CN105420307A

CN105420307A - 一种制备(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法

Info

Publication number: CN105420307A
Application number: CN201510867063.1A
Authority: CN
Inventors: 吴中柳; 许光鹏; 刘艳; 裴小琼
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2015-12-02
Filing date: 2015-12-02
Publication date: 2016-03-23

Abstract

本发明涉及一种羰基还原酶生物催化N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮制备(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法。本发明方法反应条件温和，转化效率高，立体选择性高，产物ee值99.5％以上。底物的浓度可提高到250g/L，时空产率最高可达到1600g/L/d，极大地提高了生产效率，具有重要的工业化应用价值。

Description

一种制备(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法

技术领域

本发明涉及一种由生物催化技术制备(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法，属于生物制药工业技术领域。

背景技术

(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶是一种重要的药物中间体，被广泛应用于镇痛、抗精神病、抗肿瘤等药物的合成，如药物依鲁替尼。该药物于2013年底在美国上市，保守预计2018年全球销售额可以达到23.2亿美元。

目前，光学活性的(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶化合物可通过化学或酶促方法拆分外消旋体获得。但是拆分方法的局限性在于最大理论收率为50％，分离提取也较为繁琐(USpatent2011092698A1，WO2011036280A1)。

生物催化羰基不对称还原，其最大理论产率及对映体过量值为100％，且反应体系简单，绿色环保，是手性醇生产的重要方法之一。目前已发掘的制备该中间体的生物催化剂大多来自于生物离体组织(如磨碎的野生胡萝卜根)，细菌，真菌等，也有重组羰基还原酶生物催化的报道。然而，这些催化剂大多获取困难，立体选择性不高，底物耐受性差，转化率较低，从而导致时空产率低，没有良好的工业化经济效益(Org.Lett.2009，11，1245-1248；OPRD.2014,18,827-830；CN104603278A，CN103276027A，CN103923957A，CN103571908A，CN103131734A，WO2013190341A1)。

发明内容

本发明旨在提供一种高产率，高立体选择性及高时空产率的羰基还原酶催化前手性酮N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮制备(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法，以满足工业化生产需求。

本发明涉及用于制备式(I)的化合物方法：

(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶

所述方法包括在还原型辅酶或者辅酶再生体系(包括氧化型辅酶，氢供体及偶联酶)存在的情况下，用羰基还原酶还原式(II)的化合物：

N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮

式(II)的化合物(在本文中也称为“底物”)在本领域是已知的。

本发明生物催化体系为：羰基还原酶、辅酶、底物、缓冲液。

在本发明中使用的羰基还原酶为ChKRED03(NCBI登录号为KC342003)，ChKRED08(NCBI登录号为KC342008)，ChKRED23(NCBI登录号为KC342023)或者ChKRED26(NCBI登录号为KC342026)。根据本领域一般常识，上述羰基还原酶可通过商业化的全基因合成服务得到。

根据本领域的一般常识，反应体系中可以用上述羰基还原酶构建的重组酶的休止细胞、粗酶液、纯酶或者粗酶粉等。为获得较高的转化效率，优选使用粗酶液。羰基还原酶的用量与底物用量比率优选为1％～6％(w/w)(羰基还原酶以粗酶液的总蛋白量计)。

本发明的辅酶可以为NADH或者NADPH或者构建一个可以产生这两种还原型辅酶之一的辅酶再生体系。

本发明优选的辅酶再生体系为：葡萄糖脱氢酶GDH、氧化型辅酶NADP⁺、葡萄糖。葡萄糖脱氢酶为1～30U/mL，NADP⁺用量与底物用量比率为0.2％～0.9％(w/w)，葡萄糖的物质的量为底物物质的量的1.1～3倍。

本发明的底物为：N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮。底物优选加入助溶剂后添加到反应体系中，所述助溶剂是二甲亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮，浓度优选5％～25％(v/v)。根据本发明的有利实施例，助溶剂最优选于甲醇。

反应体系中底物终浓度优选1～250g/L。

本发明缓冲液优选Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液；缓冲液的pH优选6.0～8.0；缓冲液浓度优选0.1M；

本发明反应温度优选20℃～40℃，转速优选100～200rpm。

根据上述优选体系(合成路线见说明书附图1)，所述制备方法的实施过程如下：将底物充分溶解在甲醇中，然后加入到缓冲液中，搅拌均匀后，加入重组羰基还原酶，葡萄糖脱氢酶、氧化型辅酶、葡萄糖，维持在20℃～40℃，TLC或HPLC监控，至反应转化率达到99％以上，用甲基叔丁基醚终止反应。

在反应过程中，通过定期监测并添加常规的碱性试剂(例如碳酸钠和氢氧化钠)将反应体系的pH值保持在6.0～8.0的范围。

反应终止后，向反应液中加入硅藻土搅拌，过滤，滤液用甲基叔丁基醚萃取，滤饼返回反应釜，加入甲基叔丁基醚搅拌过滤两次，合并有机相；用饱和食盐水洗涤2～3次，浓缩后得到浅黄色油状物，加石油醚于浅黄色油状物中，于45℃～50℃下搅拌至均相，于-10℃～20℃下静置，过滤后得到(S)-N-叔丁氧羰基-1-羟基哌啶。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相矛盾的特征和/或步骤外，均可以以任何方式组合。

