CN108359651A

CN108359651A - 一种单胺氧化酶及其基因和应用

Info

Publication number: CN108359651A
Application number: CN201810159916.XA
Authority: CN
Inventors: 陈永正; 万南微; 邓国忠; 秦磊
Original assignee: Zunyi Medical University
Current assignee: Zunyi Medical University
Priority date: 2018-02-26
Filing date: 2018-02-26
Publication date: 2018-08-03

Abstract

本发明公开了一种源于假单胞菌（Pseudomonas sp.）的单胺氧化酶、编码基因、重组表达载体和重组表达转化体，及其在四氢喹啉类手性胺化合物的合成应用。本发明所述单胺氧化酶MAO5‑ZMU的编码基因来源于假单胞菌（Pseudomonas sp）ZMU‑T01，该单胺氧化酶蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，相应的编码基因核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；该单胺氧化酶基因可与表达载体连接构建得到重组表达质粒，再转化至大肠杆菌，获得具有单胺氧化酶活性的基因工程菌。该单胺氧化酶基因工程菌能有效催化2‑甲基‑1,2,3,4‑四氢喹啉类化合物氧化拆分，具有选择性高、反应条件温和环境友好等特点，可用于手性四氢喹啉类化合物的生物合成。

Description

一种单胺氧化酶及其基因和应用

技术领域

本发明涉及一种单胺氧化酶、编码基因及重组表达载体，产生单胺氧化酶的新大肠杆菌菌株，以及该酶在手性胺类化合物合成中的应用。

背景技术

单胺氧化酶属于氧化还原酶家族，能够氧化胺类化合物生成相应的亚胺，同时将氧气还原为过氧化氢，是生物体降解胺类化合物的途径之一。手性胺作为一类重要化合物，广泛存在于临床药物、农用化学品、手性拆分剂中。化学方法合成手性胺主要有金属催化的不对成还原、小分子催化剂催化的不对称合成等方法。化学法合成手性胺往往能够得到高对映纯的手性化合物，但会用到环境有害的重金属、有机溶剂，不符合绿色可持续发展的要求。生物酶作为一类绿色生物催化剂且具有高立体选择性，因而广泛运用于手性醇、手性胺等手性化合物的合成。在酶催化合成手性胺中，主要应用的酶有单胺氧化酶、亚胺还原酶、ω-转氨酶等生物酶。单胺氧化酶能直接以消旋体的胺为底物，立体选择性的氧化其中一个构型生成相应的亚胺，达到拆分的目的制备手性胺。配合还原剂还原生成的亚胺，构建动态动力学拆分反应，理论可得到100%的产率。由此可见，单胺氧化酶作为一种用于合成手性胺的高效生物酶催化剂，在手性胺的绿色生物合成中扮演着不可或缺的重要地位。单胺氧化酶家族主要包括从Aspergillusniger菌株中克隆得到单胺氧化酶（MAO-N）和从Brevibacteriumoxydans菌株中克隆得到的环乙胺氧化酶（CHAO）。近年，Turner小组对MAO-N开展了深入的研究，通过酶蛋白的定向进化技术得到诸多MAO-N的突变体，并应用于伯胺、仲胺、叔胺等多种手性胺的合成，包括一些重要的药物中间体。朱敦明小组开展了对CHAO的定向进化研究，主要是拓展了CHAO在合成手性胺的底物谱。目前，除了被广泛研究的MAO-N和CHAO，而关于新型的单胺氧化酶的发现在国内外报道十分罕见。因此，本发明的目的是发现一种新型单胺氧化酶并用于手性2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉类化合物的绿色合成。

发明内容

本发明目的是发现一种源于假单胞菌（Pseudomonas sp）的单胺氧化酶、编码基因及重组表达载体，及其在在生物催化手性合成2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉类化合物合成中的应用。

本发明所提供的一种单胺氧化酶蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

SEQIDNo.1氨基酸序列

Met Arg Ile Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ile Ala Gly Leu Ser Cys Ala

