CN109456949A - 一种用于制备r型去氧肾上腺素的酮还原酶突变体 - Google Patents

一种用于制备r型去氧肾上腺素的酮还原酶突变体 Download PDF

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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract

本发明涉及一种用于制备R型去氧肾上腺素的酮还原酶突变体，属于蛋白质工程技术领域。通过蛋白质工程对酮还原酶进行饱和突变，构建出突变体文库，并对该文库进行筛选，得到了在催化α‑氯代‑3‑羟基苯乙酮转化为(R)‑2‑氯‑1‑(3‑羟基苯基)乙醇中间体过程中，手性选择性提高的酮还原酶突变体，中间体ee值由突变模板酶的98.5％提高至99.8％，可以不需提纯直接用于后续化学反应，直接制备R型去氧肾上腺素，工艺得到了进一步简化，降低了生产成本，适合工业化生产。

Description

一种用于制备R型去氧肾上腺素的酮还原酶突变体
技术领域
本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种用于制备R型去氧肾上腺素的酮还原酶突变体。
背景技术
去氧肾上腺素(phenylephrine，PE)，又名苯肾上腺素，是一种α1受体激动药物，具有血管收缩作用。去氧肾上腺素由于侧链存在手性碳原子而存在异构体，分为R型去氧肾上腺素和S型去氧肾上腺素，其中R型异构体的受体激动作用远强于S型异构体。
在临床中，广泛应用于阵发性室上性心动过速、在休克及麻醉时用于维持血压、在眼科检查中可作为安全的短效扩瞳药使用，作为伪麻黄碱最简单有效的替代品，R型去氧肾上腺素在非处方感冒药中的使用也呈现增长趋势。
R型去氧肾上腺素最初是通过化学法进行手性拆分来制得的，后来随着合成工艺的改进，开始采用不对称氢化方法制备R型去氧肾上腺素。
鉴于生物酶具有独特的催化专一性，反应温和等优点，越来越多的研究学者采用生物法手性拆分R型去氧肾上腺素。
专利US8617854公开报道一种采用酶催化技术改进R型去氧肾上腺素的制备工艺。他们使用固氮弧菌属物种EBN1的醇脱氢酶催化合成R型去氧肾上腺素的中间体(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇，底物浓度<50mM(8.5g/L)，ee值未见报道。该路线使用了醇脱氢酶(EC1.1.1.1)作为生物催化剂，且在两相液体反应介质中进行。由于在两相反应体系中，反应产物与水分离，不利于使反应液直接参与下一步的甲胺化反应，增加了操作成本。
因此，目前急需一种能够在单相体系中，具有高催化效率、高手性选择性地还原α-氯代-3-羟基苯乙酮为(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇的酮还原酶，以此简化和改进R型去氧肾上腺素的合成工艺，提高原料药R型去氧肾上腺素的生产效率。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明提供一种用于制备R型去氧肾上腺素的酮还原酶突变体。
一方面，本发明提供的酮还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.2所编码的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，所述发生突变的氨基酸序列的突变位点为第199位的天冬酸突变为亮氨酸。
进一步，所述酮还原酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
进一步，酮还原酶表达于基因工程菌，如大肠杆菌或酵母菌。
进一步，所述酮还原酶用于制备R型去氧肾上腺素，见Scheme 1。
更进一步，α-氯代-3-羟基苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇，产物ee值可达99.8％。
进一步，基因编码权利要求1所述的酮还原酶突变体。
进一步，所述的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
本发明有益效果：提供一种制备手性纯度提高的R型去氧肾上腺素的酮还原酶突变体，用于催化α-氯代-3-羟基苯乙酮转化为(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇，生产过程在单相体系进行，产物(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇ee值达99.8％，并且反应的原料转化率超过99％，所制备的产物浓度达300g/L,能够使得底物完全、高效的转化成为目标产物。提高了产物的手性纯度，并且所制备的产物可直接进行第二步反应，简化了后处理工艺成本，整个工艺流程环境友好，原子利用率高。
附图说明
图1为反应底物α-氯代-3-羟基苯乙酮的手性HPLC分析谱图
图2为消旋2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇标品的手性HPLC分析谱图
图3为实施例5反应液的手性HPLC分析谱图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1构建酮还原酶的定点饱和突变体库
对(SEQ ID No.2，对应的核苷酸序列为SEQ ID No.1)的酮还原酶通过计算机模拟结构，与底物进行对接，推测199位点与催化作用密切相关，对该位点构建饱和突变体库，具体序列信息见表1。
表1饱和突变的引物序列
表1中带下划线的序列为突变位点，利用全质粒PCR扩增反应，扩增出带有突变基因的载体。接着利用DpnI限制性内切酶对PCR产物进行重组质粒模板消化，再经过纯化之后，转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态，之后将其涂布于含有50ug/L Amp的LB平板上，在37℃的培养箱中倒置培养18h长出单克隆。
