CN104212850B - 利用腈水解酶工程菌制备1‑氰基环己基乙酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用腈水解酶工程菌制备1‑氰基环己基乙酸的方法：将含重组腈水解酶基因的工程菌经发酵培养后的培养液离心，以湿菌体作为催化剂，以1‑氰基环己基乙腈为底物，以pH值为3.0～10.0的缓冲液为反应介质，在25～70℃进行转化反应，反应结束后，获得含1‑氰基环己基乙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得1‑氰基环己基乙酸；所述含重组腈水解酶基因的工程菌由SEQ IDNO.2所示核苷酸序列编码基因构建而成；本发明所述含腈水解酶的工程菌作为催化剂，具有良好的区域选择性和催化活力，生产过程对环境友好。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种加巴喷丁关键中间体1-氰基环己基乙酸的制备方法，特别涉及一种利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法。
(二)背景技术
1-氰基环己基乙酸是合成加巴喷丁的关键中间体，目前主要用化学法生产，反应条件苛刻，产生的废气须大量碱液吸收，步骤较多，收率较低。
腈水解酶能够实现有机腈化合物的一步区域选择性水解合成对应的有机羧酸。通过腈水解酶实现氰基水解反应条件温和，反应效率高，而且具有比较高的区域选择性和立体选择性。近年来，利用腈水解酶进行氰基水解合成有机羧酸已经成为研究的热点，大量文献、专利报道了利用腈水解酶的区域选择性在有机羧酸合成中的应用。
Zhu等人报道了来自于菌株Bradyrhizobium japonicum USDA110中的腈水解酶bll6402(Dunming Zhu,Adv.Synth.Catal.2007,349,1667-1670)，发现此腈水解酶可以催化各种双腈，对部分双腈(包括1-氰基环己基乙腈及其类似物)具有较高的区域选择性。
Sophie Bergeron等人报道了一株腈水解酶BD9570(来自Diversa)(SophieBergeron,Organic Process Research & Development 2006,10,661-665)，此腈水解酶可以催化3-羟基戊二腈合成阿托伐他汀侧链关键手性中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸，具有较高的区域选择性和立体选择性。
Zhiyi Xie等人报道了一株来自于Arabidopsis thaliana的腈水解酶AtNit1(Zhiyi Xie,Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2006,41,75–80)，该腈水解酶可以催化异丁基丁二腈合成普瑞巴林手性中间体(3S)-3-氰基-5-甲基己酸，具有很高的区域选择性和立体选择性。
John E.Gavagan等人报道了一株来源于Acidovorax facilis 72W腈水解酶(JohnE.Gavagan,J.Org.Chem.,1998,63,4792-4801)，该脂肪族腈水解酶对于α,ω-双腈具有较好的区域选择性。专利US2005009157 A1也报道了该腈水解酶可以催化1-氰基环己基乙腈合成加巴喷丁中间体1-氰基环己基乙酸。
专利US2005009157 A1还报道了商品化腈水解酶NIT-104，NIT-105，NIT-106(来自Biocatalytics Inc.)以及来自菌株Bacillus sphaericus的腈水解酶对于1-氰基环己基乙腈具有区域选择性活力。
Carmela Bengis-Garber等人报道了菌株Rhodococcus rhodochrousN.C.I.B.11216中的腈水解酶对于α,ω-双腈的催化具有区域选择性。且该菌株的区域选择性与底物α,ω-双腈的碳链长度以及培养时所用的诱导剂有关。(Carmela Bengis-Garber,Appl Microbiol Biotechnol(1989)32:11-16)
Chandrani Mukherjee等人报道了一株来自于Synechocystis sp.StrainPCC6803的腈水解酶(Chandrani Mukherjee,Eur.J.Org.Chem.2006,5238–5242)，该腈水解酶催化各种α,ω-双腈，其区域选择性与α,ω-双腈的碳链长度有很大的关系。随着碳链长度的增加，该腈水解酶的区域选择性逐渐下降。
迄今为止，有关对1-氰基环己基乙腈具有区域选择性催化活力的腈水解酶报道较少，主要来自Acidovorax facilis 72W，Bradyrhizobium japonicum USDA110，Bacillussphaericus以及商品化腈水解酶NIT-104、NIT-105、NIT-106。但是这些腈水解酶催化1-氰基环己基乙酸存在催化活性较低和催化剂用量较大的问题。所以筛选新型生物催化剂，开发高效加巴喷丁关键中间体酶法合成工艺，建立绿色经济的加巴喷丁合成新工艺具有重要意义。
(三)发明内容
本发明目的在于解决传统的化学法水解1-氰基环己基乙腈为1-氰基环己基乙酸的工艺中，反应条件苛刻，反应中需要大量的有机溶剂，成本较高，收率较低，环境污染较为严重的问题。
