CN109666687A - 一种生物转化生产鲨肌醇的大肠埃希氏菌工程菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种生物转化生产鲨肌醇的大肠埃希氏菌工程菌株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株大肠埃希氏菌工程菌株及其构建方法，以及利用该菌株进行的鲨肌醇的制造方法，属于生物技术领域，其特征在于包括稳定的重组表达质粒及重组表达质粒构建大肠埃希氏菌工程菌株pSI3的方法和利用得到的所述的重组大肠埃希氏菌工程菌株pSI3催化肌醇生产鲨肌醇的方法，本发明的有益效果是:利用该工程菌株的静息细胞法催化肌醇生产鲨肌醇，由于肌醇转运蛋白的存在，底物肌醇的浓度在反应温度下可得到最大化，可以充分利用细胞进行鲨肌醇的转化生产，利用该工程菌株进行发酵培养，处理后菌体可以收集进行静息细胞反应，发酵液粗处理后既可以用于鲨肌醇的分离提取，也可以重复用于菌株的发酵培养。

Description

一种生物转化生产鲨肌醇的大肠埃希氏菌工程菌株及其构建 方法和应用
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地涉及利用分子生物学方法和微生物学方法制备一株大肠埃希氏菌工程菌株及其构建方法，以及利用该菌株进行的鲨肌醇的制造方法。
背景技术：
鲨肌醇是一种环己烷的多元羟基衍生物，在一些植物和哺乳动物中存在，分布广，但含量少。它具有与肌醇相似的化学和生理性质，并且还被发现具有一些特殊的生物活性。
鲨肌醇可以透过人体的血脑屏障，降解人脑内积聚的β-淀粉样蛋白斑块，而β-淀粉样蛋白的沉积是人体脑内老年斑周边神经元变性和死亡的主要原因。因此鲨肌醇对治疗阿尔茨海默病、唐氏综合症和Angelman综合症等脑部疾病具有一定效果。
鲨肌醇的获得主要有三种方法：提取法、化学转化法和生物合成法。提取法和化学方法操作较为复杂，并且有污染，不够安全环保；而生物合成法由于反应条件温和，能耗低，环境友好，正在被广泛研究和应用。
目前国内尚无鲨肌醇的生产和研制报告。国外则主要为日本和欧美的研究报告，包括生理代谢过程、生产方法和在医药上的应用等。其中：
专利号为EP1674578B1和CN1867676A的发明，阐述了利用筛选获得的醋杆菌属的菌株，进行突变育种后，可以将肌醇通过鲨肌糖转化为鲨肌醇，并对相关反应的酶进行了研究。通过向反应液中加入硼酸和金属盐形成复合物，再将其溶于酸中并从其中分离得到鲨肌醇产品。该方法整个流程操作复杂，并且反应液中副产物较多；对鲨肌醇的分离方法中包括浓盐酸的使用和硼酸的清除既不安全也难保证产品质量要求，并且鲨肌醇的产率的损耗也较大。因此存在应用局限性。
专利号为EP2357222A1和CN102203238A的发明，公开了一株可以将肌醇转化为鲨肌醇的枯草芽孢杆菌，通过对该菌内部酶系的研究，对其进行了基因改造，得到的变异菌株通过发酵可以直接得到鲨肌醇。但是发酵液中可能会有副产物D-手性肌醇，同时鲨肌醇的转化效率也较低，最高转化率仅为16%。
专利号为EP2811029A1、CN104245950A和TWI506137B的发明，通过基因工程方法，构建了含有肌醇-1-磷酸合酶基因、肌醇-单磷酸酶基因、肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因的工程菌株，通过发酵培养可以直接将葡萄糖和其相似物等转化为鲨肌醇。其在底物利用情况上有一定的进步性，但在生产上也存在一定的局限性。培养基成分较复杂，一次发酵时间较长，发酵液中存在副产物葡萄糖-鲨肌醇衍生物，最终鲨肌醇的产率仅为12.4g/L。这可能与参与反应的酶系较多，反应难以最大化协调作用有关。
发明内容：
本发明提供了一株生物转化生产鲨肌醇的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3、一种生物转化生产鲨肌醇的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3的构建方法及应用该菌株进行生物转化鲨肌醇的方法。
解决的第一个技术问题是：化学方法合成鲨肌醇使用高温条件和强酸，产生了污染环境的大量的含有盐类物质酸性废水的问题；
解决的第二个技术问题是：离体酶稳定性差，持续反应受限的问题；
解决的第三个技术问题是：通过微生物发酵生产鲨肌醇，发酵液成分复杂，鲨肌醇的分离提取过程复杂，成本较高。
本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：
稳定的重组表达质粒，所述质粒的载体为pCOLADuet-1，所述重组表达质粒包含：一段编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸；
所述编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸包括在宿主细胞中表达肌醇-2-脱氢酶基因的聚核苷酸和在宿主细胞中表达鲨肌醇脱氢酶基因的聚核苷酸；
所述宿主细胞为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21（DE3）；
