CN107699505A - 一种富硒酵母培养工艺的优化方法及工艺 - Google Patents
一种富硒酵母培养工艺的优化方法及工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种富硒酵母培养工艺的优化方法，其采取一种新型的亚硒酸钠的添加方式，不仅不会影响菌丝的产量，而且大大提高了硒的利用率，使无机硒尽可能的转化为有机硒，减少产品的毒性，具有极高的工业化应用，根据上述结果，调节摇床培养温度为23℃、初始pH为6.0、转速为120 rpm，培养基中含有1.0 g/L硫酸镁、2.0 g/L氯化钠、0.5 g/L磷酸二氢钾、2 g/L亚硒酸钠时，并且我们将亚硒酸钠均分为三等分，分别在发酵第一、二、三天加入培养基中，发酵7天可以获得约11.4 g干重菌丝、富硒量约331.7μg/g，并且有机硒转化率高达90.0%，相对与现存的产品，本发明大大节约了成本，适合现代化工业发展。
Description
技术领域
本发明涉及一种富硒酵母培养工艺的优化方法，属于富硒酵母技术领域。
背景技术
酵母是一种结构比较简单的单细胞真核微生物，含有丰富的氨基酸和维生素，如蛋氨酸、赖氨酸和维生素C等，是一种兼性厌氧的真菌。氧气充足的情况下菌体大量繁殖，氧气缺乏的条件下可发酵葡萄糖产生酒精，是一种非常容易培养的菌体，普通的蛋白胨培养基上就可大量繁殖。因此，在现代工业生产中，酵母的利用特别广泛，例如酿酒、甘油生产、食用酵母、有机酸、酶制剂等。酵母可通过生物富集作用对培养基中的微量元素进行富集，因此可作为一种对硒富集的载体。
硒(Se)是对人体健康非常重要的微量元素之一，也是具有重要生物活性的硒蛋白的重要组成部分。由于硒是人体内谷胱甘肽过氧化酶的重要组成部分，因此，硒与酶的活性密切相关。然而，缺硒能使心肌变性、坏死，硒能刺激免疫反应，可以提高机体的免疫能力，促进免疫抗体的生成。目前我国大部分地区都存在着缺硒的现象，而且天然食品中的硒含量一般比较少，因此补硒是一个很值得关注的问题。但是国内大多数补硒仍然采用的是以亚硒酸盐为主的无机硒进行补硒，这种补硒方式的价格相对比较便宜，但是无机硒具有不易被吸收、生物活性不大、硒利用率低、动物易发生中毒等缺点，显然不能作为生物补硒的主要硒源。由于以无机硒为主的补硒方式存在着如此多的缺点，现在更多地倾向于将以富硒酵母为主的有机硒作为动物补硒的硒源。有机硒虽然在价格上较高，但是却具有生物活性高、利用率高、易吸收等优点，是一种优质的硒源。
研究表明，硒在生物体内主要转化为硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸，而在生物体内可以由丝氨酸合成甲硫氨酸和半胱氨酸。
本发明针对以上问题，提供一种富硒酵母培养工艺的优化方法，其致力于向培养基中加入一定量的丝氨酸，从而提高甲硫氨酸和半胱氨酸的含量，使得无机硒更多地转化为有机硒，提高硒的利用率。同时，由于酵母良好的生长特性、较高的营养价值以及较强的富硒能力，所以硒和酵母的结合是一个完美的组合，怎么能让他们达到平衡并发挥出最好的效果，就是本发明的目的所在。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种富硒酵母培养工艺的优化方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)选取酿酒酵母；
(2)培养基的培养：培养基组分包括葡萄糖、蛋白胨和酵母膏，对这三个成分因素进行正交实验，得出发酵培养基的最佳配方，其中，正交实验时，装液量为50mL/250mL，接种量为5％，温度为30℃，pH为自然，转速为200rpm，发酵48h后测定其菌丝生物量；
(3)培养条件的优化：采用正交实验，优化转速、温度、初始pH这三个变量，其中，装液量为50mL/250mL，接种量为5％，发酵48h后测定其菌丝生物量；