本发明提供一种水解1-氰基环己基乙腈的区域选择性腈水解酶，该酶在催化上述反应时具有良好的区域选择性和催化活力，生产过程对环境友好。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法，所述方法为：将含重组腈水解酶基因的工程菌经发酵培养后的培养液离心，以湿菌体作为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为3.0～10.0的缓冲液为反应介质(优选pH值为7的磷酸缓冲液)，在25～70℃(优选35℃)进行转化反应，反应结束后，获得含1-氰基环己基乙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸；所述含重组腈水解酶基因的工程菌由SEQ ID NO.2所示核苷酸序列编码基因构建而成。所述底物初始浓度为0.02～1mol/L，优选100mmol/L，所述湿菌体的质量终浓度为10～100g/L，优选50g/L。
进一步，本发明所述催化剂按如下方法制备：将含腈水解酶基因的工程菌接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm培养10～12小时，获得种子液；随即将种子液以体积浓度2％的接种量接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm培养至培养液的OD600为0.6～0.8，向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃、150rpm诱导培养10小时，将培养液离心，取沉淀水洗，获得湿菌体即为催化剂；所述LB液体培养基组成为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为水，pH值为7。
本发明所述1-氰基环己基乙酸分离纯化的方法通常为：转化结束后，转化液内加入7～8mL、10.5M的NaOH溶液(使产物较好溶解，提高回收率)，调pH至8.5-9.0，离心(9000rpm，10min)，取上清液。往上清液中按体积比1:1比例加入乙醇水溶液(含水量5％体积浓度)(去除菌体破碎产生的核酸，蛋白质等)，抽滤。取滤液，减压蒸馏(温度控制在50℃以下)。馏出酒精后的剩余液体内加入5‰的HC-767针剂用活性炭吸附杂质，抽滤。滤液内加盐酸调pH至2.5左右，静置，抽滤，将漏斗内含有单酸的滤液回收烘干(35℃以下)，即获得产物1-氰基环己基乙酸。
本发明所述生物催化1-氰基环己基乙腈制备1-氰基环己基乙酸的反应方程为：
本发明所述含腈水解酶基因的工程菌的构建方法为：利用蛋白质(PDB)和(NCBI)数据库对腈水解酶基因序列进行筛选，以紫红红球菌K22(Rhodococcus rhodochrous K22)的腈水解酶基因(GeneBank accession no.D12583)序列为基础，依据大肠杆菌偏好的密码子进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了SEQ ID NO.2所示的腈水解酶基因RkN，该基因编码的腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。然后将上述腈水解酶基因转入载体中构建重组表达载体pET28b(+)–RkN，再用重组表达载体转化宿主菌(优选大肠杆菌BL21(DE3))，构建含腈水解酶基因的工程菌。
经过序列比对，Rhodococcus rhodochrous K22腈水解酶与已有报道对于1-氰基环己基乙腈具有催化活力的腈水解酶—Acidovorax facilis 72W腈水解酶(GeneBankaccession no.ABD98457)和Bradyrhizobium japonicum USDA110的腈水解酶bll6402(GeneBank accession no.BAC51667)同源性分别为68.15％和40.31％。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种微生物催化1-氰基环己基乙腈制备1-氰基环己基乙酸的方法，本发明所述含腈水解酶的工程菌作为催化剂，具有良好的区域选择性和很高的催化活力(比酶活达到4800U/g)，生产过程对环境友好；解决了传统的化学法水解1-氰基环己基乙腈为1-氰基环己基乙酸的工艺中反应条件苛刻、反应需要大量的有机溶剂、成本较高、收率较低，环境污染较为严重的问题。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例所用主要实验材料来源为：
大肠杆菌宿主菌株E.coli BL21(DE3)购自Invitrogen公司，表达载体pET-28b(+)购自Novagen公司，限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ购自Fermentas公司，T4 DNA连接酶和卡那霉素均购自大连宝生物有限公司；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)为Promega公司产品。DNA Marker和染色剂Gold View购自TaKaRa公司；Axygen DNA凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、PCR纯化试剂盒购自爱思进生物技术有限公司。
实施例1：腈水解酶基因的合成