实施例2阳性克隆的高通量筛选
随机挑选188个单克隆进行96孔板振荡培养，在无菌的96孔板中加入400uL的LB培养基，37℃培养约12h，按照10％的接种量，转接于第二个96孔板中培养，继续培养约3h，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达16h，诱导温度25℃。培养结束后离心弃上清，冻存于-20℃冰箱中待用。
按照表2配制转化体系，用排枪吸取400uL转入上述离心后的96孔板中，在30℃的恒温下，400rpm的转速下反应24h。最后对所有转化反应液进行TLC点板检测，选取几乎能完全转化底物的候选反应液，进行手性HPLC检测。
表2筛选饱和突变体库的转化体系
实施例3阳性候选突变体的测序
从TLC和HPLC结果中，找到转化率>95％，且手性纯度>99.9％(ee>99.8％)的突变体编号，共3个，选取相应的菌种进行测序，根据序列比对发现突变氨基酸均变为了Leu，选取1C7为突变体菌种进行保种。表3为测序获得的序列突变信息。
表3测序后的密码子和氨基酸突变信息
Sample Codon Mutation
1C7 GAC->CTG D199L
1F2 GAC->TTG D199L
2B6 GAC->CTA D199L
实施例4酮还原酶突变体细胞/酶粉的制备
将突变体1C7(载体pET21a，宿主细胞E.Coli BL21(DE3))接种至5mL含氨苄青霉素的LB试管培养基中活化培养(37℃培养12h)，按1％接种量转接活化培养物至400mL含氨苄青霉素的2YT液体培养基中，37℃培养OD至0.6-0.8，加入IPTG(终浓度0.1mM)于25℃诱导培养16h。离心收集菌体得到酮还原酶突变体细胞。若要制备酶粉以利于长期保存，则用40mL磷酸盐缓冲液(10mM，pH 7.5)重悬20g菌体后，于均质机中均质破碎，离心收集上清，-20℃预冻后真空冷冻干燥48h后碾碎，即得酮还原酶突变体1C7酶粉。
实施例5(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇的制备
于10mL反应体系中加入2-丁醇(8mL)及底物α-氯代-3-羟基苯乙酮(3g)，搅拌均匀后加入1C7细胞1g、辅酶NADP 2mg，最后采用磷酸盐缓冲液定容至10mL，30℃下磁力搅拌反应。反应24h结束后取样，用2倍体积乙酸乙酯萃取，送手性HPLC检测。底物α-氯代-3-羟基苯乙酮的手性HPLC图谱如图1所示；消旋体的2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇手性HPLC如图2所示；反应液的手性HPLC如图3所示。检测可知底物转化率＝99.2％，产物ee值＝99.8％。
实施例6 R型去氧肾上腺素的制备
于100mL反应体系中加入2-丁醇(80mL)及底物α-氯代-3-羟基苯乙酮(20g)，搅拌均匀后加入1C7细胞10g、辅酶NADP 20mg，最后采用磷酸盐缓冲液定容至100mL，30℃下磁力搅拌反应。反应24h结束后，加入一甲胺的乙醇溶液(30％)22mL，加入NaOH 0.1g，于40℃反应3h，加入3倍体积水后开始分层，离心收集有机相，水相使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，硅藻土过滤，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品，取样溶于乙酸乙酯中，HPLC检测。底物转化率＝99.7％，R型产物ee值＝99.8％。
序列表
<110> 尚科生物医药（上海）有限公司
<120> 一种用于制备R型去氧肾上腺素的酮还原酶突变体
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 759
<212> DNA
<213> Lactobacillus kefiri
<400> 1
atgaccgacc gtctgaaatc taaagttgct atcgttaccg gtggtaccct gggtatcggt 60
ctggctatcg ctgacaaatt cgttgctgaa ggtgctaaag ttgttatcac cggtcgtcac 120
gctgacgttg gtgaaaaagc tgctaaatct atcggtggta ccgacgttat ccgtttcgtt 180
cagcacgacg cttctgacga agctggttgg accaaactgt tcgacaccac cgaagaagcg 240
ttcggtccgg ttaccaccgt tgttaacaac gcgggcatcg ctgtaagcaa atctgttgaa 300
gacaccacca ccgaagaatg gcacaaactg ctgtctgtta acctggacgg tgttttcttc 360
ggtacccgtc tgggtatcca gcgtatgaaa aacaaaggtc tgggtgcttc tatcatcaac 420
atgtcttcta tctctggtct ggttggtgac ccgaccctgg gtgcttacaa cgcttctaaa 480
ggtgctatcc gtatcatgtc taaatctgct gctctggact gcgctgttaa agactacgac 540
gttcgtgtta acaccgttca cccgggttac atcaaaaccc cgctggttga caaagacccg 600
ggtgctgaag aaatgatgtc tcagcgtacc cgtaccccga tgggtcacat cggtgaaccg 660