(4)富硒条件的优化：正交实验结果，确定了酿酒酵母的最适的培养条件，选择不同添加时间、添加方式来添加亚硒酸钠，进行优化，达到硒的最大化利用；
(5)生产效率测定：采用干重法，将菌丝发酵液5000rpm离心5min，弃去上清液并收集菌丝，之后将培养的菌丝冷冻干燥机中冻干，其中，生产效率g/L＝富硒产品干重g÷液体培养基的体积L；
(6)硒的测定：利用3,3-二氨基联苯胺比色法对硒的含量进行测定；
(7)总硒含量的测定：
酵母菌丝中硒含量测定：准确称取1g富硒产物，放入烧瓶中，加入10mL消化液， 4℃消化至无色透明为止，待冷却后，将此消化液转入50mL容量瓶中，用NaOH调节pH 到7.0左右，最后将溶液定容到50mL，最后取10mL消化样液，按DAB比色法计算硒含量；
(8)有机硒含量；
准确称取酵母富硒产物0.5g，放入透析袋中，充分透析24h后去除无机硒，取透析袋中物质，按上述方法进行硒含量测定；
(9)综合考虑富硒量和有机硒转化率，以确定最优的培养基硒浓度；
富硒量μg/g＝总硒含量μg÷菌丝干重g；
有机硒转化率％＝有机硒含量μg÷总硒含量μg×100％；
(10)氨基酸的测定：
氨基酸的测定是利用反相高效液相色谱HPLC完成，该测定配备了Hypersil ODSC18色谱柱，色谱柱为4mm×125mm，以1mL/min的流速进行梯度洗脱，柱温为40℃，移动相的配置为：缓冲液A：0.8g醋酸钠溶于500mL超纯水，加入90μL三乙胺和2.9 mL四氢呋喃，最后用醋酸将pH值调整为7.2±0.05；缓冲液B：0.8g醋酸钠溶于100 mL超纯水，加入200mL甲醇，最后用醋酸将pH值调整为7.2±0.05；洗脱程序设置为：缓冲液A/缓冲液B分别为100:0，50:50，0:100，0:100，100:0和100:0，对应的时间分别是0，17，20，20.1，24和24.1min；邻苯二甲醛作为衍生试剂，检测波长设置为338nm，262nm用于检测脯氨酸；标准氨基酸均用0.1M HCl配置成浓度为1mM的储液，样品中各氨基酸的含量，通过标准品绘制的标准曲线计算得来，所有样品分析三次，取平均值；
(11)数据处理与分析：
试验数据进行单因子方差分析，多重比较，结果以平均数士标准差表示。
进一步，作为优选，所述步骤(4)中，向培养基中加入2mg/L丝氨酸，以获得亚硒酸钠的最大转化率。
进一步，作为优选，所述步骤(4)中，富硒条件的优化的具体步骤如下：
①硒含量的优化：
分别选取0，20，40，60，80，100μg/mL的七个设计点，培养48h后测定菌体含量，单位硒含量以及有机硒转化率；
②按不同添加时间添加：将最适的亚硒酸钠浓度分别在发酵0，12，24，36h时加入培养基；
③按不同的添加方式添加：
组Ⅰ：在发酵开始就将亚硒酸钠加入培养基；
组Ⅱ：将最适亚硒酸钠含量等分为两份，分别在发酵开始和12h后加入；
组Ⅲ：将最适亚硒酸钠含量等分为三份，分别在发酵开始，12h和24h后加入；
④4.4丝氨酸添加方式的优化：
组Ⅳ：在发酵开始时就将向其中加入2mg/L丝氨酸；
组Ⅴ：将丝氨酸含量等分为两份，分别在发酵开始和12h后加入；
组Ⅵ：将丝氨酸含量等分为三份，分别在发酵开始，12h和24h后加入。
进一步，作为优选，所述步骤(7)中，硒的测定的具体步骤如下：
①硒总含量：
黄牛肝菌菌丝中硒含量测定：准确称取1g富硒产物，放入烧瓶中，加入10mL消化液，4℃消化至无色透明为止，待冷却后，将此消化液转入50mL容量瓶中，用氢氧化钠调节pH到7.0左右，最后将溶液定容到50mL，取10mL消化样液，按DAB比色法计算硒含量。
②有机硒含量：
准确称取黄牛肝菌富硒产物0.5g，放入透析袋中，充分透析24h后去除无机硒，取透析袋中物质，按上述方法进行硒含量测定；
