CN114107236B - 一种酮还原酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酮还原酶突变体，该酮还原酶突变体能够将N‑叔丁氧羰基‑3‑羟基哌啶酮转化为(S)‑N‑叔丁氧羰基‑3‑羟基哌啶，1g酮还原酶能够催化50g底物，催化效能高，细胞成本低，反应时间短，具有重大的工业化应用价值。

Description

一种酮还原酶突变体
技术领域：
本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种用于制备(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的酮还原酶突变体。
背景技术：
伊布替尼(Ibrutinib)，又名依鲁替尼，是一种布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂的首创新药，2013年11月13日Pharmacyclics公司宣布美国食品药品管理局批准其作为套细胞淋巴癌的单个治疗药物，适用于之前用其他手段治疗过的套细胞淋巴癌患者，2015年发现其可用于另一新适应症——EGFR突变型的非小细胞肺癌。此外还有应用于多个适应症的临床研究包括I期临床的体瘤，II期临床的多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病、边缘带淋巴瘤、移植物抗宿主病，后期临床的弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、胰腺癌等。作为未来的重磅炸弹药物，伊布替尼具有非常好的市场前景，预计高峰年份销售额将达到115～120亿美元。
(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶是合成伊布替尼的关键手性醇中间体。目前文献报道(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的制备方法主要有化学拆分法和生物转化法。
化学拆分法是将外消旋3-羟基哌啶在手性有机酸的作用下成盐析出得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的盐，然后游离、上保护基得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。该方法存在拆分收率低、操作繁琐及成本高昂的缺点。
2009年，文献Organic Letters Vol.11，No.6，1245-1248报道了一种生物转化合成(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法。该方法利用磨碎的野生胡萝卡根为生物催化剂，将N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶酮还原得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，该方法存在生物催化剂大量获得困难及产物光学纯度不高等问题，反应效率太低、生产成本过高，难以产业化应用。
CN103789368B中公开了一种醇脱氢酶催化制备(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法，该方法虽然转化率(99％)和产物ee值都较高(>99.5％)，但是反应过程中底物浓度太低为1 g/L，仅停留在实验室研究阶段，无法工业化放大应用。
发明内容：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于制备(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的酮还原酶突变体。
一方面，本发明提供的酮还原酶突变体的氨基酸序列是以SEQID NO.2所示的酮还原酶为参考序列发生突变的氨基酸序列，突变位点为第67位的天冬氨酸突变为甘氨酸，第91位的亮氨酸突变为甘氨酸，第113位的半胱氨酸突变为丙氨酸，第150位的谷氨酰胺突变为丙氨酸，第153位的苯丙氨酸突变为缬氨酸。
进一步，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步，所述酮还原酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述酮还原酶突变体来源于细长聚球藻(Synechococcuselongatus)，野生型模板NCBI的登录号为AAB82041.1。
更进一步，酮还原酶突变体表达于基因工程菌，优选大肠杆菌或酵母菌。
另一方面，本发明提供的酮还原酶突变体可以将N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶酮转化为(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，具体方案如下：
进一步，所述酮还原酶突变体为酮还原酶酶粉或含有该酮还原酶的全细胞或细胞破碎液，优选酮还原酶酶粉。
进一步，所述酮还原酶酶粉浓度为1～10 g/L。
进一步，所述酮还原酶细胞浓度为5～50 g/L。
进一步，所述N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮浓度为10～250 g/L。
进一步，该反应在辅酶和辅酶再生体系中进行。
更进一步，辅酶因子选自NAD+、NADH、NADP+和NADPH的任意一种或它们的组合物，优选NADP+，辅酶浓度为0.001～1g/L。
进一步，该反应在缓冲溶液中进行，其中缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，优选磷酸盐缓冲液，缓冲液的浓度为50～100 mmol/L。
进一步，该反应在pH＝5～8、温度为20～45℃下进行。
本发明的有益效果在于，本发明公开的酮还原酶突变体能够将N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮转化得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，1 g酮还原酶能够催化50 g底物，催化效能高，细胞成本低，具有重大的工业化应用价值。
附图说明
无
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1构建酮还原酶的定点饱和突变体库
对SEQ ID No.2(对应的核苷酸序列为SEQ ID No.1)的酮还原酶通过计算机模拟结构，与底物进行对接，推测67位点、91位点、113位点、150位点、153位点与催化作用密切相关，对这些位点构建饱和突变体库，具体序列信息见表1。
表1饱和突变的引物序列
