CN108410830A - 一种酮还原酶及其催化制备(s)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酶法制备手性醇，属于基因工程技术用于制备医药中间体的领域。本发明提供一种酮还原酶及其催化制备(S)‑1‑(2‑氯苯基)乙醇的方法。在该方法中邻氯苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为(S)‑1‑(2‑氯苯基)乙醇。通过特定氨基酸序列的酮还原酶用于催化制备(S)‑1‑(2‑氯苯基)乙醇，实现底物99％以上的转化率，所制备的产物ee值不低于99.5％，且反应的底物浓度最高280g/L,具备工业放大生产的价值。该反应能够使得底物完全、高效的转化成为目标产物，并且所制备的产物分离提纯简单，后处理成本低，整个工艺流程环境友好度高，原子利用率高。

Description

一种酮还原酶及其催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法

技术领域

本发明涉及一种医药中间体制备方法，尤其涉及一种酮还原酶及其催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法。

背景技术

(S)-1-(2-氯苯基)乙醇英文名称(S)-1-(2-chlorophenyl)ethanol，对应的CAS号：131864-71-6，分子结构式为：

该分子中拥有卤代苯基、手性羟基等活性基团，被广泛用作合成医药、农药及其它精细化学品的重要手性砌块。例如葛兰素史克GSK-461364A项目的肿瘤药物分子CAS#929095-18-1；Schwabe公司ADD-137022项目的癫痫药物CAS#112856-44-7；大麻素受体2药物CAS#1438465-84-9分子均以(S)-1-(2-氯苯基)乙醇为关键手性中间体进行制备。各药物分子结构式为：

除此之外，(S)-1-(2-氯苯基)乙醇在医药化工领域仍具有广阔的市场需求。目前化学合成领域已开发出多种光学活性手性醇合成的方法，包括动力学拆分和不对称合成。其中，利用前手性羰基化合物通过生物酶催化的不对称还原合成光学活性手性醇的途径，是生产光学活性手性醇的重要方法。

文献Tetrahedron:Asymmetry 22(2011)345–350报道采用来自C.la urentiia的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，收率约80％，底物浓度最高18g/L。

文献P.Vitale et al./Tetrahedron:Asymmetry 24(2013)389–394报道采用Kluyveromyces marxianus CBS 6556的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，收率90％，产物ee值为92％，底物浓度为100g/L，反应时间约96h。

文献Biotechnology and Bioengineering,Vol.108,No.4,April,2011报道采用全细胞啤酒酵母催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，底物浓度仅15.4g/L。

文献Tetrahedron Letters 57(2016)899–904报道采用Kuraishia c apsulateCBS1993的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，底物浓度为7.38g/L。

文献Biotechnol Lett(2012)34:2083–2086报道采用Chlorella sp.MK201的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，收率约69％，底物浓度最高0.5g/L。

文献J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,2000,3205–3211报道采用G eotrichumcandidum的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，底物浓度为4.1g/L。

文献Tetrahedron:Asymmetry 20(2009)1521–1525报道采用Asperg illusterreus、Rhizopus oryzae的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，转化率为44％～49％，底物浓度为0.47g/L。

文献Appl Microbiol Biotechnol(2012)93:1075–1085报道采用Rhod ococcussp.ST-10、Leifsonia sp.S749的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，转化率为1.25％，底物浓度为1.5g/L。

文献Catal Lett(2016)146:1079–1086报道采用R.mucilaginosa C CTCCM2014255的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，转化率为94.4％，底物浓度为9.24g/L。

专利CN102876734采用Kluyveromyces thermotolerans CGMCC 2.1492的酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，底物浓度为154g/L，但此浓度下转化率仅为5％。

专利CN103667368采用干面包酵母催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，转化率为88％，底物浓度为6.6g/L。

鉴于现有技术中，还原邻氯苯乙酮得到(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的生物催化工艺多存在底物浓度低、转化率低、工艺不具备工业生产实用价值的问题，阻碍酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的工艺推向工业化生产。

