CN105112468A - 一种多酶耦联体系制备手性胺的方法 - Google Patents
一种多酶耦联体系制备手性胺的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105112468A CN105112468A CN201510661106.0A CN201510661106A CN105112468A CN 105112468 A CN105112468 A CN 105112468A CN 201510661106 A CN201510661106 A CN 201510661106A CN 105112468 A CN105112468 A CN 105112468A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dehydrogenase
- amine
- hydrogenlyase
- add
- glycerol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 title claims abstract description 194
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 156
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 94
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 94
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims abstract description 42
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims abstract description 34
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 claims abstract description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 104
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 78
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 claims description 62
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 44
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 41
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 31
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 30
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 28
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 28
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 27
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 17
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N Acetophenone Chemical compound CC(=O)C1=CC=CC=C1 KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 12
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 11
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 11
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 claims description 10
- QQZOPKMRPOGIEB-UHFFFAOYSA-N 2-Oxohexane Chemical compound CCCCC(C)=O QQZOPKMRPOGIEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 7
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 claims description 7
- 241000193408 Bacillus badius Species 0.000 claims description 6
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 claims description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 6
- 229940045505 klebsiella pneumoniae Drugs 0.000 claims description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 5
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 abstract description 4
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 abstract description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract 1
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical class CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 4
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IZCBXLKODYZSDJ-SSDOTTSWSA-N (2r)-5-methylhexan-2-amine Chemical compound CC(C)CC[C@@H](C)N IZCBXLKODYZSDJ-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- BHRZNVHARXXAHW-SCSAIBSYSA-N (2r)-butan-2-amine Chemical group CC[C@@H](C)N BHRZNVHARXXAHW-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710157860 Oxydoreductase Proteins 0.000 description 2
- 238000011914 asymmetric synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)C(O)=O BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 108010078226 phenylalanine oxidase Proteins 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000005477 standard model Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种多酶耦联体系制备手性胺的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明构建了胺脱氢酶与甘油脱氢酶、胺脱氢酶与甲酸脱氢酶以及胺脱氢酶与甘油脱氢酶、甲酸脱氢酶的多酶耦联体系，实现手性胺的不对称制备和辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的再生。本发明所提供的多酶耦联体系及其制备手性胺的方法，具有产品转化率高，反应条件温和，操作简单，辅酶可再生等优势，成本低、酶利用率高，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物催化不对称转化技术领域，涉及一种多酶耦联体系制备手性胺的方法。
