CN103196860B - 辅酶q10高产菌株选育快速筛选的方法 - Google Patents
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Abstract
辅酶Q10高产菌株选育快速筛选的方法，涉及辅酶Q10。1）从发酵液中超声波提取辅酶Q10样品；2）通过酶标仪初筛高含量辅酶Q10菌株；3）HPLC复筛。在常规的紫外分光光度法的基础上进行了改进，菌株发酵液通过超声波破碎法获得辅酶Q10样品，利用还原剂将辅酶Q10样品转化为还原型辅酶Q10，以还原型辅酶Q10做对照来消除提取液中蛋白质、核酸等杂质所造成误差，同时结合酶标仪批量快速测定辅酶Q10样品，既提高了测定的效率，又保证该方法的可靠性，最后通过HPLC法对少量初筛的高产菌株进行复筛获得辅酶Q10高产菌株，从而大大缩减了育种的周期，提高筛选辅酶Q10高产菌株的效率。
Description
技术领域
本发明涉及辅酶Q10，尤其是涉及一种辅酶Q10高产菌株选育快速筛选的方法。
背景技术
辅酶Q10是人类生命中不可缺少的重要元素之一。它是一种能激活人体细胞的能量、提高人体免疫力、增强细胞抗氧化能力和延缓衰老的重要生理活性物质，已经成为世界生物医药领域研究的热点。近年来广泛应用在保健品、化妆品和食品行业中。随着辅酶Q10需求的日益增长，各国学者都纷纷聚焦在辅酶Q10的生产研究。目前的生产方法主要包括直接提取法、化学合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法最具有发展前途，是最可能实现工业化生产规模的生产方法。
菌种筛选是提高菌种质量和稳定发酵水平的重要手段。由于菌株选育要经过初筛和复筛两个阶段，初筛的单菌落众多，一般在500～1000个，如果采用比较繁琐的测定方法势必影响菌株筛选的效率。辅酶Q10通常采用常规紫外分光光度法和高效液相色谱法进行检测，这两种检测方法的缺点是：（1）常规的紫外分光度法因核酸和蛋白质等杂质的影响造成测定结果偏高，误差大；（2）高效液相色谱法工序复杂耗时，无法测定大量样品，效率较低，从而影响整体育种周期。
《60Coγ射线对辅酶Q10产生菌三孢布拉氏霉的诱变选育》（《西北农林科技大学学报》第34卷第4期）公开了一种辅酶Q10产生菌三孢布拉氏霉的诱变选育方法，其筛选测定采用的方法是紫外分光光度法，通过蒸馏回流、石油醚萃取减压浓缩，然后用薄层层析分离浓缩液中的辅酶Q10，并采用紫外分光光度法测定辅酶Q10的含量。该方法虽然测定结果准确，但是辅酶Q10样品处理步骤繁琐，处理大批量的样品费时费力，筛选的效率较低，其中薄层层析其色泽深浅与样品质量浓度呈正相关，只能半定量测定比较各突变菌株相对产量。
《发酵菌体中辅酶Q10的提取及其测定方法》（《无锡轻工大学学报》第22卷第2期）公开了一种提取及测定发酵菌体中辅酶Q10的方法，该方法采用皂化提取纯度较高的辅酶Q10，通过紫外分光光度法测定具有很好的重现性和稳定性，但其提取步骤繁琐，处理大量样品耗时耗力，从而筛选的效率较低。
《利用空间诱变选育辅酶Q10高产菌》（《科技导报》第24卷第14期）公开了采用卫星空 间育种获得诱变菌株，通过菌体大小和颜色作为初筛的主要标准，发酵液用石油醚等溶剂萃取辅酶Q10，然后通过旋转蒸发仪获得辅酶Q10样品，提取耗时近2h，辅酶Q10样品采用HPLC检测。该方法能通过颜色和菌体大小对诱变菌体进行快速的初筛，但肉眼分辨有局限性，往往会遗漏一些高产菌株，其提取和检测方法都比较的耗时，影响整体的筛选效率。
