CN106520856B - (s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的酶催化制备方法 - Google Patents

(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的酶催化制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种(S)‑N‑叔丁氧羰基‑3‑羟基哌啶的酶催化制备方法，其特征在于：以氨基酸序列为SIQ ID NO.2的酮还原酶为催化剂、催化N‑叔丁氧羰基‑3‑哌啶酮进行还原反应得到(S)‑N‑叔丁氧羰基‑3‑羟基哌啶。与现有技术相比，本发明反应过程中底物浓度最高可达250g/L，产物收率(97％)及光学纯度高(>99％)，可工业化放大生产，具有良好的应用价值。

Description

(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的酶催化制备方法
技术领域
本发明属于制药工业生物技术领域，具体涉及一种(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的酶催化制备方法。
背景技术
(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶是一个在医药领域具有重要应用价值的化合物，被广泛应用于镇痛、抗精神病和抗肿瘤等药物的合成，如依鲁替尼(用于治疗套细胞淋巴瘤、慢性淋巴性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤和EGFR突变型的非小细胞肺癌)。目前文献报道(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的制备方法主要有化学拆分法和生物转化法。
化学拆分法是将外消3-羟基哌啶在手性有机酸的作用下成盐析出得到(S)-3-羟基哌啶的盐，然后游离、上保护基得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。该方法存在拆分收率低、操作繁琐及成本高昂的缺点。
2009年，文献Organic Letters Vol.11,No.6,1245-1248报道了一种生物转化合成(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法。该方法利用磨碎的野生胡萝卜根为生物催化剂，将N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮还原得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，该方法存在生物催化剂大量获得困难及产物光学纯度不高等问题，反应效率太低、生产成本过高，难以产业化应用。
CN103789368B中公开了一种醇脱氢酶催化制备(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法，该方法虽然转化率(99％)和产物ee值都较高(>99.5％)，但是反应过程中底物浓度太低为1g/L，仅停留在实验室研究阶段，无法工业化放大应用。
CN103898178B以共表达的重组酮还原酶和葡萄糖脱氢酶为催化剂，N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮为底物，在辅酶NADP的存在下得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，产物ee值为99.9％，但是反应过程中底物浓度最高可达150g/L，虽然可以工业化应用，但是由于底物浓度较低使得生产成本大大增加。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明公开了一种(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的酶催化制备方法。
具体工艺路线如下所示：
Figure BDA0001144419110000021
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：以氨基酸序列为SIQ ID NO.2的酮还原酶为催化剂、催化N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮进行还原反应得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，该反应在pH＝5～8、温度为20～45℃下进行，其中酮还原酶浓度为5～100g/L、N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮浓度为10～250g/L，反应结束后过滤，滤液用有机溶剂萃取、浓缩和结晶得到纯度大于99％、光学纯度大于99.9％的目标产物。
进一步说，编码酮还原酶的氨基酸序列的基因序列为SIQ ID NO.1。
进一步说，还原反应在辅酶和辅酶再生体系中进行，其中辅酶为NAD或NADP，优选NADP，辅酶浓度为0.001～1g/L，
进一步说，辅酶再生体系为葡萄糖脱氢酶/葡萄糖体系或者氨基酸序列为SIQIDNO.2的酮还原酶/异丙醇体系，优选氨基酸序列为SIQ ID NO.2的酮还原酶/异丙醇体系。
进一步说，还原反应在缓冲溶液中进行，其中缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，优选磷酸盐缓冲液，缓冲液的浓度为50～100mmol/L。
进一步说，酮还原酶以酶粉、表达酮还原酶的细胞、表达酮还原酶的细胞破碎液、固定化酶、固定化细胞任一形式存在。
进一步说，重组酮还原酶为来源于细长聚球藻(Synechococcus elongatus)，NCBI的登录号为AAB82041.1。
进一步说，酮还原酶或葡萄糖脱氢酶由基因工程菌发酵得到，基因工程菌选自大肠杆菌或酵母菌，其中优选为大肠杆菌。
进一步说，葡萄糖脱氢酶以酶粉、表达葡萄糖脱氢酶的细胞、表达葡萄糖脱氢酶的细胞破碎液、固定化酶、固定化细胞任一形式存在。
与现有技术相比，本发明反应过程中底物浓度最高可达250g/L，产物收率(97％)及光学纯度高(>99％)，可工业化放大生产，具有良好的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的合成
向1L圆底烧瓶中加入0.5L事先配好的pH＝7的100mmol/L的磷酸盐缓冲液、10g酮还原酶酶粉和0.004g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，搅拌均匀后，加入64g N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和0.3L异丙醇，反应过程中用10％氢氧化钠水溶液控制反应液为pH＝5.8，30℃搅拌6h，过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩甲苯得到70g淡黄色液体；粗品加入0.5kg正己烷，在0～5℃搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品58g，纯度99.8％，光学纯度99.9％，收率90％。
