CN108441491A - 一种快速筛选合成米格列醇关键中间体突变菌株的方法及菌株 - Google Patents
一种快速筛选合成米格列醇关键中间体突变菌株的方法及菌株 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种快速定量检测米格列醇关键中间体突变菌株的方法及菌株，所述方法将野生氧化葡糖杆菌经诱变处理后的诱变菌株进行发酵培养，取发酵培养后的诱变菌株湿菌体细胞加入底物反应液中，在15℃转化反应完全后，将反应液离心，测上清中6NSL含量，根据6NSL含量的高低来筛选获得合成米格列醇关键中间体的高活力突变菌株。本发明所提供的检测方法具有简便、快捷、特异性高，重复性好等特点，该方法能够进一步应用于高活力氧化葡糖杆菌的筛选，有效加快育种进程，筛选获得的突变菌株转化合成米格列醇中间体6NSL催化能力显著提升，适用于米格列醇的工业化大规模生产。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种快速定量检测米格列醇关键中间体6-脱氧-6-氨基 (N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖(6NSL)的方法。
(二)背景技术
米格列醇[1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇，miglitol]，为葡萄糖结构类似物(如图1所示)，是德国拜耳(Bayer)公司开发的一种新型α-糖苷酶抑制剂类降糖药物，其对胰淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有高亲和力，能够抑制二糖、多糖和复合糖的水解，延缓葡萄糖和其它单糖的吸收，降糖效果明显，毒副作用明显低于磺酞脉类及双肌类药物，已经成为治疗 II型糖尿病的重要治疗药物之一。
US4246345，US4806650，US5401645等公开了以N-羟乙基葡萄糖胺为底物用化学生物组合法合成米格列醇的工艺路线是目前合成米格列醇的主要技术路线，该底物由葡萄糖和乙醇胺经一步化学加氢过程合成，引入氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)对底物N-羟乙基葡萄糖胺进行 4-羟基的选择性不对称氧化，获得的中间产物直接耦合化学加氢环化合成米格列醇。该工艺较传统的全化学合成具有合成工艺路线短，成本低，产量较高的优势。其中，氧化葡糖杆菌不对称选择性氧化是该路线的关键限制步骤，其合成的中间体为6-脱氧-6-氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖 (6NSL)，化学式为C8H17NO6。传统的化学生物组合法合成米格列醇的工艺路线缺乏对工艺节点中的米格列醇关键中间体6NSL的快速定量检测方法，仅通过对底物N-羟乙基葡萄糖胺的薄层色谱定性分析及对产物米格列醇的终端检测，缺乏对整个合成工艺进行及时、有效的检测监控。
前期文献报道了中间体6-脱氧-6氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖 (6NSL)的异构化及其稳定性会显著影响米格列醇的最终产率。因此，在 G.oxydans催化合成6NSL及化学加氢合成米格列醇工艺中，山梨醇脱氢酶高效催化、6NSL的稳定存在条件及与化学氢化高效耦合需要寻找一个合适的平衡工艺条件，才能够最终实现米格列醇的快速转化及高效合成，而对转化过程中重要中间体6NSL的快速定量方法是监控整个转化过程的基础。已有的专利和文献未见针对6NSL的快速定量检测的相关报道。此外，目前国内尽管已有制取米格列醇中间体的菌株的相关报道，如 CN101302549，CN105968042A，CN104693109A等，但由于氧化葡糖杆菌发酵单位的菌体量少，N-羟乙基葡萄糖胺脱氢酶的活力相对较弱，催化进程较慢，底物浓度及转化率较低，限制了米格列醇的生产水平，亟需建立高活力菌株的高效筛选方法，而以米格列醇关键中间体6NSL快速定量检测方法为技术平台建立的高通量筛选方法，能够有效加快高活力催化合成米格列醇中间体6NSL菌株的选育进程，为我国米格列醇生产工艺的进一步提升奠定基础。