背景技术
手性胺是许多生物活性分子的结构单元，是合成天然产物和手性药物的重要中间体。约40％的光学活性药物含有手性胺单元。同时，手性胺可以为用作为拆分剂、手性助剂和手性合成物，在精细化工、制药和农用化学品中得到广泛的应用。当前，在化工和制药产业中生物催化法制备手性化合物应用广泛，具有广阔前景。胺脱氢酶催化酮和氨基供体不对称还原胺化制备手性胺是简洁高效的反应路径。
胺脱氢酶在催化反应过程中需要辅酶作为电子传递体。然而，由于辅酶价格昂贵，对于面向工业应用的生物催化，为提高反应催化效率和经济性，需要构建辅酶循环体系。体外多酶耦联实现辅酶再生体系不乏工业化生产的实例。利用L-亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶的耦联体系催化制备酮异己酸，该体系可连续催化48天，最高转化率达99.7％，生产能力为42.5g/L/day，在德国DegussaAG实现吨级规模的工业化生产。Ronald等人采用Thermoactnomycesintermedius所产生的高活性苯丙氨酸脱氢酶与Candidaboidinii中的甲酸脱氢酶组成耦联反应体系，L-苯丙氨酸产率达到84％。Karsten构建了一种新型的以NADP+作为辅酶的甲酸脱氢酶，与乳酸杆菌中的乙醇脱氢酶构建了NADPH再生耦联系统。然而，利用胺脱氢酶与其他依赖NADH的氧化还原酶构建多酶耦联体系催化制备手性胺并实现辅酶再生还未见报道。
发明内容
本发明构建了多种多酶耦联体系，催化制备手性胺并实现辅酶的循环再生。同时考察了耦联体系的组成、反应条件对催化效率的影响。该发现所获得的耦联体系具有简单高效等优点，并实现了辅酶的循环再生，促进不对称转化反应的持续进行，降低成本，提高胺脱氢酶制备手性胺的效率。
所述的多酶耦联体系制备手性胺的方法，包括以下步骤：
1)催化不对称合成手性胺的胺脱氢酶的制备：构建如SEQIDNO.1所示的胺脱氢酶基因；利用上述基因制备可表达胺脱氢酶的工程菌；将上述工程菌接种，加入诱导剂，培养所得发酵液离心获得细胞；细胞超声破碎，离心，得到含有胺脱氢酶的粗酶液；将上述含有胺脱氢酶的粗酶液进行纯化除盐，得到胺脱氢酶；
2)辅酶再生酶的制备：分别构建如SEQIDNO.2所示的甘油脱氢酶基因和如SEQIDNO.3所示的甲酸脱氢酶基因；利用上述基因分别制备可表达甘油脱氢酶的工程菌和可表达甲酸脱氢酶的工程菌；将上述工程菌分别接种，加入诱导剂，培养所得发酵液离心获得细胞；细胞超声破碎，离心，得到含有甘油脱氢酶的粗酶液和含有甲酸脱氢酶的粗酶液；将上述两种粗酶液分别进行纯化除盐，得到两种辅酶再生酶即甘油脱氢酶和甲酸脱氢酶；
3)利用胺脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系：
(3a)胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系：将甘油与氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为0.5～5M，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶与甘油脱氢酶，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系；或，
(3b)胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：将甲酸钠和NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甲酸钠的加入量为20～500mM，NAD+的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶与甲酸脱氢酶，得到胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系；或，
(3c)胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：将甘油、甲酸钠和NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为0.5～5M，甲酸钠的加入量为20～500mM，NAD+的添加量为0.2～20mM，加入胺脱氢酶、甘油脱氢酶与甲酸脱氢酶，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系；
4)利用步骤3)所配置的多酶耦联体系催化制备手性胺：将底物酮溶于少量异丙醇，加到步骤(3a)～(3c)中得到的任一种多酶耦联体系中，用氨水调节体系的pH值为8～11，底物酮的加入量为20～500mM；利用所述多酶耦联体系对底物酮进行催化反应，即得手性胺。
一实施例中：所述步骤1)中，胺脱氢酶基因序列来源于Bacillusbadius，所述可表达胺脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-adh。
一实施例中：所述步骤2)中，甘油脱氢酶基因序列来源于Klebsiellapneumoniae，所述可表达甘油脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-gldA；
一实施例中：所述步骤2)中，甲酸脱氢酶基因序列来源于Candidaboidinii，所述可表达甲酸脱氢酶的工程菌为E.coliBL21(DE3)-fdh。
一实施例中：所述步骤3)中，加入胺脱氢酶并使其终浓度为20～200U/L，加入甘油脱氢酶并使其终浓度为50～150U/L，加入甲酸脱氢酶并使其终浓度为50～150U/L；加入的胺脱氢酶和/或甘油脱氢酶和/或甲酸脱氢酶均为溶解在浓度20～100mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中的酶液。
一实施例中：所述步骤3)中，氯化铵-氨水缓冲液为反应体系中的氨基供体，其浓度为200～500mM，用氨水调节pH值为8～11。
一实施例中：所述步骤4)中，底物为苯氧基-2丙酮、4-甲基-2-戊酮、苯乙酮、5-甲基-2-己酮、丁酮中的一种。
一实施例中：所述步骤4)中，催化反应条件如下：在4～60℃，100～300rpm下反应6～48小时。
本发明还提供了一种多酶耦联体系的制备方法，参照上述步骤1)～3)。
本发明的有益效果如下：
构建多种多酶耦联体系不对称还原底物酮获得产物手性胺，并通过在胺脱氢酶催化不对称合成手性胺的体系中添加使辅酶NAD+再生成NADH的氧化还原酶及其辅助底物。通过构建多酶耦联体系，实现了辅酶的再生循环，较好地解决了胺脱氢酶生物催化反应过程中的辅酶再生问题，提高了辅酶的利用效率，促进不对称转化反应的持续进行，提高胺脱氢酶制备手性胺的效率，降低了生产成本。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为苯氧基-2-丙酮、R-苯氧基-2-丙胺、S-苯氧基-2-丙胺标准样品的高效液相色谱图，苯氧基-2-丙酮的保留时间为6.435min，R-苯氧基-2-丙胺和S-苯氧基-2-丙胺的保留时间分别为7.24min和8.681min。
图2为实验例一产物R-苯氧基-2-丙胺的高效液相色谱图。
图3为实施例四的4-甲基-2-戊酮和R/S-4-甲基-2-戊胺的气相色谱图，4-甲基-2-戊酮保留时间为6.157min，S-4-甲基-2-戊酮和R-4-甲基-2-戊酮的保留时间分别为11.533min和11.637min。
图4为实施例五的5-甲基-2-己酮和S/R-5-甲基-2-己胺的气相色谱图，5-甲基-2-己酮的保留时间为8.658min，S-5-甲基-2-己胺和R-5-甲基-2-己胺的保留时间分别为14.529min和14.665min。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