利用蛋白质PDB和NCBI数据库对腈水解酶基因序列进行筛选，得到一个腈水解酶基因(GeneBank accession no.D12583)。该腈水解酶来源于紫红红球菌K22(Rhodococcusrhodochrous K22)，根据Rhodococcus rhodochrous K22腈水解酶的序列(GeneBankaccession no.D12583)，依据大肠杆菌偏好的密码子进行密码子优化，根据表达载体pET28b(+)的特点设计了酶切位点Nco Ⅰ、Xho Ⅰ，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了该段腈水解酶基因RkN(SEQ ID NO.2所示)，编码酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
实施例2：腈水解酶基因表达载体及其重组转化子的构建
合成的腈水解酶基因RkN与pET28b(+)都分别用Nco I和Xho I进行双酶切，大约酶切6h后，回收酶切产物，利用T4连接酶在16℃下连接16小时，得到重组表达质粒pET28b(+)-RkN。将表达载体pET28b(+)-RkN转化至E.coli BL21(DE3)受体菌，涂布于含卡那霉素(终浓度50mg/L)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜后，平板上长出菌落(黄白色圆形菌落)。随机挑取单克隆，培养后提取质粒进行测序，测序结果表明得到阳性克隆E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-RkN。
实施例3：腈水解酶的表达
实施例2中得到的重组转化子E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-RkN接种到LB液体培养基中，37℃，150rpm培养10-12小时，然后按体积浓度2％的接种量接种至含有卡那霉素(终浓度50mg/L)的LB液体培养基进行扩大培养，37℃，150rpm培养至培养液的OD600为0.6-0.8之间，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mM，28℃，150rpm诱导培养10小时。培养液离心收集菌体，用生理盐水清洗2次得到湿菌体。
实施例4：腈水解酶活力验证
对实施例3中得到的湿菌体进行静息细胞催化反应，以验证腈水解酶对于1-氰基环己基乙腈的活力。
实验方法：称取0.5g湿菌体(终浓度50g/L)悬浮于10mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(pH＝7.0，0.2M)，加入0.296g1-氰基环己基乙腈(终浓度200mM)，35℃恒温水浴反应30min。反应完成后，取1mL反应液，12000rpm离心，弃去沉淀，取上清液用高效液相色谱(C18柱)分析产物浓度。高效液相色谱分析条件为：流动相为缓冲液(0.58g磷酸二氢铵+1.83g过氯酸钠溶于1L纯水中，用高氯酸调节pH为1.8)∶乙腈＝76∶24，柱温为40℃。同样条件下，以E.coli BL21(DE3)空载体和未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-RkN以及含有Acidovorax facilis 72W腈水解酶的E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-AcN为对照，结果如表1所示。酶活定义为：在一定条件下，每分钟催化底物生产1μmol产物所需的酶量定义为一个活力单位，记为U。
表1：腈水解酶RkN活力验证结果
实施例5：使用含有腈水解酶RkN的重组大肠杆菌转化100mM 1-氰基环己基乙腈。
实验方法：称取0.5g湿菌体(实施例3制备，终浓度50g/L)悬浮于10mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(pH＝7.0，0.2M)，加入0.148g1-氰基环己基乙腈(终浓度100mM)，35℃恒温水浴反应4小时。反应完成后，取1mL反应液，12000rpm离心，弃去沉淀，取上清液用高效液相色谱(C18柱)分析产物浓度。高效液相色谱分析条件为：流动相为缓冲液(0.58g磷酸二氢铵+1.83g过氯酸钠溶于1L纯水中，用高氯酸调节pH为1.8)∶乙腈＝76∶24，柱温为40℃。结果：产物1-氰基环己基乙酸的浓度为99mM，产率为99％。
实施例6：使用含有腈水解酶RkN的重组大肠杆菌转化200mM 1-氰基环己基乙腈
实验方法：称取0.5g湿菌体(实施例3制备，终浓度50g/L)悬浮于10mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(pH＝7.0，0.2M)，加入0.296g1-氰基环己基乙腈(终浓度200mM)，35℃恒温水浴反应30min。反应完成后，取1mL反应液，12000rpm离心，弃去沉淀，取上清液用高效液相色谱(C18柱)分析产物浓度。高效液相色谱分析条件为：流动相为缓冲液(0.58g磷酸二氢铵+1.83g过氯酸钠溶于1L纯水中，用高氯酸调节pH为1.8)∶乙腈＝76∶24，柱温为40℃。
结果如下：产物1-氰基环己基乙酸的浓度为192mM，产率为96％。
实施例7：使用含有腈水解酶RkN的重组大肠杆菌转化500mM 1-氰基环己基乙腈
实验方法：称取实施例3方法制备的10g湿菌体(终浓度100g/L)悬浮于100mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(pH＝7.0，0.2M)，加入7.4g1-氰基环己基乙腈(终浓度500mM)，35℃恒温水浴反应12小时。反应液使用2倍体积的乙酸乙酯萃取，弃去有机相。水相加入醋酸酸化，再加入2倍体积的乙酸乙酯萃取。有机相35℃烘干，得到1-氰基环己基乙酸。