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种快速定量检测米格列醇关键中间体6-脱氧-6- 氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖的方法，并结合诱变选育筛选获得了一株高活力氧化葡糖杆菌突变菌株ZJB16009，并将该菌株应用于催化合成米格列醇中间体6NSL，以克服现有米格列醇合成工艺中关键转化中间体监控技术缺乏、底物投料浓度低、转化进程慢等局限。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种快速筛选合成米格列醇关键中间体突变菌株的方法，所述方法为：将野生氧化葡糖杆菌经诱变处理后的诱变菌株进行发酵培养，取发酵培养后的诱变菌株湿菌体细胞加入底物反应液中，在15℃转化反应完全后，将反应液离心，取上清加入DNPH显色溶液，37℃保温 15min后加入NaOH水溶液终止反应并测定445nm处吸收峰值，根据6NSL标准曲线，获得上清中6NSL含量，根据6NSL含量的高低来筛选获得合成米格列醇关键中间体的高活力突变菌株；所述底物反应液终浓度组成为：N-羟乙基葡萄糖胺60g/L、七水硫酸镁5g/L，pH 5.0，溶剂为去离子水；所述DNPH显色溶液是将DNPH(二硝基苯腙)用HCl水溶液溶解后加去离子水配制而成；所述6NSL标准曲线是将6NSL用去离子水配制成不同浓度梯度，与上清相同条件下测定445nm处吸收峰值，以不同梯度浓度为横坐标，以吸收峰值为纵坐标制备而成。
进一步，所述DNPH显色溶液中，HCl水溶液(优选10M)体积用量以DNPH质量计为50-300mL/g，DNPH终浓度为20mmol/L。
进一步，所述NaOH水溶液浓度为8mol/L。
进一步，所述DNPH显色溶液与上清体积比为1:4-6，所述DNPH显色溶液与NaOH水溶液体积比为1:1。
进一步，所述6NSL标准曲线按如下方法制备：将6NSL用去离子水分别配制成浓度5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L和50g/L的6NSL 标准液，分别吸取150μL不同浓度的6NSL标准液滴加至96孔板中，加入25μL、20mM的DNPH显色溶液混合，于37℃恒温保温15min，加入25μL、8M的NaOH水溶液停止反应，测试在445nm的吸收峰值，以6NSL浓度为横坐标，以吸收峰值为纵坐标制作而成。
进一步，所述野生氧化葡糖杆菌诱变处理方法为：
(1)菌种活化：从甘油管中接野生氧化葡糖杆菌至斜面培养基，28℃恒温培养箱培养3～5天；斜面培养基质量终浓度组成：酵母浸出粉1.0％，碳酸钙2.0％，葡萄糖4.0％，琼脂2.4％，溶剂为水，pH值自然；
(2)菌悬液和单孢子的制备：加入10mL 0.85％生理盐水到步骤(1) 中斜面培养基中，刮下菌体，将菌液倒入到带有玻璃珠的三角瓶中，振荡 10min，使菌体散开，用灭菌的滤纸过滤到灭菌的空三角瓶中，将过滤的菌液用无菌水进行稀释，稀释倍数为10-3，即为菌悬液；
(3)紫外线诱变：将步骤(2)中的菌悬液吸取500μL到平皿中，自然风干20min，事先打开诱变箱(如CBIO-UV1A，功率：4W；波长 254nm)37℃预热20min，将步骤(2)中平皿放置于距紫外灯20cm处，依次照射45-90s，放置于诱变箱中黑暗静置2h，其他条件自然；
(4)平皿单菌落培养：向步骤(3)中诱变的平皿中加入1mL无菌水，使风干过的菌液洗下，吸取100μL涂平板，28℃恒温培养箱内培养 3～5天，获得诱变后的突变菌株；所述平板质量组成为：葡萄糖40g/L，酵母10g/L，碳酸钙20g/L，琼脂2.4％，溶剂为去离子水，pH值自然。
进一步，所述诱变菌株发酵培养方法为：将诱变菌株接种至发酵培养基，在28℃、150rpm培养48h后，取发酵液离心，弃上清，收集沉淀即为诱变菌株湿菌体细胞；发酵培养基组成为：D-山梨醇50g/L，酵母浸出粉20～25g/L，KH2PO4 5g/L，K2HPO4 5g/L，溶剂为水，pH值自然。