所述的编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸还包括包含在宿主细胞中表达转运蛋白基因的聚核苷酸。
所述转运蛋白基因包括MFS1和MFS2，所述MFS1的多核苷酸序列为：SEQ NO3所示的DNA序列MFS1；所述转运蛋白基因MFS2的多核苷酸序列为：SEQ NO4所示的DNA序列MFS2。
所述的肌醇-2-脱氢酶基因的多核苷酸序列为：SEQ NO1所示的DNA序列iolG；所述的鲨肌醇脱氢酶基因的多核苷酸序列为：SEQ NO2所示的DNA序列iolX。
进一步地，所述的重组表达质粒构建大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3的方法：其特征在于包括如下步骤：
第1步：利用引物1和引物2得到脱氢酶基因（iolG），连接到载体pCOLADuet-1上，构建表达载体pCOLA-iolG；
第2步：利用引物3和引物4 得到脱氢酶基因（iolX），连接到所述载体pCOLA-iolG上，构建双酶表达载体pCOLA-iolG-iolX；
第3步：利用引物5和引物6得到转运蛋白基因（MFS1），连接到所述载体pCOLA-iolG-iolX上，构建表达载体pCDLA-iolG-iolX-MFS1；
第4步：利用引物7和引物8得到转运蛋白基因（MFS2），连接到所述载体pCDLA-iolG-iolX-MFS1上，构建表达载体pCDLA-iolG-iolX-MFS1-MFS2；
第5步：将步骤4中构建的表达载体pCDLA-iolG-iolX-MFS1-MFS2导入宿主细胞大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中得到重组大肠埃希氏菌工程菌株pSI3。
进一步地，所述脱氢酶基因（iolG）为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）通过PCR扩增获得。
进一步地，所述脱氢酶基因（iolX）为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）通过PCR扩增获得。
进一步地，所述MFS转运蛋白MFS1和MFS2为鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2）通过PCR扩增获得。
所述的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3，其特征在于：所述
引物1的DNA序列为：CGCCATGGTCATGACTCTTCGTATCGCCCTTTTCG；
引物2的DNA序列为：GCTGGATCCTTACTAAACGTTGGCAGGGTTGAGGG；
引物3的DNA序列为：CGTCATATGAAAAACATCACCATCGGAATGG；
引物4的DNA序列为：GCTGGTACCTCATTAAGCAGATGGAACCAGCGCAC；
引物5的DNA序列为：CGAGAATTCGTACATGTCCACATCAGATAGTTG；
引物6的DNA序列为：GATGGATCCTTAATCAGAATAACGTTCGGTTTG；
引物7的DNA序列为：GCTGGATCCAGGATGTCTCAGAGAAGTAAGTAC；
引物8的DNA序列为：GCAGTCGACTTAGGCTATTACATCGCGACGTTTCC。
进一步地，根据所述的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3生物转化生产鲨肌醇的方法，其特征在于：利用得到的所述的重组大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3催化肌醇生产鲨肌醇。
进一步地，菌种发酵的培养基为TB培养基，所述TB培养基添加50μg/mL卡那霉素、0.1-0.5%乳糖和5-15%肌醇，在37℃、100-200rpm条件下培养至稳定期，离心收集菌体得到静息细胞。
进一步地，以pH 6.0-9.0的磷酸盐缓冲液将细胞重悬至OD600=15-40，以5-15%的肌醇为底物，同时添加0.1-0.5%的乳糖和0.1-1%的葡萄糖，在37℃、100-250rpm条件下进行静息细胞反应；菌体离心收集后重复利用，进行上述静息细胞反应。
进一步地，将各批次反应的鲨肌醇料液收集，115℃下灭酶处理，离心去除沉淀杂质；利用阴离子和阳离子交换树脂，相互交错处理料液，水洗至混合液中电导率值小于10μS/cm，将洗脱液浓缩至鲨肌醇近饱和状态，于低温4-8℃处理1-3天，得到鲨肌醇产品。
本发明的有益效果是：
利用了具有多酶基因表达的工程菌，并利用该菌体以肌醇为底物生产鲨肌醇，解决化学方法合成鲨肌醇使用高温条件和强酸，产生污染环境的大量的含有盐类物质酸性废水的问题。
利用该工程菌株的静息细胞法催化肌醇生产鲨肌醇，由于肌醇转运蛋白的存在，底物肌醇的浓度在反应温度下可得到最大化（约15%），近于饱和，可以充分利用细胞进行鲨肌醇的转化生产。