实施例1
1)胺脱氢酶的制备：
菌株构建、培养与收集：构建如SEQIDNO.1所示的胺脱氢酶基因，胺脱氢酶基因序列来源于Bacillusbadius，利用上述胺脱氢酶基因制备可表达胺脱氢酶的工程菌重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-adh；以1％的接种量，将上述工程菌接入200mLLB培养基中，接种前添加卡那霉素使其终浓度为40μg/mL。37℃、转速200rpm培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/ml，继续在30℃、200rpm条件下培养4小时。
粗酶液制备：培养结束所得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞。利用超声破碎仪对细胞液进行处理，然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为含有胺脱氢酶的粗酶液。
纯酶制备：采用GE公司(GeneralElectricCompany)的HisTrap镍柱对上述含有胺脱氢酶的粗酶液进行分离纯化，并用PALL公司(PallCorporation)的10K的超滤离心管进行超滤除盐，得到胺脱氢酶。
2)辅酶再生酶的制备：
甘油脱氢酶：
菌株构建、培养与收集：构建如SEQIDNO.2所示的甘油脱氢酶基因，甘油脱氢酶基因序列来源于Klebsiellapneumoniae，利用上述甘油脱氢酶基因制备可表达甘油脱氢酶的工程菌重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-gldA；以1％的接种量，将菌种接入200mLLB培养基中，接种前添加氨苄霉素使其终浓度为50μg/mL。37℃、200rpm培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/ml，继续在30℃、200rpm条件下培养4小时。
粗酶液制备及纯酶制备步骤同上述胺脱氢酶的粗酶液制备及纯酶制备步骤，即得甘油脱氢酶。
3)利用胺脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系，本实施例之中为胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系：
将甘油与氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)溶于浓度为400mM，pH值为9的氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为1M，NAD+的添加量为0.2mM，加入胺脱氢酶酶液与甘油脱氢酶酶液，并使胺脱氢酶与甘油脱氢酶的终浓度均为150U/L，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系；所述加入的胺脱氢酶酶液与甘油脱氢酶酶液分别为溶解在100mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中。
4)利用步骤3)中得到的胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系催化制备手性胺：将底物苯氧基-2-丙酮溶于少量异丙醇，加到步骤3)中得到的胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系中，用氨水调节体系的pH值为11，底物苯氧基-2-丙酮的加入量为300mM，利用所述胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系对底物苯氧基-2-丙酮在60℃、200rpm条件下催化反应24小时，即得手性胺；本实施例之中，底物为苯氧基-2-丙酮，产物为R-苯氧基-2-丙胺。
5)分离与检测：取步骤4)得到的反应液，加入等体积的正己烷，混合震荡均匀，离心吸取上清液备用，重复上述过程，合并萃取液。用高效液相色谱检测，色谱柱为DaicelOD-H，检测波长254nm，流动相为体积比为90/9.9/0.1的正己烷/乙醇/二乙胺，流速为1ml/min，柱温为35℃。检测结果如图2所示。计算R-苯氧基-2-丙胺产物收率为95.3％，e.e.值(光学纯度)为97.5％。
实施例2
1)胺脱氢酶的制备：同实施例1的步骤1)。
2)辅酶再生酶的制备：
甲酸脱氢酶：
菌株构建、培养与收集：构建如SEQIDNO.3所示的甲酸脱氢酶基因，甲酸脱氢酶基因序列来源于Candidaboidinii，利用上述甲酸脱氢酶基因制备可表达甲酸脱氢酶的工程菌重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-fdh；以1％的接种量，将菌种接入200mLLB培养基中，接种前添加卡那霉素使其终浓度为40μg/mL。37℃、转速200rpm培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/ml，继续在30℃、200rpm条件下培养4小时。
粗酶液制备及纯酶制备步骤同实施例1步骤1)中胺脱氢酶的粗酶液制备及纯酶制备步骤，即得甲酸脱氢酶。
3)利用胺脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系，本实施例中为胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：
将甲酸铵与NAD+溶于浓度为300mM，pH值为10的氯化铵-氨水缓冲液中，甲酸铵的加入量为300mM，NAD+的添加量为0.2mM，加入胺脱氢酶与甲酸脱氢酶酶液，并使胺脱氢酶与甲酸脱氢酶的终浓度均为100U/L，得到胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系；所述加入的胺脱氢酶酶液与甲酸脱氢酶酶液分别为溶解在20mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中。
4)利用步骤3)中得到的胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系催化制备手性胺：将底物苯氧基-2-丙酮溶于少量异丙醇，加到步骤3)中得到的胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系中，用氨水调节体系的pH值为10，底物苯氧基-2-丙酮的加入量为400mM，利用所述胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系对底物苯氧基-2-丙酮在60℃、200rpm条件下催化反应36小时，即得手性胺；本实施例之中，底物采用苯氧基-2-丙酮，产物为R-苯氧基-2-丙胺。
5)分离与检测：取步骤4)得到的反应液，加入等体积的正己烷，混合震荡均匀，离心吸取上清液备用。用高效液相色谱检测，检测方法同实施例1步骤5)，结果如图2所示，计算R-苯氧基-2-丙胺产物收率为90.8％，e.e.值为98.8％。
实施例3
1)胺脱氢酶的制备：同实施例1的步骤1)。
2)辅酶再生酶的制备：参照实施例1步骤2)，得到甘油脱氢酶；参照实施例2步骤2)，得到甲酸脱氢酶。
3)利用胺脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系，本实施例之中为胺脱氢酶-甲酸脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系：
将甘油、甲酸钠和NAD+溶于浓度为500mM，pH值为8的氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为2M，甲酸钠的加入量为300mM，NAD+的添加量为0.2mM，加入胺脱氢酶酶液、甲酸脱氢酶酶液、甘油脱氢酶酶液，并使胺脱氢酶的终浓度为100U/L，甲酸脱氢酶与甘油脱氢酶的终浓度均为50U/L，得到胺脱氢酶-甲酸脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系；所述加入的胺脱氢酶酶液、甲酸脱氢酶酶液、甘油脱氢酶酶液分别为溶解在20～100mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中。
