CN106701840B

CN106701840B - (1r,2s)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺d-扁桃酸盐（ⅰ）的生物制备方法

Info

Publication number: CN106701840B
Application number: CN201611008108.0A
Authority: CN
Inventors: 张福利; 倪国伟; 陈少欣; 鞠佃文; 汤佳伟; 谭支敏; 邹杰; 郭翔; 王政文
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2016-11-16
Publication date: 2020-03-20
Anticipated expiration: 2036-11-16
Also published as: CN106701840A; WO2018090929A1

Abstract

本发明提供了一种(1R,2S)‑2‑(3,4‑二氟苯基)环丙胺D‑扁桃酸盐(Ⅰ)的生物制备方法。具体地，本发明方法包括以下步骤：(a)在液态反应体系中，以式Ⅵ化合物为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，从而形成式Ⅴ化合物；(b)式Ⅴ化合物与膦酰基乙酸三乙酯反应得式Ⅳ化合物；(c)式Ⅳ化合物经氨解、霍夫曼降解后与D‑扁桃酸成盐制得式Ⅰ化合物。本发明还提供了一种反应体系，包括：(i)水性溶剂；(ii)底物，所述底物为式VI化合物；(iii)辅酶；(iv)羰基还原酶；(v)共底物；和(vi)用于辅酶再生的酶。

Description

(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐（Ⅰ）的生物制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐的制备方法。

背景技术

替卡格雷(ticagrelor)，化学名[1S-[1α,2α,3β(1S,2R),5β]]-3-[7 -[2-(3,4-二氟苯基)-环丙胺基]-5-(丙硫基)-3H-1,2,3-三唑并[4,5-d]嘧啶- 3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇，是由阿斯利康公司(AstraZeneca A B)研发的一种口服抗血小板药物。该药能可逆地作用于ADP P2Y12受体，对ADP引起的血小板聚集有明显的抑制作用，且口服起效迅速，临床用于降低急性冠状动脉综合征患者的血栓性心血管事件发生率。

替卡格雷的结构式如下：

(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(Ⅱ)是合成替卡格雷的关键中间体，因其是油状物，不利于保存及质控，故通常将其成D-扁桃酸盐制得(1R,2S)-2 -(3,4-二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐(Ⅰ)。

专利WO 2008018822公开了一种制备化合物(Ⅱ)的如下方法：

以邻二氟苯为起始原料，与氯乙酰氯发生傅-克酰化反应得化合物(Ⅵ)，化合物(Ⅵ)在S-2-甲氧基-CBS-噁唑硼烷(须由三甲氧基硼烷和S-二苯基脯氨醇原位制备)催化下与硼烷-二甲硫醚络合物进行CBS不对称还原得化合物 (Ⅴ)，化合物(Ⅴ)与膦酰基乙酸三乙酯经环丙烷化反应得化合物(Ⅳ)，化合物(Ⅳ)经氨解、霍夫曼降解制得替卡格雷关键中间体(1R,2S)-2-(3,4- 二氟苯基)环丙胺(Ⅱ)。

该方法中CBS还原反应的催化剂S-2-甲氧基-CBS-噁唑硼烷性质不稳定，未商品化，必须由三甲氧基硼烷和S-二苯基脯氨醇原位制备，增加了操作工序，不利于工业化生产；而还原剂硼烷-二甲硫醚络合物则在后处理时放出恶臭的二甲硫醚气体，不利于生产的劳动保护。参照该方法操作，用原位制备的S-2 -甲氧基-CBS-噁唑硼烷和硼烷-二甲硫醚络合物还原化合物(Ⅵ)，于40℃反应1h制得化合物(Ⅴ)，其ee值仅为76％。参照该法制得的(1R,2S)-2-(3, 4-二氟苯基)环丙胺(Ⅱ)的ee值为81％。

在发明人申请专利CN201410139006中，对该工艺CBS还原反应进行了优化，改进后为S-2-甲基-CBS-噁唑硼烷和硼烷-四氢呋喃络合物还原化合物(Ⅵ) 得化合物(Ⅴ)，将ee值由76％提高至98-99％。由于该反应对反应条件的控制较为严苛，在放大实验中发现产物ee值较难达到99％，稳定在96-97％，反应后淬灭反应时，体系出现剧烈放热，存在明显的安全隐患。