利用该工程菌株进行发酵培养，处理后菌体可以收集进行静息细胞反应，发酵液粗处理后既可以用于鲨肌醇的分离提取，也可以重复用于菌株的发酵培养；一次静息细胞反应时间较短，用于静息细胞反应的菌体，经过分离后可重复使用20次以上，鲨肌醇产率较高；另外，静息细胞反应液的成分简单，有利于反应料液中鲨肌醇产物的提取和纯化结晶。
利用该工程菌株生产鲨肌醇产物，整个工艺流程操作简单，安全环保，并且成本较低，鲨肌醇产率较高，产物的提取和纯化方便简单。
附图说明：
附图1是本发明原理图；
附图2是不同浓度的乳糖进行发酵培养，鲨肌醇的转化对比效果图；
附图3是不同pH进行静息细胞反应，鲨肌醇的转化对比效果图；
附图4是不同温度进行静息细胞反应，鲨肌醇的转化对比效果图；
附图5是细胞重复利用进行静息反应次数中鲨肌醇的转化效果图；
附图6是发明菌株与不含转运蛋白的工程菌株对不同浓度底物肌醇的利用对比效果图；
具体实施方式：
在本发明的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明所涉及的菌种保藏于中国科学院微生物研究所；
保藏单位代码：CGMCC
地址为：北京市朝阳区北辰西路一号院3号；
保藏编号为：No:16774
分类命名：大肠埃希氏菌
保藏日期：2018-11-23
本发明及实施例中提到的百分比浓度，如无特别说明均为质量/体积(W/V， 单位g/100mL)百分比浓度。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor）。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明中所用引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司提供。所公布的核苷酸序列，如无特别说明，均为5’至3’方向。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
（一）构建大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3
本发明具体提供一株用于生产鲨肌醇的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3及其构建方法，其技术路线如图1所示，包括以下三个方面：
（1）将来源于谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）的肌醇-2-脱氢酶基因（iolG）连接到载体pCOLADuet-1上，构建表达载体pCOLA-iolG，该基因表达产物可以将肌醇转化为鲨肌糖（2-脱氧-肌醇）
（2）将来源于谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）的脱氢酶基因（iolX）连接到载体pCOLA-iolG上，构建双酶表达载体pCOLA-iolG-iolX，iolX的表达产物可以将鲨肌糖转化为鲨肌醇。
（3）将来源于鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica subsp. enterica serovarTyphimurium str. LT2）的肌醇转运蛋白MFS1和MFS2，连接到pCOLA-iolG-iolX载体上，构建表达载体pCDLA-iolG-iolX-MFS1-MFS2，其基因表达产物可以提高肌醇转运到细胞内部的速率。
具体来讲，本发明大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3的构建方法，包括以下步骤：
（1）利用引物1和引物2PCR扩增来源于谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）的肌醇-2-脱氢酶基因（iolG），连接到载体pCOLADuet-1上，构建表达载体pCOLA-iolG；
利用引物3和引物4 PCR扩增来源于谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）的脱氢酶基因（iolX），连接到载体pCOLA-iolG上，构建双酶表达载体pCOLA-iolG-iolX；
分别利用引物5和引物6、引物7和引物8 PCR扩增来源于鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2）的MFS转运蛋白MFS1和MFS2，连接到pCOLA-iolG-iolX载体上，构建表达载体pCOLA-iolG-iolX-MFS1-MFS2；
各引物序列如下：
引物1：CGCCATGGTCATGACTCTTCGTATCGCCCTTTTCG
引物2：GCTGGATCCTTACTAAACGTTGGCAGGGTTGAGGG
引物3：CGTCATATGAAAAACATCACCATCGGAATGG
引物4：GCTGGTACCTCATTAAGCAGATGGAACCAGCGCAC
引物5：CGAGAATTCGTACATGTCCACATCAGATAGTTG
引物6：GATGGATCCTTAATCAGAATAACGTTCGGTTTG
