CN111073912B - (s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的生物制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种(S)‑2‑氯‑1‑(2,4‑二氯苯基)乙醇(I)的生物制备方法，该制备方法以2‑氯‑1‑(2,4‑二氯苯基)乙酮为原料，在羰基还原酶，辅酶的催化下，进行不对称还原反应制得化合物(I)。该制备方法能够显著的降低生产成本，简化操作，具备经济，绿色环保，易于实现产业化生产的特点。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的制备方法。
背景技术
卢立康唑(Luliconazole)，化学名为4-(2,4-二氯苯基)-1,3-二硫戊环-2-亚基-1-咪唑基乙腈(4-(2,4-Dichlorophenyl)-1,3-dithiolan-2-ylidene-1-imidazolylacetonitrile)，是由日本农药株式会社开发的咪唑类抗真菌药物。2005年7月20日在日本上市，于2013年获准在中国上市，主要用于治疗皮肤真菌感染。
卢立康唑的结构式如下：
(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇是合成卢立康唑的关键中间体，可通过生物催化法和化学合成法制备。化学法合成往往存在ee值不够高，催化剂有毒、腐蚀性强或者价格昂贵等不足之处。
相较化学法，生物催化具有高选择性、且更加绿色，环保，经济。
然而，目前现有的技术中所提及的羰基还原酶存在底物浓度低，转化率低的缺点，例如专利CN 102876734 B报道来源于耐热克鲁维酵母的羰基还原酶在底物浓度为10mmol/L时，转化率仅为38％。Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic 56(2009)272–276中报道来源于Pyrococcus furiosus的羰基还原酶(PFADH)的底物转化率可达100％，但底物浓度也仅为12.5mmol/L，立体选择性仅为98％。专利CN 108285909 A利用来源于Candidamagnoliae的羰基还原酶的突变体催化合成卢立康唑中间体，收率为92％，ee值可达99％，但是底物浓度最高仅为50g/L，仍无法达到工业要求的百克级别的水平。此外Thiago deS.Fonseca等人利用脂肪酶拆分法合成卢立康唑中间体，虽ee值可达99％，但收率仅为43％，造成了底物的浪费，因此该方法也存在一定的缺陷。
因此，本领域迫切需要开发出一种高底物浓度、高转化率、高立体选择性的(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的生物制备方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高底物浓度、高转化率、高立体选择性的(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的生物制备方法。
在本发明的第一方面，提供了一种制备(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的方法，包括步骤：
(a)在液态反应体系中，以式II化合物为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，从而形成式I化合物，即(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇；
其中，所述反应体系中，式II化合物浓度为30-500g/L；和
(b)任选地从所述上一步骤的反应后的反应体系中分离出式I化合物。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式II化合物的浓度为30g/L以上、50g/L以上、70g/L以上、90g/L以上、100g/L以上、120g/L以上、120g/L以上、140g/L以上、160g/L以上、180g/L以上、200g/L以上、220g/L以上、240g/L以上、260g/L以上、280g/L以上、300g/L以上、320g/L以上、350g/L以上、400g/L以上，或450g/L以上。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式II化合物的浓度为100-400g/L，较佳地200-400g/L，更佳地300-400g/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式II化合物的浓度为50-350g/L，较佳地150-350g/L，更佳地250-350g/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，还存在共底物。
在另一优选例中，所述的共底物选自下组：异丙醇、葡萄糖、甲酸铵、或其组合。
在另一优选例中，所述的反应体系中，共底物的浓度为5％～50％。
在另一优选例中，所述的反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶。
在另一优选例中，所述的用于辅酶再生的酶选自下组：醇脱氢酶，甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、或其组合。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，温度为10℃-50℃，较佳地20℃-40℃，更佳地25℃-35℃。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，时间为0.1-240小时，较佳地0.5-120小时，更佳地1-72小时。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，pH为6-9，较佳地6.5-8.5，更佳地6.5-7.5。