实施例2(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的合成
向1L圆底烧瓶中加入0.5L事先配好的pH＝7的100mmol/L的磷酸盐缓冲液、16g酮还原酶酶粉和0.004g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，搅拌均匀后，加入100g N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和0.3L异丙醇，反应过程中用10％氢氧化钠水溶液控制反应液为pH＝5.8，30℃搅拌6h，过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩甲苯得到110g淡黄色液体；粗品加入0.5kg正己烷，在0～5℃搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品96g，纯度99.8％，光学纯度99.9％，收率95％。
实施例3公斤级(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的合成
向10L带夹套的玻璃反应釜中加入5L事先配好的pH＝7的100mmol/L的磷酸盐缓冲液、0.16kg酮还原酶酶粉和0.04g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，搅拌均匀后，加入1kgN-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和3L异丙醇，反应过程中用10％氢氧化钠水溶液控制反应液为pH＝5.8，30℃搅拌6h，过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩甲苯得到1.2kg淡黄色液体；粗品加入5kg正己烷，在0～5℃搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品0.97kg，纯度99.8％，光学纯度99.9％，收率96％。
实施例4公斤级(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的合成
向20L带夹套的玻璃反应釜中加入10L事先配好的pH＝7的90mmol/L的三乙醇胺缓冲液、0.3kg酮还原酶酶粉和0.09g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，搅拌均匀后，加入4kg N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和6L异丙醇，反应过程中用10％氢氧化钠水溶液控制反应液为pH＝6，30℃搅拌6h，过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩甲苯得到4kg淡黄色液体；粗品加入20kg正己烷，在0～5℃搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品3.92kg，纯度99.9％，光学纯度99.9％，收率97％。
实施例5公斤级(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的合成
向10L带夹套的玻璃反应釜中加入5L事先配好的pH＝7的100mmol/L的磷酸盐缓冲液、0.12kg酮还原酶固定化全细胞和0.04g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，搅拌均匀后，加入1kg N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和3L异丙醇，反应过程中用10％氢氧化钠水溶液控制反应液为pH＝5.8，20℃搅拌8h，过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩甲苯得到1.2kg淡黄色液体；粗品加入5kg正己烷，在0～5℃搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品0.96kg，纯度99.8％，光学纯度99.9％，收率95％。
实施例6公斤级(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的合成
向10L带夹套的玻璃反应釜中加入8L事先配好的pH＝7的100mmol/L的磷酸盐缓冲液、0.25kg酮还原酶酶粉、0.4kg葡萄糖脱氢酶酶粉、0.4kg葡萄糖和0.04g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，搅拌均匀后，加入1.8kg N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮，反应过程中用10％氢氧化钠水溶液控制反应液为pH＝5.8，40℃搅拌6h，过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩甲苯得到2kg淡黄色液体；粗品加入10kg正己烷，在0～5℃搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品1.71kg，纯度99.6％，光学纯度99.9％，收率94％。
实施例7公斤级(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的合成
向10L带夹套的玻璃反应釜中加入8L事先配好的pH＝7的100mmol/L的磷酸盐缓冲液、0.8kg含有酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的固定化全细胞、0.4kg葡萄糖和0.06g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，搅拌均匀后，加入2kg N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮，反应过程中用10％氢氧化钠水溶液控制反应液为pH＝6，40℃搅拌6h，过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩甲苯得到2kg淡黄色液体；粗品加入10kg正己烷，在0～5℃搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品1.92kg，纯度99.7％，光学纯度99.9％，收率95％。
Figure BDA0001144419110000051
Figure BDA0001144419110000061
Figure BDA0001144419110000071
。
SEQUENCE LISTING
<110> 尚科生物医药（上海）有限公司
