CN113025542B - 产l-谷氨酰胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

产l-谷氨酰胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产L‑谷氨酰胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明首先公开了重组大肠杆菌，其与作为出发菌的大肠杆菌相比，谷氨酰胺合成酶的基因的表达量和/或含量和/或活性增加，和/或下述蛋白质的基因的表达量和/或含量和/或活性降低；所述蛋白质为如下至少一种：谷氨酰胺酶A；谷氨酰胺酶B；同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶；肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶；PII‑1蛋白。进一步提供了制备L‑谷氨酰胺的方法。本发明通过在大肠杆菌中过表达谷氨酰胺合成酶的基因，同时阻断旁路途径，开发了一套以L‑谷氨酸为底物高效合成游离L‑谷氨酰胺的方法。

Description

产L-谷氨酰胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种产L-谷氨酰胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。
背景技术
L-谷氨酰胺(L-glutamine，L-Gln)，别名左旋谷氨酰胺，学名2-氨基-4-氨甲酰基丁酸，是谷氨酸的酰胺。谷氨酰胺于1914年首次在人体中被发现，是人体内丰度最高的非必需氨基酸，血液中的浓度可高达0.4～0.9mM。谷氨酰胺主要由骨骼肌合成、储存和释放，少部分在脂肪细胞、肝和肺合成；可被肠细胞、肾、肝、胰岛细胞和免疫细胞吸收。由于谷氨酰胺合成能力大大超过了蛋白质中的谷氨酰胺含量，并且存在于细胞质中，因此，谷氨酰胺主要由从头合成获得。在运动等生理应激过程中，血液中皮质醇浓度的增加可引起肌肉蛋白质的水解，氨基酸转氨为谷氨酸，谷氨酰胺合成和释放增加。每天大约有8-9克谷氨酰胺从整个人类肌肉组织中释放出来。
谷氨酰胺被认为是一种“条件必需氨基酸”，在所有氨基酸中具有最丰富的功能，在维持肠道功能，促进免疫机能，维持内环境稳态以及提高机体对应激的适应性等方面都发挥着极其重要的作用，对人类健康具有重要意义。
健康状态下，通过食物获取、骨骼肌和肝脏内源合成维持充足的谷氨酰胺储量；而当人体处于疾病或应激压力时，谷氨酰胺的需求量会大大增加而失衡，导致人体出现代谢紊乱和临床症状。
目前生产L-谷氨酰胺的方法主要为：1)化学合成谷氨酰胺：主要以谷氨酸和甲醇为原料，该过程主要经过酷化、氨解、酸解和结晶等过程。该方法相对复杂，成本较高，并且在制取过程中使用的化学试剂残留会使产品带有一定的异味，使该工艺的发展受到了严重制约，其产品的应用范围也受到了影响。2)发酵法生产谷氨酰胺是谷氨酰胺生产中采用的最普遍的方法。由于发酵生产中的原料来源广泛以及对生产菌的不断剔选和改造，发酵法生产谷氧酰胺取得了更加显著地成就。但发酵法效价仍有待进一步提高，发酵液成分复杂，分离纯化步骤较为复杂，因谷氨酰胺在常温下易分解，因而只能在低温下进行，更进一步增加了谷氨酰胺精制的成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供L-谷氨酰胺高产菌株，以实现发酵法高效大规模工业化生产 L-谷氨酰胺。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组大肠杆菌。
本发明所述重组大肠杆菌与受体大肠杆菌相比，所述重组大肠杆菌中下述蛋白质的基因的表达量降低和/或所述蛋白质的含量降低和/或所述蛋白质的活性降低；
所述蛋白质选自如下至少一种：
1)谷氨酰胺酶A(GlsA)；
2)谷氨酰胺酶B(GlsB)；
3)同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性(ATase)和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性(ATd) 的双功能酶(GlnE)；
4)肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶(LpxM)；
5)PII-1蛋白(GlnB)。
上述重组大肠杆菌中，所述重组大肠杆菌与受体大肠杆菌相比，所述重组大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶的基因的表达量增加和/或所述谷氨酰胺合成酶的含量增加和/或所述谷氨酰胺合成酶的活性增加。
上述重组大肠杆菌中，所述受体大肠杆菌可为大肠杆菌K12；具体为大肠杆菌K12菌株BW25113。
在本发明具体的实施方式中，所述谷氨酰胺合成酶(即CgglnA、BpglnA、Bb1glnA、Bb2glnA) 可为如下A1)-A8)任一所示的蛋白质：
A1)SEQ ID No.1所示的DNA分子编码的蛋白质；
A2)将A1)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
A3)SEQ ID No.2所示的DNA分子编码的蛋白质；
A4)将A3)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A3)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
A5)SEQ ID No.3所示的DNA分子编码的蛋白质；
A6)将A5)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A5)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