上述方法是在手性配体催化下，经硼烷还原羰基制得手性醇化合物(Ⅴ)，该法存在以下不足：配体成本较高，对氧气，水敏感，因此工艺操作条件严苛，如氮气保护，无水无氧；溶剂体系复杂甲苯，四氢呋喃混合体系等。相较化学法，生物催化法更加绿色，环保，经济。生物催化理论中将能够实现立体选择性还原羰基为手性羟基的酶称为羰基还原酶。由于酶具有高的立体选择性，底物特异性特点，对于本申请中提及的特定底物化合物(Ⅵ)，能立体选择性的将其还原的羰基还原酶，文献报道较少,仅在CN201610051136.4中，吴中柳等人报道ChKRED20羰基还原酶，可立体选择性还原本发明所述底物。Applied andEnvironmental Microbiology 2013,79(4),p1378-1384中报道来源于Microbacteriumluteolum JCM 9174羰基还原酶QNR对于奎宁环酮表现良好活性，但对于类似底物脂肪环酮则表现出较低的催化活性，因此仍未有相关文献报道将其用于芳香酮底物的还原，包括对于本发明中涉及的底物式(Ⅵ)化合物。

发明内容

针对现有制备方法存在的上述问题，本发明目的是提供了一种(1R,2S)-2- (3,4-二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐生物催化的制备方法。

本发明的第一方面提供了一种式Ⅴ化合物的制备方法，包括步骤：

(a)在液态反应体系中，以式Ⅵ化合物为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，从而形成式Ⅴ化合物；

和

(b)任选地从所述上一步骤的反应后的反应体系中分离出式Ⅴ化合物。

在另一优选例中，所述反应体系中，所述式Ⅵ化合物的浓度为50～1000g/L。

在另一优选例中，所述反应体系中，所述式Ⅵ化合物的浓度为60～700g/L。

在另一优选例中，所述反应体系中，所述式Ⅵ化合物的浓度为80～600g/L。

在另一优选例中，所述反应体系中，所述式Ⅵ化合物的浓度为20～500g/L。

在另一优选例中，所述反应体系中，所述式Ⅵ化合物的浓度为50～200g/L。

在另一优选例中，所述反应体系中，所述式Ⅵ化合物的浓度为100～150g/L。

在另一优选例中，所述的反应体系中，还存在共底物。

在另一优选例中，所述的共底物选自下组：异丙醇、葡萄糖、甲酸铵、或其组合。

在另一优选例中，所述的反应体系中，共底物的浓度为5-30％。

在另一优选例中，所述的反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶。

在另一优选例中，所述的用于辅酶再生的酶选自下组：醇脱氢酶，甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、或其组合。

在另一优选例中，步骤(a)中，温度为10℃-50℃，较佳地20℃-40℃，更佳地25℃-35℃。

在另一优选例中，步骤(a)中，时间为0.1-240小时，较佳地0.5-120小时，更佳地1-72小时，又更佳地3-10小时。

在另一优选例中，步骤(a)中，pH为6-9，较佳地6.5-8.5，更佳地7.0-7.5。

在另一优选例中，所述的反应体系中，羰基还原酶为游离形式的酶、固定化酶、或菌体形式的酶。

在另一优选例中，所述的反应体系为磷酸缓冲盐体系。

在另一优选例中，所述的反应体系还含有助溶剂。

在另一优选例中，所述的助溶剂选自下组：二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，甲苯、丙酮、或其组合。

在另一优选例中，所述助溶剂的浓度为5～30％。

在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的分离包括：加入异丙醇，离心菌体，部分浓缩，甲叔醚萃取，浓缩有机层。

在另一优选例中，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式Ⅴ化合物的ee 值≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％。

在另一优选例中，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥80％(较佳地≥85％，更佳地≥90％)式Ⅵ化合物被转化为式Ⅴ化合物。