③综合考虑富硒量和有机硒转化率，以确定最优的培养基硒浓度，其中，
富硒量μg/g＝硒总含量μg÷菌丝干重g
有机硒转化率％＝有机硒含量μg÷硒总含量μg×100％。
进一步，作为优选，所述10ml的消化液为5g钼酸钠加入混合溶液中配制而成，其中，混合溶液为蒸馏水:浓硫酸:高氯酸的体积比为3:3:4的溶液中配置而成。
进一步，本发明还提供了一种富硒酵母培养工艺，其特征在于：其采用酿酒酵母为实验菌种，培养基中的葡萄糖、蛋白胨、酵母膏浓度分别为20g/L、15g/L、10g/L，设置培养温度为30℃，转速为200rpm，初始pH为5，向培养基中加入2mg/L丝氨酸，在发酵24h后加入亚硒酸钠，使得亚硒酸钠浓度为60μg/mL。
进一步，作为优选，加入亚硒酸钠时采用分批次加入的方式进行添加。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明采用一种独特的优化方式，采取正交实验，既涵盖了各个条件之间的协同与拮抗作用，还大大减少了实验次数，提高了实验效率；
(2)本发明采取不同的亚硒酸钠添加时间与添加方式，从而获得最大菌丝生物量，富硒量和有机硒转化率，相对于传统工业大大减少了食用原料，节约了成本。
(3)本发明采用一种新型加硒方式，向培养基中加入一定量的丝氨酸，提高了亚硒酸钠的转化率，同时显著提高了生物体内甲硫氨酸，半胱氨酸的含量，提高了酵母的营养价值。
附图说明
图1是本发明中随着硒含量的增加，菌丝单位硒含量以及有机硒转化率关系示意图；
图2是本发明随着硒含量的增加与有机硒转化率关系示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
材料与方法：
1.实验菌株：
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae:四川农业大学食品学院实验室分离保藏)。
2.发酵培养基的优化：
本实验使用的培养基组分主要是葡萄糖，蛋白胨，酵母膏，对这三个因素进行正交实验，如表1得出发酵培养基的最佳配方。其中，装液量为50mL/250mL，接种量为5％，温度为30℃，pH为自然，转速为200rpm，发酵48h后测定其菌丝生物量。
表1培养介质的因素水平表
3.培养条件的优化：
众所周知，初始pH，培养温度，摇床转速对酿酒酵母的生长具有很大的影响，故本发明采用正交实验，优化转速，温度，初始pH这三个变量，如表2，其中，培养基组分为上述优化后的最佳配方，装液量为50mL/250mL，接种量为5％，发酵48h后测定其菌丝生物量。
表2培养条件的因素水平表
4.富硒条件的优化：
根据以上正交实验结果，确定了酿酒酵母的最适的培养条件，但是，亚硒酸钠的添加会抑制酵母菌体的生长，过早添加会使酵母菌体含量比较少，过晚添加会影响硒的转化与吸收，酿酒酵母处于对数期时富硒能力最强。故本试验选择不同添加时间、添加方式来添加亚硒酸钠，进行优化，达到硒的最大化利用。
同时，研究表明，丝氨酸是合成甲硫氨酸和半胱氨酸的重要物质，以根据上述亚硒酸钠的优化为基础，向培养基中加入2mg/L丝氨酸，以获得亚硒酸钠的最大转化率。
4.1硒含量的优化：
在上述结果的基础上对硒含量进行优化，本实验分别选取0，20，40，60，80，100μg/mL 的七个设计点，培养48h后测定菌体含量，单位硒含量以及有机硒转化率。
4.2按不同添加时间添加：
将最适的亚硒酸钠浓度分别在发酵0，12，24，36h时加入培养基。
4.3按不同的添加方式添加：
组Ⅰ：在发酵开始就将亚硒酸钠加入培养基；
组Ⅱ：将最适亚硒酸钠含量等分为两份，分别在发酵开始和12h后加入；
组Ⅲ：将最适亚硒酸钠含量等分为三份，分别在发酵开始，12h和24h后加入；
4.4丝氨酸添加方式的优化：
组Ⅳ：在发酵开始时就将向其中加入2mg/L丝氨酸；
