CN105602922B

CN105602922B - 一种泛生菌酰胺酶、基因、载体、工程菌及其应用

Info

Publication number: CN105602922B
Application number: CN201510729058.4A
Authority: CN
Inventors: 郑仁朝; 郑裕国; 吴哲明
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2015-10-30
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2035-10-30
Also published as: CN105602922A

Abstract

本发明公开了一种泛生菌酰胺酶、基因、载体、工程菌及其在生物催化1‑氰基环己基乙酰胺制备1‑氰基环己基乙酸中的应用，所述酰胺酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；本发明首次报道了利用酰胺酶生物催化生成1‑氰基环己基乙酸的合成工艺，具有催化剂用量小(2g/L)，底物浓度高(100g/L)，反应时间短(20min)，产物转化率达100％等显著优势。

Description

一种泛生菌酰胺酶、基因、载体、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种编码酰胺酶的基因、编码酶蛋白、含有该基因的重组载体以及转化得到的重组基因工程菌及其在催化1-氰基环己基乙酰胺合成加巴喷丁关键中间体1-氰基环己基乙酸中的应用。

(二)背景技术

加巴喷丁，化学名为1-(氨甲基)环己基乙酸(I)，是由美国Warner-Lambert公司开发的癫痫治疗药物，其后又被用于神经病理性疼痛的治疗。与当前同类药物相比，加巴喷丁在口服吸收、毒副作用、耐受性以及治疗效果等方面具有优势显著。而且加巴喷丁在体内不易代谢，不诱导产生肝酶，与其它抗癫痫药物极少相互作用。因此，加巴喷丁在癫痫治疗药物市场中占有重要地位。

尽管加巴喷丁分子结构相对简单，但其为两性分子(既有-NH₂又有-COOH)，极易形成五元环内酯。目前，已报道的加巴喷丁合成路线一般以环己酮为起始原料，经全化学法合成(US2003009055A,DE2543821,EP4l4262A)。如环己酮经环合、水解、缩合、氨解和Hoffmann降解等步骤得到加巴喷丁(WO2003002504，WO2003002517)。但该工艺会产生大量酸性废液，且产物需用离子交换分离，成本较高。此外，以非环己酮的六元环化合物如苯甲腈为起始原料的工艺，由于原料价格高，反应条件苛刻，工业化开发价值低。

区域选择性水解脂环族α,ω-二腈化合物1-氰基环己基乙腈(Ⅱ)可获得加巴喷丁关键中间体1-氰基环己基乙酸(Ⅲ)，该中间体经一步催化加氢即得到终产品。该路线是目前最为简便、绿色的加巴喷丁合成工艺之一(US20050009154)。但该催化工艺底物浓度低，反应时间长，2.96g/L底物经22h催化，转化率为97％。此外，专利CN201410053739.9报道了红球菌ZJB1208腈水合酶区域选择性催化1-氰基环己基乙腈合成1-氰基环己基乙酰胺(Ⅳ)的工艺。但在化学水解1-氰基环己基乙酰胺合成1-氰基环己基乙酸时，该分子中的氰基和酰胺基团易同时被水解。因此，酰胺酶催化水解1-氰基环己基乙酰胺成为合成1-氰基环己基乙酸的首选方法。

酰胺酶(Amidase,EC 3.5.1.4)是一类可催化各类天然、非天然酰胺类化合物水解生成相应羧酸的水解酶。由于具有良好的化学、区域和立体选择性，以及宽广的底物谱，酰胺酶在医药化工行业的应用前景广阔。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种酰胺酶基因、含有该酰胺酶基因的重组载体、该重组载体转化得到的基因工程菌和表达得到的重组酰胺酶，及其在催化1-氰基环己基乙酰胺水解合成1-氰基环己基乙酸中的应用，为腈水合酶/酰胺酶耦联催化合成加巴喷丁关键中间体奠定基础，解决目前腈水解酶选择性水解路线所存在的催化剂用量过大，反应时间过长等问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种泛生菌酰胺酶，所述酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。任何对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有酰胺酶活性的，仍属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种所述泛生菌酰胺酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该酰胺酶基因通过分子生物学手段人工合成，具体的筛选方法为根据酰胺酶标签(Amidase signature，AS)家族及腈水解酶(Nitrilase superfamily,NF)家族酰胺酶保守序列针对性地寻找NCBI收录的氨基酸序列，进一步筛选可匹配催化三联体的蛋白。最终确定了一个酰胺酶(GenBank accession NO.WP_008109374)，该酰胺酶来源于泛生菌(Pantoea sp.YR343)，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。依据该氨基酸序列推测编码该酰胺酶的基因，并根据大肠杆菌偏好的密码子对该基因进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了该段酰胺酶基因pa-ami，为方便重组酰胺酶的分离纯化，在该基因末端加入表达组氨酸标签的核苷酸序列，全长1445bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

如本领域技术人员所知，本发明的酰胺酶基因核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的其它任何核苷酸序列。