引物7：GCTGGATCCAGGATGTCTCAGAGAAGTAAGTAC
引物8：GCAGTCGACTTAGGCTATTACATCGCGACGTTTCC
（2）将表达载体pCOLA-iolG-iolX-MFS1-MFS2导入大肠埃希氏菌BL21（DE3）中，得到重组大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3。
（二）大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3在转化生产鲨肌醇中的应用
（1）大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3的培养
将大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3接种于含有50μg/mL卡那霉素和15%肌醇的LB培养基中，在37℃、200rpm条件下对菌株进行培养，至OD600=2.0-3.0。接种种子液于发酵培养基TB中，其中含有50μg/mL卡那霉素、0.2%乳糖和15%肌醇，初始OD600值稀释至0.1，37℃、150rpm条件下对菌株进行培养，至稳定期后停止发酵并收集菌体。
加入高浓度的底物肌醇，能够使细胞更好的适应和利用肌醇转化生产鲨肌醇。加入乳糖作为诱导剂能够促进工程菌株中重组蛋白的表达，提高鲨肌醇的转化效率。通过添加不同浓度的乳糖（0、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%）进行发酵培养，利用静息细胞反应5h，对比鲨肌醇的转化效果。
如图2结果显示，添加乳糖作为诱导剂，鲨肌醇转化效率明显提高；添加乳糖浓度为0.2%时，鲨肌醇转化效率最高；
（2）大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3静息细胞的制备
离心收集大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3菌体，用pH 8.0的磷酸盐缓冲液重悬菌体，得到的细胞悬浮液即为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3的静息细胞。
利用不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的缓冲液分别重悬菌体制备静息细胞，静息细胞反应5h，对比各反应中鲨肌醇的转化效果。如图3结果显示，缓冲液pH值为8.0时，利用该工程菌株静息细胞转化生产鲨肌醇的效率最高；
（3）鲨肌醇的转化生产以15%的肌醇为底物，同时添加0.2%的乳糖和0.3%的葡萄糖，大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3静息细胞终浓度为OD600=20，在37℃、200rpm条件下进行静息细胞反应。利用不同温度（25、30、37、42℃）分别进行静息细胞反应，反应5h，对比各反应中鲨肌醇的转化效果。如图4结果显示，反应温度为37℃时，该工程菌株静息细胞转化生产鲨肌醇的效率最高。
由于鲨肌醇的溶解度较低，反应时间过长，随着转化效率的提高，鲨肌醇的含量逐渐升高，会造成鲨肌醇晶体的析出，影响细胞的重复使用，因此控制静息细胞反应的时间为5h，鲨肌醇转化率最高近35%，接近饱和。如图5所示离心收集菌体，利用相同条件进行反应，细胞可反复使用20次，转化率基本稳定。
（4）鲨肌醇的制备
将各批次反应的鲨肌醇料液进行收集，115℃下灭酶处理20min；离心分离后去除沉淀杂质，得到含有鲨肌醇和肌醇混合物的上清料液；此时料液中的杂质主要为缓冲液中的无机盐成分；可以利用一些公知的方法进行简单的处理。如分别利用阴离子和阳离子交换树脂，相互交错处理料液，水洗至混合吸附液中电导率值小于10μS/cm。将洗脱液浓缩至鲨肌醇近饱和状态，于低温4-8℃处理1-3天；
由于鲨肌醇溶解度较低，低温条件下会以较快速度进行晶体的析出，再通过过滤和干燥处理，即可达到不同纯度的鲨肌醇产品；滤液可重复利用于菌株的培养或静息细胞的反应。
对比例1：
方法与实施例1相同，不同之处在于：为了直观的展现所构建的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3中含有肌醇转运蛋白重组基因在生物转化生产鲨肌醇上的优势，特以本发明中不含肌醇转运蛋白重组基因，而只具有多脱氢酶基因表达的工程菌株作为对照，利用实施例1中所述的静息细胞方法进行反应，通过鲨肌醇的具体转化生产效果进行对比；同时，利用不同浓度的肌醇作为反应底物。
如图6结果显示：未转入转运蛋白重组基因的大肠埃希氏菌工程菌株对底物肌醇的利用效果很低，这可能与肌醇的转运效果差有关；同时随着底物浓度的增加，鲨肌醇的转化率更低，这是由于随着底物肌醇浓度的增加，没有转运蛋白的细胞对肌醇的运输和耐受性有限，使得鲨肌醇的转化率更低。
而本发明提供的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3，其中含有肌醇转运蛋白，因此细胞能充分转运肌醇和鲨肌醇，在双脱氢酶的催化作用下，鲨肌醇的转化效率较高；随着底物肌醇浓度的升高，鲨肌醇的转化率逐渐下降，但鲨肌醇的产率不断增加。