结果如下：得到产物1-氰基环己基乙酸6.75g，产率为91.2％。
Claims (5)
1.一种利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法，其特征在于所述方法为：将含重组腈水解酶基因的工程菌经发酵培养后的培养液离心，以湿菌体作为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为3.0～10.0的缓冲液为反应介质，在25～70℃进行转化反应，反应结束后，获得含1-氰基环己基乙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸；所述含重组腈水解酶基因的工程菌是将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列编码基因转入载体中构建重组表达载体，再用重组表达载体转化宿主菌构建而成。
2.如权利要求1所述利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法，其特征在于所述底物初始浓度为0.02～1mol/L，所述湿菌体的质量终浓度为10～100g/L。
3.如权利要求1所述利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含腈水解酶基因的工程菌接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10～12小时，获得种子液；随即将种子液以体积浓度2％的接种量接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至培养液的OD600为0.6～0.8，向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养10小时，将培养液离心，取沉淀水洗，获得湿菌体即为催化剂；所述LB液体培养基组成为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为水，pH值为7。
4.如权利要求1所述利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法，其特征在于所述转化反应介质为pH值为7的磷酸缓冲液。
5.如权利要求1所述利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法，其特征在于所述转化反应温度为35℃。
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Application publication date: 20141217 Assignee: Hangzhou Guangyoujiu Enterprise Management Partnership (L.P.) Assignor: JIANG University OF TECHNOLOGY Contract record no.: X2023980033595 Denomination of invention: Preparation of 1-Cyanocyclohexylacetic Acid Using Nitrile Hydrolase Engineered Bacteria Granted publication date: 20170613 License type: Common License Record date: 20230316 Application publication date: 20141217 Assignee: Hangzhou baibeiyou Biotechnology Co.,Ltd. Assignor: JIANG University OF TECHNOLOGY Contract record no.: X2023980033594 Denomination of invention: Preparation of 1-Cyanocyclohexylacetic Acid Using Nitrile Hydrolase Engineered Bacteria Granted publication date: 20170613 License type: Common License Record date: 20230315 Application publication date: 20141217 Assignee: Hangzhou Zhiguo Enterprise Service Co.,Ltd. Assignor: JIANG University OF TECHNOLOGY Contract record no.: X2023980033596 Denomination of invention: Preparation of 1-Cyanocyclohexylacetic Acid Using Nitrile Hydrolase Engineered Bacteria Granted publication date: 20170613 License type: Common License Record date: 20230316 |
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