CN107475218A - 一种酯酶Bae02030及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酯酶Bae02030及其编码基因和应用。本发明从芽孢杆菌Bacillus sp.SCSIO 15029中开发得到新的酯酶基因bae02030，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长为696bp，其编码的酯酶Bae02030的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，含有231个氨基酸；通过将克隆的酯酶基因bae02030在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达后，得到了重组表达的酯酶Bae02030。该酯酶具有较好的稳定性，而且对部分表面活性剂及有机溶剂的具有很好的耐受性；可用于洗涤剂、生物医药、化妆品和精细化工等领域。同时该酯酶作为催化剂常温下可催化酯类水解反应，可以选择性的拆分乳酸甲酯，在反应条件优化后制备得到的D‑乳酸甲酯的光学纯度超过99％，转化率为56％。

Description

一种酯酶Bae02030及其编码基因和应用

技术领域：

本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种酯酶Bae02030及其编码基因和应用。

背景技术：

酶在药品和精细化工产品的制备中具有重要的意义，如拆分制备高附加值的光学纯手性药物中间体和手性化工产品。生物酶催化的反应是绿色环保的生产过程，生产的手性药物中间体/化工产品具有很高的光学纯度，同时还可以避免传统有机合成反应带来的高毒性的金属催化剂残留。水解酶除了可以通过水解反应制备大宗化工产品，还可以通过不对称水解和转酯等反应制备手性药物中间体/化工产品。乙酰酯酶(EC 3.1.1.6)是来自于SGNH超家族中的一类水解酶，其具有4个保守区，催化三联体为Ser-Asp-His，Gly和Asn在空间上靠近催化中心，与催化中心构成氧离子穴。乙酰酯酶通常催化乙酸酯的水解，生成相应的醇和乙酸。目前对乙酰酯酶应用研究较多的是围绕果胶、木聚糖等植物细胞壁成分的脱乙酰化，木聚糖的脱乙酰化有利于加速其他裂解酶和水解酶分解多糖分子。

高光学纯的乳酸通常是可生物降解聚乳酸和多聚物产品的原料单体。聚L-乳酸和聚D-乳酸具有较高的熔点，从而提高塑料的性能。光学纯的乳酸和其酯类同时也是制药工业重要的手性前体试剂。L-乳酸和酯类是合成非甾体消炎镇痛药布洛芬的前体手性试剂。D-乳酸常用于不对称合成D-氨基酸。高等植物缺乏利用D-乳酸的相关酶类，由此不能合成或分解D-乳酸酯类，因此常用D-乳酸酯类合成农药。D-乳酸甲酯是(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的前体物质，而(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸是合成芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的重要中间体，市场缺口大。然而，工业上生产D-乳酸比L-乳酸更加困难，大部分光学纯的乳酸制品主要是以L-乳酸为原料。本发明旨在提供一种制备D-乳酸甲酯的方法，从而为工业上制备光学纯D-乳酸提供新的途径。

发明内容：

本发明的目的是提供一种新的酯酶Bae02030及其编码基因和应用。

本发明从一株来自海洋的芽孢杆菌Bacillus sp.SCSIO 15029中克隆得到一种酯酶Bae02030及其编码基因酯酶基因bae02030，构建了含有酯酶基因bae02030的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得酯酶Bae02030，其可应用于催化酯类水解反应。

本发明的第一个目的是提供一种酯酶Bae02030，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的酯酶Bae02030的酯酶基因bae02030。

优选，所述的酯酶基因bae02030的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种含有所述的酯酶基因bae02030的重组表达载体。所述的表达载体，优选pET-28a(+)载体。

本发明还提供一种含有所述的酯酶基因bae02030的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第三个目的是提供所述的酯酶Bae02030在催化酯类水解中的应用。