本申请人在中国专利CN102154182A中公开一种辅酶Q10生产的固料母种发酵培养的方法。采用的菌种为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides（保藏号CGMCCNo.4497）。采用斜面菌种传代，斜面培养基培养；将固料培养基蒸煮后晾干，分装灭菌，所述固料培养基包含固料组分与液体组分；将新鲜斜面菌种类球红细菌Rhodobacter sphaeroides加无菌水制成菌悬液，倒入固料培养基，培养后作为一级发酵的母种。在种子工艺中使用，有效提高辅酶Q10发酵水平，节省发酵级数缩短了周期，简化生产环节，降低生产成本。
发明内容
本发明的目的在于针对现有辅酶Q10菌株选育筛选方法的不足，提供一种辅酶Q10高产菌株选育快速筛选的方法。
本发明包括以下步骤：
1）从发酵液中超声波提取辅酶Q10样品；
2）通过酶标仪初筛高含量辅酶Q10菌株；
3）HPLC复筛。
在步骤1）中，所述从发酵液中超声波提取辅酶Q10样品的方法可为：取辅酶Q10发酵液，辅酶Q10发酵液与提取溶剂按体积比为1～2∶10混匀后进行超声波提取，所述提取溶剂为乙醇和丙酮的混合溶液，所述乙醇与丙酮的体积比可为（5～10）∶1，提取的温度为30～35℃，超声处理，震荡后，静置，再用滤膜过滤收集滤液，即得到氧化型辅酶Q10样品；所述超声处理的时间可为30～40min，所述滤膜可采用0.22μm的滤膜。
在步骤2）中，所述通过酶标仪初筛高含量辅酶Q10菌株的方法可为：吸取相同体积的氧化型辅酶Q10样品于酶标板中，通过酶标仪测定氧化型辅酶Q10样品在275nm波长下的吸光值，再加入还原剂溶液，震荡后，测定还原型辅酶Q10在275nm波长下的吸光值，根据氧化型辅酶Q10和还原型辅酶Q10吸光值差值的大小，通过查询标准曲线判断辅酶Q10浓度的大小；所述还原剂溶液可选自硼氢化钠溶液、硼氢化钾溶液、氢化铝锂溶液、氯化亚锡溶液等中的一种；所述标准曲线的制作方法可为：吸取相同体积不同浓度梯度的氧化型辅酶Q10标准品溶液于酶标板中，通过酶标仪测定其在275nm波长下的吸光值，然后加入还原剂，在275nm波长下测定其还原型的吸光值，以辅酶Q10标准品的氧化型与还原型在275nm波长下的吸光度差值对氧 化型辅酶Q10标准品浓度做回归曲线，即得到标准曲线；所述还原剂选自硼氢化钠、硼氢化钾、氢化铝锂、氯化亚锡等中的一种；所述还原剂的加入量最好是至少能使全部的辅酶Q10还原，还原剂的加入量的确定方法可为：吸取3mL浓度为80～150mg/L辅酶Q10标准品溶液加入到石英比色皿中，然后分别加入不同剂量梯度的还原剂溶液，均匀振荡，无水乙醇作为对照，待气泡消失后测定275nm波长下吸光值，当辅酶Q10渐渐被还原时，吸光值逐渐下降，当275nm波长下的吸光值不变时，说明添加的还原剂剂量足够使氧化型辅酶Q10标准品被完全还原，更进一步，可通过HPLC法来验证辅酶Q10是否已经完全还原。
在步骤3）中，所述HPLC复筛的方法可为：将初筛得到的吸光值差值大的辅酶Q10样品用高效液相色谱法进行复测，最终筛选出辅酶Q10高产菌株；HPLC色谱条件可为：色谱柱为不锈钢柱Inertsil.ODS-SP、规格为4.6×100mm，直径为5μm，检测波长275nm，流动相为无水甲醇∶无水乙醇=65∶35（V/V），流速：1.1～1.3mL/min，柱温：35℃，进样量：20～25μL，洗脱时间：20min；所述辅酶Q10高产菌株选自类球红细菌属（Rhodobacter sphaeroides）及其诱变菌株，优选为类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）JDW-610，已于2010年12月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.4497。