因此，利用基因工程的方法将表达肌醇转运蛋白的基因重组到该工程菌株中，能充分的发挥肌醇-2-脱氢酶和鲨肌醇脱氢酶的作用，从而充分利用高浓度的肌醇作为底物来转化生产鲨肌醇。
综上所述：本发明的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3可以实现鲨肌醇的生物转化法生产，可以将廉价的肌醇转化为稀有的鲨肌醇，在底物浓度大于15%时，鲨肌醇转化率最高近35%，产量大于50g/L。
该生产工艺操作简单，污染小，发酵一批得到的细胞进行静息细胞反应，可以反复使用20次以上，在很大程度上降低了成本。所生产的鲨肌醇可以应用于食品、保健品和医药品等，具有一定的应用前景。
序列表
<110> 艾美科健(中国)生物医药有限公司
<120> 一种生物转化生产鲨肌醇的大肠埃希氏菌工程菌株及其构建方法和应用
<130> TW1506137B
<141> 2018-12-14
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1008
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 1
atgactcttc gtatcgccct tttcggcgct ggccgcatcg gtcacgtcca cgctgccaac 60
attgctgcaa accctgatct tgaactcgtt gttatcgccg atcctttcat tgaaggcgca 120
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gctttcggct ctaagggcat gctcgccgcc gacaacatca ggcccaccac ggtgcgcaag 780
cacaatgcgg aaagcaccga gcaggcagat ccgattttca acttcttcct cgagcgctac 840
gacgccgctt acaaggcaga gctcgcaact tttgctcaag gaatccgcga cggccaaggc 900
ttctcaccaa acttcgagga cggcgtcatc gcccttgaac tagcgaatgc atgccttgaa 960
tcagctcaaa ccggccgcac cgtcaccctc aaccctgcca acgtttag 1008
<210> 2
<211> 1086
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 2
atgaaaaaca tcaccatcgg aatggtcggc gtcggccgca ttggccgcat gcacgtcgcc 60
aacatgcttg ccgttgctga aactttgaag gaacgcgacc tcaacattga gatcgtgctc 120
gcagacgcaa tgcccggttt tgcggagcag gtgggcgcgg acatgggcgt gaaggcggcg 180
gcaagcgtcg ataagcttat tgaggacggg gtggatgccc ttttcattgc caccagcacc 240
gctggccacg tcgatgtttt gcgcaagggc atcgcggcaa agctgccgat gttctgcgag 300
aagccgatcg cgtcggatgt gcctgagtcg ctgaacatca tccgcgaaat tgatgcggct 360
ggcgcgacgg ttcaggtcgg ccaccagcgc cgttttgacc tcggttacca ggaagctaaa 420
cgacgcctag atgcaggcga cctcggctgg cttcattcgc tcaaggccgt atcgagcgat 480
gcgtttccgc caccggtgtc ctactgcgct acctctggtg gacttttccg cgatgtgtcg 540
ctgcacgatt tcgacatcat tcgctggctg accggccagg atattgtcga ggtgtacgcc 600
aagggcagca acaacggcga cccagaaatc ggcgcagtcg gtgacatcga taccggagcg 660
gccctactca cgcttgccga cggcaccctc gccaccgcca tcgccactcg ttacaacggt 720
gcaggccacg acgttcgcct cgatgttatg ggctctaaag attccacgat cgttggcctg 780
gatgaaaagt ctgcgttcgc ttctgcggag gagggcatcg atttcccaac cggcgaatcg 840
cacccaacgt ttgccgagcg cttcgccgac gcatacaaga atgagtgcat tgcgttcgtg 900
