CN109423484B - 一种酮还原酶及其在制备（s）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇上的应用 - Google Patents

一种酮还原酶及其在制备（s）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及酶法制备手性醇，属于基因工程技术用于制备医药中间体领域。一种酮还原酶及其在制备（S）‑2‑氯‑1‑（3,4‑二氟苯基）乙醇上的应用，提供一种与现有技术酮还原酶来源不同的酮还原酶，该酮还原酶能够转化的底物2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙酮浓度达到350g/L以上，并且产物（S）‑2‑氯‑1‑（3,4‑二氟苯基）乙醇的ee值能够达到99%以上，同时底物转化率在99%以上。本技术方案所提供的新来源的酮还原酶解决了酶催化制备（S）‑2‑氯‑1‑（3,4‑二氟苯基）乙醇在工业应用上底物浓度不高的问题，并提升了高浓度（S）‑2‑氯‑1‑（3,4‑二氟苯基）乙醇的转化率、产物的ee值。

Description

一种酮还原酶及其在制备（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇 上的应用
技术领域
本发明涉及一种生物酶，尤其涉及一种酮还原酶及其在制备（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇上的应用。
背景技术
替格瑞洛是一种血小板聚集抑制剂，其临床疗效和安全性已得到血小板抑制和患者后果结局研究（PLATO研究）及其多项亚组研究的验证和支持。PLATO研究也显示替格瑞洛的疗效明显优于氯吡格雷，所以被国内外多个指南列于一线推荐。
替格瑞洛的合成路线如式I：
Figure RE-GDA0001418839570000021
其中，式II所示的化合物作为制备替格瑞洛的关键中间体，因 其具备独特的手性中心，其制备方法的改进，一直是替格瑞洛中间体 合成工艺领域的重要工作。
目前手性分子式II主要通过式III所示的（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇分子是通过多步反应得到（见专利文件WO 2008018822、WO 2008018823及Singh A K ；Rao M N;Simpson J H; et al，Org. Process Res . Dev . 2002, 6, 618-620. 及Zhang H ; Liu; zhang L .Y; et al .Bioorg . Med. Chem. Lett., 2012, 22, 3598-3602），因此式III所示（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇分子的高效率、高手性选择性的制备是目前替格瑞洛原料药制备的关键步骤。
Figure 375600DEST_PATH_IMAGE003
式III
现有技术中式III及后续中间体的制备工艺如下：
（1）专利CN 103408399：
Figure 770809DEST_PATH_IMAGE004
式IV
该专利采用(S)-CBS-Me 或者(+)-DIP-Cl做还原剂，制备手性分子（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式III），该方法能耗高，污染严重。并且手性还原剂成本较高，不利于降低工艺成本。且反应收率较低，手性选择性不好。
（2）专利CN 104744266A
该专利所提供的制备方法中，采用与式IV相似的合成方案制备（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式III）。制备过程中采用硼氢化钠作为还原剂，使得反应不具备手性选择性，原子经济利用率不超过50%。并且硼氢化钠作为活泼金属还原剂在使用过程危险系数较高，不利于工业化。
（3）专利CN 102924457、公布号201410139006.7
该专利亦采用与式IV相似的合成方案制备（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式III），制备过程中仍采用硼烷类还原剂，无法解决反应手性选择性低、环境污染严重和危险系数较高的问题。
（4）专利CN105969757A、专利CN 105671099 A、CN 106047828以及文献ApplMicrobiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-016-7947-0
以上四篇现有技术文献给出采用酮还原酶的方法，通过式V制备出（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式III）：
Figure 772132DEST_PATH_IMAGE005
式V
该技术通过酮还原酶制备（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式III），但从专利CN105671099 A给出的具体实施例可以看出，随着底物浓度从100g/L升高至150g/L,底物的转化率从99.6%降低至89%，说明发明CN 105671099 A所提供的酶在高底物浓度的反应条件下，其底物转化率会骤降，虽然该专利在权利要求书中要求保护底物浓度为1～300g/L，但本领域常规技术人员根据该专利具体实施例的数据变化趋势很容易得知，该专利所提供的酶在高底物浓度下存在转化率较低的缺点，其有效实用于工业生产的底物催化浓度将限定在150g/L以下。这就限定了专利CN 105671099 A技术方案在工业生产上的应用。
而专利CN 106047828 A所提供的酶最高完全催化浓度可达到200g/L，这并不是一个非常高的反应底物浓度，距离工业化仍有一定的距离，并且200g/L的底物浓度下反应时间在20h以上，这进一步降低了专利中所提供酶的应用价值。
因此，目前急需一种新的高效制备（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇并实现工业化应用的技术，提高药物替格瑞洛的生产效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转换为（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的酮还原酶；
