CN109576312B - 一种制备（r）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法 - Google Patents

一种制备（r）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及酶法制备手性醇，属于基因工程技术用于制备医药中间体的领域。一种制备（R）‑2‑氯‑1‑（3‑羟基苯基）乙醇的方法，α‑氯代‑3‑羟基苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）‑2‑氯‑1‑（3‑羟基苯基）乙醇。该方法通过筛选出特定氨基酸序列的酮还原酶用于催化制备（R）‑2‑氯‑1‑（3‑羟基苯基）乙醇，实现底物99%以上的转化率，所制备的产物ee值不低于98.5%，且反应的底物浓度接近280g/L,具备工业放大生产的价值。该反应能够使得底物完全、高效的转化成为目标产物，并且所制备的产物分离提纯简单，后处理成本低，整个工艺流程环境友好度高，原子利用率高。

Description

一种制备（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法
技术领域
本发明涉及一种中间体制备方法，尤其涉及一种制备（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法。
背景技术
去氧肾上腺素是一种α1 受体激动药物，具有血管收缩作用，在临床中应用广泛，并呈稳定的增长趋势。1927 年德国化学家Helmut Legerlotz 首次合成了去氧肾上腺素，之后又分离得到其手性异构体。去氧肾上腺素（phenylephrine，PE）侧链α碳为手性碳原子，其R(-)-异构体的α1-肾上腺素受体激动作用远强于S(+)-异构体，因此R型去氧肾上腺素在临床上广泛应用于阵发性室上性心动过速，治疗休克及麻醉时维持血压，在眼科检查中可作为安全的短效扩瞳药使用。作为伪麻黄碱最简单有效的替代品，R型去氧肾上腺素在非处方感冒药中的使用也呈现增长趋势。
最初R型去氧肾上腺素广泛利用L-(+)-酒石酸作为拆分剂，经过手性拆分得到S型去氧肾上腺素-L-(+)-酒石酸盐结晶，氨水碱化后，经水洗、干燥得S型去氧肾上腺素。而R型去氧肾上腺素-L-(+)-酒石酸盐留在母液中，加氨水回收得R型去氧肾上腺素。得到的S型去氧肾上腺素在酸性或碱性条件下外消旋化，可再次进行拆分，从而提高整体产率。具体文献见：Bao W N，Pan H F，Zhang Z H，et al. Isolation of the stable strain Labrys sp.BK-8 for L-(+)-tartaric acid production[J]. Journal of Bioscience andBioengineering，2014，118（1）：1-5.除此之外，还包括与萘普生拆分工艺串联的方法及水解动力学拆分方法等。
随着去氧肾上腺素合成工艺的改进，越来越多的生产厂家采用不对称合成方法制备R型去氧肾上腺素。目前常见的不对称合成法制备R型去氧肾上腺素中，研究最早、应用最普遍的是不对称氢化法。除此之外，Sharpless 不对称双羟基化法、Salen 催化醛的Henry反应法也是合成R型去氧肾上腺素的有效途径。
文献2008 年Hossein（WO2009086283）最先报道了钌手性双膦催化剂不对称催化氢化合成S型去氧肾上腺素的方法。他们以α-甲氨基-间羟基乙酰苯为原料，形成硫酸盐后，在3MPa 下利用钌-手性双膦催化剂进行不对称催化氢化，之后再用氨水中和得R型去氧肾上腺素，产品光学纯度为95% ee。
2010 年McGarrity 等（Tetrahedron：Asymmetry，2010（21）：2479-2486） 则直接用钌双配体催化剂[(R)-Xyl-P-Phos RuCl2(R)-DAIPEN]催化α-甲氨基-间羟基乙酰苯的不对称氢化反应得到R型去氧肾上腺素；(R)-Xyl-P-Phos为C 手性双膦配体，(R)-DAIPEN为手性二胺配体，反应时间为16h，产品光学纯度为96% ee。
2011 年冯文化等（CN 102234237）利用商品化的(R)-BINAP-Ru(II)类催化剂催化合成了L-去氧肾上腺素。(R)-BINAP为C-手性双齿双膦配体，还原所得粗品光学纯度为75%ee，经甲醇结晶后可达96% ee。以上所列文献反应如式I所示：
Figure 8938DEST_PATH_IMAGE001
式I
更有采用酶催化技术改进R型去氧肾上腺素的制备工艺，2013 年巴斯夫欧洲公司的Breuer 等（US8617854）公开了固氮弧菌属物种EBN1 的醇脱氢酶催化合成R型去氧肾上腺素的方法，该酶可在大肠杆菌中重组制备。该路线是以间羟基苯乙酮为起始原料，丙醇存在的情况下与磺酰氯反应得到α-氯代-3-羟基苯乙酮，之后以固氮弧菌属物种EBN1 的醇脱氢酶作为生物催化剂，以NADP 作为电子供体，在葡萄糖脱氢酶和2-丁醇存在的条件下，将α-氯代-3-羟基苯乙酮还原成手性醇，甲胺胺化后得到L-去氧肾上腺素，产品光学纯度大于99% ee。反应路线如式II：
Figure 926078DEST_PATH_IMAGE002
式II