在另一优选例中，所述的反应体系为发酵体系。
在另一优选例中，所述的反应体系中，羰基还原酶的存在形式选自下组：羰基还原酶为游离形式的酶、固定化酶、或菌体形式的酶。
在另一优选例中，所述的反应体系为水性体系。
在另一优选例中，所述的反应体系含有选自下组的溶剂：水、醇、或其组合。
在另一优选例中，所述的反应体系还含有助溶剂。
在另一优选例中，所述的助溶剂选自下组：二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，甲苯、丙酮、或其组合。
在另一优选例中，所述助溶剂的浓度为5-50％。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述的分离包括：加入异丙醇，离心菌体，部分浓缩，正庚烷萃取，浓缩有机层。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的ee值≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥80％(较佳地≥85％，更佳地≥90％，更佳地≥95％)式II化合物被转化为(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式I化合物的浓度为30-500g/L。
在另一优选例中，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Lactobacillus kefiri的羰基还原酶LKCR，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；
(ii)对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述羰基还原酶为氨基酸序列选自下组的酶：SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8。
在另一优选例中，所述羰基还原酶为氨基酸序列选自下组的酶：SEQ ID NO:5或6。
在另一优选例中，所述羰基还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
在另一优选例中，所述的羰基还原酶LKCR的编码基因序列选自下组：
(a)SEQ ID NO：13所示的序列；
(b)与(a)限定的序列互补的多核苷酸；或
(c)与(a)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
在另一优选例中，所述羰基还原酶基因构建在表达载体上。
在另一优选例中，所述的辅酶选自：还原性辅酶、氧化性辅酶，或其组合。
在另一优选例中，所述还原性辅酶选自NADH、NADPH、或其组合。
在另一优选例中，所述氧化性辅酶选自NAD、NADP、或其组合。
在另一优选例中，所述NAD用量与底物用量比率为0.1％～1.5％(w/w)；较佳地0.2％～0.9％(w/w)。
在另一优选例中，所述用于辅酶再生的酶为醇脱氢酶。
在另一优选例中，所述醇脱氢酶为异丙醇脱氢酶，其核酸序列选自：
(d)SEQ ID NO：14所示的序列；
(e)与(d)限定的序列互补的多核苷酸；或
(f)与(d)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
在另一优选例中，所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:15。
在本发明的第二方面，提供了一种反应体系，所述反应体系包括：
(i)水性溶剂；
(ii)底物，所述底物为式II化合物；
(iii)辅酶；
(iv)羰基还原酶；
(v)共底物；和
(vi)用于辅酶再生的酶。
在另一优选例中，在所述的反应体系中，式Ⅱ化合物浓度为30～500g/L。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的ee值≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥80％(较佳地≥85％，更佳地≥90％，更佳地≥95％)式II化合物被转化为(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇。
在另一优选例中，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Lactobacillus kefiri的羰基还原酶LKCR，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；
(ii)对SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述羰基还原酶为氨基酸序列选自下组的酶：SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8。
在另一优选例中，所述羰基还原酶为氨基酸序列选自下组的酶：SEQ ID NO:5或6。
在另一优选例中，所述羰基还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
在另一优选例中，所述的羰基还原酶LKCR的编码基因序列选自下组：
(a)SEQ ID NO：13所示的序列；
(b)与(a)限定的序列互补的多核苷酸；或
(c)与(a)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
在另一优选例中，所述的反应体系中，羰基还原酶的存在形式选自下组：羰基还原酶为游离形式的酶、固定化酶、或菌体形式的酶。
在另一优选例中，所述羰基还原酶基因构建在表达载体上。