本发明的有益效果：在常规的紫外分光光度法的基础上进行了改进，菌株发酵液通过超声波破碎法获得辅酶Q10样品，利用还原剂将辅酶Q10样品转化为还原型辅酶Q10，以还原型辅酶Q10做对照来消除提取液中蛋白质、核酸等杂质所造成误差，同时结合酶标仪批量快速测定辅酶Q10样品，既提高了测定的效率，又保证该方法的可靠性，最后通过HPLC法对少量初筛的高产菌株进行复筛获得辅酶Q10高产菌株，从而大大缩减了育种的周期，提高筛选辅酶Q10高产菌株的效率。
附图说明
图1为氧化型辅酶Q10HPCL检测图谱。
图2为部分还原型辅酶Q10HPLC检测图谱。
图3为完全还原型辅酶Q10HPLC检测图谱。
图4为辅酶Q10浓度—吸光差值标准曲线图。
具体实施方式
实施例1：还原剂最适用量的确定
以还原剂为硼氢化钠为例：
配制浓度为80mg/L氧化型辅酶Q10标准品，精确吸取3mL加入到石英比色皿中，然后分别加入2μL、6μL、12μL、16μL、20μL、32μL、40μL、50μL浓度为9mg/mL硼氢化钠溶液，均匀振荡，无水乙醇做为对照，待气泡消失后测定275nm吸光值，记录最终稳定数值，结果如表1所示。
表1 还原剂最适用量
从表1可以看出，添加还原剂后，随着硼氢化钠溶液剂量的增加，275nm波长下的吸光值将逐渐下降，当硼氢化钠添加量大于20μL时，275nm吸光值稳定不变，可判断出添加20μL的硼氢化钠时，辅酶Q10已被完全还原。
HPLC法验证辅酶Q10还原过程：将上述添加了不同剂量还原剂的辅酶Q10分别进行HPLC图谱检测。
所用HPLC检测条件为：色谱柱为不锈钢柱Inertsil.ODS-SP、规格为4.6×100mm直径为5μm，检测波长275nm，流动相为无水甲醇∶无水乙醇=65∶35（V/V），流速：1.3mL/min，柱温：35℃，进样量20μL，洗脱时间20min。
图1为氧化型辅酶Q10标准品HPLC检测图谱，图中保留时间为11.3min的特征峰为氧化型辅酶Q10的峰。
图2为添加6μL的硼氢化钠溶液后的辅酶Q10HPLC检测图谱，图谱中具有2个特征峰，保留时间分别为7.7min和11.3min，对照图1可以得知保留时间11.3min为氧化型辅酶Q10的峰，结合图3可以得知保留时间min时为部分氧化型辅酶Q10转变成还原型辅酶Q10的峰，说明添加6μL硼氢化钠时，氧化型的辅酶Q10部分转变为还原型的辅酶Q10。
图3为添加20μL硼氢化钠后辅酶Q10HPLC检测图谱，图谱中保留时间为7.7min的特征峰为还原型辅酶Q10的峰，保留时间为11.3min处无特征峰，说明无氧化型辅酶Q10存在，可以证明添加20μL硼氢化钠溶液后，氧化型辅酶Q10已完全转化成还原型辅酶Q10。
实施例2：辅酶Q10浓度—吸光差值标准曲线的制备
分别测定浓度为8mg/L、16mg/L、32mg/L、48mg/L、64mg/L、80mg/L的氧化型辅酶Q10标准品与还原型辅酶Q10标准品在275nm下的吸光值，即可求得△A（氧化型OD275nm-还原型OD275nm），然后对不同浓度辅酶Q10标准品做线性回归，即得辅酶Q10浓度—吸光差值标准曲线，如图4所示。
实施例3：
1、菌体诱变发酵
出发菌株类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）JDW-610保种斜面通过画线分离单菌落，然后将成熟的单菌落接入新鲜的斜面，于32℃培养2天，然后加入5mL无菌水洗下菌悬液，转入含有25mL pH6.0PBS缓冲液、若干玻璃珠的三角瓶中，充分打匀，加入NTG使最终菌液中的NTG浓度为0.2mg/mL，于32℃水浴处理菌液15min，用pH6.0PBS缓冲液稀释终止反应，将诱变后的菌液涂于含有0.002g/L叠氮钠的平板培养基，于32℃培养5天。
所述类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）JDW-610已于2010年12月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.4497。