因此，目前急需一种新的适于工业化应用的技术，实现高转化率、高底物浓度、低成本制备高光学纯度的(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，满足药物研发与生产方面的市场需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酮还原酶及其催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法,该方法能够通过高转化率、高光学纯度、高底物浓度的生物催化工艺制备出(S)-1-(2-氯苯基)乙醇。

技术方案

一种酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，如式III所示，将邻氯苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇：

式III中所采用的酮还原酶(KRED)的氨基酸序列如(a)或(b)所述：

(a)、所述酮还原酶具有如表SEQ ID No.2所记载的氨基酸序列；

(b)、所述酮还原酶为将表SEQ ID No.2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且能催化邻氯苯乙酮转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的酮还原酶的序列。

进一步，(b)所述的酮还原酶的氨基酸序列与(a)所述酮还原酶的氨基酸序列具备85％以上的同源性，且该氨基酸序列所编码的酮还原酶能催化邻氯苯乙酮转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇。

进一步，(b)所述的酮还原酶的氨基酸序列与(a)所述酮还原酶的氨基酸序列具备90％以上的同源性，优选为具备93％以上的同源性，更优选为具备95％以上的同源性，最优选为具备97.5％以上的同源性。

进一步，所述酮还原酶的基因如下(c)或(d)：

(c)、基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示；

(d)、与(c)具有N％以上的同源性(N选自85、90、97.5、99)，且能编码催化邻氯苯乙酮转换为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的酮还原酶的基因。

一种含有上述基因的重组表达载体、重组菌或转基因细胞系。

进一步，上述酮还原酶以酮还原酶酶粉、酮还原酶酶液、含酮还原酶的细胞等形式参与催化反应，用于催化邻氯苯乙酮转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇。

进一步，所述酮还原酶催化邻氯苯乙酮制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的工艺步骤包括：将邻氯苯乙酮、酮还原酶酶粉或含有该酮还原酶的细胞(本技术方案中所述“含有酮还原酶的细胞”是指本技术领域常见的用于生产发酵的工程细菌，比如酵母菌、大肠杆菌等。)、辅酶配置成水/异丙醇混合溶液，反应得到产物。

进一步，所述邻氯苯乙酮浓度为1～280g/L，优选为180～280g/L，更优选为200～280g/L；

进一步，所述酮还原酶的酶粉使用质量与含有酮还原酶细胞的使用质量之比为1:4～6。即1质量份数的酮还原酶酶粉催化效率相当于4～6质量份数酮还原酶细胞的催化效率。

进一步，所述含有酮还原酶的细胞浓度为20～90g/L，优选为30～70g/L。如果采用酮还原酶酶粉替换酮还原酶细胞，则酮还原酶酶粉的使用浓度为4～20g/L；

进一步，所述异丙醇水溶液中，水与异丙醇体积比为1:1～3，优选为1:1.5～2.5；

进一步，反应体系中可以加入辅酶促进反应，当采用含酮还原酶的细胞时，细胞内部含有少量辅酶，此时也可以不加入辅酶；某些情况下制备的酮还原酶酶粉中亦含有少量辅酶，此时也可以不加入辅酶。但反应体系中也可以加入辅酶进一步促进反应进行，当反应体系中加入辅酶促进反应时，所述辅酶选自NADP⁺；添加辅酶的浓度为0.02～0.5g/L，优选为0.1～0.4g/L。

进一步，本技术方案中所采用的辅酶，均来自尚科生物医药(上海)有限公司对外销售的辅酶产品。

进一步，相比于其它酶催化反应，本技术方案中所提供的酶、活体微生物细胞在催化该反应过程中不需要另行添加缓冲剂，直接在水/异丙醇中即可完成催化反应。

进一步，催化邻氯苯乙酮制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的反应温度为25～40℃，反应时间为5～36h。根据本说明书的实施例部分可知，通过控制反应温度、物料浓度和配比，能够将完成反应的时间缩短至5h。但对于5h能完成反应，却仍故意延长反应时间的反应操作行为，亦视为本发明的保护范围。但过长的反应时间将导致副反应增多，产品分析纯度和光学纯度降低，因此一般不宜超过35h。