4)利用步骤3)中得到的胺脱氢酶-甲酸脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系催化制备手性胺：将底物苯氧基-2-丙酮溶于少量异丙醇，加到步骤3)中得到的胺脱氢酶-甲酸脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系中，用氨水调节体系的pH值为9，底物苯氧基-2-丙酮的加入量为400mM，利用所述胺脱氢酶-甲酸脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系对底物苯氧基-2-丙酮在4℃、200rpm条件下催化反应48小时，即得手性胺；本实施例之中，底物采用苯氧基-2-丙酮，产物为R-苯氧基-2-丙胺。
5)分离与检测：取步骤4)得到的反应液，加入等体积的正己烷，混合震荡均匀，离心吸取上清液备用。用高效液相色谱检测，检测方法同实施例1步骤5)，计算R-苯氧基-2-丙胺产物的收率为94.5％，e.e.值为96.4％。
实施例4
1)胺脱氢酶的制备：同实施例1的步骤1)。
2)辅酶再生酶的制备：参照实施例1步骤2)，得到甘油脱氢酶。
3)利用胺脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系，本实施例之中为胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系：
将甘油与NAD+溶于浓度为200mM，pH值为11的氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为2M，NAD+的添加量为5mM，加入胺脱氢酶酶液与甘油脱氢酶酶液，并使胺脱氢酶与甘油脱氢酶的终浓度均为80U/L，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系；所述加入的胺脱氢酶酶液与甘油脱氢酶酶液分别为溶解在20～100mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中。
4)利用步骤3)中得到的胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系催化制备手性胺：将底物4-甲基-2-戊酮溶于少量异丙醇，加到步骤3)中得到的胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系中，用氨水调节体系的pH值为10，底物4-甲基-2-戊酮的加入量为400mM，利用所述胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系对底物4-甲基-2-戊酮在30℃、200rpm条件下催化反应48小时，即得手性胺，本实施例之中，底物为4-甲基-2-戊酮，产物为R-4-甲基-2-戊胺。
5)分离与检测：取步骤4)得到的反应液，加入NaOH调节pH至14，用等体积的甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚用无水硫酸钠除水，低温真空干燥。获得的残余固体加入200μL乙酸酐，200μL乙酸乙酯，密封置于微波炉内衍生3min，冷却后吹干，200μL去离子水定容后用气相色谱检测分析，结果如图3所示。计算产物R-4-甲基-2-戊胺的收率为61.7％，e.e.值为85.7％。
气相色谱的检测条件为：色谱柱型号：安捷伦cyclosil-B手性柱
前进样口：温度250℃；压力11.258Psi；流速25mL/min；隔垫吹扫流量3.0mL/min；色谱柱流量：1mL/min；前检测器：温度250℃；燃气流量40.00mL/min；尾吹气流量：50mL/min
实施例5
1)胺脱氢酶的制备：同实施例1的步骤1)。
2)辅酶再生酶的制备：照实施例2步骤2)，得到甲酸脱氢酶。
3)利用胺脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系，本实施例之中为胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：
将甲酸铵与NAD+溶于浓度为200～500mM，pH值为8～11的氯化铵-氨水缓冲液中，甲酸铵的加入量为200mM，NAD+的添加量为20mM，加入胺脱氢酶和甲酸脱氢酶两种酶液，并使胺脱氢酶和甲酸脱氢酶的终浓度分别为150U/L，得到胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系；所述加入的胺脱氢酶和甲酸脱氢酶酶液为溶解在50mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中。
4)利用步骤3)中得到的胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系催化制备手性胺：将底物5-甲基-2-己酮溶于少量异丙醇，加到步骤3)中得到的胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系中，用氨水调节体系的pH值为8，底物5-甲基-2-己酮的加入量为400mM，利用所述胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系对底物5-甲基-2-己酮在30℃、200rpm条件下催化反应36小时，即得手性胺；本实施例之中，底物为5-甲基-2-己酮，产物为R-5-甲基-2-己胺。
5)分离与检测：取步骤4)得到的反应液，加入NaOH调节pH至14，用等体积的甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚用无水硫酸钠除水，低温真空干燥。获得的残余固体加入200μL乙酸酐，200μL乙酸乙酯，密封置于微波炉内衍生3min，冷却后吹干，200μL去离子水定容后用气相色谱检测分析，检测方法同实施例4步骤5)，结果如图4所示。计算产物R-5-甲基-2-己胺的收率为49.9％，e.e.值为89.3％。
实施例6
1)胺脱氢酶的制备：同实施例1的步骤1)。
2)辅酶再生酶的制备：参照实施例1步骤2)，得到甘油脱氢酶；参照实施例2步骤2)，得到甲酸脱氢酶。
3)利用胺脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系，本实施例之中为胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：
将甘油、甲酸钠和NAD+溶于浓度为400mM，pH值为9.5的氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为0.5M，甲酸钠的加入量为200mM，NAD+的添加量为1mM，加入胺脱氢酶酶液、甘油脱氢酶酶液、甲酸脱氢酶酶液，并使胺脱氢酶的终浓度为100U/L，甘油脱氢酶、甲酸脱氢酶的终浓度均为50U/L，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系；所述加入的胺脱氢酶酶液、甲酸脱氢酶酶液、甘油脱氢酶酶液分别为溶解在50mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中。
4)利用步骤3)中得到的胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系催化制备手性胺：将底物丁酮溶于少量异丙醇，加到步骤3)中得到的胺脱氢酶、甘油脱氢酶与甲酸脱氢酶耦联体系中，用氨水调节体系的pH值为10，底物丁酮的加入量为200mM，利用所述胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系对底物丁酮在20℃、200rpm条件下催化反应24小时，即得手性胺；本实施例之中，底物为丁酮，产物为R-2-丁胺。
5)分离与检测：取步骤4)得到的反应液，加入NaOH调节pH至14，用等体积的甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚用无水硫酸钠除水，低温真空干燥。获得的残余固体加入200μL乙酸酐，200μL乙酸乙酯，密封置于微波炉内衍生3min，冷却后吹干，200μL去离子水定容后，用气相色谱检测分析，检测方法同实施例4步骤5)。计算产物R-2-丁胺的收率为72.1％，e.e.值为92.7％。