挑选100株生长良好的诱变菌株分别接入种子瓶，于32℃ 220rpm培养20h后按接种量为10%接入发酵培养基，32℃ 220rpm发酵30h后收集发酵液。
2、超声波提取辅酶Q10样品
分别精密吸取上述100株诱变菌株的发酵液5mL置于50mL棕色容量瓶，加入5mL丙酮振荡，然后用无水乙醇定容至50mL，将容量瓶再放入超声波清洗器30℃处理40min，超声波处理结束后充分震荡，然后静置30min，最后用0.22μm有机滤头过滤收集滤液。
3、快速检测辅酶Q10
精确吸取3mL浓度为80mg/L辅酶Q10标准品溶液加入到石英比色皿中，然后分别加入0μL、2μL、6μL、12μL、16μL、20μL、26μL、32μL、40μL、50μL浓度为6mg/ml硼氢化钠溶液，均匀振荡，无水乙醇做为对照，待气泡消失后测定275nm波长下的吸光值，检测结果如表2所示。
表2 硼氢化钠最适用量
从表2可以看出，随着硼氢化钠添加量的逐渐增加，275nm波长下的吸光值逐渐下降，当硼氢化钠添加量大于20μL时，吸光值稳定不变，说明辅酶Q10已被完全还原。
吸取相同体积的上述100份辅酶Q10样品于酶标板，通过酶标仪批量测定辅酶Q10样品在275nm波长下的吸光值，然后依次加入20μL浓度为6mg/mL硼氢化钠振荡均匀后测定其还原型辅酶Q10在275nm波长下的吸光值，计算吸光值差值，通过查询图4的标准曲线来判断辅酶Q10浓度的大小，测定结果如表3所示。
表3 快速检测辅酶Q10含量
4、HPLC复筛
将初筛获得辅酶Q10含量较高的9号和10号菌株用HPLC法进行复测，HPLC色谱条件为：色谱柱为不锈钢柱Inertsil.ODS-SP、规格为4.6×100mm直径为5μm，检测波长275nm，流动相为无水甲醇∶无水乙醇=65∶35（V/V），流速：1.1mL/min，柱温：35℃，进样量：20μL，洗脱时间：20min。通过HPLC法测得9号和10号菌株的辅酶Q10含量分别为181.45mg/L和192.86mg/L，可知快速检测辅酶Q10含量的误差分别为5.9%和4.3%，由此可知本发明的筛选方法的快速性及结果的准确性，从而可以完成辅酶Q10生产菌种快速筛选的工作。
实施例4：
1、菌体诱变发酵
出发菌株类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）CGMCCNo.4497保种斜面通过画线分离单菌落，然后将成熟的单菌落接入新鲜的斜面，于32℃培养2天，然后加入5mL无菌水洗下菌悬液，转入含有25mL pH6.0PBS缓冲液、若干玻璃珠的三角瓶中，充分打匀，加入NTG使最终菌液中的NTG浓度为0.5mg/mL，于32℃水浴处理菌液20min，用pH6.0PBS缓冲液稀释终止反应，将诱变后的菌液涂于含有0.005g/L叠氮钠的平板培养基于32℃培养6天。
挑选100株生长良好的诱变菌株分别接入种子瓶，于34℃220rpm培养30h后按接种量为15%接入发酵培养基，34℃220rpm发酵40h后收集发酵液。
2、超声波提取辅酶Q10样品
分别精密吸取上述100株诱变菌株的发酵液5mL置于50mL棕色容量瓶，加入7mL丙酮振荡，然后用无水乙醇定容至50mL，将容量瓶再放入超声波清洗器35℃处理30min，超声波处理结束后充分震荡，然后静置30min，最后用0.22μm有机滤头过滤收集滤液。
3、快速检测辅酶Q10
精确吸取3mL浓度为120mg/L辅酶Q10标准品溶液加入到石英比色皿中，然后分别加入0μL、2μL、6μL、12μL、16μL、20μL、26μL、32μL、40μL、50μL浓度为6mg/mL氯化亚锡溶液，均匀振荡，无水乙醇做为对照，待气泡消失后测定275nm波长下的吸光值，检测结果如表4所示。
表4 硼氢化钾最适添加量