1 5 10 15

His Leu Leu Ser Arg Lys His Glu Val Thr Val Phe Glu Ala Glu Lys

20 25 30

Trp Ile Gly Gly His Thr His Thr Leu Asp Val Ile Trp Gln Gly Glu

35 40 45

Arg His Ala Ile Asp Thr Gly Phe Ile Val Phe Asn Asp Trp Thr Tyr

50 55 60

Pro His Phe Ile Arg Leu Leu Asp His Leu Lys Val Ala Ser Arg Pro

65 70 75 80

Thr Glu Met Ser Phe Ser Val His Asp Pro Val Thr Gly Leu Glu Tyr

85 90 95

Asn Gly His Asp Leu Asn Thr Leu Phe Ala Gln Arg Arg Asn Leu Val

100 105 110

Ser Pro Gly Phe Trp Gly Met Leu Arg Asp Ile Leu Arg Phe Asn Arg

115 120 125

Gln Ala Leu Ala Asp Leu Asp Asn Gln Arg Ile Asp Ala Asn Ala Thr

130 135 140

Leu Gly Ala Tyr Leu Arg Ala Gln Arg Tyr Gly Gln Arg Phe Ile Asp

145 150 155 160

His Tyr Ile Val Pro Met Gly Ser Ala Ile Trp Ser Met Ser Arg Ala

165 170 175

Asp Met Leu Gly Phe Pro Leu Ala Phe Phe Val Arg Phe Cys Arg Asn

180 185 190

His Gly Leu Leu Ser Val Asn Gln Arg Pro Gln Trp Arg Val Ile Glu

195 200 205

Gly Gly Ser Arg Ser Tyr Val Ser Pro Leu Cys Arg Pro Phe Ala Gly

210 215 220

Arg Ile Arg Leu Asp Cys Lys Val Phe Arg Val Ser Arg Asp Glu Gly

225 230 235 240

Gly Val Thr Leu Thr Ser Ala Ala Gly Thr Glu Arg Phe Asp Asn Val

245 250 255

Val Phe Ala Cys His Ser Asp Gln Ala Leu Ala Leu Leu Glu Ala Pro

260 265 270

Ser Val Gln Glu Arg Glu Val Leu Gly Ala Ile Gly Tyr Ala Ser Asn

275 280 285

Asp Val Val Leu His Thr Asp Thr Arg Leu Leu Pro Arg Arg Lys Arg

290 295 300

Ala Trp Ala Ser Trp Asn Tyr Arg Leu Gly Gly Pro Gln Gln Ala Pro

305 310 315 320

Ala Ala Leu Thr Tyr Asn Met Asn Ile Leu Gln Gly Ile Gln Ala Pro

325 330 335

Thr Thr Phe Cys Val Ser Leu Asn Gln Thr Ala Leu Val Asp Pro Ala

340 345 350

Gln Ile Ile Ala Arg Phe Gln Tyr Asp His Pro Gln Tyr Ser Leu Ala

355 360 365

Ala Cys Ala Ala Gln Ala Arg Gln Ala Gln Leu Gln Gly Gln Arg His

370 375 380

Ser Tyr Phe Cys Gly Ala Tyr Trp Gly Asn Gly Phe His Glu Asp Gly

385 390 395 400

Val Val Ser Ala Leu Lys Val Ala Ala His Phe Gly Glu His Leu

405 410 415

所述单胺氧化酶的编码基因的序列如下（a）或（b）的DNA分子：

（a）序列表中序列SEQIDNo.2所示的DNA分子：

SEQIDNo.2核苷酸序列

atgcgtatag caatcatcgg cagcggcatt gcagggctgt cctgcgctca tctgctgtca 60

cgcaagcatg aggtgacggt tttcgaagcc gagaaatgga tcgggggcca cacgcatacc 120

ctcgatgtga tctggcaggg tgaacgccat gcaatagata ccggcttcat cgtcttcaat 180

gactggacct acccgcactt catccgcttg ctcgaccacc tgaaggtcgc ctcacggccg 240

accgaaatga gtttctcggt gcatgatccg gtcactggcc tggaatacaa cgggcacgac 300

ctgaataccc tgttcgccca acgccgcaac ctggtgtccc cggggttctg ggggatgcta 360

cgggatattc tgcgtttcaa tcgtcaggca ctcgccgacc tggataacca gcgtatcgat 420

gccaacgcga ccctgggcgc ctacctccgg gctcagcgct atggacagcg cttcatcgac 480

cattacatcg taccgatggg gtcggcgatc tggtcgatgt cccgcgcgga catgctcggc 540