A7)SEQ ID No.4所示的DNA分子编码的蛋白质；
A8)将A7)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A7)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
所述谷氨酰胺酶A可为A9)或A10)所示：
A9)Genbank号为NC_000913.3的第511641-512573位所示的DNA分子编码的蛋白质；
A10)将A9)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A9)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
所述谷氨酰胺酶B可为A11)或A12)所示：
A11)Genbank号为NC_000913.3的第1612325-1613251位所示的DNA分子编码的蛋白质；
A12)将A11)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A11)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
所述同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶可为A13)或A14)所示：
A13)Genbank号为NC_000913.3的第3196801-3199641位所示的DNA分子编码的蛋白质；
A14)将A13)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A13)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
所述PII-1蛋白可为A15)或A16)所示：
A15)Genbank号为NC_000913.3的第2687070-2687408位所示的DNA分子编码的蛋白质；
A16)将A15)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A15)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
所述肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶可为A17)或A18)所示：
A17)Genbank号为NC_000913.3的第1939222-1940193位所示的DNA分子编码的蛋白质；
A18)将A17)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A17)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
其中，SEQ ID No.1由1434个核苷酸组成，第1-1434位为编码序列，编码Genbank号为 WP_003859638.1(update date为19-JUN-2019)第1-477位的谷氨酰胺合成酶。
SEQ ID No.2由1335个核苷酸组成，第1-1335位为编码序列Genbank号为WP_007499421.1(update date为30-MAY-2019)第1-444位的谷氨酰胺合成酶。
SEQ ID No.3由1338个核苷酸组成，第1-1338位为编码序列，编码Genbank号为WP_003812280.1 (update date为19-JUN-2019)第1-445位的谷氨酰胺合成酶。
SEQ ID No.4由1449个核苷酸组成，第1-1449位为编码序列，编码Genbank号为WP_003812616.1 (update date为03-JUN-2019)第1-481位的谷氨酰胺合成酶。
Genbank号为NC_000913.3的第511641-512573位，即Gene ID:946187，由933个核苷酸组成，第1-933位为编码序列，编码Genbank号为NP_415018(update date为11-OCT-2018)第1-310位的谷氨酰胺酶A。
Genbank号为NC_000913.3的第1612325-1613251位，由927个核苷酸组成，第1-927位为编码序列，编码Genbank号为NP_416041(update date为11-OCT-2018)第1-308位的谷氨酰胺酶B。
Genbank号为NC_000913.3的3196801-3199641位，即Gene ID:947552，由2841个核苷酸组成，第1-2841位为编码序列，编码Genbank号为NP_417525(update date为11-OCT-2018)第1-946位的同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶。
Genbank号为NC_000913.3的第2687070-2687408位，即Gene ID:947016，由339个核苷酸组成，第1-339位为编码序列，编码Genbank号为NP_417048(update date为11-OCT-2018)第1-112位的 PII-1蛋白。
Genbank号为NC_000913.3的第1939222-1940193位，即Gene ID:945143，由972个核苷酸组成，第1-972位为编码序列，编码Genbank号为NP_416369(update date为11-OCT-2018)第1-323位的肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶。