优选，所述的应用为酯酶Bae02030在催化D/L-乳酸甲酯水解制备D-乳酸甲酯中的应用。

优选，所述的应用是取酯酶Bae02030于pH8-9.5缓冲液中，再加入D/L-乳酸甲酯，进行反应，得到D-乳酸甲酯。

本发明的第四个目的是提供酯酶Bae02030在耐受有机溶剂或表面活性剂环境下进行催化的应用。

所述的有机溶剂为正庚烷、正己烷、环己烷、DMSO或甲醇。

所述的表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通或三聚磷酸钠。

本发明的酯酶基因bae02030来自深海来源的芽孢杆菌Bacillus sp.SCSIO 15029(其来源为：89°29.22′E，10°00.12′N，-3400m，pH7.8，2℃)，保存在中国科学院南海海洋研究所。本发明利用生物信息学分析方法，从基因组测序的芽孢杆菌Bacillus sp.SCSIO15029中克隆得到酯酶基因bae02030，全长为696bp(从起始密码子到终止密码子)，其编码的酯酶Bae02030含有231个氨基酸。将酯酶基因bae02030与表达载体pET-28a(+)连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组酯酶Bae02030。将纯化的酯酶Bae02030作为催化剂催化酯类水解反应，具有较好的稳定性，而且对部分表面活性剂及有机溶剂的具有很好的耐受性，且对拆分具有较好的促进作用。酯酶Bae02030的特性符合洗涤剂添加剂、绿色化工业上需求，可用于洗涤剂、生物医药、化妆品和精细化工等领域。

附图说明

图1是酯酶Bae02030的SDS-PAGE电泳图。其中，M为蛋白marker，泳道1为IPTG诱导前的含有pET-28α(+)-bae02030的大肠杆菌BL21(DE3)粗蛋白，泳道2为IPTG诱导后的含有pET-28α(+)-bae02030的大肠杆菌BL21(DE3)粗蛋白，泳道3为纯化的酯酶Bae02030蛋白；

图2是比较酯酶Bae02030水解不同长度酰基的对硝基苯酚酯C₂-C₁₀的图；

图3是pH和温度对酯酶Bae02030活性的影响；

图4是有机溶剂和表面活性剂对Bae02030酶活的影响；

图5是D,L-乳酸甲酯的标准品的GC图；

图6是酯酶Bae02030拆分乳酸甲酯制备D-乳酸甲酯GC图；

图7是不同正庚烷浓度对Bae02030拆分的影响；

图8是酶浓度对拆分反应的影响。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：酯酶基因bae02030开放阅读框边界确定及引物设计

提取芽孢杆菌Bacillus sp.SCSIO 15029的基因组DNA，经全基因组测序后，利用生物信息学手段对基因组进行基因注释，分析其中的酯酶基因，确定了其中酯酶基因bae02030的开放阅读框，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，全长为696bp(从起始密码子到终止密码子)，其编码的酯酶Bae02030的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共231个氨基酸。根据分析得到的酯酶基因bae02030序列，设计全长扩增引物如下：上游引物：5′-TGCTAGCCATATGATGAAGAAACCAATTCAAGTATTTT-3′(下划线为NdeI酶切位点)；下游引物：5′-CGAATTCTTATACATGTTCTTTCCCCTCC-3′(下划线为EcoRI酶切位点)。

实施例2：酯酶基因bae02030的克隆及载体构建

2.1 PCR扩增

将实施例1设计的引物(上游引物：5′-TGCTAGCCATATGATGAAGAAACCAATTCAAGTATTTT-3′；下游引物：5′-CGAATTCTTATACATGTTCTTTCCCCTCC-3′)送至上海生物工程有限公司合成，合成的引物使用TE缓冲液溶解成终浓度为10μM，以提取的芽孢杆菌Bacillus sp.SCSIO15029总DNA作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：

表1 PCR反应体系

使用以下PCR扩增程序扩增酯酶基因bae02030：94℃变性5min；94℃变性1min，62℃退火30s，72℃延伸1.5min，进行30个循环；72℃延伸10min，冷却到18℃。

将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观察，回收750bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20μL无菌水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。

2.2酶切

PCR产物使用以下体系进行酶切，酶切时间1.5h。酶切体系为：NdeI 1μL，EcoRI 1μL，DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至50μL。酶切后按照胶回收试剂盒的方法回收，得到双酶切后的PCR产物。