进一步，所述野生氧化葡糖杆菌为氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CCTCCNo.M 208069，专利公开号CN101591681A。
本发明还涉及一种利用所述方法筛选得到的高活力诱变菌株--氧化 葡糖杆菌诱变菌株(Gluconobacter oxydans)ZJB16009，保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC No.M 2017013，保藏日期为2017年 1月6日，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
本发明还提供一种所述氧化葡糖杆菌诱变菌株CCTCC No.M 201703在催化合成米格列醇中间体6NSL中的应用。
进一步，所述应用为：以N-羟乙基葡萄糖胺为底物，以氧化葡糖杆菌诱变菌株CCTCC No.M 201703经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，加入七水硫酸镁，以去离子水为反应介质，构成pH 5.0反应体系，在15℃进行转化反应，反应完全后，获得含6NSL的反应液，将反应液分离纯化，获得6NSL；所述反应体系中，底物终浓度为40～100g/L，优选60～80g/L，七水硫酸镁终浓度1～10g/L(优选5g/L)，催化剂用量以湿菌体重量计为 40～60g/L。
本发明所述催化剂按如下方法制备：将氧化葡糖杆菌诱变菌株 CCTCC No.M201703接种斜面培养基，28℃培养3～5天，待斜面培养基中CaCO3变透明光亮，肉眼目测无染菌；挑取斜面培养的菌种，将斜面的菌株接种到装有40mL种子培养液的250mL三角摇瓶中，28℃， 235rpm培养48h，获得种子液，pH 4.0～7.0，OD600≥8达到转接标准，镜检菌形呈短杆状，着色深，无杂菌；按体积接种量2％转接于装有100mL 发酵培养基的500mL三角摇瓶中，28℃，235rpm发酵培养24h后，获得含湿菌体的发酵液，离心10000rpm，10min，弃上清，清水洗涤一遍，离心弃上清，沉淀为催化剂；所述斜面培养基质量终浓度组成：酵母浸出粉1.0％，碳酸钙2.0％，葡萄糖4.0％，琼脂2.4％，溶剂为水，pH值自然；种子培养基终浓度组成：D-山梨醇30～60g/L、酵母浸出粉20～30g/L、 KH2PO4 3～8g/L、K2HPO4 0.2～0.8g/L；发酵培养基终浓度组成：D-山梨醇50～100g/L，酵母浸出液20～30g/L，KH2PO4 3～10g/L、K2HPO4 3～10 g/L，pH＝6.5。本发明优选种子培养基组成：D-山梨醇50g/L，酵母浸出粉25g/L，KH2PO4 5g/L，K2HPO4 5g/L，溶剂为水，pH值自然。发酵培养基配方：D-山梨醇50g/L，酵母浸出粉25g/L，KH2PO4 5g/L，K2HPO4 5g/L，溶剂为水，pH值自然。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明提供的快速筛选合成米格列醇关键中间体突变菌株的方法，利用在一定条件下，6-脱氧-6-氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖与2,4-二硝基苯肼水溶液反应形成2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈现黄色物质，用酶标仪测定在445nm处有特征峰，而底物N-羟乙基葡萄糖胺无特征峰，可以定性定量地测定米格列醇中间体6NSL。该筛选方法操作简便易行，所提供的筛选方法综合利用多孔板、酶标仪等高通量仪器，可以提升菌株的筛选量，加快诱变选育进程，有效提高获得氧化葡糖杆菌正突变株的几率，促进米格列醇中间体的生物转化合成，本发明为化学生物组合法生产米格列醇提供高活力氧化葡糖杆菌菌株催化合成米格列醇关键中间体 6NSL的生产水平奠定基础。