组Ⅴ：将丝氨酸含量等分为两份，分别在发酵开始和12h后加入；
组Ⅵ：将丝氨酸含量等分为三份，分别在发酵开始，12h和24h后加入。
5.生产效率测定:
采用干重法(将菌丝发酵液5000rpm离心5min，弃去上清液并收集菌丝)，将培养的菌丝冷冻干燥机中冻干。
生产效率g/L＝富硒产品干重g÷液体培养基的体积L
6.硒的测定：
利用3,3-二氨基联苯胺(DAB)比色法对硒的含量进行测定。
7.1总硒含量的测定：
酵母菌丝中硒含量测定：准确称取1g富硒产物，放入烧瓶中，加入10mL消化液(5 g钼酸钠加入蒸馏水:浓硫酸:高氯酸/3:3:4的溶液中配置而成)，4℃消化至无色透明为止。待冷却后，将此消化液转入50mL容量瓶中，用NaOH调节pH到7.0左右，最后将溶液定容到50mL，最后取10mL消化样液，按DAB比色法计算硒含量。
7.2有机硒含量；
准确称取酵母富硒产物0.5g，放入透析袋中，充分透析24h后(去除无机硒)，取透析袋中物质，按上述方法进行硒含量测定。
7.3综合考虑富硒量和有机硒转化率，以确定最优的培养基硒浓度。
富硒量μg/g＝总硒含量μg÷菌丝干重g
有机硒转化率％＝有机硒含量μg÷总硒含量μg×100％
7.氨基酸的测定：
氨基酸的测定是利用反相高效液相色谱(HPLC)完成，该测定配备了Hypersil ODSC18 色谱柱(4mm×125mm,Agilent)，以1mL/min的流速进行梯度洗脱，柱温为40℃。移动相的配置为：缓冲液A：0.8g醋酸钠溶于500mL超纯水，加入90μL三乙胺和2.9 mL四氢呋喃，最后用醋酸将pH值调整为7.2±0.05；缓冲液B：0.8g醋酸钠溶于100 mL超纯水，加入200mL甲醇，最后用醋酸将pH值调整为7.2±0.05。洗脱程序设置为：(缓冲液A/缓冲液B)100:0，50:50，0:100，0:100，100:0和100:0，对应的时间分别是0，17，20，20.1，24和24.1min。邻苯二甲醛(OPA,Sigma)作为衍生试剂，检测波长设置为338nm(262nm用于检测脯氨酸)。标准氨基酸均用0.1 M HCl配置成浓度为1mM的储液。样品中各氨基酸的含量，是通过标准品绘制的标准曲线计算得来。所有样品分析三次，取平均值。
8.数据处理与分析：
试验数据采用IBM SPSS Statistics 22软件进行单因子方差分析，多重比较，结果以平均数士标准差表示。
结果与讨论：
1.培养条件及培养介质的优化：
a)培养介质的确定：
培养基的组成对菌体生长有一定的影响，浓度过高会导致培养基渗透压增高，不利于菌体生长，浓度过低又使得营养成分不足，难以供给菌体生长所需的原料，故本专利采用正交实验，如表3所示，对葡萄糖、蛋白胨、酵母膏浓度这三个因素进行了优化，结果显示，在葡萄糖、蛋白胨、酵母膏浓度分别为20，15，10g/L时，酿酒酵母可以获得最大产量，相对于最低产量增加了26.5％。
表3培养介质的正交实验设计及结果
每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一列中不同的字母表示具有显著差异(P<0.05)；
b)培养条件的确定：
根据表4结果显示，温度、转速、初始pH对菌体的生长影响较大，在以上述最适培养基为基础的条件下，温度为30℃，转速为200rpm，初始pH为5的情况下可以获得最大菌丝干重，相较于最少量增加了14.4％，相对于pH自然地条件下也增加了2.1％。
根据上述结果，在葡萄糖，蛋白胨，酵母膏浓度分别为20，15，10g/L时，设置培养温度为30℃，转速为200rpm，初始pH为5可以获得最高产量，菌丝干重可达约15.1g/L。
表4培养条件的正交实验设计及结果
每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一列中不同的字母表示含具有显著差异(P<0.05)；