在另一优选例中，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式Ⅴ化合物的浓度50～1000g/L。

在另一优选例中，所述羰基还原酶选自下组：

(i)来源于M.luteolum JCM 9174的羰基还原酶QNR，其氨基酸序列如SE Q IDNO.2所示；

(ii)对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的羰基还原酶QNR的编码基因序列选自下组：

(a)SEQ ID NO.1所示的序列(NCBI的登录号为AB733448)；

(b)与(a)限定的序列互补的多核苷酸；或

(c)与(a)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。

在另一优选例中，所述羰基还原酶基因构建在表达载体上。

在另一优选例中，所述的辅酶选自：还原性辅酶、氧化性辅酶，或其组合。

在另一优选例中，所述还原性辅酶选自NADH、NADPH、或其组合。

在另一优选例中，所述氧化性辅酶选自NAD、NADP、或其组合。

在另一优选例中，所述NAD用量与底物用量比率为0.01％～1.0％(w/w)、较佳地0.01％～0.5％(w/w)。

在另一优选例中，所述用于辅酶再生的酶为醇脱氢酶，其基因选自：

(d)SEQ ID NO.3所示的序列(NCBI的登录号为AB213459)；

(e)与(d)限定的序列互补的多核苷酸；或

(f)与(d)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。

在另一优选例中，所述用于辅酶再生的酶的基因构建在表达载体上。

本发明第二方面提供了一种反应体系，所述反应体系包括：

(i)水性溶剂；

(i i)底物，所述底物为式VI化合物；

(iii)辅酶；

(iv)羰基还原酶；

(v)共底物；和

(vi)用于辅酶再生的酶。

在另一优选例中，在所述的反应体系中，式VI化合物浓度为50～1000g/L。

本发明第三方面提供了一种制备式Ⅴ化合物的方法，包括步骤：使用本发明第二方面所述的反应体系，在适合酶催化的条件下，进行酶促反应，从而制得式Ⅴ化合物：

本发明第四方面提供了一种式Ⅰ化合物扁桃酸盐的制备方法，通过本发明第一方面所述的方法所制得式Ⅴ化合物进行如下的反应步骤制得。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了式V化合物的消旋体的手性图谱。

图2显示了羰基还原酶催化所得式V化合物与消旋体的比较。

图3显示了羰基还原酶催化所得式V化合物的ee值。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现一种(1R,2S)-2-(3,4- 二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐(I)生物催化的制备方法。具体地，本发明将现有(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐(I)制备方法中的关键的羰基还原反应改进为羰基还原酶催化还原，即在羰基还原酶和辅酶的存在下，将式Ⅵ化合物立体选择性的还原为式Ⅴ化合物(即使在高浓度的底物，如50～ 1000g/L条件下，也能够非常高效地制备获得具有立体构象的式Ⅴ化合物)。然后以式Ⅴ化合物为底物，进行后续反应。本发明仅需萃取操作，操作简单，成本低廉，绿色环保，更适合工业化生产具有高化学纯度和高光学纯度式Ⅴ化合物，然后进一步进行后续反应，生产替卡格雷的关键中间体(1R,2S)-2-(3,4- 二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐(Ⅰ)，以用于替卡格雷等药品的制备。在此基础上完成了本发明。

在一具体优选例中，本发明人利用来源于Microbacterium luteolum JCM 9174羰基还原酶作为代表性的羰基还原酶时，通过在反应体系中偶联辅酶再生，从而显著提高了反应体系对有机溶剂、底物的耐受性，这样可以大幅提高了底物浓度，也能够非常高效地制备获得具有立体构象的式Ⅴ化合物(ee值≥ 98％、99％、或更高)，从而极大地提高生产效率，降低生产成本。此外，本发明方法大幅简化了后续处理，而且与化学合成法相比，显著减少或消除了各类污染性化学品的使用，从而显著降低了环境污染风险。

