2；发酵培养基同实施例4。

2.甘露醇的提取

取发酵液四层纱布过滤，菌体用少量自来水淋洗，除去残存的发酵液，菌体自然干燥。将干燥的菌体反复使用体积百分比为95％乙醇超声浸提，在40℃下通过旋转蒸发器浓缩经乙醇抽提出来的粗提取物；连续用不同极性溶剂石油醚、乙酸乙酯、甲醇处理粗提取物，得到白色粉末的糖醇。

3.甘露醇的纯化

将白色粉末的糖醇用乙醇∶水(95∶5)溶解，重结晶2次。得到占粗提取物质量的69％白色针状甘露醇。

实施例6 发酵培养尖孢镰孢菌SG-76生产甘露醇

1.尖孢镰孢菌SG-76的发酵

斜面培养基和种子培养基同实施例2；发酵培养基同实施例3。

2.甘露醇的提取同实施例5

3.甘露醇的纯化

将白色粉末的糖醇用适量乙醇∶水(90∶10)溶解，重结晶2次。得到占粗提取物质量的70％白色片状甘露醇。

实施例7 甘露醇产物的鉴定

对实施例2至6所得甘露醇进行熔点(m.p.)、紫外-可见吸收光谱法(UV-VIS)、红外吸收光谱法(IR)、核磁共振(NMR)分析，并与甘露醇标准品(AR，广东汕头西陇化工厂)进行对照。

1.熔点(m.p.)

用X-4双目显微熔点测定仪测待测样品熔点166～168℃，使其和甘露醇标准样品混合测定熔点不变。

2.紫外-可见吸收光谱法(UV-VIS)

取两支25mL比色管分别准确加入50μg.mL^-1的甘露醇标准溶液1.0mL和50μg.mL^-1的样品溶液1.0mL然后在每支比色管中加入1mL高碘酸钠溶液(0.015mol高碘酸钠溶于0.12mol/L HCl溶液中)，混匀，放10min，后加入2mL 0.1％L-鼠李糖溶液，充分混匀后加入Nash试剂(75g醋酸铵+1mL冰醋酸+1mL乙酰丙酮，蒸馏水定容至100mL)4mL，53℃水浴保温15min，使其呈色，用UV-2102PCS型紫外分光光度计使呈色的标准溶液和样品溶液，以蒸馏水为空白，分别在300nm～800nm范围内扫描，得到两者在该范围内的特征吸收波长图(见图2，图3)光谱扫描可知：二者的最大特征吸收峰基本完全重叠，波长为413nm。

3.红外吸收光谱法(IR)

IR(KBr)显示3400～3200cm^-1出现强而宽的吸收峰，为缔合-OH峰；2937cm^-1饱和C-H的伸缩振动；1085cm^-1、1020cm^-1为C-O键的伸缩振动峰；722cm^-1为O-H键的面外弯曲振动峰；红外谱图中未发现有不饱和键的吸收峰；推测该化合物为饱和醇类化合物。并进行红外数据库检索，与甘露醇标准红外谱图匹配度96.81％(见图4)。

4.核磁共振(NMR)

¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ：4.41(s，1H)，4.33(s，1H)，4.14(s，1H)，3.60(dd，J＝10.9，3.2Hz，1H)，3.53(d，J＝8.2Hz，1H)，3.45(m，1H)，3.37(dd，J＝10.8，6.2Hz，1H)(见图5)；¹³CNMR(75MHz，DMSO-d₆)和DEPT 135表明δ：64.31(-CH₂-，C-1，6)，70.11(-CH-，C-3，4)，71.75(-CH-，C-2，5)(见图6，图7)；从化合物波谱数据可知该化合物有一定对称性。以上数据与文献(“木榄内生真菌菌株ZD6及其代谢产物的抑菌活性”菌物学报2010 29(5)：739-745李明月常敏张庆华等)报道的甘露醇基本一致。

综合以上信息，该化合物被鉴定为甘露醇。分子结构式如下：

Claims

1.一种利用尖孢镰孢菌生产甘露醇的方法，其特征是生产甘露醇的菌株是真菌尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)SG-76；保藏编号：CGMCC No.4178。

2.一种利用尖孢镰孢菌生产甘露醇的方法，其特征是制备步骤为：

(1)将尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)SG-76纯菌种在培养基PDA斜面上培养6～8天获得菌丝体；

(2)将菌丝体转移到种子培养基内，在28～30℃下将菌种培养3～5天获得接种体；所述的种子培养基中各成分的质量百分比为：葡萄糖2.0％、蛋白胨0.1％、酵母浸膏0.4％、pH6.8；

(3)挑适量接种体保持温度在28～30℃范围之间发酵培养18～20天获得菌丝体膜；发酵培养基中各成分的质量百分比为：葡萄糖5.0％～6.0％、淀粉0.4％～0.6％、蛋白胨0.2％～0.4％、酵母浸膏0.4％～0.6％、K₂HPO₄ 0.05％～0.1％、 KH₂PO₄ 0.01％～0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.02％～0.05％、pH 6.5～8.0；

(4)反复使用甲醇或乙醇超声浸提菌丝体膜，获取粗抽提物；

(5)浓缩所得到的粗抽提物；

(6)用不同极性的溶剂处理所得到的已浓缩过的粗抽提物获得含有粗甘露醇的白色粉末；所述的不同极性的溶剂是石油醚，乙酸乙酯，和甲醇；

(7)通过重结晶纯化所得到的粗甘露醇以获得纯甘露醇。

3.如权利要求2所述的利用尖孢镰孢菌生产甘露醇的方法，其特征是浓缩粗抽提物使用旋转蒸发器在30～40℃范围内进行。

4.如权利要求2所述的利用尖孢镰孢菌生产甘露醇的方法，其特征是重结晶是在甲醇或乙醇∶水的体积比＝90～95∶10～5中进行。