式II所示的路线关键工艺在于通过酶催化制备出关键中间体（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇，然后合成出R型去氧肾上腺素。该工艺虽然实现了酶法制备（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇，但该文献所提供酶催化反应的浓度不得超过8.5g/L，并且采用连续加料、MTBE持续萃取出反应液中生成的（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的工艺，每1000mL反应液最终生成（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的量不超过175g。并且该工艺超过一半的溶液质量为有机溶剂，降低了酶催化绿色化学工艺的优点，增加反应成本和环境污染成本。这种低浓度长时间且不环保的酶催化工艺并不具备工业上大规模生产的应用价值。
因此，目前急需一种新的高效制备（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇并实现工业化应用的技术，提高药物R型去氧肾上腺素的生产效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法；
本发明的另一个目的在于提供上述制备方法所用到的酮还原酶及其氨基酸序列；
本发明的另一个目的在于提供上述制备方法所用到的酮还原酶的基因序列，此基因序列能够编码上述酮还原酶；
本发明的另一个目的在于提供包含上述酮还原酶基因序列的载体及工程菌体；
本发明的最终目的在于提供一种利用酮还原酶催化α-氯代-3-羟基苯乙酮制备（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法，该方法能够高效、高纯度的制备出（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇。
技术方案
一种制备（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法，如式III，将α-氯代-3-羟基苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇：
Figure 643499DEST_PATH_IMAGE003
式III
式III中所采用的酮还原酶（KRED）的氨基酸序列如（a）或（b）所述：
（a）、所述酮还原酶具有如表SEQ ID No.2 所记载的氨基酸序列；
（b）、所述酮还原酶为将表SEQ ID No.2 中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且能催化α-氯代-3-羟基苯乙酮转化为（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的酮还原酶。
进一步，（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备85%以上的同源性，且该氨基酸序列所编码的酮还原酶能催化α-氯代-3-羟基苯乙酮转化为（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇。
进一步，（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备90%以上的同源性，优选为具备93%以上的同源性，更优选为具备95%以上的同源性，最优选为具备97%以上的同源性。
进一步，所述酮还原酶的基因如下（c）或（d）：
（c）、基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示；
（d）、与（c）具有N%以上的同源性（N选自85、90、95、99），且能编码催化α-氯代-3-羟基苯乙酮转换为（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的酮还原酶的基因。
一种含有上述基因的重组表达载体、重组菌或转基因细胞系。
进一步，上述酮还原酶以酮还原酶酶粉、酮还原酶酶液、含酮还原酶的细胞等形式参与催化反应，用于催化α-氯代-3-羟基苯乙酮转化为（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇。
进一步，所述酮还原酶催化α-氯代-3-羟基苯乙酮制备（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的工艺步骤包括：将α-氯代-3-羟基苯乙酮、酮还原酶酶粉或含有酮还原酶的细胞（本技术方案中所述“含有酮还原酶的细胞”是指本技术领域常见的用于生产发酵的工程细菌，比如酵母菌、大肠杆菌等。）、辅因子、缓冲剂配置成水/2-丁醇混合溶液，反应得到产物。
进一步，所述α-氯代-3-羟基苯乙酮浓度为1～280g/L，优选为100～260g/L，更优选为200～260g/L；
进一步，所述酮还原酶的酶粉使用质量与含有酮还原酶细胞的使用质量之比为1:4～6。即1质量份数的酮还原酶酶粉催化效率相当于4～6质量份数酮还原酶细胞的催化效率。
进一步，所述含有酮还原酶的细胞浓度为20～90g/L，优选为30～70g/L。如果采用酮还原酶酶粉替换酮还原酶细胞，则酮还原酶酶粉的使用浓度为4～20g/L；
进一步，所述水/2-丁醇溶液中，水与2-丁醇体积比为1:3～6，优选为1:4～5；
进一步，反应体系中可以加入辅因子促进反应，当采用含酮还原酶的细胞时，细胞内部含有少量辅酶，此时也可以不加入辅酶；某些情况下制备的酮还原酶酶粉中亦含有少量辅酶，此时也可以不加入辅酶。但反应体系中也可以加入辅酶进一步促进反应进行，当反应体系中加入辅因子促进反应时，所述辅因子选自NAD+、NADH、NADP+和NADPH 的任意一种或它们的组合物，优选为NADP+；所述辅因子浓度为0.02～0.5 g/L，优选为0.1～0.4g/L。