在本发明的第三方面，提供了一种制备(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的方法，包括步骤：使用如本发明第二方面所述的反应体系，在适合酶催化的条件下，进行酶促反应，从而制得(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇，即式I化合物：
在另一优选例中，在所述的反应体系中，式Ⅱ化合物浓度为30～500g/L。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的ee值≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥80％(较佳地≥85％，更佳地≥90％，更佳地≥95％)式II化合物被转化为(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇。
在本发明的第四方面，提供了一种羰基还原酶，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Lactobacillus kefiri的羰基还原酶LKCR，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2、3、4、5、6、7或8所示；
(ii)对SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列；和
(iii)对SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，在序列的N端或C端进行一个或多个氨基酸的插入，所述插入的氨基酸残基个数包括1个至30个；
所述羰基还原酶在液态反应体系中，以式II化合物为底物，在辅酶存在下，催化不对称还原反应，从而形成式I化合物，即(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇；
在另一优选例中，在所述的反应体系中，式Ⅱ化合物浓度为30～500g/L。
在另一优选例中，所述反应后的反应体系中，(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的ee值≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％。
在另一优选例中，所述反应后的反应体系中，≥80％(较佳地≥85％，更佳地≥90％，更佳地≥95％)式II化合物被转化为(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇。
在本发明的第五方面，提供了一种如本发明第四方面所述的羰基还原酶的用途，用于在液态反应体系中，以式II化合物为底物，在辅酶存在下，催化不对称还原反应，从而形成式I化合物，即(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了化合物(I)的消旋体手性图谱。
图2显示了羰基还原酶催化所得化合物(I)的ee值。
图3显示了羰基还原酶催化所得化合物(I)与消旋体的比较。
图4显示了羰基还原酶催化还原化合物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮制备化合物(I)的反应式。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地开发出一种(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的生物制备方法。具体地，本发明的生物制备方法以2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮为原料/底物，以羰基还原酶为生物催化剂，在辅酶的存在下，即使在高浓度的底物(如30-500g/L)条件下，也能够非常高效地制备获得具有立体构象的式I化合物。本发明仅需萃取操作，操作简单，成本低廉，绿色环保，更适合工业化生产具有高化学纯度和高光学纯度关键中间体(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇，以用于卢立康唑药品的制备。在此基础上完成了本发明。
在一具体优选例中，本发明人利用来源于Lactobacillus kefiri羰基还原酶LKCR作为代表性的羰基还原酶时，通过在反应体系中偶联辅酶再生，从而显著提高了反应体系对有机溶剂、底物的耐受性，这样可以大幅提高了底物浓度，即使当反应体系放大百克级时，底物浓度可高达300g/L或更高(显著高于现有生物催化方法中同类底物浓度级别)，也能够非常高效地制备获得具有立体构象的式I化合物(ee值≥98％、99％、或更高)，从而极大地提高生产效率，降低生产成本。此外，本发明方法大幅简化了后续处理，而且与化学合成法相比，显著减少或消除了各类污染性化学品的使用，从而显著降低了环境污染风险。
术语
羰基还原酶
本发明中，“羰基还原酶”是能够立体选择性催化潜手性酮不对称还原得到手性醇的酶。
在本发明中，所述的羰基还原酶可以是野生型的或突变型的。此外，可以分离的，也可以是重组的。
可用于本发明的羰基还原酶可以来自不同物种。例如，来自乳杆菌属，更佳地来自Lactobacillus kefiri的羰基还原酶。此外，与上述羰基还原酶有类似活性或同源性(如≥80％，较佳地≥90％，更佳地较佳地≥95％)的酶(包括来自其他物种的酶)也在本发明范围之内。一种典型的羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，其编码基因如SEQ ID No：13所示。