质粒pET-28a(+)的双酶切：挑取含有该质粒的大肠杆菌DH5α单菌落，过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用NdeI和Hind III按以下体系双酶切，酶切时间1.5h。酶切体系为：NdeI 1μL，EcoRI 1μL，DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至50μL。酶切后在0.8％琼脂糖凝胶中电泳，按照胶回收试剂盒方法回收得到经过双酶切的线性pET-28a(+)载体。

上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化回收使用核酸纯化回收试剂盒(Magen，Hipure Gel Pure DNA Micro Kit)，质粒提取试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。

2.3连接

将经过双酶切的PCR产物和双酶切的线性pET-28a(+)载体按以下体系进行连接：双酶切PCR产物5μL，双酶切的线性pE T-28a(+)载体0.5μL，T4连接酶(5U/μL)0.5μL，连接缓冲液(5×)2μL，用去离子水补足10μL；连接温度为25℃，20min。由此得到连接产物。

2.4转化及筛选

取10μL连接产物加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴20～30min，后于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm转速下，孵育培养30min。取一定量的菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mL LB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。

2.5基因核苷酸序列测定

将筛选的阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与酯酶基因序列进行比对，进一步确认是将酯酶基因bae02030(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)插入到pET-28a(+)质粒中，结果完全正确后确认得到带有酯酶基因bae02030的pET-28a(+)质粒(命名为pET-28a(+)-bae02030)，可用于进行下一步试验。

实施例3：酯酶Bae02030在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达

3.1大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞制备

1.将少量大肠杆菌BL21(DE3)菌种接入5mL LB试管液中，200rpm，37℃过夜培养；

2.按1％体积比的接种量将试管中的菌液接种到200mL LB摇瓶中，200rpm，25℃过夜培养，得到原培养物；

3.将培养好的摇瓶在冰水中迅速冷却至0℃，将原培养物分装至冰预冷的离心管(50mL)，冰置数分钟；

4. 4℃，4000rpm离心15min回收细胞，弃上清；

5.用冰预冷的10mL 0.1M的CaCl₂重悬细胞，4℃，4000rpm离心10～15min回收细胞；

6.重复5，用10mL 0.1M的CaCl₂重悬细胞，冰浴1h以上；

7. 4℃，4000rpm离心10min回收细胞；

8.每50mL原培养物得到的细胞用2～3mL含15％DMSO+CaCl₂来重悬，分装于1.5mL离心管，50～100μL每管。-80℃保藏。由此得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

3.2转化

取实施例2中得到的pET-28a(+)-bae02030质粒0.5～1μL与50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm培养1h。培养物离心后涂布50μg/mL的卡那霉素LB平板，培养过夜20h后挑选单菌。由此得到含有pET-28α(+)-bae02030的大肠杆菌BL21(DE3)。

实施例4：酯酶Bae02030的表达和纯化

4.1蛋白诱导

将含有pET-28a(+)-bae02030的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.85左右，加IPTG至终浓度0.2mM，22℃培养18h。300mL菌液4000rpm，4℃离心20min，收集菌体，用30mL(50mM，pH 7.4)PBS缓冲液重悬菌体，超声400w，超5s，停5s，破碎10min分钟，离心，收集上清。

4.2酯酶Bae02030的纯化与SDS-PAGE电泳

用镍离子亲和层析柱纯化4.1中收集的上清，具体实施方案如下：使用20mM的咪唑洗脱5个柱体积，40mM咪唑洗脱20～30个柱体积，最后使用3.5mL 300mM咪唑洗脱，收集最后的2.5mL洗脱液。用脱盐柱SephadexG25进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。将纯化的表达产物进行SDS-PAGE凝胶电泳，得到纯化的酯酶Bae02030(图1)，纯化的蛋白大小约28kD，符合理论预期。

4.3酯酶Bae02030活性测定

酯酶Bae02030活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：①用DMSO配制200mM的对硝基苯酚酯溶液；②在0.5mL反应体系中加入495μL Tris-HCl buffer(100mM，pH 8.5)，2μL对硝基苯酚酯溶液，3μL稀释50倍的酯酶Bae02030纯酶液(终浓度0.0428μg/μL)；③35℃下，反应2min后，加入0.5mL乙腈终止反应，于405nm测定吸光度。

酶活单位定义：1min内水解对硝基苯酚酯，释放1μM对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活单位。