进一步，所述缓冲剂为磷酸-磷酸盐缓冲剂、柠檬酸-柠檬酸盐缓冲剂，优选为磷酸-磷酸盐缓冲剂；缓冲剂的pH为6.5～9.0，优选为7.0～8.7；缓冲剂摩尔浓度为0.01～0.5mol/L,优选为0.05～0.2 mol/L。
进一步，所述催化α-氯代-3-羟基苯乙酮制备（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的反应温度为24～45℃，反应时间为5～36h。
进一步，酮还原酶以酶粉形式、含酮还原酶的细胞破碎液或全细胞的形式参与反应，优选以酶粉形式参与反应。
进一步，本技术方案中，所述酮还原酶为来源于Lactobacillus kefiri的突变体，是通过对L. kefiri的酮还原酶的突变体文库进行筛选后得到的。来源于L. kefiri的野生型酮还原酶在NCBI的登记号为WP_054768785.1。并且本专利中所有的氨基酸序列及其可能对应的基因序列均可通过商业化的全基因合成服务制得。
进一步，所述酮还原酶由基因工程菌发酵得到，所述基因工程菌选自酵母菌、大肠杆菌，优选为酵母菌。
进一步，根据本领域技术人员可知，编码酮还原酶的DNA序列最后三个碱基为终止密码子，终止密码子可有多种碱基序列，经过替换不同碱基序列的终止密码子后，其技术方案的本质是与我们所申请的技术方案内容一致的，亦视为本发明的保护范围。
有益效果
本发明提供一种制备（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法，该方法通过筛选出特定氨基酸序列的酮还原酶，用于催化α-氯代-3-羟基苯乙酮转化为（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇，使得生产过程在水相高效进行，并且反应的原料转化率超过99%，所制备的产物（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇ee值不低于98.5%，底物浓度接近280g/L,能够使得底物完全、高效的转化成为目标产物，并且所制备的产物分离提纯简单，后处理成本低，整个工艺流程环境友好度高，原子利用率高。
本技术方案提供了一种高效制备（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的技术方案，该技术方案相比于现有技术，提供了一种酮还原酶、及其氨基酸序列和基因序列，通过该基因序列编码的酮还原酶能够实现环保无污染的反应工艺条件下，实现转化率不低于99.5%的催化结果，制备出ee值大于98.5%的（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇，克服了现有技术酶催化制备工艺中，底物浓度不超过8.5g/L的缺点，使该工艺能够切实可应用于工业化制备（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇。
附图说明
图1为反应底物α-氯代-3-羟基苯乙酮的HPLC分析谱图；
图2为实施例2反应液的手性HPLC分析谱图；
图3为实施例3反应液的手性HPLC分析谱图；
图4为实施例4反应液的手性HPLC分析谱图；
图5为实施例5反应液的手性HPLC分析谱图；
图6为消旋体的手性HPLC分析谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。
实施例1 酮还原酶的制备
将含有酮还原酶的编码基因（SEQ ID No.1）的基因工程菌（载体pET21a，宿主细胞E.Coli BL21(DE3)）接种至5mL 含氨苄青霉素的LB 试管培养基中活化培养（37℃培养12h），按1%接种量转接活化培养物至400mL 含氨苄青霉素的LB 液体培养基中，37℃培养OD至0.6-0.8，加入IPTG（终浓度0.1mM）于25℃诱导培养16h。离心收集菌体得到酮还原酶细胞，用40mL 磷酸盐缓冲液（10mM，pH 7.5）重悬菌体后，于冰水浴中超声破碎15min，离心收集上清，-20℃预冻后真空冷冻干燥48h 后碾碎，即得重组酮还原酶酶粉。
实施例2 克级 （R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入2-丁醇（8mL）及底物α-氯代-3-羟基苯乙酮（1.5g），搅拌均匀后加入酶粉0.1g、辅酶NADP 1mg最后采用pH=8.5的磷酸盐缓冲液定容至10mL，28℃下磁力搅拌反应，同时TLC 检测反应进程。反应24 h结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。反应液反应前的HPLC图谱如图1所示；消旋体的2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇手性HPLC如附图6所示；反应液的手性HPLC如图2，附图2检测产物ee 值及转化率可知：底物转化率=99.7%，R 型产物ee 值=98.7%。
实施例3 克级 （R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入2-丁醇（6.5mL）及底物α-氯代-3-羟基苯乙酮（2.5g），搅拌均匀后加入酮还原酶细胞0.3g，最后采用pH=8.2的磷酸盐缓冲液定容至10mL，30℃下磁力搅拌反应，同时TLC 检测反应进程。反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。反应液的手性HPLC如图3，附图3检测产物ee值及转化率可知：底物转化率=99.6%，R型产物ee 值=98.5%。