实施例7
1)胺脱氢酶的制备：同实施例1的步骤1)。
2)辅酶再生酶的制备：参照实施例1步骤2)，得到甘油脱氢酶。
3)利用胺脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系，本实施例之中为胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系：
将甘油与NAD+溶于浓度为200mM，pH值为8的氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为2M，NAD+的添加量为5mM，加入胺脱氢酶酶液与甘油脱氢酶酶液，并使胺脱氢酶与甘油脱氢酶的终浓度均为80U/L，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系；所述加入的胺脱氢酶酶液与甘油脱氢酶酶液分别为溶解在50mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中。
4)利用步骤3)中得到的胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系催化制备手性胺：将底物苯乙酮溶于少量异丙醇，加到步骤3)中得到的胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系中，用氨水调节体系的pH值为10，底物苯乙酮的加入量为400mM，利用所述胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系对底物苯乙酮在4℃、200rpm条件下催化反应48小时，即得手性胺，本实施例之中，底物为苯乙酮，产物为S-苯乙胺。
5)分离与检测：取步骤4)得到的反应液，加入NaOH调节pH至14，用等体积的甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚用无水硫酸钠除水，低温真空干燥。获得的残余固体加入200μL乙酸酐，200μL乙酸乙酯，密封置于微波炉内衍生3min，冷却后吹干，200μL去离子水定容后，用气相色谱检测分析，检测方法同实施例4步骤5)。计算产物S-苯乙胺的收率为80.7％，e.e.值为90.2％。
本领域技术人员可知，当本发明的技术参数在如下范围内变化时，可以预期得到与上述实施例相同或相近的技术效果：
一种多酶耦联体系制备手性胺的方法，包括以下步骤：
1)胺脱氢酶的制备：构建如SEQIDNO.1所示的胺脱氢酶基因；利用上述基因制备可表达胺脱氢酶的工程菌；将上述工程菌接种，加入诱导剂，培养所得发酵液离心获得细胞；细胞超声破碎，离心，得到含有胺脱氢酶的粗酶液；将上述含有胺脱氢酶的粗酶液进行纯化除盐，得到胺脱氢酶；
2)辅酶再生酶的制备：分别构建如SEQIDNO.2所示的甘油脱氢酶基因和如SEQIDNO.3所示的甲酸脱氢酶基因；利用上述基因分别制备可表达甘油脱氢酶的工程菌和可表达甲酸脱氢酶的工程菌；将上述工程菌分别接种，加入诱导剂，培养所得发酵液离心获得细胞；细胞超声破碎，离心，得到含有甘油脱氢酶的粗酶液和含有甲酸脱氢酶的粗酶液；将上述两种粗酶液分别进行纯化除盐，得到两种辅酶再生酶即甘油脱氢酶和甲酸脱氢酶；
3)利用胺脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系：
(3a)胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系：将甘油与NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为0.5～5M，NAD+的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶与甘油脱氢酶，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系；或，
(3b)胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：将甲酸钠和NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甲酸钠的加入量为20～500mM，NAD+的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶与甲酸脱氢酶，得到胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系；或，
(3c)胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：将甘油、甲酸钠和NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为0.5～5M，甲酸钠的加入量为20～500mM，NAD+的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶、甘油脱氢酶与甲酸脱氢酶，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系；
4)利用步骤3)所配置的多酶耦联体系催化制备手性胺：将底物酮溶于少量异丙醇，加到步骤(3a)～(3c)中得到的的任一种多酶偶联体系中，调节pH值为8～11，底物酮的加入量为20～500mM；利用所述多酶偶联体系对底物酮进行催化反应，即得手性胺。
所述步骤1)中，胺脱氢酶基因序列来源于Bacillusbadius，所述可表达胺脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-adh。
所述步骤2)中，甘油脱氢酶基因序列来源于Klebsiellapneumoniae，所述可表达甘油脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-gldA；
所述步骤2)中，甲酸脱氢酶基因序列来源于Candidaboidinii，所述可表达甲酸脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-fdh。
所述步骤3)中，加入胺脱氢酶并使其终浓度为20～200U/L，加入甘油脱氢酶并使其终浓度为50～150U/L，加入甲酸脱氢酶并使其终浓度为50～150U/L；加入的胺脱氢酶和/或甘油脱氢酶和/或甲酸脱氢酶均为溶解在20～100mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中的酶液。
所述步骤3)中，氯化铵-氨水缓冲液为反应体系中的氨基供体，其浓度为200～500mM，pH值为8～11。
所述步骤4)中，底物为苯氧基-2丙酮、4-甲基-2-戊酮、苯乙酮、5-甲基-2-己酮、丁酮中的一种。
所述步骤4)中，催化反应条件如下：在4～60℃，100～300rpm下反应6～48小时。
一种多酶耦联体系的制备方法，包括：
1)胺脱氢酶的制备：构建如SEQIDNO.1所示的胺脱氢酶基因；利用上述基因制备可表达胺脱氢酶的工程菌；将上述工程菌接种，加入诱导剂，培养所得发酵液离心获得细胞；细胞超声破碎，离心，得到含有胺脱氢酶的粗酶液；将上述含有胺脱氢酶的粗酶液进行纯化除盐，得到胺脱氢酶；
2)辅酶再生酶的制备：分别构建如SEQIDNO.2所示的甘油脱氢酶基因和如SEQIDNO.3所示的甲酸脱氢酶基因；利用上述基因分别制备可表达甘油脱氢酶的工程菌和可表达甲酸脱氢酶的工程菌；将上述工程菌分别接种，加入诱导剂，培养所得发酵液离心获得细胞；细胞超声破碎，离心，得到含有甘油脱氢酶的粗酶液和含有甲酸脱氢酶的粗酶液；将上述两种粗酶液分别进行纯化除盐，得到两种辅酶再生酶即甘油脱氢酶和甲酸脱氢酶；
3)利用胺脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系：
(3a)胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系：将甘油与NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为0.5～5M，NAD+的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶与甘油脱氢酶，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系；或，