ttcccacttg cgttctttgt gcggttttgt cgcaaccacg gcttgttgtc ggtcaaccaa 600

cgtccacagt ggcgcgtgat cgaagggggt tcgcgcagct atgtcagtcc gctgtgccgg 660

ccgtttgccg ggcgcatccg cctcgactgc aaggttttcc gggtcagccg cgacgaaggt 720

ggcgtcaccc tgacgagcgc tgccggtacc gagcgtttcg acaatgtggt gttcgcctgc 780

cacagcgacc aggccctggc tttgctcgaa gcgccgagcg tgcaggaacg ggaagtgctc 840

ggcgccatcg gttatgccag caacgatgtg gtgctgcaca ccgatacccg tctgctaccc 900

cgccgcaagc gcgcctgggc cagctggaac taccgtctcg gcgggccgca gcaggcgcct 960

gccgcgctga cctacaacat gaacattctg caaggtatcc aggcaccgac gaccttctgc 1020

gtgagcctca accagaccgc gctggtggat ccggcgcaga tcattgcccg cttccagtac 1080

gaccatccgc aatacagcct tgcggcgtgc gccgcgcagg cgcgccaggc gcagctgcag 1140

ggccagcgcc acagttactt ctgcggcgcc tactggggca acggctttca cgaggatggc 1200

gtagtcagtg cgttgaaggt ggccgcgcat ttcggagagc acctgtga 1248

（b）与序列表中序列SEQIDNo.2的核苷酸序列具有90%以上的同源性的且所编码蛋白具有单胺氧化酶功能的核苷酸序列。

序列表中SEQIDNo.2全长为1248个核苷酸，包含一个长度为1248个核苷酸的开放阅读框（ORF，自SEQIDNo.2的第1-1248位核苷酸序列），编码一个长度为415个氨基酸（序列表中SEQIDNo.1）、分子量约为45.7KDa的蛋白质，即为单胺氧化酶MAO5-ZMU。

含有所述单胺氧化酶编码基因的重组表达载体、含有该重组表达载体的基因工程菌均属于本发明的保护范围。

上述单胺氧化酶及其编码基因在制备手性2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉类化合物中的应用也属于本发明的保护范围。

经实验证明，本发明中的假单胞菌单胺氧化酶MAO5-ZMU，能氧化拆分2mM浓度的(rac)-2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉为(R)-2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉，转化率为51%，对映选择性ee值为>99%，反应时间为6h。

附图说明

图1为单胺氧化酶基因扩增电泳图；M：DNA分子量标准。

图2为单胺氧化酶基因重组表达载体物理图谱。

图3为单胺氧化酶基因重组表达载体酶切检测电泳图；M：DNA分子量标准。

图4为该单胺氧化酶的SDS-PAGE图；1：E.coli BL21(DE3)；2：IPTG诱导的E.coliBL21(DE3)/pET28b-MAO5；M：蛋白分子量Marker。

图5为该单胺氧化酶蛋白的基因工程菌催化（rac）-2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉氧化拆分的结果。

底物	底物浓度(mM)	时间(h)	ee(%)	构型	转化率(%)
						(rac)-2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉	2	6	>99	(R)	51

具体实施方式

我们从假单胞菌基因组中克隆了一个单胺氧化酶基因全长，通过重组表达载体导入大肠杆菌构建了单胺氧化酶基因工程菌，并以基因工程菌整细胞为生物催化剂，通过氧化拆分2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉类化合物得到手性2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉。下述实施例中所述方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1.单胺氧化酶编码基因的获得

分析假单胞菌菌株基因组序列，确定了一条长为1248bp的单胺氧化酶序列，设计一对特异性引物利用PCR技术进行扩增并最终获得了该基因全长编码框序列。具体方法如下：以提取的基因组DNA为模板，使用引物1：5’-CCATGGGCCGTATAGCAATCATCG-3’和2：5’-CTCGAGTCACAGGTGCTCTCCGAAATG-3’，并引入酶切位点，进行PCR扩增。PCR反应体系如下：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、基因组DNA 1μL、上下游引物各0.5μL、ddH₂O 10.5μL。PCR反应条件：95 ˚C预变性10 min；以98 ˚C变性10 s，56˚C退火30 s，72 ˚C延伸90 s为一个循环；72 ˚C延伸10 min，30个循环。PCR产物以0.9%琼脂糖凝胶电泳验证是否获得符合目的基因大小的片段。切胶回收符合预期大小基因片段并纯化，直接同T载体进行连接，得到克隆重组质粒pGEM-T-MAO5。将该重组质粒通过热激法转化至大肠杆菌DH5α中，通过氨苄青霉素抗性进行筛选，随机挑取阳性克隆子测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增得到的核苷酸序列长度为1248bp（SEQIDNo.2）,该序列编码一个完整的开放阅读框。