术语

羰基还原酶

本发明中，“羰基还原酶”是能够立体选择性催化潜手性酮不对称还原得到手性醇的酶。

在本发明中，所述的羰基还原酶可以是野生型的或突变型的。此外，可以分离的，也可以是重组的。

可用于本发明的羰基还原酶可以来自不同物种。例如，来自微杆菌属，更佳地来自Microbacterium luteolum的羰基还原酶。此外，与上述羰基还原酶有类似活性或同源性(如≥80％，较佳地≥90％，更佳地较佳地≥95％)的酶(包括来自其他物种的酶)也在本发明范围之内。

在本发明中，一种代表性的羰基还原酶为微杆菌属luteolum JCM 9174(Microbacterium luteolum JCM 9174)的羰基还原酶。

一种典型的羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.:2所示，其编码基因如SEQ IDNo.:1所示。

由于密码子的简并性，编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID NO.1。本领域技术人员可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来获得该碱基序列的同系物，本发明涵盖这些同系物，只要其表达的重组酶保持对式Ⅵ化合物的催化还原活性即可。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ ID NO.1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

本发明的羰基还原酶还包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。

根据本领域的一般常识，反应体系中可以使用上述羰基还原酶构建的重组酶静息细胞、湿菌体、粗酶液、纯酶或者粗酶粉等。为获得较高的转化效率，优选使用粗酶液。羰基还原酶用量与底物用量比率优选为1％～6％(w/w)，或者静息细胞质量与底物质量比率为10-100％。

辅酶

本发明中，“辅酶”是指能够实现氧化还原反应中电子传递的辅酶。

典型地，本发明的辅酶为还原性辅酶NADH、NADPH或氧化性辅酶NAD⁺、NADP⁺。由于还原性辅酶的价格成本昂贵，优选选择氧化性辅酶NAD⁺、NADP⁺。

当选择氧化性辅酶时，需要选择实现辅酶再生的方法，主要包括三种(1) 葡萄糖脱氢酶与共底物葡萄糖；(2)醇脱氢酶与共底物异丙醇；(3)甲酸脱氢酶与共底物甲酸铵。

在一个优选实施例中，辅酶为NAD⁺，辅酶再生体系为醇脱氢酶，本发明优选醇脱氢酶与共底物异丙醇，醇脱氢酶的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示(N CBI的登录号为AB213459)。

氧化性辅酶NAD⁺用量与底物用量比率为0.01％～0.5％(w/w)，异丙醇的用量为缓冲液体积的5％-30％(v/v)。缓冲体系为0.1mol/L磷酸缓冲盐。缓冲液的pH为7.0-7.3。

助溶剂

本发明中，可以在反应体系中添加或不添加助溶剂。

如本文所用，术语“助溶剂”是指难溶性物质与加入的第三种物质在溶剂中形成可溶性分子间的络合物、缔合物或复盐等，以增加难溶性物质在溶剂中的溶解度。这种第三种物质称为助溶剂。

本发明中，底物化合物(Ⅵ)难溶于水，当底物浓度增大时，严重影响反应转化率。因此，需通过加入助溶剂提高底物溶解性，以改善反应转化情况。可选的助溶剂为二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，甲苯、丙酮，浓度优选为5-30％(v/v)，优选为二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇。

