CN103436467B - 一种屎鞘氨醇杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株新的菌种——屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6(Sphingobacterium faecium ZJF-D6)，及其在微生物生物催化制备D-阿洛糖关键药物中间体3-酮蔗糖中的应用。本发明的屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6(Sphingobacterium faecium ZJF-D6)是本发明的发明人从采自全国各地的土壤样品中经初筛、复筛及分离纯化而得到的一株能够高选择性转化蔗糖为3-酮蔗糖的新菌株。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2013年6月6日，保藏编号CCTCC M2013251。本发明的菌株可以以蔗糖为底物，生物催化制备3-酮蔗糖。该新菌株作为生物催化剂的稳定性好，能够耐受高浓度的底物和产物，且选择性严格；该生物催化过程反应条件温和，可大幅减少有机溶剂使用，环境友好。
Description
技术领域
本发明涉及一株新的菌种——屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6(Sphingobacteriumfaecium ZJF-D6)，及其在微生物生物催化制备D-阿洛糖关键药物中间体3-酮蔗糖中的应用。
背景技术
葡萄糖3-脱氢酶[Glucoside3-dehydrogenase、Glucose3-dehydrogenase、简称G3DH,EC.1.1.99.13]是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶的新型氧化还原酶，能氧化糖及其衍生物上葡萄糖环上的C-3羟基，并将它们转化为3-酮糖及其衍生物。3-酮蔗糖（3-ketosucrose）是蔗糖的G3DH酶催化反应产物（如化学方程式1所示），它含有一个用于选择性化学合成的特殊基团－羰基。从3-酮蔗糖出发，在水相中通过一些简单的化学反应可以合成一系列的产品，如阿洛蔗糖（allosucrose）、D-阿洛糖（D-allose）、氰醇（cyanhydrin）、肟（oxime）和3-氨基-3-脱氧-α-D-阿洛吡喃酮糖基-β-D-呋喃果糖苷（3-amino-3-deoxy-alpha-D-allopyranosyl beta-D-fructofuranoside）等。
化学方程式1G3DH酶催化蔗糖转化为3-酮蔗糖
D-阿洛糖是一种重要的稀有糖，是葡萄糖在C-3位置上的差向异构体，具有广泛的生理功能。已有多篇文献报道，D-阿洛糖可以显著抑制中性分叶核白细胞的生成、消除中性粒细胞受调理的多糖刺激后生成的活性氧，减轻急性肾损伤，成为器官组织移植中和缺血再灌注损伤科学中的研究热点。研究证实，D-阿洛糖通过诱导抑癌基因人硫氧还蛋白结合蛋白（TXNIP）的表达显著抑制多种肿瘤细胞的增生繁殖，包括HeLa、HepG2、HuH-7、PC3、MOLT-4F等，而对正常的细胞没有任何副作用。因此，D-阿洛糖将有可能开发成为新的临床抗癌药物。D-阿洛糖在自然界含量极少，只有通过化学合成、生物转化等方法生产。目前，D-阿洛糖的价格昂贵，其生产工艺复杂，产量低，限制了D-阿洛糖的大规模生产和应用。化学合成D-阿洛糖不仅步骤繁琐，而且需要用到很多有毒试剂，对环境构成很大的压力，很难实现工业化的大生产。由3-酮蔗糖生产D-阿洛糖的途径是：3-酮蔗糖通过水合作用，得到阿洛蔗糖，然后阿洛蔗糖通过水解反应除去一分子的果糖后，得到D-阿洛糖。此法工艺简单，产物的产率和选择率高，结合了生物转化和化学合成的优点，具有广阔的应用前景。
目前报道的能生产G3DH的微生物一般存在效率低、副产物多等缺陷。如来源于A.tumefaciens的G3DH是诱导酶，在培养时需要添加昂贵的诱导剂（α-甲基葡萄糖），才能促使G3DH的生产；又如来源于F.saccharophilum的G3DH在细胞内有80％属于膜结合蛋白，在提取时需要使用大量的去垢剂，限制了它的工业化应用。此外，目前已发现的G3DH对蔗糖的转化率并不高，而且细胞内同时存在着除了G3DH之外的其它一系列降解3-酮蔗糖的酶系（如蔗糖酶等），造成3-酮蔗糖的产率较低。因此，筛选无需诱导、产生可溶G3DH的高产菌株，对于3-酮蔗糖的生物转化法生产，G3DH的工业化应用，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株新菌株——屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6(Sphingobacterium faecium ZJF-D6)，及该菌株在生物催化制备3-酮蔗糖中的应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案如下：
本发明的屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6(Sphingobacterium faecium ZJF-D6)是本发明的发明人从采自全国各地的土壤样品中经初筛、复筛及分离纯化而得到的一株能够高选择性转化蔗糖为3-酮蔗糖的新菌株。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2013年6月6日，保藏编号CCTCCM2013251。
本发明的屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6菌株特征如下：
菌落形态：菌落呈黄色、不透明、有光泽、圆形、低凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润。
细胞形态：革兰氏阴性杆菌，无芽孢，无荚膜，无鞭毛,不运动，直径0.5～0.6μm，长1.0～2.1μm。
生理生化特征：革兰氏阴性，氧化酶和接触酶阳性，好氧，无内生芽孢，具体生理生化特征见表1。
表1.屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6的生理生化特征
本发明的屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6的16S rDNA测序结果见序列表。
本发明的屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6的培养基组成为(终浓度)：乳糖5～20g/L，酵母粉5～15g/L，蛋白胨5～10g/L，氯化钠1～5g/L，磷酸氢二钾0.5～2.0g/L，磷酸二氢钾0～2.0g/L。