进一步，酮还原酶以酶粉形式、含酮还原酶的细胞破碎液或全细胞的形式参与反应，优选以酶粉形式参与反应。

进一步，本技术方案中，所述酮还原酶为来源于Lactobacillus kefiri的突变体，是通过对Lactobacillus kefiri的酮还原酶的突变体文库进行筛选后得到的。来源于Lactobacillus kefiri的野生型酮还原酶在NCBI的登记号为WP_054768785.1。并且本专利中所有的氨基酸序列及其可能对应的基因序列均可通过商业化的全基因合成服务制得。

进一步，所述酮还原酶由基因工程菌发酵得到，所述基因工程菌选自酵母菌、大肠杆菌，优选为酵母菌。

进一步，根据本领域技术人员可知，编码酮还原酶的DNA序列最后三个碱基为终止密码子，终止密码子可有多种碱基序列，经过替换不同碱基序列的终止密码子后，其技术方案的本质是与我们所申请的技术方案内容一致的，亦视为本发明的保护范围。

有益效果

本发明提供一种酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，该方法通过筛选出特定氨基酸序列的酮还原酶，用于催化邻氯苯乙酮转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，使得生产过程在水相高效进行，并且反应的原料转化率超过99％，所制备的产物(S)-1-(2-氯苯基)乙醇ee值不低于99.5％，底物浓度最高为280g/L,能够使得底物完全、高效的转化成为目标产物，并且所制备的产物分离提纯简单，后处理成本低，整个工艺流程环境友好度高，原子利用率高。

本技术方案提供了一种酮还原酶、及其氨基酸序列和基因序列，通过该基因序列编码的酮还原酶能够实现转化率不低于99％的催化结果，制备出ee值大于99.5％的(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，克服了现有技术酶催化制备工艺中，底物浓度低、转化率不高、产物ee值低于ICH对光学活性药物要求值的缺点，使该工艺能够切实可应用于工业化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇。并且试验中偶然发现所制备的酮还原酶粉及相应的活体微生物细胞在无缓冲剂参与下，纯水/异丙醇反应体系中依然具备良好的催化性能。这相比于其它类酮还原酶具备较大的产业优势，简化生产工艺与成本。

附图说明

图1为反应底物邻氯苯乙酮的常规HPLC分析谱图；

图2为反应底物邻氯苯乙酮的手性HPLC分析谱图；

图3为消旋体1-(2-氯苯基)乙醇的手性HPLC分析谱图；

图4为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇标准品的手性HPLC分析谱图；

图5为实施例2产物的常规HPLC分析谱图；

图6为实施例3产物的常规HPLC分析谱图；

图7为实施例4产物的常规HPLC分析谱图；

图8为实施例5产物的常规HPLC分析谱图；

图9为实施例6产物的常规HPLC分析谱图；

图10为实施例7产物的常规HPLC分析谱图；

图11为实施例2产物的手性HPLC分析谱图；

图12为实施例3产物的手性HPLC分析谱图；

图13为实施例4产物的手性HPLC分析谱图；

图14为实施例5产物的手性HPLC分析谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。

实施例1 酮还原酶的制备

将含有酮还原酶的编码基因(SEQ ID No.1)的基因工程菌(载体pET21a，宿主细胞E.Coli BL21(DE3))接种至5mL含氨苄青霉素的LB试管培养基中活化培养(37℃培养12h)，按1％接种量转接活化培养物至400mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养OD至0.6-0.8，加入IPTG(终浓度0.1mM)于25℃诱导培养16h。离心收集菌体得到酮还原酶细胞，用40mL蒸馏水重悬菌体后，于冰水浴中超声破碎15min，离心收集上清，-20℃预冻后真空冷冻干燥48h后碾碎，即得重组酮还原酶酶粉。