本发明诱变菌株ZJB16009山梨醇脱氢酶活力为原始菌株ZJB-605的 1.5倍，并具有良好的遗传稳定性。与原始菌株ZJB-605相比，突变菌株 ZJB16009单位体积酶活提高了近600％，在相同发酵条件下所得的静息细胞催化合成米格列醇中间体6NSL转化体系中(40g/L湿菌体，60g/L底物浓度，15℃下)，突变菌株ZJB16009转化进程缩短了12h，产物累积浓度达到58.2g/L，较出发菌株提高了24％，并适用于80g/L底物浓度的转化体系中。
(四)附图说明
图1、化学生物组合法合成米格列醇工艺路线。
图2、D-山梨醇(f)、L-山梨糖(c)、葡萄糖(d)、N-羟乙基葡萄糖胺(e)、 DNPH(b)和6NSL(a)全波长(300～700nm)扫描。
图3、6NSL浓度10～110g/L的全波长(300～800nm)扫描。
图4、多孔板6NSL-DNPH显色结果，1-6分别代表6NSL的浓度。
图5、不同6NSL浓度下DNPH快速筛选方法445nm吸收峰值。
图6、DNPH快速筛选方法标准曲线。
图7、DNPH显色法与HPLC法检测6NSL浓度结果比较。
图8、突变菌株ZJB16009与出发菌株ZJB-605催化N-羟乙基葡萄糖胺合成6NSL转化进程比较。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1米格列醇关键中间体6NSL显色法的快速测定
(1)试剂的配制：
DNPH显色溶液(20mM)的配制：称AR级DNPH(二硝基苯腙) 39.6mg，加入10M HCl水溶液10mL，使DNPH完全溶解，用去离子水定容至100mL，将溶液转移到棕色试剂瓶内，避光保存。
NaOH水溶液(8M)的配制：称NaOH固体32g，溶于100mL去离子水中。
底物反应液的制备：N-羟乙基葡萄糖胺60g/L和七水硫酸镁5g/L，浓盐酸调pH至5.0，溶剂为去离子水。
(2)测定步骤：分别吸取150μL底物反应液于96孔板中，加入25μL、 20mM的DNPH显色溶液进行充分混匀，于37℃恒温保温15min，加入 25μL、8M NaOH水溶液终止反应，将96孔板移放入酶标仪中，进行全波长(300～700nm)扫描(图2中曲线e)。同样条件下，将底物溶液中 N-羟乙基葡萄糖胺分别替换为空白(图2中曲线b)、20g/L葡萄糖(图2 中曲线d)、20g/LD-山梨醇(图2中曲线f)、20g/L米格列醇中间体6NSL (图2中曲线a)和20g/L L-山梨糖(图2中曲线c)，检测出底物N-羟乙基葡萄糖胺无特征峰，中间体6NSL在波长445nm处有特征吸收峰。
(3)显色体系的优化：
a、将步骤(2)曲线a测试中6NSL浓度分别改为10g/L、20g/L、 30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L，其它操作同步骤(2)进行显色反应，全波长(300～800nm)扫描，结果见图3。图3表明，随着6NSL浓度的增大，445nm处的吸光值逐渐增大，但当6NSL浓度高于50g/L时，445nm处吸光值处于稳定状态，即6NSL 的饱和显色浓度为50g/L。
b、将步骤(2)曲线a测试中6NSL浓度改为50g/L，20mM DNPH 显色溶液用量分别改为10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70 μL、80μL，加入总体积为200μL不变的情况下对应8M NaOH水溶液的加入量分别为10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL，其它操作同步骤(2)进行显色反应，结果提示优选的DNPH添加量为30 μL，NaOH的最适添加量为30μL。
(4)6NSL标准曲线的绘制：将中间体6NSL用去离子水分别配制成浓度5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L和50g/L的6NSL标准液，分别吸取150μL不同浓度的6NSL标准液滴加至96孔板中，加入30μL、 20mM的DNPH显色溶液混合，于37℃恒温保温15min，加入30μL、 8M的NaOH水溶液停止反应，拍照记录，溶液中亮黄色程度随着6NSL 的添加浓度的提高而显著增加(5-50g/L)。此外，以加入150μL、30g/L N- 羟乙基葡萄糖胺水溶液替代6NSL水溶液的显色孔在445nm的吸光值作为对照(图4中1号孔)。