任何对SEQ ID NO.2所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。

本发明还涉及一种由所述泛生菌酰胺酶编码基因构建的重组载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本发明的泛生菌酰胺酶核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28a。较佳地，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的酰胺酶基因产物pa-ami与载体pUC57连接形成克隆载体。该克隆载体经限制性内切酶Nco I/HindⅢ双酶切，切胶回收后与同样经酶切处理回收的pET-28a连接，构建本发明的酰胺酶基因重组表达质粒pET28a-Pa-Ami。

本发明还涉及一种由所述重组载体转化获得的重组基因工程菌，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的酰胺酶基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将重组质粒pET28a-Pa-Ami转化至E.coli BL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami。

本发明还涉及一种所述泛生菌酰胺酶编码基因在制备泛生菌酰胺酶中的应用，所述的应用为：构建含泛生菌酰胺酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化，获得含泛生菌酰胺酶的菌体细胞。所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的泛生菌酰胺酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生酰胺酶即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组酰胺酶，具体为：将构建的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种到含50μg/mL卡那霉素LB培养基中，37℃，150rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃，8000rpm离心10min，收集湿菌体。

此外，本发明提供一种所述泛生菌酰胺酶在生物催化1-氰基环己基乙酰胺制备1-氰基环己基乙酸中的应用，具体所述的应用为：以含泛生菌酰胺酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以1-氰基环己基乙酰胺为底物，以pH 6～10的缓冲液为反应介质，在25～45℃进行水解反应，反应完全后，获得含1-氰基环己基乙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸。所述的底物终浓度以缓冲液体积计为80～120g/L缓冲液，所述湿菌体用量以缓冲液体积计为1～2g/L缓冲液。

进一步，优选的底物终浓度以缓冲液体积计为100g/L缓冲液，所述湿菌体用量以缓冲液体积计为2g/L缓冲液。

进一步，优选所述的缓冲液为0.02～0.1mol/L，pH 8.0～8.5的Tris-HCl缓冲液，最优选pH＝8.5，50mM Tris-HCl缓冲液。

本发明所述含1-氰基环己基乙酸的混合液分离纯化的方法为：反应结束后，反应液于12,000rpm下离心10min去除菌体，用1M HCl将上清液调至pH 2.0，抽滤获得1-氰基环己基乙酸粗品。粗品经重结晶后于50～60℃烘干，获得1-氰基环己基乙酸。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明获得了一株可高效催化1-氰基环己基乙酰胺的酰胺酶工程菌，并首次报道了利用酰胺酶生物催化生成1-氰基环己基乙酸的合成工艺，具有催化剂用量小(2g/L)，底物浓度高(100g/L)，反应时间短(20min)，产物转化率达100％等显著优势。

(四)附图说明

图1为酰胺酶基因琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1为DL2000 DNA Marker(从上至下条带大小分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道2为酰胺酶基因片段；

图2为pET28a-Pa-Ami重组质粒物理图谱；

图3为酰胺酶分离纯化SDS-PAGE图；泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2为未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami，泳道3为IPTG诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami，泳道4为诱导后E.coli BL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami破碎上清，泳道5为纯化后的Pa-Ami；

图4为酰胺酶催化1-氰基环己基乙酰胺水解生成1-氰基环己基乙酸的高效液相色谱图，保留时间4.72min为1-氰基环己基乙酰胺，保留时间10.26min为1-氰基环己基乙酸。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：泛生菌酰胺酶基因pa-ami的获得

该酰胺酶基因通过分子生物学手段合成，具体的筛选方法为根据AS家族及NF家族酰胺酶保守序列，有针对性地寻找NCBI收录的基因编码的氨基酸序列，进一步筛选可匹配催化三联体的蛋白。最终确立了一个来源于泛生菌(Pantoea sp.YR343)的酰胺酶(GenBankaccession NO.WP_008109374)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。依据大肠杆菌偏好的密码子对该酰胺酶基因进行优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了该段酰胺酶基因pa-ami，全长1445bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框。

实施例2：重组表达载体pET28a-Pa-Ami的构建

利用TaKaRa公司PMD-18T试剂盒将实施例1合成的酰胺酶基因pa-ami片段与pUC57载体连接，得到克隆重组质粒pUC57-Pa-Ami。将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，随机挑取单菌落测序，得到核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的基因。

培养含重组质粒pUC57-Pa-Ami的E.coli JM109菌体，利用质粒提取试剂盒提取质粒pUC57-Pa-Ami，经过限制性内切酶Nco I/HindⅢ(Fermentas)进行双酶切，切胶回收后用T4连接酶(Promega)将该片段与用相同限制性内切酶处理的商业化载体pET-28a(Novagen)连接过夜，构建重组表达质粒pET28a-Pa-Ami。

实施例3：基因工程菌E.coli BL21/pET28a-Pa-Ami的构建

将实施例2中构建的重组表达载体pET28a-Pa-Ami转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB平板，于37℃下培养过夜。随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆测序验证。结果表明重组表达载体pET28a-Pa-Ami成功转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)中，且酰胺酶基因已成功克隆至pET-28a的Nco I和HindⅢ位点，获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami。