从表4可以看出，随着氯化亚锡添加量的逐渐增加，275nm波长下的吸光值逐渐下降，当氯化亚锡添加量大于32μL时吸光值稳定不变，说明辅酶Q10已被完全还原。
吸取相同体积的上述100份辅酶Q10样品放入酶标板，通过酶标仪批量测定辅酶Q10样品在275nm波长下的吸光值，然后依次加入32μL浓度为6mg/mL氯化亚锡振荡均匀后测定其还原型辅酶Q10在275nm下的吸光值，计算吸光值差值，通过查询图4的标准曲线来判断辅酶Q10浓度的大小，测定结果如表5所示。
表5 快速检测辅酶Q10含量
4、HPLC复筛
将初筛获得辅酶Q10含量较高的4号和6号菌株用HPLC法进行复测，HPLC色谱条件为：色谱柱为不锈钢柱Inertsil.ODS-SP、规格为4.6×100mm直径为5μm，检测波长275nm，流动相为无水甲醇∶无水乙醇=65∶35（V/V），流速：1.3mL/min，柱温：35℃，进样量25μL，洗脱时间20min。通过HPLC法测得的4号和6号菌株辅酶Q10含量分别为196.45mg/L和189.86mg/L，可知快速检测辅酶Q10含量的误差分别为5.2%和4.1%。
实施例5：
1、菌体诱变发酵
出发菌株类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）CGMCCNo.4497保种斜面通过画线分 离单菌落，然后将成熟的单菌落接入新鲜的斜面，于32℃培养3天，然后加入5mL无菌水洗下菌悬液，转入含有25mL pH6.0PBS缓冲液、若干玻璃珠的三角瓶中，充分打匀，加入NTG使最终菌液中的NTG浓度为1mg/mL，于32℃水浴处理菌液30min，用pH6.0PBS缓冲液稀释终止反应，将诱变后的菌液涂于含有0.007g/L叠氮钠平板培养基于32℃培养7天。
挑选100株生长较好诱变菌株接入种子瓶，于35℃220rpm培养40h后按接种量为20%接入发酵培养基，35℃220rpm发酵50h后收集发酵液。
2、超声波提取辅酶Q10样品
分别精密吸取上述100株诱变菌株的发酵液8mL置于50mL棕色容量瓶，加入6mL丙酮振荡，然后用无水乙醇定容至50mL，将容量瓶再放入超声波清洗器35℃处理40min，超声波处理结束后充分震荡，然后静置30min，最后用0.22μm有机滤头过滤收集滤液。
3、快速检测辅酶Q10
精确吸取3mL浓度为150mg/L辅酶Q10标准品溶液加入到石英比色皿中，然后分别加入0μL、2μL、6μL、12μL、16μL、20μL、26μL、32μL、40μL、50μL浓度为9mg/mL氢化铝锂溶液，均匀振荡，无水乙醇做为对照，待气泡消失后测定275nm波长下吸光值，检测结果如表6所示。
表6 氢化铝锂最适添加量
从表6可以看出，随着氢化铝锂添加量的逐渐增加，275nm波长下的吸光值逐渐下降，当氢化铝锂添加量大于40μL时吸光值稳定不变，说明辅酶Q10已被完全还原。
吸取相同体积的上述100份辅酶Q10样品放入酶标板，通过酶标仪批量测定辅酶Q10样品在275nm波长下的吸光值，再加入40μL浓度9mg/mL氢化铝锂震荡均匀，然后测定其还原型辅酶Q10的在275nm波长下的吸光值，计算吸光值差值，通过查询图4的标准曲线来判断辅酶Q10浓度的大小，测定结果如表7所示。
表7 快速检测辅酶Q10含量
4、HPLC复筛
将初筛获得辅酶Q10含量较高的2号和8号菌株用HPLC法进行复测，HPLC色谱条件为：色谱柱为不锈钢柱Inertsil.ODS-SP、规格为4.6×100mm直径为5μm，检测波长275nm，流动相为无水甲醇∶无水乙醇=65∶35（V/V），流速：1.2mL/min，柱温：35℃，进样量20μL，洗脱时间20min。通过HPLC法测得2号和8号菌株的辅酶Q10含量分别为197.45mg/L和210.86mg/L，误差分别为4.6%和3.8%。