实施例5：酯酶Bae02030的酶学性质

5.1水解不同侧链长度的对硝基苯酚酯

按照4.3的测定条件，比较酯酶Bae02030水解不同长度酰基的对硝基苯酚酯C₂-C₈，结果如图2。说明酯酶Bae02030对长链对硝基苯酚酯特异性差，而对于短链长度的对硝基苯酚酯的作用效果较好，最佳的底物是C₂，即对硝基苯酚乙酸酯。

5.2最适pH和最适温度

配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，如表2所示，其浓度均为100mM。

表2不同pH的缓冲体系

将4.3中测定条件所述的缓冲液(Tris-HCl缓冲液)按照表2中的缓冲溶液分别进行替换，测定不同pH的缓冲溶液中重组酯酶Bae02030的酶活力。由于酯酶Bae02030对对硝基苯酚乙酸酯水解活性最高，对其他对硝基苯酚酯水解活性较差，因此后续的活性测定均用对硝基苯酚乙酸酯作为最适底物。根据上述标准反应条件，在35℃下优化pH(6.5-9.5)，在最适pH下优化温度，范围为25℃-50℃。pH对重组酯酶Bae02030活性的影响结果见图3。酯酶Bae02030在pH 8-9.5范围内活性较高，保持有70％以上的酶活，最适pH为8.5。pH低于8时，酶活性降低迅速，相对酶活只有28.6％。在最适pH下测定不同温度的活性，结果见图3b。酯酶Bae02030在较宽的温度范围内(25-50℃)均具有较高的活性，保持有58.9％以上的酶活，最适温度为35℃。在最适条件下测得的特异性酶活为36.83±0.93U·mg^-1。

5.3有机溶剂和表面活性剂对酯酶Bae02030活性的影响

用100mmol·L^-1Tris-HCl(pH 8.5)稀释纯酯酶Bae02030酶液至20倍，加入体积分数为10％的有机溶剂(正己烷，环己烷，正庚烷，甲醇，丙醇，丙酮，甲苯，1,4-二氧六环，乙腈，二甲基亚砜(DMSO)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，四氢呋喃(THF))或质量分数(ω)为0.01％的表面活性剂(吐温20，吐温80，曲拉通，三聚磷酸钠(STPP))，35℃孵育0.5h，测定各试验的相对酶活。以不加有机溶剂和表面活性剂的试验为对照组，相对酶活为100％。有机溶剂和表面活性剂对酯酶Bae02030活性的影响结果见图4。酯酶Bae02030在5种有机溶剂(正庚烷、正己烷、环己烷、DMSO、甲醇)和4种表面活性剂中的活性均高于对照组，其中在正庚烷中的活性是对照的3.01倍。在THF中的活性最低，仅保留4.82％的相对酶活。

实施例6：酯酶Bae02030制备D-乳酸甲酯

6.1 pH和反应温度对酯酶Bae02030制备D-乳酸甲酯的影响

反应pH的优化。在0.5mL的反应体系中加入0.4mL 100mmol·L^-1Tris-HCl缓冲液(pH 7.5-10.0)，0.1mL纯酯酶Bae02030酶液(23U)，终浓度为25mmol·L^-1乳酸甲酯。置于35℃和转速为200r·min^-1的摇床中振荡反应4h。

反应温度的优化。在0.5mL的反应体系中加入0.4mL 100mmol·L^-1Tris-HCl缓冲液(pH9.0)，0.1mL纯酯酶Bae02030酶液(23U)，终浓度为25mmol·L^-1乳酸甲酯。设定反应的温度范围为30℃-50℃，于转速为200r·min^-1的摇床中振荡反应4h。(标样GC图5和拆分GC图6，以此类推)，根据峰面积计算底物对映体过量值(ee_s)和转化率(C)，公式如下。公式1：公式3：公式3：