2.硒含量的优化
根据图1-2显示，随着硒含量的增加，菌丝干重逐渐减少，在亚硒酸钠浓度为100μg/mL 时，菌丝干重减少约59.9％，单位硒含量逐渐增加，最高时可达6231.0μg/g，有机硒转化率先增加再减少，在亚硒酸钠浓度达到60μg/mL时，获得最大转化率，达91.1％，综合菌丝干重、单位硒含量以及有机硒转化率，根据对酿酒酵母菌丝的生长抑制并没有过于显著，并且可以获得较高的单位硒含量和有机硒转化率，因此，我们选择亚硒酸钠浓度为 60μg/mL。
3.硒的添加方式的确立：
根据发酵过程中培养基颜色的改变以及表5的数据，可以发现，按不同时间向培养基中添加亚硒酸钠，菌液中出现红硒现象的时间变短，这说明有较多的菌丝以极快的速度利用了亚硒酸钠，但是，随着发酵天数的增加，后加硒的培养基中获得的菌丝量没有过大的差异，富硒量却大大减少，并且在发酵过程中存在着不稳定性，在发酵12h或24h后加入亚硒酸钠时，可以获得更高的富硒量，相对于最少量增加了68.7％，这是由于在酵母菌的培养过程中，一般会经历适应期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段，由于硒是在酵母生长繁殖的过程中掺入到初级代谢产物中的，因此对数生长期是硒元素吸收富集的最佳时期，到了稳定期以后，酵母的生长基本停止，代谢降低，乙醇等发酵产物开始积累，硒很难再掺入到细胞内；对比不同添加时间下的有机硒的转化率，随着发酵天数的增加，最后加硒的培养基中有机硒转化率极小，最小时可达39.8％，尽管可以获得相对高产的菌丝体，但是有机硒含量的急剧减少不利于工业化应用，故选择在发酵24h后加入亚硒酸钠，从而获得硒的最大化利用，减少工业成本。
表5不同时间加入亚硒酸钠对菌丝生长的影响
每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一列中不同的字母表示具有显著差异(P<0.05)；
一次性加入亚硒酸钠可能由于亚硒酸钠浓度过高从而抑制了菌丝的生长，所以我们又采用了分批次加入的方式，根据表6的结果，我们发现分批次加亚硒酸钠可以提高菌丝的产量，这说明分批次加入亚硒酸钠后，由于菌液中菌丝含量较高，亚硒酸钠对菌丝的抑制作用减弱；结合表6结果，我们选择在将最适亚硒酸钠含量等分为两份，分别在发酵开始和12h后加入培养基中，在这种条件下，可以获得最高的富硒量，同时有机硒转化率也达最大。
表6不同亚硒酸钠的添加方式对菌丝生长的影响
每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一列中不同的字母表示具有显著差异(P<0.05)；
4.丝氨酸的添加方式的确立：
硒酵母作为一种有机硒补品，探明其有机硒的存在形式，对研究硒在生物体内的存在形式及其作用机制、从分子水平阐明某些酶的催化作用以及许多疾病的发病机理等方面具有重要的理论意义；而对其在安全性、营养作用及合理服用等方面具有重要的实际意义。经过实验确定，硒酵母中有机硒的主要存在形式是硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸，尚有少量有机硒是以其它形式存在，但目前还无法确定其形式和含量，而生物体内半胱氨酸和甲硫氨酸主要是由丝氨酸合成，所以丝氨酸对于硒的有机化至关重要。根据表7结果显示，在加丝氨酸的情况下，有机硒转化率最高可达95％，远高于不加丝氨酸时的情况。
根据表8结果，我们发现在加入丝氨酸之后可以显著提高酿酒酵母体内半胱氨酸和甲硫氨酸的含量，同时由于培养基中含有部分丝氨酸，故生物体内丝氨酸含量也有明显提高，相同条件下，酿酒酵母体内甲硫氨酸的含量大约增长了2倍，半胱氨酸增长了20％以上，这与硒的转化有着密切联系。