本发明的另一个目的在于提供上述酮还原酶的氨基酸序列；
本发明的另一个目的在于提供基因序列，此基因序列能够编码上述氨基酸序列的酮还原酶；
本发明的另一个目的在于提供包含上述酮还原酶基因序列的载体及工程菌体；
本发明的最终目的在于运用所制备的酮还原酶催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转换为（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇，提高药物替格瑞洛的合成效率。
技术方案
一种酮还原酶及其在制备（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇上的应用，采用酮还原酶在水相中催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转换为（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇，工艺路线如下：
Figure 594595DEST_PATH_IMAGE006
式VI
路线中Isopropyl alcohol指异丙醇，Acetone指丙酮；
路线中所采用的酮还原酶（KRED）为(a)或（b）：
（a）、SEQ ID No.2所示氨基酸序列的酮还原酶；
（b）、将表SEQ ID No.2 中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所编码的且能够催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转换为（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的酮还原酶。
进一步，（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备85%以上的同源性，且能催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转换为（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇。
进一步，（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备90%以上的同源性，优选为具备93%以上的同源性，更优选为具备95%以上的同源性，最优选为具备99%以上的同源性。
一种上述酮还原酶的基因如下（c）或（d）或（e）：
（c）、基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；
（d）、在严格条件下可与序列表SEQ ID No.1限定的DNA分子杂交，且能催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转换为（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的酮还原酶的基因；
（e）、与（c）具有N%以上的同源性（N选自85、90、95、99），且能编码催化2-氯-1-( 3,4-二氟苯基)乙酮转换为（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的酮还原酶的基因。
一种含有上述基因的重组表达载体、重组菌或转基因细胞系。
进一步，上述酮还原酶以酮还原酶酶粉、酮还原酶酶液、含酮还原酶的细胞等形式参与催化反应，用于催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转化为（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇。
进一步，所述酮还原酶催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮制备（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的工艺步骤包括：将2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮、酮还原酶酶粉或含有酮还原酶的细胞（本技术方案中所述“含有酮还原酶的细胞”是指本技术领域常见的用于生产发酵的工程细菌，比如酵母菌、大肠杆菌等。）、辅因子、缓冲剂配置成水/异丙醇混合溶液，反应得到产物。
进一步，所述2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮浓度为1～350g/L，优选为100～350g/L，更优选为300～350g/L；
进一步，所述酮还原酶的酶粉使用量与含有酮还原酶细胞的使用质量之比为1:4～6。即1质量份数的酮还原酶酶粉催化效率相当于4～6质量份数酮还原酶细胞的催化效率。
进一步，所述含有酮还原酶的细胞浓度为50～100g/L，优选为75～85g/L。如果采用酮还原酶酶粉替换酮还原酶细胞，则酮还原酶酶粉的使用浓度为8.3～25g/L；
进一步，所述水/异丙醇溶液中，水与异丙醇体积比为1:0.7～1.5，优选为1:0.8～1.2；
进一步，所述辅因子选自NAD+、NADH、NADP+、NADPH 的任一种或多种组合物，优选为NADP+；所述辅因子浓度为0.02～0.2 g/L，优选为0.08～0.12g/L。
进一步，所述缓冲剂为磷酸-磷酸盐缓冲剂、柠檬酸-柠檬酸盐缓冲剂，优选为磷酸-磷酸盐缓冲剂；缓冲剂的pH为6.5～7.5，优选为6.8～7.2；缓冲剂摩尔浓度为0.01～0.5mol/L,优选为0.05～0.2。
进一步，所述催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮制备（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的反应温度为20～55℃，反应时间为5～36h。
进一步，酮还原酶以酶粉形式、含酮还原酶的细胞破碎液或全细胞的形式参与反应，优选以酶粉形式参与反应。
进一步，本技术方案中，所述酮还原酶为来源于Lactobacillus kefiri的突变体，是通过对Lactobacillus kefiri的酮还原酶的突变体文库进行筛选后得到的。来源于Lactobacillus kefiri的野生型酮还原酶在NCBI的登记号为WP_054768785.1。并且本专利中所有的氨基酸序列及其可能对于的基因序列均可通过商业化的全基因合成服务制得。
