CN103789368B - 一种n-保护哌啶醇的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种N-保护哌啶醇的生产方法，所述N-保护哌啶醇的结构式为，其中，R为叔丁氧羰基或苄基，其特征在于，所述生产方法以N-保护哌啶酮为底物，在醇脱氢酶、ADH-A、异丙醇和NAD+的存在下反应获得，所述醇脱氢酶为cpsADH或cmADHmut。本发明的方法高效简便，具有较好的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种N-保护哌啶醇的生产方法。
背景技术
(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶（(S)-1-Boc-3-hydroxypiperidine）可用于合成抗充血性心力衰竭药卡莫瑞林（PhilipACarpinoetal.Pyrazolinone-piperidinedipeptidegrowthhormonesecretagogues(GHSs):Discoveryofcapromorelin.Bioorganic&MedicinalChemistry,2003,11(4):581-590），也可用于淋巴癌新药伊布鲁替尼（ibrutinib）的合成。(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶可以由化学催化或者拆分获得，但是由于效率较低，反应条件苛刻，产生的三废较多，工业化成本较高。生物催化不对称合成手性醇已得到广泛应用，(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的生物催化不对称合成虽然已有报道，但至今没有一种高效的方法，例如：文献（LacheretzRetal.DaucuscarotaMediated-ReductionofCyclic3-Oxo-amines.OrganicLetters,2009,11(6):1245-1248）中报道的转化率只有73%，ee值只有95%，不具有工业应用价值；CN201310173088.2虽然披露了生物催化可以实现高效转化，但没有披露具体的催化用酶。
发明内容
本申请的发明人在长期的研究中发现，以N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮（1-Boc-3-oxopiperidine）或1-苄基-3-哌啶酮（1-benzylpiperidin-3-one）为底物，以ADH-A/异丙醇为辅酶NADH再生体系，cpsADH和cmADHmut能够催化N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和1-苄基-3-哌啶酮产生相应的哌啶醇的ee值超过99.5%，具有较好的工业应用价值。
因此，本发明的一个目的在于提供一种N-保护哌啶醇的生产方法。
本发明提供了一种N-保护哌啶醇的生产方法，所述N-保护哌啶醇的结构式为其中，R为叔丁氧羰基或苄基，所述生产方法以N-保护哌啶酮为底物，在醇脱氢酶、ADH-A、异丙醇和NAD+的存在下反应获得，所述醇脱氢酶为cpsADH或cmADHmut。
根据本发明，所述ADH-A具有如SEQIDNO：4所示的氨基酸序列，所述cpsADH具有如SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，所述cmADHmut具有如SEQIDNO：6所示的氨基酸序列。
根据本发明，所述反应的反应温度为30～40℃。
根据本发明，在反应体系中，所述底物的浓度为2%～20%（w/v），所述异丙醇的浓度为10%～20%（v/v），所述NAD+的浓度为0.003%～0.005%（w/v）。
根据本发明，在反应体系中，所述ADH-A的浓度为20000～40000U/L。
根据本发明，所述醇脱氢酶为表达所述醇脱氢酶的重组大肠杆菌发酵培养的菌体、菌体破碎液或提取的酶冻干粉。
根据本发明，所述表达所述醇脱氢酶的重组大肠杆菌发酵培养的方法如下：
培养基：LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2；TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油5g/L，KH2PO42.13g/L，K2HPO4·3H2O16.43g/L，pH7.0～7.5；
发酵培养条件：将表达所述醇脱氢酶的重组大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37℃、220rpm培养过夜后，按1%接种量接种到TB培养基中，37℃、220rpm培养至OD600=5～6，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，28℃下诱导过夜。
根据本发明，在反应体系中，所述醇脱氢酶的浓度为0.01%～0.5%（w/v）。
本发明的有益效果：本发明提供了一种N-保护哌啶醇的生物催化方法，以N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮或1-苄基-3-哌啶酮为底物，以ADH-A/异丙醇为辅酶NADH再生体系，cpsADH和cmADHmut能够催化N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和1-苄基-3-哌啶酮产生相应的哌啶醇，产物ee值超过99.5%。本发明的方法高效简便，具有较好的工业应用价值。
附图说明
图1为本发明的反应示意图，其中，（A）为N保护基团为叔丁氧羰基，（B）为N保护基团为苄基。
图2为N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶标准品HPLC图谱。
图3为cmADHmut转化的HPLC图谱。