式中：A_D和A_L分别表示D-乳酸甲酯和L-乳酸甲酯的峰面积，A₀和A分别表示反应前和反应后乳酸甲酯的峰面积。

由表3可看出，随着pH的升高，底物e.e._s值先升高后逐渐下降，在pH 9.0达到最大值，而底物转化率逐渐升高。在拆分反应中，优先考虑e.e._s值，因此以pH 9.0作为拆分反应的最佳pH。与pH的影响类似，底物e.e._s值随着温度的升高，在40℃达到最大值，后逐渐下降，而底物转化率c逐渐升高，当温度达到50℃时，转化率略有下降，可能与高温抑制酶的活性有关。因此，以40℃作为拆分反应的最佳温度。

表3 pH和温度对Bae02030拆分乳酸甲酯的影响

6.2有机溶剂和表面活性剂对酯酶Bae02030制备D-乳酸甲酯的影响

参考酶活性耐受实验，选取相对酶活保持80％以上的有机溶剂和表面活性剂作为添加剂，考察酯酶Bae02030的立体选择性。在0.5mL的反应体系中加入0.35mL 100mmol·L^{- 1}Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)，0.1mL纯酶液(23U)，终浓度为25mmol·L^-1乳酸甲酯，以及体积分数为10％的有机溶剂(正己烷，正庚烷，环己烷，甲醇，甲苯，丙酮，和DMSO)或质量分数(ω)为0.01％的表面活性剂(曲拉通X-100，吐温20，吐温80，STPP)，以不加任何有机溶剂和表面活性剂为对照。反应混合液置于最适温度(40℃)和转速为200r·min^-1的摇床中振荡反应4h。

由表4可看出，添加环己烷、正庚烷、吐温20、吐温80和STPP的反应，产物e.e._s值略高于对照，尤其以正庚烷促进作用较佳，其转化率更接近理论值(50％)。对正庚烷的浓度进行优化的实验发现，e.e._s值随着正庚烷浓度增加到60％时达到最大值，而后下降，底物转化率c则一直减少(图7)，在浓度为60％时，立体选择性最大。因此，以60％正庚烷作用溶剂用于后续的实验优化。

表4有机溶剂/表面活性剂对Bae02030拆分乳酸甲酯的影响

注：a：有机化合物脂水分配系数，数值参考自www.chemspider.com.

6.3酶浓度对酯酶Bae02030制备D-乳酸甲酯的影响

在0.5mL的反应体系中加入0.1mL 100mmol·L^-1Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)，不同终浓度(0.32,0.64,0.96,1.28,1.60,1.92mg·mL^-1)的纯酯酶Bae02030酶液，终浓度为25mmol·L^-1乳酸甲酯，以及60％正庚烷。反应混合液置于40℃和转速为200r·min^-1的摇床中振荡反应1h。从图8可看出，反应1h，测定的e.e._s值和c值都随酶浓度的增加而升高，但是当浓度为1.60mg·mL^-1时，转化率c增加缓慢，说明酶的用量已经趋向过量，反应速率也趋向恒定。因此，酶浓度为1.60mg·mL^-1作为最适反应酶量。

6.4底物浓度和时间的动力学制备D-乳酸甲酯

在0.5mL的反应体系中加入0.2mL 100mmol·L^-1Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)，不同终浓度的乳酸甲酯(12.5，25，37.5，50mmol·L^-1)，以及60％正庚烷。反应体系的酯酶Bae02030酶浓度为1.60mg·mL^-1(23U)。反应混合液置于最适温度(40℃)和转速为200r·min^-1的摇床中振荡反应，每间隔1h取0.5mL样品测定。由表5的结果可看出，底物浓度影响Bae02030的拆分效果。当底物浓度为12.5mmol·L^-1时，转化率更接近理论值(50％)，D-乳酸甲酯的产率均高于其他3个浓度的值。当底物浓度为50mmol·L^-1时反应6h后，e.e._s值和c值均不再增加，说明底物已经过量，抑制酶的反应，也可能产生过量的乳酸降低反应的pH，不利于反应的进行。

表5不同底物浓度对Bae02030拆分乳酸甲酯的影响

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种酯酶Bae02030及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 696

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌Bacillus sp. SCSIO 15029(Bacillus sp. SCSIO 15029)