gagttgatcc tgggagagcg ggaaaaccct tgtacccctg cagacgctgt ggctgcggcg 960
attgttgccg atgcagctca gctgtcgctg gtcactggcg agccagtgaa gattcctact 1020
gtacgggaaa ttcttgaagg ttctgcgcag ccagttgagg tgcgtgcgct ggttccatct 1080
gcttaa 1086
<210> 3
<211> 1434
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica subsp. enterica serovarTyphimurium str. LT2)
<400> 3
atgtccacat cagatagttg ttataatacg ggttacatat tacgcatctg cgcgattgcc 60
gcactgggcg gaatattatt tggctacgat actgctgtta tttcaggtgc gattggttca 120
ctgaccagct actttcatct atctcctgct gagaccggct gggcggtttc ctgcgttgtg 180
gtggggtgcg ttattggttc gtttagcgcc ggatatttat ccaaacgttt tggacgcaag 240
aaatcattga tggtttcagc gctgttattc actatttccg cagtgggcac ctccctctcc 300
tacacgttca cccattttgt gatttatcgc attatcggtg gactggcagt cggcctggcg 360
gcaacagtat caccgatgta tatgtctgaa gtctcaccga aaaacatgcg cggcagagca 420
ttaagtatgc agcagttcgc tatcgttttc ggtcagattc tgatcttcta cgttaactac 480
aaaatagcat cgattgcagc ggatacctgg ctcattgaac ttggctggcg ctatatgttt 540
gctgcgggta ttattccctg cattttgttc tgtattttag tctttttaat cccggaatct 600
ccccgctgga tgatgatgat tggtcgcgag gaggagacgc taaaaatact gaccaaaata 660
tccaacgaag aacatgccag acatcttctt gccgatataa aaacctcact gcaaaatgac 720
caactaaacg cccatcaaaa actcaattac cgcgacggga acgtgcgttt catcctgatc 780
ctgggctgca tgatcgctat gctgcaacag gtaacagggg ttaacgtcat gatgtattac 840
gcgccaatcg tccttaagga tgtgaccggt agcgcccagg aggccctgtt ccagacaatc 900
tggatcggcg tgattcagct tatcggttcc attattggcg caatgattat ggataagatg 960
gggcgtttgt cgctgatgcg taaaggcact atcggcagca tcatcggctt gttgctcacc 1020
tcatgggcgc tgtacagcca ggcaaccggt tatttcgcgc tattcggtat gctgttcttt 1080
atgattttct acgcgctttc ctggggcgtg ggcgcatggg tgcttatttc tgaaatattc 1140
cctaaccgga tgaggtcgca gggaatgagt atttcggtcg gatttatgtg gatggcaaac 1200
tttttagttt cgcaattctt cccgatgatt aatgaaaacc cgtatttact ttcgcatttc 1260
cacggcgcat ttccaatgtg gatatttgcc atctgctgca tcttcagtta cttctttatc 1320
tgccgttacc tgccggaaac aaaaggcatt tcgctggaga aaatggagag cgtagtgtta 1380
gcaaaacgca gaaaaaaact gcagccaatt caaaccgaac gttattctga ttaa 1434
<210> 4
<211> 1437
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica subsp. enterica serovarTyphimurium str. LT2)
<400> 4
atgtctcaga gaagtaagta caattcggcc tatgtgtacg tcctgtgttg tattgcggcg 60