将96孔板移放入酶标仪中，在波长445nm条件下测定吸光值，6NSL 的浓度作为横坐标，各浓度标准品(0～50g/L)的吸光值为纵坐标(图5)，进一步通过线性回归方程拟合获得6NSL标准曲线(图6)： Y＝0.0566X+0.0385，R2＝0.9969，(Y为445nm处吸光值，X为米格列醇关键中间体6NSL的浓度)。
(5)氧化葡糖杆菌静息细胞的制备及N-羟乙基葡萄糖胺脱氢酶活力检测方法
氧化葡糖杆菌静息细胞的制备：将氧化葡糖杆菌接种斜面培养基，28℃培养3～5天，待斜面培养基中CaCO3变透明光亮，肉眼目测无染菌。挑取斜面培养的菌种，将斜面的菌株接种到装有40mL种子培养液的250mL三角瓶中，28℃，235rpm培养48h，获得种子液，pH4.0～7.0， OD600≥8达到转接标准，镜检菌形呈短杆状，着色深，无杂菌。按体积接种量2％转接于发酵培养基，进行二级发酵产酶，28℃，235rpm发酵培养24h后，获得含湿菌体的发酵液20mL，离心10000rpm，10min，弃上清，清水洗涤一遍，离心弃上清，沉淀为后续用于转化的静息细胞。斜面培养基质量终浓度组成：酵母浸出粉1.0％，碳酸钙2.0％，葡萄糖 4.0％，琼脂2.4％，溶剂为水，pH值自然。种子培养基组成：D-山梨醇 50g/L，酵母浸出粉25g/L，KH2PO45g/L，K2HPO4 5g/L，溶剂为水， pH值自然。发酵培养基配方：D-山梨醇50g/L，酵母浸出粉25g/L，KH2PO4 5g/L，K2HPO4 5g/L，溶剂为水，pH值自然。
N-羟乙基葡萄糖胺脱氢酶活力单位(U)定义为15℃条件下，每分钟催化底物N-羟乙基葡萄糖胺生成1.0μmoL米格列醇中间体6NSL的酶量。
单位生物量的静息细胞N-羟乙基葡萄糖胺脱氢酶活力定义为每毫克菌体量所含有的酶活力单位数(U/mg)。
酶活力(U/mL)＝X×10×103/(M×T)
X：6NSL(g/L)
10：反应体积(mL)
103：单位换算
M：6NSL的摩尔质量(g/mol)
T：反应时间(h)
实施例2氧化葡糖杆菌的诱变选育及高通量筛选
(1)菌种活化：从甘油管中接氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans ZJB-605CCTCC No.M 208069，专利公开号CN101591681)至斜面培养基，28℃恒温培养箱培养3～5天；斜面培养基质量终浓度组成同实施例1。
(2)菌悬液和单孢子的制备：加入10mL 0.85％生理盐水到步骤(1) 中斜面培养基中，刮下菌体，将菌液倒入到带有玻璃珠的三角瓶中，振荡 10min，使菌体散开，用灭菌的滤纸过滤到灭菌的空三角瓶中，将过滤的菌液用无菌水进行稀释，稀释倍数为10-3，即为菌悬液；
(3)紫外线诱变：将步骤(2)中的菌悬液吸取500μL到平皿中，自然风干20min，事先打开诱变箱(CBIO-UV1A，功率：4W；波长254 nm)37℃预热20min，将步骤(2)中平皿放置于距紫外灯20cm处，依次照射60s，放置于诱变箱中静置2h，即保持在黑暗环境内，使菌种充分进行诱变过程，其他条件自然；
(4)平皿单菌落培养：向步骤(3)中诱变的平皿中加入1mL无菌水，使风干过的菌液洗下，吸取100μL涂平板，28℃恒温培养箱内培养 3～5天。所述平板质量组成为：葡萄糖40g/L，酵母10g/L，碳酸钙20g/L，琼脂2.4％，溶剂为水，pH值自然；
(5)96孔深孔板培养氧化葡糖杆菌诱变菌：从步骤(4)中的平皿上挑取单菌落到96孔板Ⅰ，加入1.5mL发酵培养基，放入28℃摇床间 150rpm培养48h后，吸取500μL菌液到96孔板Ⅱ，放入4℃冰箱内进行保存；发酵培养基配方同实施例1。
(6)深96孔板催化反应：将步骤(5)中培养48h后的96孔板Ⅰ离心1000rpm，30min，弃去上清，再用超纯水洗涤一遍，离心去上清，每个孔分别加入底物反应液200μL，在15℃转化反应24h后停止应，随后进行显色实验；底物反应液终浓度组成：N-羟乙基葡萄糖胺60g/L和七水硫酸镁5g/L，浓盐酸调pH至5.0，溶剂为去离子水。