<400> 1

atgaagaaac caattcaagt atttttagcg ggagattcca ctgtgagtga ctgcccgcct 60

catgaagcgc cgatggcggg gtgggggcag gtattcgggc aattgttttc tgaagaggta 120

gtggtgcaca atcatgccaa aggaggagcg agcaccaatt cttttgtgga ggaaggaagg 180

cttcaagcaa ttgccgaacg catcacacaa ggcgattatt tgttgattca attcggccac 240

aatgaccaaa aaccgcgggg gacgaagccg tactccacat ttcagcagtt tcttaccttg 300

tttgcagata cggcacgcga aaagggcgcg catcctgtgt tcgtcacatc ggtgcagcgc 360

cgccgctttg atgaaaacgg acggatcgag catacgctcg gtgagtatcc cgatgcgatg 420

aaagcactgg cgaaggagct cgatgtacct gtgattgatc tgcttgcgaa aacaaaggtg 480

ctgtatgaag catacgggcc ggaggagtcg aagcgattgt tcgtttggtt tcagccgaat 540

gaacatccga attacccgga cggcattgag gacaatacgc atttttcgga agaaggtgca 600

atggaggttg cgaagcttgt ggcagaaggc attgaagagc tcggacttcc gcttaaggac 660

catcttgtga gccgggaggg gaaagaacat gtataa 696

<210> 2

<211> 231

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌Bacillus sp. SCSIO 15029(Bacillus sp. SCSIO 15029)

<400> 2

Met Lys Lys Pro Ile Gln Val Phe Leu Ala Gly Asp Ser Thr Val Ser

1 5 10 15

Asp Cys Pro Pro His Glu Ala Pro Met Ala Gly Trp Gly Gln Val Phe

20 25 30

Gly Gln Leu Phe Ser Glu Glu Val Val Val His Asn His Ala Lys Gly

35 40 45

Gly Ala Ser Thr Asn Ser Phe Val Glu Glu Gly Arg Leu Gln Ala Ile

50 55 60

Ala Glu Arg Ile Thr Gln Gly Asp Tyr Leu Leu Ile Gln Phe Gly His

65 70 75 80

Asn Asp Gln Lys Pro Arg Gly Thr Lys Pro Tyr Ser Thr Phe Gln Gln

85 90 95

Phe Leu Thr Leu Phe Ala Asp Thr Ala Arg Glu Lys Gly Ala His Pro

100 105 110

Val Phe Val Thr Ser Val Gln Arg Arg Arg Phe Asp Glu Asn Gly Arg

115 120 125

Ile Glu His Thr Leu Gly Glu Tyr Pro Asp Ala Met Lys Ala Leu Ala

130 135 140

Lys Glu Leu Asp Val Pro Val Ile Asp Leu Leu Ala Lys Thr Lys Val

145 150 155 160

Leu Tyr Glu Ala Tyr Gly Pro Glu Glu Ser Lys Arg Leu Phe Val Trp

165 170 175

Phe Gln Pro Asn Glu His Pro Asn Tyr Pro Asp Gly Ile Glu Asp Asn

180 185 190

Thr His Phe Ser Glu Glu Gly Ala Met Glu Val Ala Lys Leu Val Ala

195 200 205

Glu Gly Ile Glu Glu Leu Gly Leu Pro Leu Lys Asp His Leu Val Ser

210 215 220

Arg Glu Gly Lys Glu His Val

225 230

Claims (10)

1.一种酯酶Bae02030，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的酯酶Bae02030的酯酶基因bae02030。

3.根据权利要求1所述的酯酶基因bae02030，其特征在于，所述的酯酶基因bae02030的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种含有权利要求2所述的酯酶基因bae02030的重组表达载体。

5.一种含有权利要求2所述的酯酶基因的基因工程菌。

6.权利要求1所述的酯酶Bae02030在催化酯类水解中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用为酯酶Bae02030在催化D/L-乳酸甲酯水解制备D-乳酸甲酯中的应用。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用是取酯酶Bae02030于pH8-9.5缓冲液中，再加入D/L-乳酸甲酯，进行反应，得到D-乳酸甲酯。

9.权利要求1所述的酯酶Bae02030在耐受有机溶剂或表面活性剂环境下进行催化的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的有机溶剂为正庚烷、正己烷、环己烷、DMSO或甲醇；所述的表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通或三聚磷酸钠。