(3b)胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：将甲酸钠和NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甲酸钠的加入量为20～500mM，NAD+的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶与甲酸脱氢酶，得到胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系；或，
(3c)胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：将甘油、甲酸钠和NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为0.5～5M，甲酸钠的加入量为20～500mM，NAD+的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶、甘油脱氢酶与甲酸脱氢酶，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系。
所述步骤1)中，胺脱氢酶基因序列来源于Bacillusbadius，所述可表达胺脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-adh；所述步骤2)中，甘油脱氢酶基因序列来源于Klebsiellapneumoniae，所述可表达甘油脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-gldA；甲酸脱氢酶基因序列来源于Candidaboidinii，所述可表达甲酸脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-fdh；所述步骤3)中，加入胺脱氢酶并使其终浓度为20～200U/L，加入甘油脱氢酶并使其终浓度为50～150U/L，加入甲酸脱氢酶并使其终浓度为50～150U/L；加入的胺脱氢酶和/或甘油脱氢酶和/或甲酸脱氢酶均为溶解在20～100mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中的酶液；氯化铵-氨水缓冲液为反应体系中的氨基供体，其浓度为200～500mM，pH值为8～11。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (10)
1.一种多酶耦联体系制备手性胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)胺脱氢酶的制备：构建如SEQIDNO.1所示的胺脱氢酶基因；利用上述基因制备可表达胺脱氢酶的工程菌；将上述工程菌接种，加入诱导剂，培养所得发酵液离心获得细胞；细胞超声破碎，离心，得到含有胺脱氢酶的粗酶液；将上述含有胺脱氢酶的粗酶液进行纯化除盐，得到胺脱氢酶；
2)辅酶再生酶的制备：分别构建如SEQIDNO.2所示的甘油脱氢酶基因和如SEQIDNO.3所示的甲酸脱氢酶基因；利用上述基因分别制备可表达甘油脱氢酶的工程菌和可表达甲酸脱氢酶的工程菌；将上述工程菌分别接种，加入诱导剂，培养所得发酵液离心获得细胞；细胞超声破碎，离心，得到含有甘油脱氢酶的粗酶液和含有甲酸脱氢酶的粗酶液；将上述两种粗酶液分别进行纯化除盐，得到两种辅酶再生酶即甘油脱氢酶和甲酸脱氢酶；
3)利用胺脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系：
(3a)胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系：将甘油与NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为0.5～5M，NAD+的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶与甘油脱氢酶，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系；或，
(3b)胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：将甲酸钠和NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甲酸钠的加入量为20～500mM，NAD+的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶与甲酸脱氢酶，得到胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系；或，
(3c)胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：将甘油、甲酸钠和NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为0.5～5M，甲酸钠的加入量为20～500mM，NAD+的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶、甘油脱氢酶与甲酸脱氢酶，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系；
4)利用步骤3)所配置的多酶耦联体系催化制备手性胺：将底物酮溶于少量异丙醇，加到步骤(3a)～(3c)中得到的的任一种多酶偶联体系中，调节pH值为8～11，底物酮的加入量为20～500mM；利用所述多酶偶联体系对底物酮进行催化反应，即得手性胺。
2.如权利要求1所述的多酶耦联体系制备手性胺的方法，其特征在于：所述步骤1)中，胺脱氢酶基因序列来源于Bacillusbadius，所述可表达胺脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-adh。
3.如权利要求1所述的多酶耦联体系制备手性胺的方法，其特征在于：所述步骤2)中，甘油脱氢酶基因序列来源于Klebsiellapneumoniae，所述可表达甘油脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-gldA。
4.如权利要求1所述的多酶耦联体系制备手性胺的方法，其特征在于：所述步骤2)中，甲酸脱氢酶基因序列来源于Candidaboidinii，所述可表达甲酸脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-fdh。
5.如权利要求1所述的多酶耦联体系制备手性胺的方法，其特征在于：所述步骤3)中，加入胺脱氢酶并使其终浓度为20～200U/L，加入甘油脱氢酶并使其终浓度为50～150U/L，加入甲酸脱氢酶并使其终浓度为50～150U/L；加入的胺脱氢酶和/或甘油脱氢酶和/或甲酸脱氢酶均为溶解在20～100mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中的酶液。
6.如权利要求1所述的多酶耦联体系制备手性胺的方法，其特征在于：所述步骤3)中，氯化铵-氨水缓冲液为反应体系中的氨基供体，其浓度为200～500mM，pH值为8～11。
7.如权利要求1所述的多酶耦联体系制备手性胺的方法，其特征在于：所述步骤4)中，底物为苯氧基-2丙酮、4-甲基-2-戊酮、苯乙酮、5-甲基-2-己酮、丁酮中的一种。
8.如权利要求1所述的多酶耦联体系制备手性胺的方法，其特征在于：所述步骤4)中，催化反应条件如下：在4～60℃，100～300rpm下反应6～48小时。
9.一种多酶耦联体系的制备方法，其特征在于：包括：
1)胺脱氢酶的制备：构建如SEQIDNO.1所示的胺脱氢酶基因；利用上述基因制备可表达胺脱氢酶的工程菌；将上述工程菌接种，加入诱导剂，培养所得发酵液离心获得细胞；细胞超声破碎，离心，得到含有胺脱氢酶的粗酶液；将上述含有胺脱氢酶的粗酶液进行纯化除盐，得到胺脱氢酶；