aacgacgttg cttggatctg cgtttacctg gcttctgacg aatctaaatt cgctaccggt 720
gctgaattcg ttgttgacgg tggttacacc gctcagtaa 759
<210> 2
<211> 252
<212> PRT
<213> Lactobacillus kefiri
<400> 2
Met Thr Ala Ala Leu Leu Ser Leu Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Ala Leu Pro Val Ala Gly Gly Ala
20 25 30
Leu Val Val Ile Thr Gly Ala His Ala Ala Val Gly Gly Leu Ala Ala
35 40 45
Leu Ser Ile Gly Gly Thr Ala Val Ile Ala Pro Val Gly His Ala Ala
50 55 60
Ser Ala Gly Ala Gly Thr Thr Leu Leu Pro Ala Thr Thr Gly Gly Ala
65 70 75 80
Pro Gly Pro Val Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Gly Ile Ala Val Ser
85 90 95
Leu Ser Val Gly Ala Thr Thr Thr Gly Gly Thr His Leu Leu Leu Ser
100 105 110
Val Ala Leu Ala Gly Val Pro Pro Gly Thr Ala Leu Gly Ile Gly Ala
115 120 125
Met Leu Ala Leu Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Ala Met Ser Ser Ile
130 135 140
Ser Gly Leu Val Gly Ala Pro Thr Leu Gly Ala Thr Ala Ala Ser Leu
145 150 155 160
Gly Ala Ile Ala Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Leu Ala Cys Ala Val
165 170 175
Leu Ala Thr Ala Val Ala Val Ala Thr Val His Pro Gly Thr Ile Leu
180 185 190
Thr Pro Leu Val Ala Leu Ala Pro Gly Ala Gly Gly Met Met Ser Gly
195 200 205
Ala Thr Ala Thr Pro Met Gly His Ile Gly Gly Pro Ala Ala Val Ala
210 215 220
Thr Ile Cys Val Thr Leu Ala Ser Ala Gly Ser Leu Pro Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Gly Pro Val Val Ala Gly Gly Thr Thr Ala Gly
245 250
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<211> 759
<212> DNA
<213> Lactobacillus kefiri
<400> 3
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<210> 4
<211> 252
<212> PRT
<213> Lactobacillus kefiri
<400> 4
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1 5 10 15
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225 230 235 240
Ala Gly Pro Val Val Ala Gly Gly Thr Thr Ala Gly
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Claims (8)

1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ IDNO.2所编码的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，所述发生突变的氨基酸序列的突变位点为第199位的天冬氨酸突变为亮氨酸。
2.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶表达于基因工程菌。
4.如权利要求3所述的基因工程菌为大肠杆菌或酵母菌。
5.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶用于制备R型去氧肾上腺素。
6.如权利要求4所述的酮还原酶用于制备R型去氧肾上腺素，其特征在于，α-氯代-3-羟基苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇，产物ee值可达99.8％。
7.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的酮还原酶突变体。
8.如权利要求7所述的基因，其特征在于，所述的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
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