本发明与已有技术相比具有如下优势：

本发明方法采用特定催化剂，成功制备出光学纯度高的(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。该方法反应条件温和，水相反应，反应效率高，操作简单。特别的，反应底物浓度可提高至200g/L以上，反应时间3h，转化率>99％，ee值99.6％，时空产率达到1600g/L/d以上。且20g的制备级规模，可实现回收率88％以上。该生物催化工艺大大提高了制备(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的效率并大幅降低了生产成本，具有重要的工业应用价值。

附图说明

图1为本发明的合成路线；

图2为实施例3中，反应1h取样所得样品的HPLC图谱；

图3为实施例3中，反应2.5h取样所得样品的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1重组羰基还原酶粗酶液的制备

本发明的生物催化剂可采用本领域常规的方法来制备。

羰基还原酶重组菌的构建：将含有羰基还原酶基因的片段及pET28a质粒进行相同限制性内切酶双酶切，经连接并将连接产物转入感受态E.coliBL21(DE3)菌株，筛选得到阳性克隆子，接种到含卡那霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基活化过夜(37℃，220rpm)制备种子液。将种子液以1％接种量转接到100mL含卡那霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD₆₀₀介于0.6～0.8时，加入IPTG(0.5mM)于20℃继续培养过夜。离心收集细胞，用10mL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声破碎15分钟(超声时间：4s，间隙时间：5s，工作次数：99次)。若大量制备，可采用高压均质机破碎。随后冷冻离心，上清液于液氮中快速冷冻，于-80℃冰箱保存备用。

实施例2羰基还原酶生物催化

在10mL反应瓶中加入一定量底物及50μL甲醇，然后依次加入0.1mL的磷酸钾缓冲液(1M，pH7.0)，0.1mL重组羰基还原酶粗酶液(30mg/mL，6.27U/mg)，0.025mLNADP⁺溶液(贮存液浓度40mM)，0.1mL葡萄糖脱氢酶粗酶液(30mg/mL，10U/mg)，0.3mL葡萄糖浆(贮存液浓度100％，w/v)，补足水至1mL，混匀后，在30℃下磁力搅拌反应，每15分钟用1M氢氧化钠溶液将反应体系pH调至6.5～7.0。反应结束后进行HPLC分析，检测结果如下：

编号	底物浓度(g/L)	转化率(％)	对映体过量值ee(％)
				ChKRED03	250	>99	99.6
ChKRED08	60	>99	>99.5
				ChKRED23	60	>99	>99.5
ChKRED26	60	>99	>99.5

实施例3百毫克级制备工艺

在10mL反应瓶中加入150mg底物及50μL甲醇，然后依次加入0.1mL的磷酸钾缓冲液(1M，pH7.0)，0.1mL重组羰基还原酶ChKRED03粗酶液(30mg/mL，4.5U/mg)，0.025mLNADP⁺溶液(贮存液浓度40mM)，0.1mL葡萄糖脱氢酶粗酶液(30mg/mL，10U/mg)，0.18mL葡萄糖浆(贮存液浓度100％，w/v)，补足水至1mL，混匀后，在30℃下磁力搅拌反应，每15分钟用1M氢氧化钠溶液将反应体系pH调至6.5～7.0。反应1h及2.5h后取样进行HPLC分析，图谱分别见说明书附图2和图3。说明书附图2中保留时间14.040min为(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，保留时间15.443为R构型，保留时间28.235min为底物；说明书附图3中保留时间14.030min为(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，保留时间15.442min为R构型，保留时间28.374min为底物。计算得到最终转化率为98.4％。

实施例4十克级制备工艺

在500mL反应瓶中加入20g底物及5mL甲醇，然后依次加入10mL的磷酸钾缓冲液(1M，pH7.0)，10mL重组羰基还原酶ChKRED03粗酶液(30mg/mL，6.27U/mg)，2.5mLNADP⁺溶液(贮存液浓度40mM)，10mL葡萄糖脱氢酶粗酶液(30mg/mL，10U/mg)，24mL葡萄糖浆(贮存液浓度100％，w/v)，补足水至100mL，混匀后，在30℃下磁力搅拌反应1h及3h后取样进行HPLC分析，最终转化率为99.1％。

Claims

1.用于制备式(I)的化合物的方法：

所述方法包括在还原型辅酶或辅酶再生体系存在的情况下，用羰基还原酶还原式(II)的化合物：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用羰基还原酶为ChKRED03，其NCBI登录号为KC342003；ChKRED08，其NCBI登录号为KC342008；ChKRED23，其NCBI登录号为KC342023；或者ChKRED26，其NCBI登录号为KC342026。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于底物先溶解于助溶剂中，所述助溶剂是二甲亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述还原型辅酶NADH或NADPH。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于辅酶再生体系包括氧化型辅酶，氢供体及偶联酶。

6.根据权利要求1和5所述的方法，其特征在于辅酶再生体系为葡萄糖脱氢酶GDH、氧化型辅酶NADP⁺、葡萄糖。