本发明不涉及特定的微生物，理论上只要是辅酶Q10的菌种都适用本发明中的方法进行测定，但菌种最好是类球红细菌属（Rhodobacter sphaeroides）及其诱变菌株，优选为类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）JDW-610及其诱变菌株，实施例中所用菌株皆为类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）JDW-610，且该菌株已在本申请人的在先专利申请201110050366.6中已经保藏过，保藏日期为2010年12月21日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.4497。
Claims (2)
1.辅酶Q10高产菌株选育快速筛选的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)从发酵液中超声波提取辅酶Q10样品，具体方法为：取辅酶Q10发酵液，辅酶Q10发酵液与提取溶剂按体积比为1～2∶10混匀后进行超声波提取，所述提取溶剂为乙醇和丙酮的混合溶液，所述乙醇与丙酮的体积比为(5～10)∶1，提取的温度为30～35℃，超声处理，震荡后，静置，再用滤膜过滤收集滤液，即得到氧化型辅酶Q10样品；
2)通过酶标仪初筛高含量辅酶Q10菌株，具体方法为：吸取相同体积的氧化型辅酶Q10样品于酶标板中，通过酶标仪测定氧化型辅酶Q10样品在275nm波长下的吸光值，再加入还原剂溶液，震荡后，测定还原型辅酶Q10在275nm波长下的吸光值，根据氧化型辅酶Q10和还原型辅酶Q10吸光值差值的大小，通过查询标准曲线判断辅酶Q10浓度的大小；所述标准曲线的制作方法为：吸取相同体积不同浓度梯度的氧化型辅酶Q10标准品溶液于酶标板中，通过酶标仪测定其在275nm波长下的吸光值，然后加入还原剂，在275nm波长下测定其还原型的吸光值，以辅酶Q10标准品的氧化型与还原型在275nm波长下的吸光度差值对氧化型辅酶Q10标准品浓度做回归曲线，即得到标准曲线；所述还原剂选自硼氢化钠、硼氢化钾、氢化铝锂、氯化亚锡中的一种；所述还原剂的加入量是至少能使全部的辅酶Q10还原，还原剂的加入量的确定方法为：吸取3mL浓度为80～150mg/L辅酶Q10标准品溶液加入到石英比色皿中，然后分别加入不同剂量梯度的还原剂溶液，均匀振荡，无水乙醇作为对照，待气泡消失后测定275nm波长下吸光值，当辅酶Q10渐渐被还原时，吸光值逐渐下降，当275nm波长下的吸光值不变时，说明添加的还原剂剂量足够使氧化型辅酶Q10标准品被完全还原，通过HPLC法来验证辅酶Q10是否已经完全还原；
3)HPLC复筛，具体方法为：将初筛得到的吸光值差值大的辅酶Q10样品用高效液相色谱法进行复测，最终筛选出辅酶Q10高产菌株；HPLC色谱条件为：色谱柱为不锈钢柱Inertsil.ODS-SP、规格为4.6×100mm，直径为5μm，检测波长275nm，流动相为无水甲醇∶无水乙醇＝65∶35(V/V)，流速：1.1～1.3mL/min，柱温：35℃，进样量：20～25μL，洗脱时间：20min；所述辅酶Q10高产菌株为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)JDW-610，已于2010年12月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.4497。
2.如权利要求1所述辅酶Q10高产菌株选育快速筛选的方法，其特征在于所述超声处理的时间为30～40min，所述滤膜采用0.22μm的滤膜。
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