(7)6NSL含量显色法快速检测：将步骤(6)中终止反应后的96 孔板Ⅰ1000rpm离心30min，分别吸取上清液150μL至浅96孔板内，加入20mM的DNPH显色溶液25μL，37℃保温15min后加入8M的 NaOH水溶液25μL，酶标仪测定445nm处的特征吸收峰，根据6NSL标准曲线获得转化反应液中6NSL含量，并计算N-羟乙基葡萄糖胺脱氢酶活力(同实施例1)，从而筛选获得酶活力高于出发菌株的正诱变菌株；
(8)正突变菌株复筛：根据步骤(7)筛选的正诱变菌株，从步骤(5) 保种的96孔板Ⅱ中吸取所选的正突变菌株的菌液500μL转入到发酵培养基中，放入28℃摇床间150rpm进行培养24h，培养完成后进行保种；
(9)小反应瓶催化反应：将步骤(8)中培养完成的发酵培养液40mL 离心10000rpm，10min，弃上清，菌体用去离子水洗涤一遍，10000rpm， 10min离心弃上清，分别向反应瓶中加入底物反应液10mL，在15℃进行转化反应24h后终止反应，随后进行6NSL显色法的快速检测及液相检测；底物反应液终浓度组成为：60g/L N-羟乙基葡萄糖胺，5g/L MgSO4·7H2O，浓盐酸调pH至5.0，溶剂为去离子水；
(10)6NSL显色法的快速检测步骤：吸取步骤(9)中的转化液150 μL到浅96孔板内，加入20mM的DNPH显色溶液25μL，37℃保温15min 后加入8M的NaOH水溶液25μL，酶标仪准确读取445nm特征吸收峰；计算诱变菌株氧化葡糖杆菌的N-羟乙基葡萄糖胺脱氢酶活力，挑取酶活力高的正突变菌株作为F1代，以区别出发菌株F0代；
(11)将F1代N-羟乙基葡萄糖胺脱氢酶活力最高的正诱变菌株重复步骤(1)～(10)，重复3个循环，得到后代诱变株分别标记为F2、F3、 F4，总共经过四次紫外诱变和酶活力的重复筛选，获得诱变菌株 ZJB16009，测定酶活力，产酶能力比出发菌株ZJB-605提高59.38％，其测定结果如表1所示：
表1.氧化葡糖杆菌正突变菌株N-羟乙基葡萄糖胺脱氢酶活力比较
氧化葡糖杆菌诱变菌株(Gluconobacter oxydans)ZJB16009，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC No.M2017013，保藏时间为2017年1月6日，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
本筛选方法首次针对米格列醇中间体6NSL含量进行快速筛选检测，较常规的高效液相色谱，气相色谱等操作方法简便，仪器设备要求低，且实现在微孔板中微生物全细胞催化反应过程，筛选通量高，周期短；传统的基于薄层色谱分析(TLC)法虽然较为简便，但准确度较低，本删选系统与HPLC检测方法有很高的相关性(98％以上)，如图7所示，显示了该筛选方法的独创性及优势。
实施例3氧化葡糖杆菌诱变菌株ZJB16009与野生菌株ZJB-605催化合成米格列醇中间体6NSL能力比较
(1)氧化葡糖杆菌静息细胞的制备：将出发菌株氧化葡糖杆菌 ZJB-605及诱变菌株ZJB16009接种斜面培养基(同实施例1)，28℃培养 3～5天，待斜面培养基中CaCO3变透明光亮，肉眼目测无染菌。挑取斜面培养的菌种，将斜面的菌株接种到装有40mL种子培养液(组成同实施例1)的250mL三角瓶中，28℃，235rpm培养48h，获得种子液， pH 4.0～7.0，OD600≥8达到转接标准，镜检菌形呈短杆状，着色深，无杂菌。按体积接种量2％转接于发酵培养基(组成同实施例1)，进行二级发酵产酶，28℃，235rpm发酵培养24h后，获得含湿菌体的发酵液20mL，离心10000rpm，10min，弃上清，清水洗涤一遍，离心弃上清，沉淀为后续用于转化的静息细胞。
(2)催化底物N-羟乙基葡萄糖胺合成米格列醇中间体6NSL转化体系的建立及催化进程比较：
反应体系(10mL)：底物N-羟乙基葡萄糖胺60g/L和七水硫酸镁5 g/L，静息细胞湿菌体浓度为40g/L，以去离子水为反应介质，饱和HCl 调节pH至5.0，建立10mL反应体系，在15℃进行转化反应，24h后终止反应，检测产物6NSL的累积浓度。