生物制备方法

本发明提供了一种式Ⅴ化合物的制备方法，包括步骤：

和

在本发明中，上述的反应可以偶联或不偶联辅酶再生体系。

优选地，上述反应是在同一体系中偶联辅酶再生系统，从而进一步提高生产效率，降低生产成本并提高对底物的耐受性。

反应体系

本发明还提供了一种用于本发明所述生物制备方法的反应体系。

一种典型的一种反应体系，包括：

(i)水性溶剂；

(ii)底物，所述底物为式VI化合物；

(iii)辅酶；

(iv)羰基还原酶；

(v)共底物；和

(vi)用于辅酶再生的酶。

在本发明的优选反应体系中，还偶联有辅酶再生系统，从而进一步提高生产效率，降低生产成本并提高对底物的耐受性。

此外，在本发明第一方面中所述的各类优选特征或其组合，同样适用于本发明所述的反应体系。

本发明还提供了所述本发明反应体系的应用，即用于制备式Ⅴ化合物，它包括步骤：使用所述的反应体系中，在适合酶催化的条件下，进行酶促反应，从而制得式Ⅴ化合物：

由于本发明的反应体系和方法减少了或消除了各类污染性化学品的使用，也不必使用昂贵的立体结构分拆试剂，因此不仅显著降低了环境污染风险，而且成本低廉。

本发明的主要优点在于：

(1)利用来源于羰基还原酶(如Microbacterium luteolum JCM 9174的羰基还原酶)的新型催化反应体系，通过生物催化还原高效进行生产。

(2)本发明适合工业化生产具有高化学纯度和高光学纯度的式Ⅴ化合物，然后进一步进行后续反应，生产替卡格雷的关键中间体(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基) 环丙胺D-扁桃酸盐(Ⅰ)。

(3)本发明方法和反应体系有高立体选择性、高催化活性、以及对有机溶剂的高耐受性、对底物的耐受性，从而可以在极高的底物浓度下，进行大规模生产。

(4)本发明极大地提高生产效率，降低生产成本。

(5)本发明方法大幅简化了后续处理。后处理仅需萃取操作，操作简单，。

(6)绿色环保。与化学合成法相比，本发明显著减少或消除了各类污染性化学品的使用，从而显著降低了环境污染风险。

本发明与现有技术比较具有显著的技术效果，主要体现如下：

1.制备式化合物(Ⅰ)的成本主要在还原步骤，对于关键还原步骤，酶催化成本较CBS还原体系具有明显优势：

表一制备1kg式(Ⅴ)化合物的成本为例

注：两种催化方法中，反应的转化率近定量，因此底物成本等同。

由上表知羰基还原酶催化体系较CBS催化体系成本显著高于生物催化体系。

表二关键还原步骤反应条件的比较

由上表比较知，羰基还原酶催化体系较CBS还原催化体系操作上得到了极大的简化，降低操作安全风险，减少人力成本，更加环保，更适于生产应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。

材料

化合物(Ⅵ)，消旋体外购自上海翰鸿化工有限公司，基因全合成由上海百利格完成。

来源于Microbacterium luteolumJCM 9174的羰基还原酶(QNR)，通过商业化的全基因合成得到编码基因，然后将编码基因构建入表达载体，导入宿主菌，诱导表达得到。

方法

1.酶的制备方法

通过本领域常规技术，将上述实现辅酶再生的醇脱氢酶与目的基因构建在同一质粒pET28a(+)载体上，然后导入表达宿主大肠杆菌，通过诱导表达，获得含有目的双酶的菌体。可直接使用离心获得菌体，也可将其破壁获得粗酶液，粗酶粉用于后续的生物转化反应。

2.生物催化还原化合物(Ⅵ)制备化合物(Ⅴ)的方法

本发明提供了一种羰基还原酶催化还原化合物(Ⅵ)制备化合物(Ⅴ)的方法。反应式如下：

其中所述的生物催化体系包括有羰基还原酶，辅酶。本发明中所述的羰基还原酶编码基因序列为SEQ ID NO.1，来源于M.luteolumJCM 9174(QNR)，羰基还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。根据本领域一般常识，上述羰基还原酶基因可通过商业化的全基因合成得到。

根据上述优选体系，所述制备方法的实施过程如下：将底物充分溶解在助溶剂，如二甲基亚砜或异丙醇，然后加入到磷酸缓冲液中，搅拌均匀后，加入菌体、粗酶液、粗酶粉或纯酶，加入辅酶NAD⁺，共底物异丙醇，维持在20℃～ 40℃，TLC或HPLC监控，至原料剩余<2％，终止反应。向反应液中加入异丙醇，离心或过陶瓷膜，除去菌体，取上清液，上清液用有机溶剂萃取，有机溶剂可选为甲基叔丁基醚、甲苯、乙酸乙酯、乙酸异丙脂、二氯甲烷，2-甲基四氢呋喃、正丁醇。萃取水层2-3次，合并有机相；用饱和食盐水洗涤2～3 次，浓缩后得到浅黄色油状物。