表1中带下划线的序列为突变位点，利用全质粒PCR扩增反应，扩增出带有突变基因的载体。接着利用DpnI限制性内切酶对PCR产物进行重组质粒模板消化，再经过纯化之后，转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态，之后将其涂布于含有50 ug/L Amp的LB平板上，在37℃的培养箱中倒置培养18小时长出单克隆。
实施例2阳性克隆的高通量筛选
对每个突变体随机挑选188个单克隆进行96孔板振荡培养，每个96孔板接种两个未突变的菌种为对照组(control)，共计10块96孔板。具体操作为：在无菌的96孔板中加入400 uL的LB培养基，37℃培养约12小时，按照10％的接种量，转接于第二个96孔板中培养，继续培养3小时，加入终浓度为0.1 mM的IPTG诱导表达16小时，诱导温度25℃。培养结束后离心弃上清，冻存于-20℃冰箱中待用。
按照表2配制转化体系，用排枪吸取300 uL转入上述离心后的96孔板中，在40℃的恒温振荡器中，300 rpm的转速下反应4小时(此为对照组转化约一半底物的反应时间)，70℃失活。最后对所有转化反应液进行TLC点板检测，选取转化率高于对照组的候选反应液，乙酸乙酯萃取后进行GC检测。
表2筛选饱和突变体库的反应液体系
原料 浓度
底物 200 g/L
异丙醇 30％
NADP+ 0.2 g/L
pH7.0磷酸钾Buffer 100 mM
实施例3阳性候选突变体的测序
在每个饱和突变体文库中，选取转化率最高(大于WT)，且GC检测中手性纯度>99.5％(ee>99.0％)的突变体进行测序，根据序列比对发现突变体分别为D67G，L91G，C113A，Q150A，F153V。表3为测序获得的序列突变信息。将其命名为Mu01-Mu05。
表3测序后的密码子和氨基酸突变信息
Name Site Sample Codon Mutation
Mu01 D67 1B6 GAT->GGT D67G
Mu02 L91 2C2 CTG->GGG L91G
Mu03 C113 1E6 TGC->GCT C113A
Mu04 Q150 1F7 CAA->GCC Q150A
Mu05 F153 2D9 TTC->GTC F153V
实施例4组合突变体的构建
在D67G突变体的基础上，构建五个位点的组合突变体，即SeqID NO.4所示氨基酸序列，将其命名为Mu06。对Mu06和未突变的WT同时接种5 mL含氨苄青霉素的LB试管培养基，37℃培养12小时，按1％接种量转接活化培养物至100 mL含氨苄青霉素的2YT液体培养基中，37℃培养OD至0.6～0.8，加入IPTG(终浓度0.1 mM)于25℃诱导培养16小时，离心收集菌体。按照表4的体系进行反应，在40℃的恒温振荡器中，300 rpm的转速下反应3小时，TLC检测结果：Mu06在3小时内即可转化完底物，而WT对照组只反应了不到一半，将Mu06反应液用乙酸乙酯萃取后，送GC检测，结果手性纯度为99.8％。
表4比较突变体催化效果的反应液体系
原料 浓度
底物 200 g/L
异丙醇 30％
NADP+ 0.2 g/L
细胞 20 g/L
pH7.0磷酸钾Buffer 100 mM
实施例5酮还原酶Mu06突变体细胞/酶粉的制备
将Mu06突变体接种至5 mL含氨苄青霉素的LB试管培养基中活化培养(37℃培养12小时)，按1％接种量转接活化培养物至400mL含氨苄青霉素的2YT液体培养基中，37℃培养OD至0.6～0.8，加入IPTG(终浓度0.1 mM)于25℃诱导培养16小时。离心收集菌体得到酮还原酶Mu06突变体细胞。用40 mL磷酸盐缓冲液(10 mM，pH 7.5)重悬20 g菌体后，于均质机中均质破碎，离心收集上清，-20℃预冻后真空冷冻干燥48小时后碾碎，即得酮还原酶Mu06突变体的酶粉。
实施例6克级(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的制备
向1 L圆底烧瓶中加入0.5 L事先配好的pH 7.0的100 mmol/L的磷酸盐缓冲液、3.0 g酮还原酶Mu06酶粉和0.004 g NADP，搅拌均匀后，加入64 g N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶酮和0.3 L异丙醇，30℃搅拌5小时，过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩甲苯得到71 g淡黄色液体；粗品加入0.5 kg正己烷，在0～50℃搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品59.2g，纯度99.8％，光学纯度99.8％，收率92.5％。
实施例7公斤级(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的制备
向20 L带夹套的玻璃反应釜中加入10 L事先配好的pH 7.0的90 mmol/L的磷酸盐缓冲液、0.1 kg酮还原酶酶粉和0.09 g NADP，搅拌均匀后，加入4 kg N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶酮和6 L异丙醇，30℃搅拌6小时，过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩得到4 kg淡黄色液体；粗品加入20 kg正己烷，在0～50℃搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品3.81kg，纯度99.9％，光学纯度99.7％，收率95％。
序列表
<110> 尚科生物医药（上海）有限公司
<120> 一种酮还原酶突变体
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 738
<212> DNA/RNA
<213> Synechococcus elongatus
<400> 1
atggctggca tgagttttct gccttctcct tttgttctga ttacaggtgc cagtagtggc 60
atcggtgcag caactgccca cgcttttgcc caagcgggtt ggtccttgct gctgttaggg 120
cgcgatcgcg gtcgcctgca atcggttgct gagtctgccc gttctcaggg tgcagcggcg 180
gtggcaacct acagtcttga tttgaccaac ctgaccgcta ttggacccgc gatcgcccag 240
ctcgtcgagc agtttggggt tcccgacgtt ctgattaaca acgcagggac tgcccaaacg 300
gggccgctgg cgaccctgtc cttatcggac ctggagtgca tctttgcgct gaatgttcac 360
agtccgctat tagtcgtgca agccctgctt ccgggaatgc gccagcgtca gcgcggcttg 420
attctcaatg tggcttccat cgccgcccaa caagccttcc ccgactgggg tgcttactgt 480