2)辅酶再生酶的制备：分别构建如SEQIDNO.2所示的甘油脱氢酶基因和如SEQIDNO.3所示的甲酸脱氢酶基因；利用上述基因分别制备可表达甘油脱氢酶的工程菌和可表达甲酸脱氢酶的工程菌；将上述工程菌分别接种，加入诱导剂，培养所得发酵液离心获得细胞；细胞超声破碎，离心，得到含有甘油脱氢酶的粗酶液和含有甲酸脱氢酶的粗酶液；将上述两种粗酶液分别进行纯化除盐，得到两种辅酶再生酶即甘油脱氢酶和甲酸脱氢酶；
3)利用胺脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系：
(3a)胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系：将甘油与NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为0.5～5M，NAD+的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶与甘油脱氢酶，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系；或，
(3b)胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：将甲酸钠和NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甲酸钠的加入量为20～500mM，NAD+的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶与甲酸脱氢酶，得到胺脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系；或，
(3c)胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：将甘油、甲酸钠和NAD+溶于氯化铵-氨水缓冲液中，甘油的加入量为0.5～5M，甲酸钠的加入量为20～500mM，NAD+的添加量为为0.2～20mM，加入胺脱氢酶、甘油脱氢酶与甲酸脱氢酶，得到胺脱氢酶-甘油脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系。
10.根据权利要求9所述的一种多酶耦联体系的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，胺脱氢酶基因序列来源于Bacillusbadius，所述可表达胺脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-adh；所述步骤2)中，甘油脱氢酶基因序列来源于Klebsiellapneumoniae，所述可表达甘油脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-gldA；甲酸脱氢酶基因序列来源于Candidaboidinii，所述可表达甲酸脱氢酶的工程菌为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-fdh；所述步骤3)中，加入胺脱氢酶并使其终浓度为20～200U/L，加入甘油脱氢酶并使其终浓度为50～150U/L，加入甲酸脱氢酶并使其终浓度为50～150U/L；加入的胺脱氢酶和/或甘油脱氢酶和/或甲酸脱氢酶均为溶解在20～100mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中的酶液；氯化铵-氨水缓冲液为反应体系中的氨基供体，其浓度为200～500mM，pH值为8～11。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510661106.0A CN105112468B (zh) | 2015-10-14 | 2015-10-14 | 一种多酶耦联体系制备手性胺的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510661106.0A CN105112468B (zh) | 2015-10-14 | 2015-10-14 | 一种多酶耦联体系制备手性胺的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105112468A true CN105112468A (zh) | 2015-12-02 |
| CN105112468B CN105112468B (zh) | 2019-01-08 |
Family
ID=54660575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510661106.0A Expired - Fee Related CN105112468B (zh) | 2015-10-14 | 2015-10-14 | 一种多酶耦联体系制备手性胺的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105112468B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110592037A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-12-20 | 厦门大学 | 一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用 |
| CN113666837A (zh) * | 2021-08-12 | 2021-11-19 | 怀化宝华生物科技有限公司 | 一种1，4-二甲基戊胺盐酸盐的制备方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003072793A2 (de) * | 2002-02-26 | 2003-09-04 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur herstellung von alkoholen aus substraten mittels oxidoreduktasen, zweiphasensystem umfassend eine wässrige phase und eine organische phase sowie vorrichtung zur durchführung des verfahrens |
| CN101384723A (zh) * | 2006-02-13 | 2009-03-11 | 罗扎股份公司 | 旋光手性胺的制备方法 |
| CN101974510A (zh) * | 2010-11-09 | 2011-02-16 | 厦门大学 | 一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法 |
| WO2013030329A1 (en) * | 2011-08-31 | 2013-03-07 | Vtu Holding Gmbh | Protein expression |
| CN103224963A (zh) * | 2013-05-24 | 2013-07-31 | 厦门大学 | 一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法 |
| US20130309734A1 (en) * | 2012-05-15 | 2013-11-21 | Georgia Tech Research Corporation | Engineered Amine Dehydrogenases and Methods of Use Thereof |
| CN104204197A (zh) * | 2011-10-04 | 2014-12-10 | 美国佛罗里达大学研究基金会公司 | 具有d-乳酸脱氢酶活性的甘油脱氢酶变体及其用途 |
| CN104404026A (zh) * | 2014-12-09 | 2015-03-11 | 厦门大学 | 一种包埋胺脱氢酶的聚乙烯亚胺-氧化钛及其制备方法 |
-
2015