由于密码子的简并性，编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID NO：13。本领域技术人员可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来获得该碱基序列的同系物，本发明涵盖这些同系物，只要其表达的重组酶保持对2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮的催化还原活性即可。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ ID NO：13的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
本发明的羰基还原酶还包括对SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。
在本发明中，提供了氨基酸序列如SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8所示的羰基还原酶突变体，其相对于野生型酶均具有更高的活性，对S构型的立体选择性均可达到95％以上。
在一优选的实施方式中，羰基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
反应体系中可以用上述羰基还原酶的湿菌体、粗酶液、粗酶粉或者纯酶等。为获得较高的转化效率，优选使用粗酶液。羰基还原酶的用量与底物用量比率优选为1％～6％(w/w)或者休止细胞菌体的质量与底物的质量比率为10～100％。
辅酶
本发明中，“辅酶”是指能够实现氧化还原反应中电子传递的辅酶。
典型地，本发明的辅酶为还原性辅酶NADH、NADPH或氧化性辅酶NAD+、NADP+。由于还原性辅酶的价格成本昂贵，优选选择氧化性辅酶NAD+、NADP+。
当选择氧化性辅酶时，需要选择实现辅酶再生的方法，主要包括三种(1)葡萄糖脱氢酶与共底物葡萄糖；(2)醇脱氢酶与共底物异丙醇，(3)甲酸脱氢酶与共底物甲酸铵。
在一个优选实施方式中，辅酶为NAD+，辅酶再生体系为醇脱氢酶，本发明优选醇脱氢酶与共底物异丙醇，醇脱氢酶的编码基因序列如SEQ ID NO：14所示(NCBI的登录号为AB213459)。
通过本领域常规技术，将上述醇脱氢酶与上述羰基还原酶构建在同一pET28a(+)载体上，然后导入宿主大肠杆菌BL21，通过诱导表达，获得重组基因工程菌。可直接使用离心获得的湿菌体，也可将其破壁获得粗酶，用于后续的生物转化反应。
NAD+用量与底物用量比率为0.2％～0.9％(w/w)，异丙醇的用量为缓冲液体积的5％-30％(v/v)。缓冲体系为磷酸缓冲盐，浓度为0.1mol/L。缓冲液的pH为6-8，优选为6.5-7.5。
助溶剂
本发明中，可以在反应体系中添加或不添加助溶剂。
如本文所用，术语“助溶剂”是指难溶性物质与加入的第三种物质在溶剂中形成可溶性分子间的络合物、缔合物或复盐等，以增加难溶性物质在溶剂中的溶解度。这种第三种物质称为助溶剂。
本发明中，底物化合物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮难溶于水，当底物浓度增大时，严重影响反应转化率。因此，需通过加入助溶剂提高底物溶解性，以改善反应转化情况。可选的助溶剂为二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，甲苯、丙酮，浓度优选为5-50％(v/v)，优选为二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇。
生物制备方法
本发明提供了一种来源于Lactobacillus kefiri的羰基还原酶(LKCR)催化还原化合物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮制备化合物(I)的方法。反应式如图4所示。
体系中底物化合物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮的终浓度为100-300g/L。反应温度为20-40℃，转速为200rpm/min，反应时间约5-24h，根据底物浓度而有所变化。
根据上述优选体系，所述制备方法的实施过程如下：将底物充分溶解在助溶剂，如二甲基亚砜或异丙醇，然后加入到磷酸缓冲液中，搅拌均匀后，加入湿菌体、粗酶液、粗酶粉或纯酶，加入辅酶NADP+，共底物异丙醇，维持在20℃-40℃，TLC或HPLC监控，至反应转化率达到98％以上。反应终止后，向反应液中加入异丙醇，离心或过陶瓷膜，除去菌体，取上清液，上清液用有机溶剂萃取，有机溶剂可选为甲基叔丁基醚、甲苯、乙酸乙酯、乙酸异丙脂、正庚烷、二氯甲烷，2-甲基四氢呋喃、正丁醇。萃取水层2-3次，合并有机相；用饱和食盐水洗涤2-3次，浓缩后得到白色固体。
反应体系
本发明提供了一种反应体系，其特征在于，所述反应体系包括：
(i)水性溶剂；
(ii)底物，所述底物为式II化合物；
(iii)辅酶；
(iv)羰基还原酶；
(v)共底物；和
(vi)用于辅酶再生的酶。
在另一优选例中，在所述的反应体系中，式Ⅱ化合物浓度为30～500g/L。
本发明的主要优点包括：
1)利用本研究筛选得到的酮还原酶可以实现对高浓度底物的手性催化，底物浓度可达300g/L，其显著高于现有技术中(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的生物制法所能达到的底物浓度。
2)本研究筛选得到的酮还原酶对(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇具有较高的立体选择性。
3)利用来源于Lactobacillus kefiri的羰基还原酶生物催化还原，仅需萃取操作，操作简单，成本低廉，菌体酶的生产成本在26元/Kg产物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
原料与方法
原料来源说明：化合物(I)购自上海萨恩化工有限公司
(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的手性监测方法：