图4为cpsADH转化的HPLC图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本发明中，如图1（A）所示，以N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮（1-Boc-3-oxopiperidine）为底物，以ADH-A/异丙醇为辅酶NADH再生体系，通过筛选得到cpsADH和cmADHmut能够催化N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮产生的(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶（(S)-1-Boc-3-hydroxypiperidine）的ee值超过99.5%，具有较好的工业应用价值。
类似地，如图1（B）所示，当N保护基团由叔丁氧羰基（Boc）改为苄基后，以1-苄基-3-哌啶酮（1-benzylpiperidin-3-one）为底物，以ADH-A/异丙醇为辅酶NADH再生体系，cpsADH和cmADHmut也能催化1-苄基-3-哌啶酮产生的(S)-1-苄基-3-羟基哌啶（(S)-1-benzylpiperidin-3-ol）的ee值超过99.5%，具有较好的工业应用价值。
以下实施例中所述全基因合成及亚克隆全部委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
以下实施例中所述表达重组大肠杆菌的发酵方法如下：
培养基配制方法：LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2）；TB培养基（蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油5g/L，KH2PO42.13g/L，K2HPO4·3H2O16.43g/L，pH7.0～7.5）；121℃高温高压灭菌20分钟。
发酵培养条件：将构建好的菌种分别接种到含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养过夜后，按1%接种量接种到新鲜TB培养基中（含100μg/mL卡那霉素），37℃、220rpm培养至OD600=5～6，加入终浓度为0.2mM的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷），28℃下诱导过夜。发酵液于8000rpm，10min离心，去上清，得到菌体于-20℃保藏备用。
菌体破碎液获取方法：发酵液离心获得菌体用4倍体积的水重悬浮，然后超声破碎。
酶冻干粉制备：菌体破碎液12000rpm，20min离心，上清冷冻干燥即得酶冻干粉。
以下实施例中产物的分析检测方法如下：
TLC检测方法：
展开剂：石油醚：乙酸乙酯=3ml：1ml（滴加0.1ml冰乙酸）
哌啶醇Rf值：0.3～0.4；哌啶酮Rf值：0.4～0.5
手性HPLC检测方法：
流动相：正己烷/异丙醇=95/5。
色谱柱：CHIRALPAK-ODH柱（250×4.6mm，5μm）
柱子温度：35度
波长：205nm
流速：1.0ml/min
出峰时间：S型：7.0minR型：7.4min
GC方法：
柱子：安捷伦DB-WAX（30m）
样品：丙酮作为溶剂配置成5.0g/L
进样口温度：230度进样口压力11.021psi分流比：10/1
柱子温度：初始温度175度，保持10min后，以每秒20度的梯度，上升至250度，保持10min
载气：氮气，流速1.5ml/min
检测器：FID氢火焰检测温度300度
氢气流速：35ml/min
空气流速：400ml/min
实施例1、N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮为底物进行酶筛选
全基因合成19种不同来源的醇脱氢酶以及ADH-A的基因序列并在基因两端设计限制性酶切位点，然后分别亚克隆到载体pET24a（购自Novagen公司）的相应位点，获得的重组质粒转化大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)进行表达。
分别称取0.4g的N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮加入到19个250ml摇瓶中，然后加入2ml异丙醇和10ml水，用氨水调pH至8.0左右后，按照终浓度40000U/L（酶活测定方案参照文献LevinI,MeiriG,PeretzM,etal.TheternarycomplexofPseudomonasaeruginosaalcoholdehydrogenasewithNADHandethyleneglycol[J].Proteinscience,2004,13(6):1547-1556中的方法）加入ADH-A菌体破碎液，按终浓度0.1g/L分别加入19种不同来源的醇脱氢酶冻干粉，定容至20ml体积，用氨水调pH8.0，加入0.05g/LNAD+，30℃，转速150rpm反应16h。
经过TLC检测19种不同来源的醇脱氢酶中有5种酶能够催化底物转化为产物，进一步使用手性HPLC检测产物的ee值，如图2～图4所示，结果显示cpsADH和cmADHmut两种脱氢酶的产物ee值高于99.5%，具有较好的工业应用价值。
ADH-A、cpsADH和cmADHmut三种醇脱氢酶的相关信息如表1所示。
表1、ADH-A、cpsADH和cmADHmut的相关信息
实施例2、N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮为底物的转化
2.1、cpsADH破碎液的转化
称取底物N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮100g，异丙醇200ml，加入2000ml发酵罐中，加入200ml水，用氨水调pH至8.0左右，然后按照终浓度40000U/L加入酶液ADH-A，按终浓度1g菌体/L（按照破碎前的菌种重量折算）加入cpsADH破碎液，定容至1000ml体积，用氨水调pH8.0，40℃，转速500rpm，加入0.03g/LNAD+开始反应，按照0.5vvm通入空气，转化3h后GC法检测转化结果，转化率达到98.9%；手性HPLC检测产物的ee值大于99.5%。