体系中底物化合物(Ⅵ)的终浓度为50-200g/L，优选为100-150g/L，满足工业要求(底物浓度>100g/L)。反应温度为20-40℃，转速为200rpm/min，反应时间约3-10h，根据底物浓度而有所变化或通过HPLC监控原料转化情况，当原料剩余<2％，终止反应。

3.(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐生物催化的制备方法

本发明还提供了一种(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐生物催化的制备方法。将上述通过生物催化法制得的化合物(Ⅴ)经过后续描述的反应如下：

在碱的作用下，上一步所得式(Ⅴ)化合物与膦酰基乙酸三乙酯在甲苯中于60～80℃反应，以获得式(Ⅳ)化合物，其中碱为氢化钠或叔丁醇钠。

在甲醇钠的作用下，式(Ⅳ)化合物与氨气在甲醇中于60～70℃反应，以获得式(Ⅲ)化合物。

式(Ⅲ)化合物在次氯酸钠和氢氧化钠的作用下经霍夫曼降解制得式(Ⅱ) 化合物，再与D-扁桃酸成盐制得式(Ⅰ)化合物。

4.2-氯-1-S-(3,4-二氟苯基)-乙醇的手性正相监测方法：

HPLC条件：Daicel IC-3(250×4.6mm，3μm)；流速0.8ml/min；流动相：正己烷:异丙醇＝99:1；紫外检测波长260nm；柱温25℃；样品溶于甲醇，浓度10mg/ml；进样体积2μl。

5.2-氯-1-S-(3,4-二氟苯基)-乙醇的反相监测方法：

HPLC条件：phenomenex Gemini 5u C18 110A，250×4.6mm,5μm；流速： 1ml/min；流动相梯度如下表；紫外检测波长：260nm；柱温：30℃；样品浓度：10mg/ml；进样体积10μl。S-39的保留时间为12.3min。

流动相梯度：

实施例1、羰基还原酶工程菌的构建

将QNR目的基因，醇脱氢酶基因委托商业化公司进行全基因合成，克隆入p ET28a(+)载体，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，平板培养，挑取阳性转化子单菌落并提取质粒测序确定后，提取重组质粒，导入BL21(DE3)菌株中，LB培养，获得可以诱导表达重组羰基还原酶与醇脱氢酶的基因工程菌。

实施例2、重组羰基还原酶，醇脱氢酶的制备

将上一步保存于甘油中的基因工程菌，接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm，培养13h，得到种子培养基，将种子培养液按1.5％的比例接种到含50ug/ml卡那霉素抗性的液体培养基上，然后37℃，220rmp培养至O D₆₀₀值>2.0，加入终浓度为1.0％乳糖，降温至25℃，继续培养3h，加入终浓度为0.5％的乳糖，培养20h，放罐，离心得菌体，为生物转化做准备。

发酵配方如下：

原材料	质量含量(％)
		酵母提取物	2.4
大豆蛋白胨	1.2
		氯化钠	0.3
甘油	0.5
		磷酸氢二钾	0.2
七水硫酸镁	0.05

实施例3、2-氯-1-S-(3,4-二氟苯基)-乙醇(化合物Ⅴ)的生物催化制备

取化合物VI(20g)，溶解于异丙醇(120ml)中，加入0.1M的磷酸盐缓冲液(400ml)，加入NAD⁺(0.2g)，加入上述发酵所得菌体(10g)，25℃， 220rpm，摇床反应，HPLC监控反应转化率>98％时，终止反应。

加入异丙醇(100ml)，离心，取上清液，部分浓缩异丙醇，甲叔醚(400 ml)萃取，有机溶剂(100ml×2)萃取水层，合并有机层，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得浅黄色油状物18.8g，收率93.0％，ee值100％。

对比实施例：QNR还原结构类似物

取化合物(Ⅵ)(1g)，溶解于异丙醇(12ml)中，加入0.1M的磷酸盐缓冲液(40ml)，加入NAD⁺(0.1g)，加入上述发酵所得菌体(0.5g)，25℃， 220rpm，摇床反应，反应24h,HPLC监控反应转化率50％，终止反应。