进一步，所述酮还原酶由基因工程菌发酵得到，所述基因工程菌选自酵母菌、大肠杆菌，其中优选为酵母菌。
有益效果
本发明提供一种与现有技术中酮还原酶来源不同的新的酮还原酶，并给出了该酮还原酶所对应的一种基因序列。该酮还原酶能够转化的底物2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮的浓度高达350g/L。并且相比于现有技术中所给出的酮还原酶，在较高的2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮浓度下该酮还原酶仍能够保持产物（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的ee值99%以上，同时能确保底物转化率在99%以上。本技术方案所提供的新来源的酮还原酶彻底解决了酶催化制备（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇在工业应用上催化浓度不高的问题，并提升了高浓度（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的转化率、产物的ee值纯度。
附图说明
图1为实施例2所制备产物的HPLC分析谱图；
图2为实施例2所制备产物的手性分析谱图；
图3为实施例3所制备产物的HPLC分析谱图；
图4为实施例4所制备产物的HPLC分析谱图；
图5为实施例5所制备产物的HPLC分析谱图；
图6为实施例6所制备产物的HPLC分析谱图；
图7为实施例7所制备产物的HPLC分析谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。
实施例1 酮还原酶的制备
将含有酮还原酶的编码基因（SEQ ID No.1）的基因工程菌（载体pET21a，宿主细胞E.Coli BL21(DE3)）接种至5mL 含氨苄青霉素的LB 试管培养基中活化培养（37℃培养12h），按1%接种量转接活化培养物至400mL 含氨苄青霉素的LB 液体培养基中，37℃培养OD至0.6-0.8，加入IPTG（终浓度0.1mM）于25℃诱导培养16h。离心收集菌体得到酮还原酶细胞，用40mL 磷酸盐缓冲液（10mM，pH 7.5）重悬菌体后，于冰水浴中超声破碎15min，离心收集上清，-20℃预冻后真空冷冻干燥48h 后碾碎，即得重组酮还原酶酶粉。
实施例2 克级 （S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入异丙醇（4mL）及底物2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮（1.5g），搅拌均匀后加入酮还原酶细胞0.5g、辅酶NADP+（0.3mg），最后采用磷酸盐缓冲液定容至10mL，25℃下磁力搅拌反应，并采用NaOH（0.5M）控制反应pH 在6.9 左右，同时TLC 检测反应进程。反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。HPLC检测转化率及产物ee 值如附图1、2所示：底物转化率=99.7%，S 型产物ee 值=99.8%。
实施例3 克级 （S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入异丙醇（4.5mL）及底物2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮（2.0g），搅拌均匀后加入酮还原酶细胞0.75g、辅酶NADP+（0.7mg），最后采用磷酸盐缓冲液定容至10mL，45.5℃下磁力搅拌反应，并采用NaOH（0.5M）控制反应pH 在6.8 左右，同时TLC 检测反应进程。反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。HPLC检测转化率如附图3、产物ee 值同附图2：底物转化率=99.3%，S 型产物ee 值=99.8%。
实施例4 克级 （S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入异丙醇（50mL）及底物2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮（25g），搅拌均匀后加入酮还原酶的酶粉1.7g、辅酶NADP+（10mg），最后采用磷酸盐缓冲液定容至100mL，50℃下磁力搅拌反应，并采用NaOH（0.5M）控制反应pH 在7.0 左右，同时TLC 检测反应进程。反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。HPLC检测转化率如附图4、产物ee 值同附图2：底物转化率=99.3%，S型产物ee 值=99.8%。
实施例5 百克级 （S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入异丙醇（550mL）及底物2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮（300g），搅拌均匀后加入酮还原酶细胞87g、辅酶NADP+（150mg），最后采用磷酸盐缓冲液定容至1.0L，40℃下磁力搅拌反应，并采用NaOH（0.5M）控制反应pH 在7.1 左右，同时TLC 检测反应进程。反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。HPLC检测转化率如附图5，产物ee 值同附图2：底物转化率=99.91%，S 型产物ee 值=99.8%。
实施例6 公斤级 （S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入异丙醇（9.5L）及底物2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮（7.0Kg），搅拌均匀后加入酮还原酶的酶粉0.36Kg、辅酶NADP+（2.5g），最后采用磷酸盐缓冲液定容至20 L，25℃下磁力搅拌反应，并采用NaOH（0.5M）控制反应pH 在7.0 左右，同时TLC 检测反应进程。反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。HPLC检测转化率如附图6，产物ee 值同附图2：底物转化率=99.8%，S型产物ee 值=99.8%。