gccagtaagt cggccttggc tgcctggtcg cgggtgctgg ctgcagaaga gcgatcgcac 540
ggcatccggg tctcgctaat ctgccctggc tctgttgata cggcgctctg ggaccaaccc 600
agcgtgggcg ctaacttcga tcgccaggcc atgttgcggc ccgaaacagt tgcccaagtg 660
ctgctgcagg tggcgacctt gccggagacg gcagtggtgg atgagctgac cctcatgccc 720
aatgcgggca cgttttag 738
<210> 2
<211> 245
<212> PRT
<213> Synechococcus elongatus
<400> 2
Met Ala Gly Met Ser Phe Leu Pro Ser Pro Phe Val Leu Ile Thr Gly
1 5 10 15
Ala Ser Ser Gly Ile Gly Ala Ala Thr Ala His Ala Phe Ala Gln Ala
20 25 30
Gly Trp Ser Leu Leu Leu Leu Gly Arg Asp Arg Gly Arg Leu Gln Ser
35 40 45
Val Ala Glu Ser Ala Arg Ser Gln Gly Ala Ala Ala Val Ala Thr Tyr
50 55 60
Ser Leu Asp Leu Thr Asn Leu Thr Ala Ile Gly Pro Ala Ile Ala Gln
65 70 75 80
Leu Val Glu Gln Phe Gly Val Pro Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gly
85 90 95
Thr Ala Gln Thr Gly Pro Leu Ala Thr Leu Ser Leu Ser Asp Leu Glu
100 105 110
Cys Ile Phe Ala Leu Asn Val His Ser Pro Leu Leu Val Val Gln Ala
115 120 125
Leu Leu Pro Gly Met Arg Gln Arg Gln Arg Gly Leu Ile Leu Asn Val
130 135 140
Ala Ser Ile Ala Ala Gln Gln Ala Phe Pro Asp Trp Gly Ala Tyr Cys
145 150 155 160
Ala Ser Lys Ser Ala Leu Ala Ala Trp Ser Arg Val Leu Ala Ala Glu
165 170 175
Glu Arg Ser His Gly Ile Arg Val Ser Leu Ile Cys Pro Gly Ser Val
180 185 190
Asp Thr Ala Leu Trp Asp Gln Pro Ser Val Gly Ala Asn Phe Asp Arg
195 200 205
Gln Ala Met Leu Arg Pro Glu Thr Val Ala Gln Val Leu Leu Gln Val
210 215 220
Ala Thr Leu Pro Glu Thr Ala Val Val Asp Glu Leu Thr Leu Met Pro
225 230 235 240
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245
<210> 3
<211> 738
<212> DNA/RNA
<213> Synechococcus elongatus
<400> 3
atggctggca tgagttttct gccttctcct tttgttctga ttacaggtgc cagtagtggc 60
atcggtgcag caactgccca cgcttttgcc caagcgggtt ggtccttgct gctgttaggg 120
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ctcgtcgagc agtttggggt tcccgacgtt gggattaaca acgcagggac tgcccaaacg 300
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<211> 245
<212> PRT
<213> Synechococcus elongatus
<400> 4
Met Ala Gly Met Ser Phe Leu Pro Ser Pro Phe Val Leu Ile Thr Gly
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Ala Thr Leu Pro Glu Thr Ala Val Val Asp Glu Leu Thr Leu Met Pro
225 230 235 240
Asn Ala Gly Thr Phe
245

Claims (5)

1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列是以SEQ IDNO.2所示的酮还原酶为参考序列发生突变的氨基酸序列，突变位点为第67位的天冬氨酸突变为甘氨酸，第91位的亮氨酸突变为甘氨酸，第113位的半胱氨酸突变为丙氨酸，第150位的谷氨酰胺突变为丙氨酸，第153位的苯丙氨酸突变为缬氨酸。
2.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的基因核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体表达于基因工程菌。
5.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体能够将N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶酮转化为(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。
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MULTISPECIES: SDR family oxidoreductase [Synechococcus].NCBI.2019,WP_011242366.1. *
unknown [Synechococcus elongatus PCC 7942 = FACHB-805].NCBI.1997,AAB82041.1. *

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