液相检测条件为：流动相为甲醇-水(2：98)，4mM庚烷磺酸钠+10 mM K2HPO4，用磷酸调pH值为3.5；流速为0.5mL/min，进样量20μL；柱温30℃，时间20min；计算产物6NSL得率。如图8所示，在60g/L 底物浓度下，诱变菌株ZJB16009催化合成6NSL的反应进程显著快于出发菌株ZJB-605，且在反应36h后累积产物浓度为58.2g/L，而出发菌株在催化48h后，产物累积浓度仅为46.8g/L，相同转化条件下，诱变菌株 ZJB16009催化合成米格列醇关键中间体6NSL的产物得率较出发菌株 ZJB-605提高了24％，且转化周期缩短了12h。转化所得的中间体进一步通过化学钯碳加氢最终合成米格列醇。加氢过程的反应体系如下：转化液装液量为600mL/L反应釜，1.0Mpa高纯氢气，钯/碳催化剂(5％)。然后固定夹套，防止漏气。打开冷凝水装置，控制温度25℃、转速为800rpm，加氢时间12h后取样，HPLC检测米格列醇的产量。检测结果提示，60g/L 底物浓度下，出发菌株静息细胞转化合成米格列醇的终产物浓度为22.5 g/L，突变菌株催化合成米格列醇的终产物浓度为29.5g/L，产物得率较出发菌株提升了31.1％。
实施例4不同底物浓度下突变菌株ZJB16009静息细胞催化合成 6NSL
转化体系：有挡板摇瓶50mL/500mL，配制N-羟乙基葡萄糖胺(先用浓HCl调至偏酸条件，再用2M NaOH调至5.0)，N-羟乙基葡萄糖胺浓度分别为40、60、80和100g/L；MgSO4·7H2O终浓度5g/L，添加实施例3方法中突变菌株ZJB16009发酵培养获得的静息细胞湿菌体，湿菌体的添加量为60g/L，以去离子水为反应介质构成50mL反应体系。
实验条件：温度：15℃；转速：220rpm；每12h用2M NaOH调碱，使转化液的pH值维持在4.5～5.0。
取样：每12h取样，离心取上清，液相检测样品产量，菌体镜检。
结果分析：考察了不同底物浓度条件下的底物转化率及产物得率，结果如表2所示，在不同底物浓度下，底物转化率达到97％以上；就产物得率分析，底物40g/L、60g/L、80g/L时得率可以达到90％以上，最高的为40g/L时为98.45％，底物浓度为100g/L时产物得率显著降低，为 71.28％。综合成本考虑，最适底物浓度选择80g/L，得率为91.02％。
表2不同底物浓度下摇瓶体系中静息细胞催化合成6NSL
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。此外，本申请提及的所有文献都以引用并参考的方式作为本发明说明书的内容。
Claims (10)
1.一种快速筛选合成米格列醇关键中间体突变菌株的方法，其特征在于所述方法为：将野生氧化葡糖杆菌经诱变处理后的诱变菌株进行发酵培养，取发酵培养后的诱变菌株湿菌体细胞加入底物反应液中，在15℃转化反应完全后，将反应液离心，取上清加入DNPH显色溶液，37℃保温15min后加入NaOH水溶液终止反应并测定445nm处吸收峰值，根据6NSL标准曲线，获得上清中6NSL含量，根据6NSL含量筛选获得合成米格列醇关键中间体的高活力突变菌株；所述底物反应液终浓度组成为：N-羟乙基葡萄糖胺60g/L、七水硫酸镁5g/L，pH5.0，溶剂为去离子水；所述DNPH显色溶液是将DNPH用HCl水溶液溶解后加去离子水配制而成；所述6NSL标准曲线是将6NSL用去离子水配制成不同浓度梯度，与上清相同条件下测定445nm处吸收峰值，以不同梯度浓度为横坐标，以吸收峰值为纵坐标制备而成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述DNPH显色溶液中，HCl水溶液体积用量以DNPH质量计为50-300mL/g，DNPH终浓度为20mmol/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述DNPH显色溶液与上清体积比为1:4-6，所述DNPH显色溶液与NaOH水溶液体积比为1:1，所述NaOH水溶液浓度为8mol/