实施例4 百克级 （R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入2-丁醇（890mL）及底物α-氯代-3-羟基苯乙酮（220g），搅拌均匀后加入酮还原酶细胞50g，最后采用pH=7.9的磷酸盐缓冲液定容至1.0 L，38℃下磁力搅拌反应，同时TLC 检测反应进程。反应22 h结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。反应液的手性HPLC如图4，附图4检测产物ee 值及转化率可知：底物转化率=99.5%，R 型产物ee 值=98.6%。
实施例5 公斤级 （R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入2-丁醇（18 L）及底物α-氯代-3-羟基苯乙酮（4.0Kg），搅拌均匀后加入酮还原酶的酶粉0.75Kg、辅酶NADP+（5.5g），最后采用pH=7.5的磷酸盐缓冲液定容至20 L，45℃下磁力搅拌反应，同时TLC 检测反应进程。反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。反应液的手性HPLC如图5，附图5检测产物ee 值及转化率可知：底物转化率=99.7%，R 型产物ee 值=99.0%。
序列表
<110> 尚科生物医药（上海）有限公司
<120> 一种制备（R）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaccgacc gtctgaaatc taaagttgct atcgttaccg gtggtaccct gggtatcggt 60
ctggctatcg ctgacaaatt cgttgctgaa ggtgctaaag ttgttatcac cggtcgtcac 120
gctgacgttg gtgaaaaagc tgctaaatct atcggtggta ccgacgttat ccgtttcgtt 180
cagcacgacg cttctgacga agctggttgg accaaactgt tcgacaccac cgaagaagcg 240
ttcggtccgg ttaccaccgt tgttaacaac gcgggcatcg ctgtaagcaa atctgttgaa 300
gacaccacca ccgaagaatg gcacaaactg ctgtctgtta acctggacgg tgttttcttc 360
ggtacccgtc tgggtatcca gcgtatgaaa aacaaaggtc tgggtgcttc tatcatcaac 420
atgtcttcta tctctggtct ggttggtgac ccgaccctgg gtgcttacaa cgcttctaaa 480
ggtgctatcc gtatcatgtc taaatctgct gctctggact gcgctgttaa agactacgac 540
gttcgtgtta acaccgttca cccgggttac atcaaaaccc cgctggttga caaagacccg 600
ggtgctgaag aaatgatgtc tcagcgtacc cgtaccccga tgggtcacat cggtgaaccg 660
aacgacgttg cttggatctg cgtttacctg gcttctgacg aatctaaatt cgctaccggt 720
gctgaattcg ttgttgacgg tggttacacc gctcagtaa 759
<210> 2
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Thr Asp Arg Leu Lys Ser Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Ala Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala
50 55 60
Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala
65 70 75 80
Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Ser
85 90 95
Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp His Lys Leu Leu Ser
100 105 110
Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
Ser Gly Leu Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys
145 150 155 160
Gly Ala Ile Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Val
165 170 175
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys
180 185 190
Thr Pro Leu Val Asp Lys Asp Pro Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln
195 200 205
Arg Thr Arg Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Val Ala