实施例4、(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐(化合物Ⅰ)的制备

参见发明人申请专利CN201410139006中所述制备方法

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海医药工业研究院

中国医药工业研究总院

<120> (1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐（Ⅰ）的生物制备方法

<130> P2016-1654

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 787

<212> DNA

<213> Microbacterium luteolum JCM 9174

<400> 1

atgcggctgg agaataagaa ggccatcgtc accggcggcg ccggcggcat cggccgcgcc 60

acgtcgatcg cgctcgccgc ggagggcgct gcggtcgccg tcgtcgacct gaacgtcgaa 120

gccgccgagg ccgtcgcggc cgagatccgc gaggcgggcg gcacggccgt cgcgatctcc 180

gccgacgtct ccagcgagcc cgacatcgag cgggtcatcg cgaccgccgt ggccgagttc 240

ggcggtgtgg acgtcgtctt caacaatgcg ggcatcatcc gccgcacgac cgccgtcgag 300

acgaccgtcg aggagtggga ccgcgtcttc ggcgtgaacg tgcgctcgat cttcctcatg 360

tgcaagcaca tcgtgccgat catggaggcc gcgggcggcg gctcgatcat caacaccgga 420

tccggctggg ggctcaaggg cggcggccag gccatctcgt actgcgcctc gaagggcgcc 480

gtggtgaaca tgacccgtgc gctggcgatc gaccacgggc cggccggcat ccgcgtcaac 540

tcggtcaatc cgggcgacgt caacaccggg atgctgcgcg aagaggcccg tcagctggcg 600

caggacacga acgcgttcct cgccgaggcc gccgaccgtc cgctgcgtcg gatgggcgag 660

ccgcacgagg tcgcgcaggc cgtggtctgg ctcgcgagcg acgactcgtc ctacgtcacg 720

ggctcggcgc tcgtggtcga cggcggcggg atcgcgtagc gccggaggtc gcgcgtccgc 780

cggtgtc 787

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> Microbacterium luteolum JCM 9174

<400> 2

Met Arg Leu Glu Asn Lys Lys Ala Ile Val Thr Gly Gly Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ile Gly Arg Ala Thr Ser Ile Ala Leu Ala Ala Glu Gly Ala Ala Val

20 25 30

Ala Val Val Asp Leu Asn Val Glu Ala Ala Glu Ala Val Ala Ala Glu

35 40 45

Ile Arg Glu Ala Gly Gly Thr Ala Val Ala Ile Ser Ala Asp Val Ser

50 55 60

Ser Glu Pro Asp Ile Glu Arg Val Ile Ala Thr Ala Val Ala Glu Phe

65 70 75 80

Gly Gly Val Asp Val Val Phe Asn Asn Ala Gly Ile Ile Arg Arg Thr

85 90 95

Thr Ala Val Glu Thr Thr Val Glu Glu Trp Asp Arg Val Phe Gly Val

100 105 110

Asn Val Arg Ser Ile Phe Leu Met Cys Lys His Ile Val Pro Ile Met

115 120 125

Glu Ala Ala Gly Gly Gly Ser Ile Ile Asn Thr Gly Ser Gly Trp Gly

130 135 140

Leu Lys Gly Gly Gly Gln Ala Ile Ser Tyr Cys Ala Ser Lys Gly Ala

145 150 155 160

Val Val Asn Met Thr Arg Ala Leu Ala Ile Asp His Gly Pro Ala Gly

165 170 175

Ile Arg Val Asn Ser Val Asn Pro Gly Asp Val Asn Thr Gly Met Leu

180 185 190

Arg Glu Glu Ala Arg Gln Leu Ala Gln Asp Thr Asn Ala Phe Leu Ala

195 200 205

Glu Ala Ala Asp Arg Pro Leu Arg Arg Met Gly Glu Pro His Glu Val

210 215 220

Ala Gln Ala Val Val Trp Leu Ala Ser Asp Asp Ser Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ser Ala Leu Val Val Asp Gly Gly Gly Ile Ala