实施例4：重组酰胺酶的诱导表达

实施例3构建的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种到含50μg/mL卡那霉素LB培养基中，37℃，150rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃，8000rpm离心10min，收集湿菌体。

以未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami、IPTG诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami，诱导后E.coli BL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami破碎上清，泳道5为纯化后的Pa-Ami作为对照，分别取20μL培养液与2×SDS-PAGE上样缓冲液混合后煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳分析。图3表明，经IPTG诱导后在50kD附近出现明显表达条带，与目的蛋白大小吻合，进一步证明工程菌构建成功。

实施例5：重组酰胺酶的分离纯化和酶活测定

实施例4收集的湿菌体细胞悬浮于50mL Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 8.0)中，振荡摇匀后置超声波下破碎(有效时间15min，作用功率40W)。破碎液于12,000rpm离心10min去除细胞碎片，收集上清液(粗酶液)用于酶的后续分离纯化。纯化柱为Ni-NTA，装柱体积为20mL，先用上样平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 8.0)平衡Ni-NTA柱，以1.5mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl和500mM咪唑，pH 8.0)洗脱收集目标蛋白。酶液在20mM，pH 8.0的Tris-HCl中透析过夜(更换2次缓冲液)，纯化后的酶液用SDS-PAGE进行分析。SDS-PAGE电泳见图3，结果表明经Ni-NTA亲和层析，得到电泳纯的Pa-Ami。

转化反应：反应体系为1mL，含Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 8.0)，终浓度为71.6ng/mL的Pa-Ami，终浓度为20mM的1-氰基环己基乙酰胺。50℃摇床150r/min条件下反应10min测定酶活力。酶活(U)定义：在50℃，pH 8.0的条件下，每分钟生成1微摩尔1-氰基环己基乙酸所需的酶量。比酶活指每毫克酶蛋白所具有的酶活，U/mg。经测定，Pa-Ami的比酶活为297.6U/mg。

实施例6：含有重组酰胺酶的重组大肠杆菌水解1-氰基环己基乙酰胺

以实施例4中收集的重组酰胺酶工程菌湿菌体及含空载体的大肠杆菌湿菌体为生物催化剂，催化底物1-氰基环己基乙酰胺水解生成1-氰基环己基乙酸。生物催化体系组成及操作如下：

对照组：称取0.2g含空载体的大肠杆菌湿菌体悬浮于10mL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5，50mM)制备成终浓度为20g/L的菌悬液，取上述1mL菌悬液于9mL Tris-HCl缓冲液体系中(pH＝8.5，50mM)中(菌体终浓度为2g/L)，加入1g 1-氰基环己基乙酰胺(终浓度100g/L)，35℃恒温水浴反应20分钟。

实验组：称取0.2g实施例4中收集的重组酰胺酶工程菌湿菌体悬浮于10mL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5，50mM)制备成终浓度为20g/L的菌悬液。

(1)取上述1mL菌悬液加入9mL Tris-HCl缓冲液体系中(pH＝8.5，50mM)中(菌体终浓度为2g/L)，加入0.8～1.2g 1-氰基环己基乙酰胺(终浓度80、100、120g/L)，35℃恒温水浴反应30分钟，见表1。

(2)取上述0.5～1mL菌悬液加入9.0～9.5mL Tris-HCl缓冲液体系中(终体积10mL，pH＝8.5，50mM)中(菌体终浓度为1、2g/L)，加入1g 1-氰基环己基乙酰胺(终浓度100g/L)，35℃恒温水浴反应30分钟，见表1。

反应过程中每隔一段时间取样，取900μL反应液加100μL HCl(1M)终止反应，12000rpm离心，弃去沉淀。处理后的反应液用高效液相色谱(C18柱)分析产物浓度。高效液相色谱分析条件为：流动相为缓冲液(0.58g磷酸二氢铵+1.83g过氯酸钠溶于1L纯水中，用高氯酸调节pH为1.8)∶乙腈＝76：24，检测波长215nm，柱温为40℃。

根据实验结果，含空载体的对照组未表现水解活力，而重组酰胺酶催化反应优选的底物终浓度以缓冲液体积计为100g/L缓冲液，所述湿菌体用量以缓冲液体积计为2g/L缓冲液。结果如表1所示：

表1 酰胺酶催化1-氰基环己基乙酰胺水解结果

Claims

1.一种泛生菌酰胺酶在生物催化1-氰基环己基乙酰胺制备1-氰基环己基乙酸中的应用，其特征在于所述酰胺酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述泛生菌酰胺酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含泛生菌酰胺酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以1-氰基环己基乙酰胺为底物，以pH 6～10的缓冲液为反应介质，在25～45℃进行水解反应，反应完全后获得含1-氰基环己基乙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的底物终浓度以缓冲液体积计为80-120g/L缓冲液，所述湿菌体用量以缓冲液体积计为1-2g/L缓冲液。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的缓冲液为0.02～0.1mol/L，pH 8.0～8.5的Tris-HCl缓冲液。