实施例2.单胺氧化酶编码基因重组表达载体的构建

以质粒pET28b(+)为该酶蛋白表达载体，构建了单胺氧化酶基因MAO5的原核重组表达载体。具体方法如下：提取重组质粒pGEM-T-MAO5，利用限制性内切酶NcoI/XhoI对重组质粒进行处理，并利用T4DNA连接酶（NEB）将该基因片段同用相同的限制性内切酶处理的表达载体pET28b(+)进行连接，构建表达载体pET28b(+)-MAO5。将构建的胞内表达载体pET28b(+)-MAO5通过热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)，涂于含有卡那霉素抗性平板，37˚C下培养过夜，随机挑取克隆子进行菌落PCR鉴定。

实施例3.单胺氧化酶蛋白重组表达与检测

将实施例2、鉴定后的含有胞内表达重组质粒pET28b-MAO5的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-MAO5分别用含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基37˚C、250rpm培养12h，再以1%接种量（v/v）接种到新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37˚C、250rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀约0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.01mM的IPTG，20˚C、250rpm诱导培养20h后，4˚C、8000rpm离心5min，收集含有重组单胺氧化酶的菌体细胞。

实施例4.含单胺氧化酶蛋白基因工程菌催化活性分析

将实施例3中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-MAO5湿菌体作为转化用酶，以外消旋的2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉为底物，进行生物催化的氧化拆分反应，制备 (R) 构型的2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉。该生物转化体系如下：5mL磷酸盐缓冲液（pH7.5）中加入0.25g湿菌体，加入2mM的底物，37˚C、200rpm震荡反应6h，加入5mL乙酸乙酯终止反应，萃取反应的底物和产物，离心取上层有机相用无水硫酸钠干燥，取上清300 μL于样品瓶中，并加入同等体积的异丙醇，经HPLC分析，依据峰面积计算产物产率和光学纯度。使用高效液相色谱仪对苯甲亚砜进行手性分析，流动相正己烷/异丙醇（90:10，V/V），流速为0.8 ml/min，检测器波长为254 nm使用Chiralcel OJ-H柱分析底物和产物。

序列表

<110> 遵义医学院

<120> 一种单胺氧化酶及其基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 415

<212> PRT

<213> 单胺氧化酶氨基酸序

<400> 2

Met Arg Ile Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ile Ala Gly Leu Ser Cys Ala