245 250

<210> 3

<211> 859

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggagttatc cgacaggtgt cggataactg aagggagatt ttcatggctc agtacgacgt 60

cgccgaccgg tccgcgatcg tgaccggagg cggctcgggc atcgggcgcg ccgtggcgct 120

cactctcgcg gcgagcggcg cagccgtcct cgtcaccgac ctgaacgagg agcacgcgca 180

ggccgtcgtg gccgagatcg aggccgcggg cggtaaggcc gccgcgctcg cgggcgacgt 240

gaccgacccc gcgttcggcg aggcgagcgt cgccggggcg aacgctctcg cgcccctcaa 300

gatcgcggtc aacaacgcgg gcatcggcgg cgaggccgcc acggtcggcg actactcgct 360

cgacagctgg cgcacggtga tcgaggtcaa cctcaacgcc gtgttctacg ggatgcagcc 420

gcagctgaag gccatggccg ccaacggcgg cggtgcgatc gtcaacatgg cgtccatcct 480

gggaagcgtc ggcttcgcca actcgtcggc ctacgtcacg gccaagcacg cgctgctcgg 540

tctcacccag aacgccgcgc tcgagtacgc cgccgacaag gtgcgcgtcg tcgcggtcgg 600

ccccggcttc atccgcaccc cgctcgtgga ggccaacctc tccgccgacg cgctggcgtt 660

cctcgagggc aagcacgccc tcggccgcct gggcgagccg gaagaggtcg cctcgctggt 720

cgcgttcctc gcctccgacg ccgcgagctt catcaccggc agctaccacc tggtggacgg 780

cggctacacc gcccagtgac cgggcgacag cccgtatcgt gcacggtcgc gctcccttag 840

gctgaggagc gtgaccccg 859

Claims

1.一种式Ⅴ化合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：

和

(b)任选地从所述上一步骤的反应后的反应体系中分离出式Ⅴ化合物；

所述羰基还原酶为来源于M.luteolum JCM 9174的羰基还原酶QNR，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶；所述用于辅酶再生的酶为醇脱氢酶，其基因选自：

(d)SEQ ID NO.3所示的序列。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系中，羰基还原酶为游离形式的酶、固定化酶、或菌体形式的酶。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的羰基还原酶QNR的编码基因序列选自下组：

(a)SEQ ID NO.1所示的序列。

4.根据权利要求1-3中任一所述的制备方法，其特征在于，所述的辅酶选自：还原性辅酶、氧化性辅酶，或其组合。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述氧化性辅酶选自NAD、NADP、或其组合。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述NAD用量与底物用量比率为0.01％～1.0％(w/w)。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述NAD用量与底物用量比率为0.01％～0.5％(w/w)。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系中，还存在共底物。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系中，共底物的浓度为5-30％。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的共底物选自下组：异丙醇、葡萄糖、甲酸铵、或其组合。

11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系还含有助溶剂。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的助溶剂选自下组：二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，甲苯、丙酮、或其组合。

13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述助溶剂的浓度为5～30％。

14.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系为磷酸缓冲盐体系。

15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应体系中，所述式Ⅵ化合物的浓度为50～200g/L。

16.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式Ⅴ化合物的ee值≥90％。

17.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式Ⅴ化合物的ee值≥95％。

18.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式Ⅴ化合物的ee值≥99％。

19.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥80％式Ⅵ化合物被转化为式Ⅴ化合物。

20.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥85％式Ⅵ化合物被转化为式Ⅴ化合物。

21.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥90％式Ⅵ化合物被转化为式Ⅴ化合物。

22.一种反应体系，其特征在于，所述反应体系包括：

(i)水性溶剂；

(ii)底物，所述底物为式VI化合物；

(iii)辅酶；

(iv)羰基还原酶；所述羰基还原酶为来源于M.luteolum JCM 9174的羰基还原酶QNR，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(v)共底物；和

(vi)用于辅酶再生的酶。

23.根据权利要求22所述的反应体系，其特征在于，在所述的反应体系中，式VI化合物浓度为50～1000g/L。

24.一种制备式Ⅴ化合物的方法，其特征在于，包括步骤：使用如权利要求22所述的反应体系，在适合酶催化的条件下，进行酶促反应，从而制得式Ⅴ化合物：