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述6NSL标准曲线按如下方法制备：将6NSL用去离子水分别配制成浓度5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L和50g/L的6NSL标准液，分别吸取150μL不同浓度的6NSL标准液滴加至96孔板中，加入25μL、20mM的DNPH显色溶液混合，于37℃恒温保温15min，加入25μL、8M的NaOH水溶液停止反应，测试在445nm的吸收峰值，以6NSL浓度为横坐标，以吸收峰值为纵坐标制作而成。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述野生氧化葡糖杆菌诱变处理方法为：
(1)菌种活化：从甘油管中接野生氧化葡糖杆菌至斜面培养基，28℃恒温培养箱培养3～5天；斜面培养基质量终浓度组成：酵母浸出粉1.0％，碳酸钙2.0％，葡萄糖4.0％，琼脂2.4％，溶剂为水，pH值自然；
(2)菌悬液和单孢子的制备：加入10mL 0.85％生理盐水到步骤(1)中斜面培养基中，刮下菌体，将菌液倒入到带有玻璃珠的三角瓶中，振荡10min，使菌体散开，用灭菌的滤纸过滤到灭菌的空三角瓶中，将过滤的菌液进行无菌水稀释，稀释倍数为10-3，即为菌悬液；
(3)紫外线诱变：将步骤(2)中的菌悬液吸取500μL到平皿中，自然风干20min，诱变箱37℃预热20min，将步骤(2)中平皿放置于距紫外灯20cm处，依次照射45～90s，放置于诱变箱中黑暗静置2h；
(4)平皿单菌落培养：向步骤(3)中诱变的平皿中加入1mL无菌水，使风干过的菌液洗下，吸取100μL涂平板，28℃恒温培养箱内培养3～5天，获得诱变后的突变菌株；所述平板质量组成为：葡萄糖40g/L，酵母10g/L，碳酸钙20g/L，琼脂2.4％，溶剂为去离子水，pH值自然。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述诱变菌株发酵培养方法为：将诱变菌株接种至发酵培养基，在28℃、150rpm培养48h后，取发酵液离心，弃上清，收集沉淀即为诱变菌株湿菌体细胞；发酵培养基组成为：D-山梨醇50g/L，酵母浸出粉20～25g/L，KH2PO4 5g/L，K2HPO4 5g/L，溶剂为水，pH值自然。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述野生氧化葡糖杆菌为氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CCTCC No.M 208069。
8.一种权利要求1所述的方法筛选获得的高活力诱变菌株，其特征在于所述高活力诱变菌株为氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)ZJB16009，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC No.M2017013，保藏日期为2017年1月6日，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
9.一种权利要求8所述氧化葡糖杆菌诱变菌株ZJB16009在催化合成米格列醇中间体6NSL中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述应用为：以N-羟乙基葡萄糖胺为底物，以氧化葡糖杆菌CCTCC No.M 201703经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，加入七水硫酸镁，以去离子水为反应介质，构成pH 5.0反应体系，在15℃进行转化反应，反应完全后，获得含6NSL的反应液，将反应液分离纯化，获得6NSL；所述反应体系中，底物终浓度为40～100g/L，七水硫酸镁终浓度1～10g/L，催化剂用量以湿菌体重量计为40～60g/L。
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