表7不同丝氨酸的添加方式对菌丝生长的影响
每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一列中不同的字母表示具有显著差异(P<0.05)；
表8亚硒酸钠和丝氨酸对菌体内氨基酸含量的影响
每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一列中不同的字母表示具有显著差异(P<0.05)；其中，组Ⅱ：将最适亚硒酸钠含量等分为两份，分别在发酵开始和12h后加入；组Ⅳ：在发酵开始时就将向其中加入2mg/L丝氨酸；组Ⅴ：将丝氨酸含量等分为两份，分别在发酵开始和12h后加入；组Ⅵ：将丝氨酸含量等分为三份，分别在发酵开始，12h和24h后加入。
总结：
本实验采取一种新型的亚硒酸钠的添加方式，不仅不会影响菌丝的产量，而且大大提高了硒的利用率，使无机硒尽可能的转化为有机硒，减少产品的毒性，具有极高的工业应用。
优点：
与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)本专利采用一种独特的优化方式，采取正交实验，既涵盖了各个条件之间的协同与拮抗作用，还大大减少了实验次数，提高了实验效率；(2)本专利采取不同的亚硒酸钠添加时间与添加方式，从而获得最大菌丝生物量，富硒量和有机硒转化率，相对于传统工业大大减少了食用原料，节约了成本。(3)本专利采用一种新型加硒方式，向培养基中加入一定量的丝氨酸，提高了亚硒酸钠的转化率，同时显著提高了生物体内甲硫氨酸，半胱氨酸的含量，提高了酵母的营养价值。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种富硒酵母培养工艺的优化方法，其特征在于，其包括以下步骤：
（1）选取酿酒酵母；
（2）培养基的培养：培养基组分包括葡萄糖、蛋白胨和酵母膏，对这三个成分因素进行正交实验，得出发酵培养基的最佳配方，其中，正交实验时，装液量为50 mL/ 250 mL，接种量为5 %，温度为30 ℃，pH 为自然，转速为200 rpm，发酵48 h后测定其菌丝生物量；
（3）培养条件的优化：采用正交实验，优化转速、温度、初始 pH 这三个变量，其中，装液量为 50 mL/ 250 mL，接种量为 5 %，发酵48 h后测定其菌丝生物量；
（4）富硒条件的优化：正交实验结果，确定了酿酒酵母的最适的培养条件，选择不同添加时间、添加方式来添加亚硒酸钠，进行优化，达到硒的最大化利用；
（5）生产效率测定：采用干重法，将菌丝发酵液 5000 rpm 离心 5 min，弃去上清液并收集菌丝，之后将培养的菌丝冷冻干燥机中冻干，其中，生产效率 g/L= 富硒产品干重 g÷ 液体培养基的体积 L；
（6）硒的测定：利用 3,3-二氨基联苯胺比色法对硒的含量进行测定；
（7）总硒含量的测定：
酵母菌丝中硒含量测定：准确称取 1 g 富硒产物，放入烧瓶中，加入 10 mL 消化液，4℃消化至无色透明为止，待冷却后，将此消化液转入 50 mL 容量瓶中，用NaOH 调节 pH到 7.0 左右，最后将溶液定容到 50 mL，最后取 10 mL 消化样液，按 DAB比色法计算硒含量；
（8）有机硒含量；
准确称取酵母富硒产物 0.5 g，放入透析袋中，充分透析 24 h 后去除无机硒，取透析袋中物质，按上述方法进行硒含量测定；
（9） 综合考虑富硒量和有机硒转化率，以确定最优的培养基硒浓度；
富硒量 µg/g = 总硒含量 µg ÷ 菌丝干重 g；
有机硒转化率 % = 有机硒含量 µg ÷ 总硒含量 µg × 100%；
（10）氨基酸的测定：