210 215 220
Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250

Claims (9)

1.一种制备(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇的方法，其特征在于：α-氯代-3-羟基苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.如权利要求1所述的制备(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇的方法，其特征在于：所述酮还原酶的基因序列如SEQ ID No.1所示。
3.如权利要求1所述的制备(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇的方法，其特征在于：α-氯代-3-羟基苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇，步骤包括：将α-氯代-3-羟基苯乙酮、酮还原酶酶粉或含有酮还原酶的细胞、辅因子、缓冲剂、2-丁醇一起配制成混合溶液，反应得到产物。
4.如权利要求3所述的制备(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇的方法，其特征在于：所述α-氯代-3-羟基苯乙酮浓度为1～280g/L；酮还原酶酶粉浓度为2～20g/L或含有酮还原酶的细胞的浓度为20～90g/L。
5.如权利要求3所述的制备(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇的方法，其特征在于：所述混合溶液中水与2-丁醇体积比为1:3～6。
6.如权利要求3所述的制备(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇的方法，其特征在于：反应温度为24～45℃。
7.如权利要求3所述的制备(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇的方法，其特征在于：反应时间为5～36h。
8.如权利要求3所述的制备(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇的方法，其特征在于：所述辅因子选自NAD+、NADH、NADP+和NADPH的任意一种或它们的组合物；所述辅因子浓度为0.1～0.4g/L。
9.如权利要求4所述的制备(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇的方法，其特征在于：所述含有酮还原酶的细胞选自基因工程改造的酵母菌或大肠杆菌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101784669A (zh) * 2007-08-24 2010-07-21 科德克希思公司 用于(r)-3-羟基四氢噻吩的立体选择性制备的改善的酮还原酶多肽
CN102186972A (zh) * 2008-08-29 2011-09-14 科德克希思公司 用于立体选择性生产(4s)-3-[(5s)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1，3-噁唑烷-2-酮的酮还原酶多肽
EP2467473B1 (en) * 2009-08-19 2016-03-23 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the preparation of phenylephrine

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101784669A (zh) * 2007-08-24 2010-07-21 科德克希思公司 用于(r)-3-羟基四氢噻吩的立体选择性制备的改善的酮还原酶多肽
CN102186972A (zh) * 2008-08-29 2011-09-14 科德克希思公司 用于立体选择性生产(4s)-3-[(5s)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1，3-噁唑烷-2-酮的酮还原酶多肽
EP2467473B1 (en) * 2009-08-19 2016-03-23 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the preparation of phenylephrine

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Engineering the third wave of biocatalysis-U. T. Bornscheuer;U. T. Bornscheuer et al.;《Nature》;20120510;第485卷;187页右栏第3段-188页左栏第1段、表1 *
Origins of stereoselectivity in evolved ketoreductases.;Noey E L et al.;《Proc Natl Acad Sci U S A》;20151207;第112卷(第51期);摘要、第1页至第2页左栏第2段、图1 *

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