HPLC条件：CHIRALPAK IA-3(250×4.6mm，5μm)；流速1.0ml/min；流动相：含0.1％的三氟乙酸的异丙醇；紫外检测波长210nm；柱温30℃；样品溶于乙醇，浓度10mg/ml；进样体积2μl。
(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的反相监测方法：
HPLC条件：SinoChrom ODS-BP C18，5μm,4.6mm×250mm；流速：1ml/min；流动相梯度如下表；紫外检测波长：210nm；柱温：30℃；样品浓度：10mg/ml；进样体积10μl。(S)-2,2’,4’-三氯苯乙醇的保留时间为6.7min。
实施例1：羰基还原酶的初筛
利用本实验室保存的分别表达6种酮还原酶的BL21菌体进行初步筛选，其中KR01、KR05、KR06的反应条件为：10g/L 2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮,10g/L湿菌体,30％异丙醇(v/v),0.1g/L NADP+和磷酸缓冲液(100mM,pH 7.0)于2ml反应体系中25℃，220rpm反应90min。KR02、KR03、KR04的反应条件为：10g/L 2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮,10g/L湿菌体,20g/L的葡萄糖,0.1g/LNADP+和磷酸缓冲液(100mM，pH 7.0)于2ml反应体系中25℃，220rpm反应90min。加入无水乙醇终止反应，离心取上清，用HPLC进行检测。
表1
结果如表1所示，在6种酶中，来源于野生型开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)的羰基还原酶LKCR对S构型的立体选择性可达90％，明显优于其它几种酶，所以本研究选择对LKCR进行随机突变，建立突变库。
实施例2：羰基还原酶工程菌的构建
将来源于开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)的羰基还原酶基因和来源于雷弗松氏菌(Leifsonia sp.S749)的异丙醇脱氢酶基因克隆入pET28a(+)载体，然后导入宿主大肠杆菌BL21，通过诱导表达，获得羰基还原酶与醇脱氢酶的重组基因工程菌。
实施例3：羰基还原酶突变库的构建
以野生型的羰基还原酶为模板，利用随机点突变试剂盒(
II Site-Directed Mutagenesis Kit)进行易错PCR，PCR产物与载体pET28a(+)进行酶切酶连，连接产物全部转入大肠杆菌BL21中，挑菌于96孔板中保存。
实施例4：羰基还原酶突变库的筛选
将上一步保存的菌转接于含有1ml新鲜培养基(100ug/ml氨苄抗性)的96孔板中，37℃，220rpm，培养12-16h，再将此种子液按1.5％的比例接种到含有1ml发酵培养基(100ug/ml氨苄抗性)的96孔板中，然后37℃，220rmp培养至OD600值>2.0，加入终浓度为1.0％乳糖，降温至25℃，继续培养2h，加入终浓度为0.5％的乳糖，培养20h，离心得到菌体。加入1ml底物浓度为5g/L的异丙醇反应体系，25℃，220rpm，反应1h。加入400ul的无水乙醇终止反应，离心取上清，用HPLC进行检测。
发酵培养基配方为：
表2
| 原材料 | 质量含量(％) |
| 酵母提取物 | 2.4 |
| 大豆蛋白胨 | 1.2 |
| 氯化钠 | 0.3 |
| 甘油 | 0.5 |
| 磷酸氢二钾 | 0.2 |
| 七水硫酸镁 | 0.05 |
野生型酶及筛选得到的活性较高的突变体为：
表3
野生型酶及筛选得到的活性较低的突变体为：
表4
利用筛选得到的酶对其他类似底物如2’,6’-二氯苯乙酮和2’,6’-二甲氧基苯乙酮的催化效率进行了实验。分别称取两种底物各0.5g，加入0.1M的磷酸盐缓冲液(50ml)，加入NADP+(0.05g)，加入菌体(1g)，25℃，220rpm，摇床反应，反应24h。HPLC检测。
表5
实施例5：重组羰基还原酶，醇脱氢酶的制备
将上一步保存于甘油中的重组基因工程菌(其中羰基还原酶突变体的序列为SEQID NO:5)，接种到含100ug/ml氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm，培养12-16h，得到种子培养基，将此种子液按1.5％的比例接种到含100ug/ml氨苄抗性的液体培养基中，然后37℃，220rmp培养至OD600值>2.0，加入终浓度为1.0％乳糖，降温至25℃，继续培养2h，加入终浓度为0.5％的乳糖，培养20h，放罐，离心得菌体，用于生物转化的催化剂。
实施例6：(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇(化合物I)的制备
反应式如图4所示。
取化合物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮(35g)，溶解于异丙醇(150ml)中，再加入0.1M的磷酸盐缓冲液(200ml)，加入NADP+(0.2g)，加入实施例5制备所得的菌体(10g)，25℃，220rpm，摇床反应，HPLC监控反应转化率>98％时，终止反应。
加入异丙醇(100ml)，离心，取上清液，部分浓缩异丙醇，正庚烷(400ml)萃取，有机溶剂(100ml×2)萃取水层，合并有机层，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得黄色油状液体32.3g，收率92％，ee值99％。
实施例7：(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇(化合物I)制备工艺的放大