本发明的屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6的培养条件为：起始pH6.0～7.5，装液量10～30%，培养温度15～35℃，摇床转速100～300rpm，培养时间为48～72h。
本发明还涉及所述的屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6在生物催化制备3-酮蔗糖中的应用。
具体的，所述的应用为：以蔗糖为底物，加入屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6湿菌体细胞，15～40℃下，于纯水相体系中反应4～48h，反应过程中利用酸或碱溶液调节生物催化反应体系pH恒定在5.0～7.5，反应液经离子交换层析分离得到3-酮蔗糖。底物及产物采用高效液相色谱分析，分析条件如下：氨基色谱柱；流动相为75%乙腈水溶液，流量1.0ml/min；进样量10μl；示差检测器检测池温度40℃，柱温25℃。
优选的，所述生物催化反应体系的pH控制在5.5～6.5，调节pH用的酸包括但不限于：①盐酸、②硫酸、③醋酸、④磷酸、⑤硝酸；调节pH用的无机碱包括但不限于：①氢氧化钠、②氢氧化钙、③氢氧化钾、④氢氧化镁、⑤碳酸钙。
优选的，所述生物催化反应体系中，屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6湿菌体细胞的初始浓度为45～180g/L，底物蔗糖的初始浓度为10～100g/L。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种具有高选择性、可制备3-酮蔗糖的新菌种；该新生物催化剂的稳定性好，能够耐受高浓度的底物和产物，且选择性严格；该生物催化过程反应条件温和，可大幅减少有机溶剂使用，环境友好。因此，提供了一种高效、廉价的工业化生产D-阿洛糖关键中间体3-酮蔗糖的新方法。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但不能限制本发明的内容。
反应液中3-酮蔗糖浓度采用高效液相色谱分析，具体分析条件如下：氨基色谱柱；流动相为75%乙腈水溶液，流量1.0ml/min，进样量10μl，示差检测器检测池温度40℃，柱温25℃。
实施例1：屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6的发酵培养
发酵培养基：乳糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，pH6.0。
250ml摇瓶装液量10%，121℃高温灭菌20min，灭菌后冷却接种，接种量5%(v/v)，10℃，100rpm下振荡培养72h，培养结束后，发酵液离心并用生理盐水洗涤2次，收集湿菌体细胞悬浮于纯水中，得湿菌体细胞含量为0.9g/ml的菌悬液，备用。
实施例2：屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6的发酵培养
发酵培养基：乳糖20g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，pH7.5。
250ml摇瓶装液量30%，121℃高温灭菌20min，灭菌后冷却接种，接种量5%(v/v)，35℃，300rpm下振荡培养48h，培养结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤2次，收集湿菌体细胞，悬浮于纯水中，得湿菌体细胞含量为0.9g/ml的菌悬液备用。
实施例3：
在95ml纯水中加入5ml实施例1所得菌悬液；加入1g蔗糖作为底物。于40℃恒温水浴搅拌反应4h，期间用1mol/L盐酸或氢氧化钠调节反应体系pH维持在6.5，反应结束后取反应液1ml，离心取上清液，经高效液相色谱分析。产物3-酮蔗糖的转化率31%。
实施例4：
在85ml纯水中加入15ml实施例1所得菌悬液；加入10g蔗糖作为底物。于20℃恒温水浴搅拌反应20h，期间用1mol/L盐酸或氢氧化钠调节反应体系pH维持在5.5。反应结束后取转化液1ml，离心取上清液，经高效液相色谱分析。产物3-酮蔗糖的转化率39%。
实施例5：
在90ml纯水中加入10ml实施例1所得菌悬液；加入5g蔗糖作为底物。于15℃恒温水浴搅拌反应48h，期间用1mol/L盐酸或氢氧化钠调节反应体系pH维持在5.0。反应结束后取转化液1ml，离心取上清液，经高效液相色谱分析。产物3-酮蔗糖的转化率35%。
实施例6：
在80ml纯水中加入20ml实施例1所得菌悬液；加入2.5g蔗糖作为底物。于25℃恒温水浴搅拌反应8h，期间用1mol/L盐酸或氢氧化钠调节反应体系pH维持在7.5。反应结束后取转化液1ml，离心取上清液，经高效液相色谱分析。产物3-酮蔗糖的转化率33%。
Claims (6)
1.一种屎鞘氨醇杆菌，其特征在于：该屎鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium faecium）的保藏名称为屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2013年6月6号，保藏编号：CCTCC No. M2013251。
2.权利要求1所述的屎鞘氨醇杆菌的应用，其特征在于：以蔗糖为底物，生物催化制备3-酮蔗糖。
3.根据权利要求2所述的屎鞘氨醇杆菌的应用，其特征在于：具体方法如下：以蔗糖为底物，加入屎鞘氨醇杆菌ZJF-D6湿菌体细胞，15～40℃条件下，于纯水相体系中反应4～48h，反应过程中利用酸或碱调节反应体系的pH值恒定在5.0～7.5，反应液经离子交换层析分离得到3-酮蔗糖。
4.根据权利要求3所述的屎鞘氨醇杆菌的应用，其特征在于：反应体系的pH值控制在5.5～6.5，所述酸为盐酸、硫酸、醋酸、磷酸或硝酸，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化镁或碳酸钙。
5.根据权利要求3所述的屎鞘氨醇杆菌的应用，其特征在于：反应体系中屎鞘氨醇杆菌湿菌体细胞的初始浓度为45～180g/L，底物蔗糖的初始浓度为10～100g/L。
6.根据权利要求3或4或5所述的屎鞘氨醇杆菌的应用，其特征在于：底物及产物浓度采用高效液相色谱分析，具体分析条件如下：氨基色谱柱；流动相为75%乙腈水溶液，流量1.0ml/min，进样量10μl，示差检测器检测池温度40℃，柱温25℃。
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