ctggctggat tgatgtttgg ttattcaacg gcggtgatta ccggagtggt attgccttta 120
cagcagtatt accaactgac gccaaccgag accggatggg ccgtttccag tatcgtgatt 180
ggttgtatca tcggcgcgct ggtcggtgga aaaattgccg ataaactggg gcgtaaacct 240
gcgcttctga tcattgcgat catttttatc gcttcttcct taggggcggc gatgagtgaa 300
tcgttcatga tcttctccct ttcccgcatt gtgtgtggtt ttgcggttgg gatggccgga 360
acggcatcca ccatgtatat gtctgaactg gcgcctgctg aaattcgcgg caaagcgctg 420
ggcatttaca atatctccgt ggtatctggc caggttatcg tgtttatagt caactatctg 480
atagcaaaag gaatgcctgc tgatgtgctg gtttcccagg gctggaagac tatgcttttt 540
gcccaagtgg taccctccat tgcgatgtta gcgattacgc ttttcctacc cgaatcaccg 600
gcatggtgcg cccgtaacaa ccgcagcgaa gctcgttcga taaaggtgct tacccggatc 660
tacagtggat taacggccac agatgtggcc gctatttttg acagcatgaa agaaaccgta 720
cgttcacagg acaacgtcgc cgggggagaa cgcaccaacc tgaaaagctc gccggtgctc 780
cgctatattc tgttggttgg atgctgtatc gccgttttgc aacagttcac aggcgttaac 840
gtaatgaact attatgcgcc gctggtgttg cagaacagca gtaccgaagt ggttatgttc 900
cagaccattt ttatcgcggt atgtaatgtg gtgggcagtt ttatcggcat gatcctgttc 960
gaccgctatg gccgtatacc gattatgaaa attggtacca tcggctcaat tgtcggcctg 1020
ttgatcgcgt catacggttt gtacacccac gatacaggct acattaccat ctttggcatc 1080
ctgtttttta tgctgctgtt tgccgtcagc tggagcgttg gcgcatgggt actgatttct 1140
gaggttttcc ctgaaaagat aaaaggtttt gggatggggc tggcggtgag tctgatgtgg 1200
atagccaact tcctcatctc actgttgttc ccggtcataa atgataacgc ctggctgcag 1260
gagaccttcg gcggcgcttt ctcgatgtgg atttttgtcg tctttaattt ggtctgctat 1320
gtctttattt ctcgttatgt gccggaaaca aaaggggtgc cgctaacaga aattgaacgg 1380
ctggccgaga acaagctgcg tgaaattcag gggaaacgtc gcgatgtaat agcctaa 1437

Claims (13)

1.一种稳定的重组表达质粒，其特征在于所述质粒的载体为pCOLADuet-1，所述重组表达质粒包含：一段编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸；
所述编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸包括在宿主细胞中表达肌醇-2-脱氢酶基因的聚核苷酸和在宿主细胞中表达鲨肌醇脱氢酶基因的聚核苷酸；
所述宿主细胞为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21（DE3）。
2.根据权利要求1所述的稳定的重组表达质粒，其特征在于所述的编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸包括还包含在宿主细胞中表达转运蛋白基因的聚核苷酸。
3.根据权利要求2所述的稳定的重组表达质粒，其特征在于所述转运蛋白基因包括MFS1和MFS2，所述MFS1的多核苷酸序列为：SEQ NO3所示的DNA序列MFS1；所述转运蛋白基因MFS2的多核苷酸序列为：SEQ NO4所示的DNA序列MFS2。