实施例2 克级(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的制备

向反应容器中加入异丙醇(5mL)及底物邻氯苯乙酮(1.5g)，搅拌均匀后加入酶粉0.1g、辅酶NADP⁺1mg最后采用纯水定容至10mL，30℃下磁力搅拌反应，同时TLC检测反应进程。6h后反应结束，反应液采用硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。反应液开始反应前底物的常规HPLC图谱如图1所示、底物的手性HPLC谱图如附图2所示；消旋体的1-(2-氯苯基)乙醇手性HPLC如附图3所示；(S)-1-(2-氯苯基)乙醇标准品的手性HPLC分析谱图如附图4；反应液反应完毕后的常规HPLC如图5、手性HPLC如附图11，附图5和附图11检测产物ee值及转化率可知：反应产物为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，反应中底物转化率＝99.6％，S型产物ee值＝99.9％。

实施例3 克级(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的制备

向反应容器中加入异丙醇(6.4mL)及底物邻氯苯乙酮(2.8g)，搅拌均匀后加入酮还原酶细胞0.26g、辅酶NADP⁺1.2mg，最后采用纯水定容至10mL，29℃下磁力搅拌反应，同时TLC检测反应进程。6h反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。反应液的手性HPLC如图12、反应液的常规HPLC谱图检测如附图6，附图12和6检测产物ee值及转化率可知：底物转化率＝99.5％，S型产物ee值＝99.9％。

实施例4 百克级(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的制备

向反应容器中加入异丙醇(400mL)及底物邻氯苯乙酮(280g)，搅拌均匀后加入酮还原酶细胞45g、辅酶NADP⁺0.25g，最后采用纯水定容至1.0L，35℃下磁力搅拌反应，同时TLC检测反应进程。反应13h结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。反应液的手性HPLC如图13、反应液的常规HPLC纯度谱图如附图7，附图7和13检测产物ee值及转化率可知：底物转化率＝99.3％，S型产物ee值＝99.7％。

实施例5 公斤级(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的制备

向反应容器中加入异丙醇(10L)及底物邻氯苯乙酮(5.0Kg)，搅拌均匀后加入酮还原酶的酶粉0.75Kg、辅酶NADP⁺(5.2g)，最后采用纯水定容至20L，40℃下磁力搅拌反应，同时TLC检测反应进程。经过20h反应结束后硅藻土过滤，液相减压蒸出有机溶剂，水相再采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。反应液的手性HPLC如图14、反应液的常规HPLC谱图如附图8，附图8和14检测产物ee值及转化率可知：底物转化率＝99.4％，S型产物ee值＝99.7％。

实施例6 高底物浓度制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇

向反应容器中加入异丙醇(6mL)及底物邻氯苯乙酮(3.0g)，搅拌均匀后加入酮还原酶细胞0.28g、辅酶NADP⁺1mg，最后采用纯水定容至10mL，30℃下磁力搅拌反应，同时TLC检测反应进程直至底物浓度不变为止，约反应40h，后采用硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。反应液的常规HPLC谱图检测如附图9，可知：底物转化率＝95.7％。

实施例7 高底物浓度制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇

向反应容器中加入异丙醇(6mL)及底物邻氯苯乙酮(2.9g)，搅拌均匀后加入酮还原酶细胞0.28g、辅酶NADP⁺1mg，最后采用纯水定容至10mL，30℃下磁力搅拌反应，同时TLC检测反应进程直至底物浓度不变为止，约反应42h，后采用硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。反应液的常规HPLC谱图检测如附图10，可知：底物转化率＝95.3％。