实施例7 公斤级 （S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入异丙醇（25L）及底物2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮（16.5Kg），搅拌均匀后加入酮还原酶细胞4.5Kg、辅酶NADP+（5 g），最后采用磷酸盐缓冲液定容至50L，36℃下磁力搅拌反应，并采用NaOH（0.5M）控制反应pH 在7.0 左右，同时TLC 检测反应进程。反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。HPLC检测转化率如附图7、产物ee 值同附图2：底物转化率=99.6%、S 型产物ee 值=99.8%。
序列表
<110> 尚科生物医药（上海）有限公司
<120> 一种酮还原酶及其在制备（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇上的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgactgatc gtttaaaagg caaagtagca attgtaactg gcggtacctt gggaattggc 60
ttggcaatcg ctgataagtt tgttgaagaa ggcgcaaagg ttgttattac cggccgtcac 120
gctgatgtag gtgaaaaagc tgccaaatca atcggcggca cagacgttat ccgttttgtc 180
caacacgatg cttctgatga agccggctgg actaagttgt ttgatacgac tgaagaagca 240
tttggcccag ttaccacggt tgtcaacaat gccggaattt tcctctacaa gagtgttgaa 300
gataccacaa ctgaagaatg gcgcaagctg ctctcagtta acttggatgg tgtcttcttc 360
ggtacccgtc ttggaatcca acgtatgaag aataaaggac tcggagcatc aatcatcaat 420
atgtcatcta tcgaaggtct tgttggtgat ccaactgggg gtgcatacaa cgcttcaaaa 480
ggtgctgtca gaattatgtc taaatcagct gccttggatt gcgctttgaa ggactacgat 540
gttcgggtta acactgttca tccaggttat atcaagacac cattggttga cgatcttgaa 600
ggggcagaag aaatgatgtc acagcggacc aagacaccaa tgggtcatat cggtgaacct 660
aacgatatcg cttggatctg tgtttacctg gcatctgacg aatctaaatt tgccactggt 720
gcagaattcg ttgtcgatgg tggatacact gctcaataa 759
<210> 2
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala
50 55 60
Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala
65 70 75 80
Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Phe Leu Tyr
85 90 95
Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser
100 105 110
Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
Glu Gly Leu Val Gly Asp Pro Thr Gly Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys
145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys
180 185 190
Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln
195 200 205
Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
210 215 220
Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250

Claims (5)

1.一种酮还原酶催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮转化为(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的方法，其特征在于，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤包括：将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮、酮还原酶酶粉或含有酮还原酶的细胞、辅因子、缓冲剂一起配置成水/异丙醇混合溶液，反应得到产物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述辅因子选自NAD+、NADH、NADP+和NADPH的任意一种或它们的组合物；所述辅因子浓度为0.02～0.2g/L。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮浓度为100～350g/L；所述含有酮还原酶的细胞浓度为50～100g/L、所述酮还原酶酶粉的使用浓度为8.3～25g/L；所述水/异丙醇溶液中水与异丙醇体积比为1:0.7～1.5；所述辅因子选自NADP+，其浓度为0.08～0.12g/L。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：反应温度为20～55℃，反应时间为5～36h。
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