取化合物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮(105g)，溶解于异丙醇(150ml)中，再加入0.1M的磷酸盐缓冲液(200ml)，加入NADP+(0.2g)，加入实施例5制备所得的菌体(20g)，25℃，220rpm，摇床反应，HPLC监控反应转化率>98％时，终止反应。
加入异丙醇(100ml)，离心，取上清液，部分浓缩异丙醇，正庚烷(400ml)萃取，有机溶剂(100ml×2)萃取水层，合并有机层，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得黄色油状液体97g，收率92％，ee值99％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海医药工业研究院
中国医药工业研究总院
<120> (S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的生物制备方法
<130> P2018-1587
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 252
<212> PRT
<213> 开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)
<400> 1
Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala
20 25 30
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65 70 75 80
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Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys
145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
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Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala
50 55 60
Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala
65 70 75 80
Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Leu Val Ser
85 90 95
Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser
100 105 110
Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys
145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Thr Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys
180 185 190
Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Ala Met Ser Gln
195 200 205
Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
210 215 220
Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
<210> 13
<211> 759
<212> DNA
<213> 开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)
<400> 13
atgactgatc gtttaaaagg caaagtagca attgtaactg gcggtacctt gggaattggc 60
ttggcaatcg ctgataagtt tgttgaagaa ggcgcaaagg ttgttattac cggccgtcac 120
gctgatgtag gtgaaaaagc tgccaaatca atcggcggca cagacgttat ccgttttgtc 180
caacacgatg cttctgatga agccggctgg actaagttgt ttgatacgac tgaagaagca 240
tttggcccag ttaccacggt tgtcaacaat gccggaattg cggtcagcaa gagtgttgaa 300
gataccacaa ctgaagaatg gcgcaagctg ctctcagtta acttggatgg tgtcttcttc 360
ggtacccgtc ttggaatcca acgtatgaag aataaaggac tcggagcatc aatcatcaat 420
atgtcatcta tcgaaggttt tgttggtgat ccaactctgg gtgcatacaa cgcttcaaaa 480
ggtgctgtca gaattatgtc taaatcagct gccttggatt gcgctttgaa ggactacgat 540
gttcgggtta acactgttca tccaggttat atcaagacac cattggttga cgatcttgaa 600
ggggcagaag aaatgatgtc acagcggacc aagacaccaa tgggtcatat cggtgaacct 660
aacgatatcg cttggatctg tgtttacctg gcatctgacg aatctaaatt tgccactggt 720
gcagaattcg ttgtcgatgg tggatacact gctcaataa 759
<210> 14
<211> 859
<212> DNA
<213> 雷弗松氏菌(Leifsonia sp.)