- 2015-10-14 CN CN201510661106.0A patent/CN105112468B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003072793A2 (de) * | 2002-02-26 | 2003-09-04 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur herstellung von alkoholen aus substraten mittels oxidoreduktasen, zweiphasensystem umfassend eine wässrige phase und eine organische phase sowie vorrichtung zur durchführung des verfahrens |
| CN101384723A (zh) * | 2006-02-13 | 2009-03-11 | 罗扎股份公司 | 旋光手性胺的制备方法 |
| CN101974510A (zh) * | 2010-11-09 | 2011-02-16 | 厦门大学 | 一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法 |
| WO2013030329A1 (en) * | 2011-08-31 | 2013-03-07 | Vtu Holding Gmbh | Protein expression |
| CN104204197A (zh) * | 2011-10-04 | 2014-12-10 | 美国佛罗里达大学研究基金会公司 | 具有d-乳酸脱氢酶活性的甘油脱氢酶变体及其用途 |
| US20130309734A1 (en) * | 2012-05-15 | 2013-11-21 | Georgia Tech Research Corporation | Engineered Amine Dehydrogenases and Methods of Use Thereof |
| CN103224963A (zh) * | 2013-05-24 | 2013-07-31 | 厦门大学 | 一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法 |
| CN104404026A (zh) * | 2014-12-09 | 2015-03-11 | 厦门大学 | 一种包埋胺脱氢酶的聚乙烯亚胺-氧化钛及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MATTHIAS HÖHNE ET AL.: "Efficient Asymmetric Synthesis of Chiral Amines by Combining Transaminase and Pyruvate Decarboxylase", 《CHEMBIOCHEM》 * |
| MICHAEL J. ABRAHAMSON ET AL.: "Development of an Amine Dehydrogenase for Synthesis of Chiral Amines", 《ASYMMETRIC AMINE SYNTHESIS》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110592037A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-12-20 | 厦门大学 | 一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用 |
| CN113666837A (zh) * | 2021-08-12 | 2021-11-19 | 怀化宝华生物科技有限公司 | 一种1，4-二甲基戊胺盐酸盐的制备方法 |
| CN113666837B (zh) * | 2021-08-12 | 2024-06-07 | 怀化宝华生物科技有限公司 | 一种1，4-二甲基戊胺盐酸盐的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105112468B (zh) | 2019-01-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| de Vrije et al. | “In situ” removal of isopropanol, butanol and ethanol from fermentation broth by gas stripping | |
| CN103789368B (zh) | 一种n-保护哌啶醇的生产方法 | |
| CN104328155B (zh) | 利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法及应用 | |
| CN104388373A (zh) | 一种共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌系统的构建 | |
| AU2012243504B2 (en) | Apparatus and method for separating and refining fermentation of product manufactured by fermenting microorganism by using adsorbent | |
| CN106399215A (zh) | 一种高效生产丁醇的重组梭菌、构建方法与应用 | |
| CN104371966A (zh) | 一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN103224963B (zh) | 一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法 | |
| CN105112468A (zh) | 一种多酶耦联体系制备手性胺的方法 | |
| CN104046586A (zh) | 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用 | |
| CN101240299A (zh) | 一种酵母细胞催化还原芳香酮制备光学活性醇的方法 | |
| CN104862326A (zh) | 一种绿僵菌氧甲基转移酶及其应用 | |
| CN101709322B (zh) | 生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法 | |
| CN105274041B (zh) | 一株重组大肠杆菌及其在生产2-丁醇中的应用 | |
| CN103820506B (zh) | 一种基因重组菌发酵生产辅酶q10的方法 | |
| Ayodele et al. | Microbial protein production using lignocellulosic biomass (switchgrass) and klebsiella oxytoca M5A1—A nitrogen fixer | |
| CN105567756B (zh) | 一种海洋菌株及其胺脱氢酶催化制备手性胺的方法 | |
| CN105506022A (zh) | 一种利用大肠杆菌全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法 | |
| CN112501219A (zh) | 一种以蔗糖为原料发酵生产乳酸单体的方法 | |
| CN104745645A (zh) | 一种生物转化丙烯醛合成丙烯酸的方法 | |
| CN104178552B (zh) | 一种高产没食子酸脱羧酶(gad)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法 | |
| CN103834600A (zh) | 一种催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法 | |
| CN103484505B (zh) | 利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法 | |
| CN103436467B (zh) | 一种屎鞘氨醇杆菌及其应用 | |
| CN103952381A (zh) | 一个不依赖nad+催化3-羟基丙醛产3-羟基丙酸的醛氧化酶及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190108 |