1 5 10 15

His Leu Leu Ser Arg Lys His Glu Val Thr Val Phe Glu Ala Glu Lys

20 25 30

Trp Ile Gly Gly His Thr His Thr Leu Asp Val Ile Trp Gln Gly Glu

35 40 45

Arg His Ala Ile Asp Thr Gly Phe Ile Val Phe Asn Asp Trp Thr Tyr

50 55 60

Pro His Phe Ile Arg Leu Leu Asp His Leu Lys Val Ala Ser Arg Pro

65 70 75 80

Thr Glu Met Ser Phe Ser Val His Asp Pro Val Thr Gly Leu Glu Tyr

85 90 95

Asn Gly His Asp Leu Asn Thr Leu Phe Ala Gln Arg Arg Asn Leu Val

100 105 110

Ser Pro Gly Phe Trp Gly Met Leu Arg Asp Ile Leu Arg Phe Asn Arg

115 120 125

Gln Ala Leu Ala Asp Leu Asp Asn Gln Arg Ile Asp Ala Asn Ala Thr

130 135 140

Leu Gly Ala Tyr Leu Arg Ala Gln Arg Tyr Gly Gln Arg Phe Ile Asp

145 150 155 160

His Tyr Ile Val Pro Met Gly Ser Ala Ile Trp Ser Met Ser Arg Ala

165 170 175

Asp Met Leu Gly Phe Pro Leu Ala Phe Phe Val Arg Phe Cys Arg Asn

180 185 190

His Gly Leu Leu Ser Val Asn Gln Arg Pro Gln Trp Arg Val Ile Glu

195 200 205

Gly Gly Ser Arg Ser Tyr Val Ser Pro Leu Cys Arg Pro Phe Ala Gly

210 215 220

Arg Ile Arg Leu Asp Cys Lys Val Phe Arg Val Ser Arg Asp Glu Gly

225 230 235 240

Gly Val Thr Leu Thr Ser Ala Ala Gly Thr Glu Arg Phe Asp Asn Val

245 250 255

Val Phe Ala Cys His Ser Asp Gln Ala Leu Ala Leu Leu Glu Ala Pro

260 265 270

Ser Val Gln Glu Arg Glu Val Leu Gly Ala Ile Gly Tyr Ala Ser Asn

275 280 285

Asp Val Val Leu His Thr Asp Thr Arg Leu Leu Pro Arg Arg Lys Arg

290 295 300

Ala Trp Ala Ser Trp Asn Tyr Arg Leu Gly Gly Pro Gln Gln Ala Pro

305 310 315 320

Ala Ala Leu Thr Tyr Asn Met Asn Ile Leu Gln Gly Ile Gln Ala Pro

325 330 335

Thr Thr Phe Cys Val Ser Leu Asn Gln Thr Ala Leu Val Asp Pro Ala

340 345 350

Gln Ile Ile Ala Arg Phe Gln Tyr Asp His Pro Gln Tyr Ser Leu Ala

355 360 365

Ala Cys Ala Ala Gln Ala Arg Gln Ala Gln Leu Gln Gly Gln Arg His

370 375 380

Ser Tyr Phe Cys Gly Ala Tyr Trp Gly Asn Gly Phe His Glu Asp Gly

385 390 395 400

Val Val Ser Ala Leu Lys Val Ala Ala His Phe Gly Glu His Leu

405 410 415

<210> 3

<211> 1248

<212> DNA

<213> 单胺氧化酶编码基因

<400> 3

atgcgtatag caatcatcgg cagcggcatt gcagggctgt cctgcgctca tctgctgtca 60

cgcaagcatg aggtgacggt tttcgaagcc gagaaatgga tcgggggcca cacgcatacc 120

ctcgatgtga tctggcaggg tgaacgccat gcaatagata ccggcttcat cgtcttcaat 180

gactggacct acccgcactt catccgcttg ctcgaccacc tgaaggtcgc ctcacggccg 240

accgaaatga gtttctcggt gcatgatccg gtcactggcc tggaatacaa cgggcacgac 300

ctgaataccc tgttcgccca acgccgcaac ctggtgtccc cggggttctg ggggatgcta 360

cgggatattc tgcgtttcaa tcgtcaggca ctcgccgacc tggataacca gcgtatcgat 420

gccaacgcga ccctgggcgc ctacctccgg gctcagcgct atggacagcg cttcatcgac 480

cattacatcg taccgatggg gtcggcgatc tggtcgatgt cccgcgcgga catgctcggc 540

ttcccacttg cgttctttgt gcggttttgt cgcaaccacg gcttgttgtc ggtcaaccaa 600

cgtccacagt ggcgcgtgat cgaagggggt tcgcgcagct atgtcagtcc gctgtgccgg 660

ccgtttgccg ggcgcatccg cctcgactgc aaggttttcc gggtcagccg cgacgaaggt 720

ggcgtcaccc tgacgagcgc tgccggtacc gagcgtttcg acaatgtggt gttcgcctgc 780

cacagcgacc aggccctggc tttgctcgaa gcgccgagcg tgcaggaacg ggaagtgctc 840

ggcgccatcg gttatgccag caacgatgtg gtgctgcaca ccgatacccg tctgctaccc 900

cgccgcaagc gcgcctgggc cagctggaac taccgtctcg gcgggccgca gcaggcgcct 960

gccgcgctga cctacaacat gaacattctg caaggtatcc aggcaccgac gaccttctgc 1020

gtgagcctca accagaccgc gctggtggat ccggcgcaga tcattgcccg cttccagtac 1080

gaccatccgc aatacagcct tgcggcgtgc gccgcgcagg cgcgccaggc gcagctgcag 1140

ggccagcgcc acagttactt ctgcggcgcc tactggggca acggctttca cgaggatggc 1200

gtagtcagtg cgttgaaggt ggccgcgcat ttcggagagc acctgtga 1248

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物1

<400> 3

ccatgggccg tatagcaatc atcg 24

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物2

<400> 4

ctcgagtcac aggtgctctc cgaaatg 27

Claims

1.一种蛋白质，其特征在于，其是如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由序列SEQIDNo.1所示氨基酸序列组成的蛋白质；（b）在（a）的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与序列SEQIDNo.1所示蛋白具有相同活性的由（a）衍生的蛋白质。

2.编码权利按要求1所述单胺氧化酶的基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。

4.如权利1所述的酶蛋白质，特征在于所述蛋白质具有单胺氧化酶活性。

5.含有权利要求3所述的编码基因的重组表达载体、或含该重组表达的基因工程菌。

6.权利要求2所述的基因在制备单胺氧化酶中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有SEQIDNo.1所示单胺氧化酶基因的重组载体，将所述的重组载体转化至大肠杆菌中得到该单胺氧化酶MAO5-ZMU的基因工程菌；将获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组单胺氧化酶的菌体细胞。

8.权利要求1所述单胺氧化酶蛋白在生物催化2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉类化合物的氧化拆分。