氨基酸的测定是利用反相高效液相色谱HPLC完成，该测定配备了Hypersil ODS C18色谱柱，色谱柱为4 mm×125 mm，以 1 mL/min 的流速进行梯度洗脱，柱温为 40℃，移动相的配置为：缓冲液 A： 0.8 g 醋酸钠溶于 500 mL 超纯水，加入 90μL 三乙胺和 2.9 mL四氢呋喃，最后用醋酸将 pH 值调整为 7.2±0.05；缓冲液 B： 0.8 g 醋酸钠溶于 100 mL超纯水，加入 200 mL 甲醇，最后用醋酸将 pH 值调整为 7.2±0.05；洗脱程序设置为：缓冲液 A/ 缓冲液 B分别为 100:0， 50:50， 0:100， 0:100， 100:0 和 100:0，对应的时间分别是 0， 17， 20， 20.1， 24 和 24.1 min；邻苯二甲醛作为衍生试剂，检测波长设置为338 nm，262 nm 用于检测脯氨酸；标准氨基酸均用 0.1 M HCl 配置成浓度为 1 mM 的储液，样品中各氨基酸的含量，通过标准品绘制的标准曲线计算得来，所有样品分析三次，取平均值；
（11）数据处理与分析：
试验数据进行单因子方差分析，多重比较，结果以平均数士标准差表示。
2.根据权利要求1所述的一种富硒酵母培养工艺的优化方法，其特征在于：所述步骤（4）中，向培养基中加入2 mg/L丝氨酸，以获得亚硒酸钠的最大转化率。
3.根据权利要求2所述的一种富硒酵母培养工艺的优化方法，其特征在于：所述步骤（4）中，富硒条件的优化的具体步骤如下：
①硒含量的优化：
分别选取0，20，40，60，80，100 μg/mL的七个设计点，培养48 h 后测定菌体含量，单位硒含量以及有机硒转化率；
②按不同添加时间添加：将最适的亚硒酸钠浓度分别在发酵0，12，24，36 h时加入培养基；
③按不同的添加方式添加：
组Ⅰ：在发酵开始就将亚硒酸钠加入培养基；
组Ⅱ：将最适亚硒酸钠含量等分为两份，分别在发酵开始和12h后加入；
组Ⅲ：将最适亚硒酸钠含量等分为三份，分别在发酵开始，12h和24h后加入；
④4.4 丝氨酸添加方式的优化：
组Ⅳ：在发酵开始时就将向其中加入2mg/L丝氨酸；
组Ⅴ：将丝氨酸含量等分为两份，分别在发酵开始和12h后加入；
组Ⅵ：将丝氨酸含量等分为三份，分别在发酵开始，12h和24h后加入。
4.根据权利要求1所述的一种富硒酵母培养工艺的优化方法，其特征在于：所述步骤（7）中，硒的测定的具体步骤如下：
①硒总含量：
黄牛肝菌菌丝中硒含量测定：准确称取 1 g 富硒产物，放入烧瓶中，加入 10 mL 消化液， 4 ℃消化至无色透明为止，待冷却后，将此消化液转入 50 mL 容量瓶中，用氢氧化钠调节 pH 到 7.0 左右，最后将溶液定容到 50 mL，取 10 mL 消化样液，按 DAB 比色法计算硒含量，
②有机硒含量：
准确称取黄牛肝菌富硒产物 0.5 g，放入透析袋中，充分透析 24 h 后去除无机硒，取透析袋中物质，按上述方法进行硒含量测定；
③综合考虑富硒量和有机硒转化率，以确定最优的培养基硒浓度，其中，
富硒量 µg/g = 硒总含量µg ÷ 菌丝干重g
有机硒转化率 % = 有机硒含量µg÷硒总含量 µg×100%。
5.根据权利要求3所述的一种富硒酵母培养工艺的优化方法，其特征在于：所述10ml的消化液为5 g 钼酸钠加入混合溶液中配制而成，其中，混合溶液为蒸馏水:浓硫酸:高氯酸的体积比为3:3:4 的溶液中配置而成。
6.一种富硒酵母培养工艺，其特征在于： 其采用酿酒酵母为实验菌种，培养基中的葡萄糖、蛋白胨、酵母膏浓度分别为20 g/L、15 g/L、10g/L，设置培养温度为30 ℃，转速为200rpm，初始pH为5，向培养基中加入2 mg/L丝氨酸，在发酵24 h后加入亚硒酸钠，使得亚硒酸钠浓度为60μg/mL。
7.根据权利要求5所述的一种富硒酵母培养工艺，其特征在于：加入亚硒酸钠时采用分批次加入的方式进行添加。
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