综上所述，可以根据实施例2～7的谱图分析结果看出，本技术方案所提供的酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇时，其底物浓度控制不超过280g/L，底物转化率即可实现99％以上，并且不受放大反应当量的影响。当底物浓度超过290g/L，将原反应时间延长一倍后底物转化率仍不超过96％。

序列表

<110> 尚科生物医药（上海）有限公司

<120> 一种生物催化工艺制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgactgatc gtctgaaggg caaagtagcc ctggtaaccg gcgggacgct gggtatcggt 60

ttggcaatcg ccgataaatt tgtagaggag ggtgcgaaag tagttattac tggtcgtcac 120

gcggatgtag gtgaaaaggc cgccaaatca atcggcggca ctgatgttat tcgctttgtc 180

cagcacgatg tatccgatga ggcaggctgg acgaaactgt tcgacatcac cgaggaggca 240

ttcggcccgg ttacgaccgt cgtgaacaat gcagggattg caatgctgaa aagccttgaa 300

gacactacca cggaggaatg gcgtaaactg ctgtccgtta atctggatgg tgtttttttc 360

ggcacccgtc tgggcattca gcgcatgaaa aataaaggct tgggcgctag catcatcaat 420

atgagcagta ttgcggggat catcggcgat ccgaccatgg gggcatacaa cgctaccaag 480

ggggcggtac gtatcatgtc gaaaagcgca gcgctggatt gcgcactgaa ggactacgat 540

gtgcgtgtca acacagtaca tccgggcggt atcaagaccc cgctggtcgc agatctgccg 600

ggttttgagg aaatgtgttc acagcgtacg aaaaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660

aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720

gcagaatttg tggtcgacgg cgggtttacc gcacagtaa 759

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Val

50 55 60

Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Ile Thr Glu Glu Ala

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Met Leu

85 90 95

Lys Ser Leu Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Ala Gly Ile Ile Gly Asp Pro Thr Met Gly Ala Tyr Asn Ala Thr Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Gly Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Leu Val Ala Asp Leu Pro Gly Phe Glu Glu Met Cys Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala

210 215 220

Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Phe Thr Ala Gln

245 250

Claims (9)

1.一种酮还原酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.2 所示，或其氨基酸序列与SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列具备97.5% 以上同源性。

2.一种酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，其特征在于：邻氯苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，所述酮还原酶的氨基酸序列如（a）或（b）所述：

（a）、所述酮还原酶具有如表SEQ ID No.2 所记载的氨基酸序列；

（b）、所述酮还原酶为将表SEQ ID No.2 中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且能催化邻氯苯乙酮转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的酮还原酶。

3.如权利要求2所述的酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，其特征在于：（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备90%以上的同源性，且能催化邻氯苯乙酮转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇。

4.如权利要求2所述的酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，其特征在于：所述酮还原酶的基因序列如下（c）或（d）所示：

（c）、基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示基因序列；

（d）、与（c）具有90%以上的同源性，且能催化邻氯苯乙酮转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的酮还原酶的基因序列。

5.如权利要求2所述的酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，其特征在于：邻氯苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为(S)-1-(2-氯苯基)乙醇，步骤包括：将邻氯苯乙酮、酮还原酶酶粉或含有酮还原酶的细胞、辅酶配制成水/异丙醇混合溶液，反应得到产物。

6.如权利要求5所述的酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，其特征在于：所述邻氯苯乙酮浓度为1～280g/L；酮还原酶酶粉浓度为2～20g/L或含有酮还原酶的细胞的浓度为20～90g/L。

7.如权利要求5所述的酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，其特征在于：反应时间为5～36h。

8.如权利要求5所述的酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，其特征在于：所述辅酶为NADP⁺；所述辅酶浓度为0.1～0.4g/L。

9.如权利要求5所述的酮还原酶催化制备(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的方法，其特征在于：所述含有酮还原酶的细胞选自基因工程改造的酵母菌或大肠杆菌。