<400> 14
tggagttatc cgacaggtgt cggataactg aagggagatt ttcatggctc agtacgacgt 60
cgccgaccgg tccgcgatcg tgaccggagg cggctcgggc atcgggcgcg ccgtggcgct 120
cactctcgcg gcgagcggcg cagccgtcct cgtcaccgac ctgaacgagg agcacgcgca 180
ggccgtcgtg gccgagatcg aggccgcggg cggtaaggcc gccgcgctcg cgggcgacgt 240
gaccgacccc gcgttcggcg aggcgagcgt cgccggggcg aacgctctcg cgcccctcaa 300
gatcgcggtc aacaacgcgg gcatcggcgg cgaggccgcc acggtcggcg actactcgct 360
cgacagctgg cgcacggtga tcgaggtcaa cctcaacgcc gtgttctacg ggatgcagcc 420
gcagctgaag gccatggccg ccaacggcgg cggtgcgatc gtcaacatgg cgtccatcct 480
gggaagcgtc ggcttcgcca actcgtcggc ctacgtcacg gccaagcacg cgctgctcgg 540
tctcacccag aacgccgcgc tcgagtacgc cgccgacaag gtgcgcgtcg tcgcggtcgg 600
ccccggcttc atccgcaccc cgctcgtgga ggccaacctc tccgccgacg cgctggcgtt 660
cctcgagggc aagcacgccc tcggccgcct gggcgagccg gaagaggtcg cctcgctggt 720
cgcgttcctc gcctccgacg ccgcgagctt catcaccggc agctaccacc tggtggacgg 780
cggctacacc gcccagtgac cgggcgacag cccgtatcgt gcacggtcgc gctcccttag 840
gctgaggagc gtgaccccg 859
<210> 15
<211> 251
<212> PRT
<213> 雷弗松氏菌(Leifsonia sp.)
<400> 15
Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly
20 25 30
Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val
35 40 45
Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly
50 55 60
Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn
65 70 75 80
Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly
85 90 95
Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val
100 105 110
Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu
115 120 125
Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser
130 135 140
Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Ser Ser Ala Tyr Val Thr Ala
145 150 155 160
Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala
165 170 175
Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr
180 185 190
Pro Leu Val Glu Ala Asn Leu Ser Ala Asp Ala Leu Ala Phe Leu Glu
195 200 205
Gly Lys His Ala Leu Gly Arg Leu Gly Glu Pro Glu Glu Val Ala Ser
210 215 220
Leu Val Ala Phe Leu Ala Ser Asp Ala Ala Ser Phe Ile Thr Gly Ser
225 230 235 240
Tyr His Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
Claims (11)
1.一种制备(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在液态反应体系中，以式II化合物为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，从而形成式I化合物，即(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇；
其中，所述反应体系中，式II化合物浓度为30-500g/L；和
(b)任选地从所述上一步骤的反应后的反应体系中分离出式I化合物；
其中，所述羰基还原酶为氨基酸序列选自下组的酶：SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应体系中，羰基还原酶的存在形式选自下组：羰基还原酶为游离形式的酶、固定化酶、或菌体形式的酶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的ee值≥90％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥80％式II化合物被转化为(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式I化合物的浓度为30-500g/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
7.一种反应体系，其特征在于，所述反应体系包括：
(i)水性溶剂；
(ii)底物，所述底物为式II化合物；
(iii)辅酶；
(iv)羰基还原酶；所述羰基还原酶为氨基酸序列选自下组的酶：SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8；
(v)共底物；和
(vi)用于辅酶再生的酶。
8.如权利要求7所述的反应体系，其特征在于，在所述的反应体系中，式Ⅱ化合物浓度为30～500g/L。
9.一种制备(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的方法，其特征在于，包括步骤：使用如权利要求8所述的反应体系，在适合酶催化的条件下，进行酶促反应，从而制得(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇，即式I化合物：
10.一种羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Lactobacillus kefiri的羰基还原酶LKCR，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8所示。
11.一种如权利要求10所述的羰基还原酶的用途，其特征在于，用于在液态反应体系中，以式II化合物为底物，在辅酶存在下，催化不对称还原反应，从而形成式I化合物，即(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇：
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