<120> (S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的酶催化制备方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggctggca tgagttttct gccttctcct tttgttctga ttacaggtgc cagtagtggc 60
atcggtgcag caactgccca cgcttttgcc caagcgggtt ggtccttgct gctgttaggg 120
cgcgatcgcg gtcgcctgca atcggttgct gagtctgccc gttctcaggg tgcagcggcg 180
gtggcaacct acagtcttga tttgaccaac ctgaccgcta ttggacccgc gatcgcccag 240
ctcgtcgagc agtttggggt tcccgacgtt ctgattaaca acgcagggac tgcccaaacg 300
gggccgctgg cgaccctgtc cttatcggac ctggagtgca tctttgcgct gaatgttcac 360
agtccgctat tagtcgtgca agccctgctt ccgggaatgc gccagcgtca gcgcggcttg 420
attctcaatg tggcttccat cgccgcccaa caagccttcc ccgactgggg tgcttactgt 480
gccagtaagt cggccttggc tgcctggtcg cgggtgctgg ctgcagaaga gcgatcgcac 540
ggcatccggg tctcgctaat ctgccctggc tctgttgata cggcgctctg ggaccaaccc 600
agcgtgggcg ctaacttcga tcgccaggcc atgttgcggc ccgaaacagt tgcccaagtg 660
ctgctgcagg tggcgacctt gccggagacg gcagtggtgg atgagctgac cctcatgccc 720
aatgcgggca cgttttag 738
<210> 2
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Gly Met Ser Phe Leu Pro Ser Pro Phe Val Leu Ile Thr Gly
1 5 10 15
Ala Ser Ser Gly Ile Gly Ala Ala Thr Ala His Ala Phe Ala Gln Ala
20 25 30
Gly Trp Ser Leu Leu Leu Leu Gly Arg Asp Arg Gly Arg Leu Gln Ser
35 40 45
Val Ala Glu Ser Ala Arg Ser Gln Gly Ala Ala Ala Val Ala Thr Tyr
50 55 60
Ser Leu Asp Leu Thr Asn Leu Thr Ala Ile Gly Pro Ala Ile Ala Gln
65 70 75 80
Leu Val Glu Gln Phe Gly Val Pro Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gly
85 90 95
Thr Ala Gln Thr Gly Pro Leu Ala Thr Leu Ser Leu Ser Asp Leu Glu
100 105 110
Cys Ile Phe Ala Leu Asn Val His Ser Pro Leu Leu Val Val Gln Ala
115 120 125
Leu Leu Pro Gly Met Arg Gln Arg Gln Arg Gly Leu Ile Leu Asn Val
130 135 140
Ala Ser Ile Ala Ala Gln Gln Ala Phe Pro Asp Trp Gly Ala Tyr Cys
145 150 155 160
Ala Ser Lys Ser Ala Leu Ala Ala Trp Ser Arg Val Leu Ala Ala Glu
165 170 175
Glu Arg Ser His Gly Ile Arg Val Ser Leu Ile Cys Pro Gly Ser Val
180 185 190
Asp Thr Ala Leu Trp Asp Gln Pro Ser Val Gly Ala Asn Phe Asp Arg
195 200 205
Gln Ala Met Leu Arg Pro Glu Thr Val Ala Gln Val Leu Leu Gln Val
210 215 220
Ala Thr Leu Pro Glu Thr Ala Val Val Asp Glu Leu Thr Leu Met Pro
225 230 235 240
Asn Ala Gly Thr Phe
245

Claims (8)

1.(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的酶催化制备方法，其特征在于：以氨基酸序列为SIQ ID NO.2的酮还原酶为催化剂，催化N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮进行还原反应得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述还原反应在辅酶和辅酶再生体系中进行。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述辅酶为NAD或NADP，所述辅酶浓度为0.001～1g/L。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述辅酶再生体系为葡萄糖脱氢酶/葡萄糖体系或者氨基酸序列为SIQ ID NO.2的酮还原酶/异丙醇体系。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述还原反应在缓冲溶液中进行，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酮还原酶浓度为5～100g/L、所述N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮浓度为10～250g/L。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应在pH＝5～8、温度为20～45℃下进行。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酮还原酶以酶粉、表达酮还原酶的细胞、表达酮还原酶的细胞破碎液、固定化酶、固定化细胞任一形式存在。
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