2.2、cpsADH菌体的转化
称取底物N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮100g，异丙醇200ml，加入2000ml发酵罐中，加入200ml水，用氨水调pH至8.0左右，然后按照终浓度40000U/L加入酶液ADH-A，按终浓度1g菌体/L加入cpsADH菌体，定容至1000ml体积，用氨水调pH8.0，40℃，转速500rpm，加入0.03g/LNAD+开始反应，按照0.5vvm通入空气，转化3h后GC法检测转化结果，转化率达到99.0%；手性HPLC检测产物的ee值大于99.5%。
2.3、cpsADH菌体的转化
称取底物N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮200g，异丙醇200ml，加入2000ml发酵罐中，加入200ml水，用氨水调pH至8.0左右，然后按照终浓度40000U/L加入酶液ADH-A，按终浓度0.1g菌体/L加入cpsADH菌体，定容至1000ml体积，用氨水调pH8.0，40℃，转速500rpm，加入0.03g/LNAD+开始反应，按照0.5vvm通入空气，转化5h后GC法检测转化结果，转化率达到98.8%；手性HPLC检测产物的ee值大于99.5%。
2.4、cmADHmut菌体的转化
称取底物N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮100g，异丙醇200ml，加入2000ml发酵罐中，加入200ml水，用氨水调pH至8.0左右，然后按照终浓度40000U/L加入酶液ADH-A，按终浓度1g菌体/L加入cmADHmut菌体，定容至1000ml体积，用氨水调pH8.0，40℃，转速500rpm，加入0.03g/LNAD+开始反应，按照0.5vvm通入空气，转化5h后GC法检测转化结果，转化率达到99.1%；手性HPLC检测产物的ee值大于99.5%。
实施例3、1-苄基-3-哌啶酮为底物的转化
3.1、cpsADH菌体的转化
称取底物1-苄基-3-哌啶酮100g，异丙醇200ml，加入2000ml发酵罐中，加入200ml水，用氨水调pH至8.0左右，然后按照终浓度40000U/L加入酶液ADH-A，按终浓度1g菌体/L加入cpsADH菌体，定容至1000ml体积，用氨水调pH8.0，40℃，转速500rpm，加入0.03g/LNAD+开始反应，按照0.5vvm通入空气，转化5h后GC法检测转化结果，转化率达到99.0%；手性HPLC检测产物的ee值大于99.5%。
3.2、cmADHmut菌体的转化
称取底物1-苄基-3-哌啶酮100g，异丙醇200ml，加入2000ml发酵罐中，加入200ml水，用氨水调pH至8.0左右，然后按照终浓度40000U/L加入酶液ADH-A，按终浓度5g菌体/L加入cmADHmut菌体，定容至1000ml体积，用氨水调pH8.0，40℃，转速500rpm，加入0.03g/LNAD+开始反应，按照0.5vvm通入空气，转化5h后GC法检测转化结果，转化率达到98.8%；手性HPLC检测产物的ee值大于99.5%。
Claims (7)
1.一种N-保护哌啶醇的生产方法，所述N-保护哌啶醇的结构式为其中，R为叔丁氧羰基或苄基，其特征在于，所述生产方法以N-保护哌啶酮为底物，在醇脱氢酶、ADH-A、异丙醇和NAD+的存在下反应获得，所述醇脱氢酶为cpsADH或cmADHmut，所述ADH-A为SEQIDNO：4所示的氨基酸序列，所述cpsADH为SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，所述cmADHmut为SEQIDNO：6所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述反应的反应温度为30～40℃。
3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，在反应体系中，所述底物的浓度为2％～20％(w/v)，所述异丙醇的浓度为10％～20％(v/v)，所述NAD+的浓度为0.003％～0.005％(w/v)。
4.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，在反应体系中，所述ADH-A的浓度为20000～40000U/L。
5.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述醇脱氢酶为表达所述醇脱氢酶的重组大肠杆菌发酵培养的菌体、菌体破碎液或提取的酶冻干粉。
6.如权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述表达所述醇脱氢酶的重组大肠杆菌发酵培养的方法如下：
培养基：LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2；TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油5g/L，KH2PO42.13g/L，K2HPO4·3H2O16.43g/L，pH7.0～7.5；
发酵培养条件：将表达所述醇脱氢酶的重组大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37℃、220rpm培养过夜后，按1％接种量接种到TB培养基中，37℃、220rpm培养至OD600＝5～6，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，28℃下诱导过夜。
7.如权利要求5所述的生产方法，其特征在于，在反应体系中，所述醇脱氢酶的浓度为0.01％～0.5％(w/v)。
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