4.根据权利要求1-3任意一项权利要求所述的稳定的重组表达质粒，其特征在于所述的肌醇-2-脱氢酶基因的多核苷酸序列为：SEQ NO1所示的DNA序列iolG；所述的鲨肌醇脱氢酶基因的多核苷酸序列为：SEQ NO2所示的DNA序列iolX。
5.一种根据权利要求2或3所述的重组表达质粒构建大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3的方法：其特征在于包括如下步骤：
第1步：利用引物1和引物2得到脱氢酶基因（iolG），连接到载体pCOLADuet-1上，构建表达载体pCOLA-iolG；
第2步：利用引物3和引物4 得到脱氢酶基因（iolX），连接到所述载体pCOLA-iolG上，构建双酶表达载体pCOLA-iolG-iolX；
第3步：利用引物5和引物6得到转运蛋白基因（MFS1），连接到所述载体pCOLA-iolG-iolX上，构建表达载体pCDLA-iolG-iolX-MFS1；
第4步：利用引物7和引物8得到转运蛋白基因（MFS2），连接到所述载体pCDLA-iolG-iolX-MFS1上，构建表达载体pCDLA-iolG-iolX-MFS1-MFS2；
第5步：将步骤4中构建的表达载体pCDLA-iolG-iolX-MFS1-MFS2导入宿主细胞大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中得到重组大肠埃希氏菌工程菌株pSI3。
6.根据权利要求5所述的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3，其特征在于脱氢酶基因（iolG）为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）通过PCR扩增获得。
7.根据权利要求5所述的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3，其特征在于脱氢酶基因（iolX）为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）通过PCR扩增获得。
8.根据权利要求5所述的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3，其特征在于所述MFS转运蛋白MFS1和MFS2为鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium str. LT2）通过PCR扩增获得。
9.根据权利要求5所述的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3，其特征在于：所述
引物1的DNA序列为：CGCCATGGTCATGACTCTTCGTATCGCCCTTTTCG；
引物2的DNA序列为：GCTGGATCCTTACTAAACGTTGGCAGGGTTGAGGG；
引物3的DNA序列为：CGTCATATGAAAAACATCACCATCGGAATGG；
引物4的DNA序列为：GCTGGTACCTCATTAAGCAGATGGAACCAGCGCAC；
引物5的DNA序列为：CGAGAATTCGTACATGTCCACATCAGATAGTTG；
引物6的DNA序列为：GATGGATCCTTAATCAGAATAACGTTCGGTTTG；
引物7的DNA序列为：GCTGGATCCAGGATGTCTCAGAGAAGTAAGTAC；
引物8的DNA序列为：GCAGTCGACTTAGGCTATTACATCGCGACGTTTCC。
10.一种根据权利要求5所述的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3生物转化生产鲨肌醇的方法，其特征在于：利用得到的所述的重组大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3催化肌醇生产鲨肌醇。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：菌种发酵的培养基为TB培养基，所述TB培养基添加50μg/mL卡那霉素、0.1-0.5%乳糖和5-15%肌醇，在37℃、100-200rpm条件下培养至稳定期，离心收集菌体得到静息细胞。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：以pH 6.0-9.0的磷酸盐缓冲液将细胞重悬至OD600=15-40，以5-15%的肌醇为底物，同时添加0.1-0.5%的乳糖和0.1-1%的葡萄糖，在37℃、100-250rpm条件下进行静息细胞反应；菌体离心收集后重复利用，进行上述静息细胞反应。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：将各批次反应的鲨肌醇料液收集，115℃下灭酶处理，离心去除沉淀杂质；利用阴离子和阳离子交换树脂，相互交错处理料液，水洗至混合液中电导率值小于10μS/cm，将洗脱液浓缩至鲨肌醇近饱和状态，于低温4-8℃处理1-3天，得到鲨肌醇产品。
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