上述重组大肠杆菌中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述重组大肠杆菌中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或 100％的同一性。
上述重组大肠杆菌中，所述谷氨酰胺合成酶的基因(即CgglnA、BpglnA、Bb1glnA、Bb2glnA)可为下述B1)-B8)中的任一所示：
B1)编码序列为SEQ ID No.1所示的DNA分子；
B2)将SEQ ID No.1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.1具有相同功能的DNA分子；
B3)编码序列为SEQ ID No.2所示的DNA分子；
B4)将SEQ ID No.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.2具有相同功能的DNA分子；
B5)编码序列为SEQ ID No.3所示的DNA分子；
B6)将SEQ ID No.3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.3具有相同功能的DNA分子；
B7)编码序列为SEQ ID No.4所示的DNA分子；
B8)将SEQ ID No.4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.4具有相同功能的DNA分子；
所述谷氨酰胺酶A的基因可为如下B9)或B10)所示：
B9)编码序列为Genbank号为NC_000913.3的第511641-512573位所示的DNA分子；
B10)将Genbank号为NC_000913.3的第511641-512573位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与Genbank号为NC_000913.3的第511641-512573位具有相同功能的DNA分子；
所述谷氨酰胺酶B的基因可为如下B11)或B12)所示：
B11)编码序列为Genbank号为NC_000913.3的第1612325-1613251位所示的DNA分子；
B12)将Genbank号为NC_000913.3的第1612325-1613251位经过一个或几个核苷酸的取代和/ 或缺失和/或添加且与Genbank号为NC_000913.3的第1612325-1613251位具有相同功能的DNA分子；
所述同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶的基因可为如下B13)或B14)所示：
B13)编码序列为Genbank号为NC_000913.3的第3196801-3199641位所示的DNA分子；
B14)将Genbank号为NC_000913.3的第3196801-3199641位经过一个或几个核苷酸的取代和/ 或缺失和/或添加且与Genbank号为NC_000913.3的第3196801-3199641位具有相同功能的DNA分子；
所述PII-1蛋白的基因可为如下B15)或B16)所示：
B15)编码序列为Genbank号为NC_000913.3的第2687070-2687408位所示的DNA分子；
B16)将Genbank号为NC_000913.3的第2687070-2687408位经过一个或几个核苷酸的取代和/ 或缺失和/或添加且与Genbank号为NC_000913.3的第2687070-2687408位具有相同功能的DNA分子；
所述肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶的基因可为如下B17)或B18)所示：
B17)Genbank号为NC_000913.3的第1939222-1940193位所示的DNA分子；
B18)将Genbank号为NC_000913.3的第1939222-1940193位经过一个或几个核苷酸的取代和/ 或缺失和/或添加且与Genbank号为NC_000913.3(update date为10-Oct-2019)的第1939222-1940193 位具有相同功能的DNA分子。
本发明进一步提供了重组大肠杆菌的构建方法。
本发明重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：对受体大肠杆菌的基因组进行下述m1)-m6) 全部、任五种、任四种、任三种、任两种或任一种的改造，所述受体大肠杆菌为大肠杆菌突变体或野生型大肠杆菌：
m1)将谷氨酰胺酶A的基因敲除；
m2)将谷氨酰胺酶B的基因敲除；
m3)将同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶的基因敲除；
m4)将PII-1蛋白的基因敲除；
m5)将肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶的基因敲除。
M6)导入谷氨酰胺合成酶的基因。
在本发明具体的实施方式中，所述重组大肠杆菌的构建方法为将谷氨酰胺合成酶的基因导入受体大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；所述受体大肠杆菌为大肠杆菌突变体；
所述大肠杆菌突变体为对所述野生型大肠杆菌基因组进行下述m1)-m5)全部、任四种、任三种、任两种或任一种的改造得到的：
m1)将谷氨酰胺酶A的基因敲除；
m2)将谷氨酰胺酶B的基因敲除；
m3)将同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶的基因敲除；
m4)将PII-1蛋白的基因敲除；
m5)将肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶的基因敲除。
在本发明具体的实施方式中，所述大肠杆菌突变体为如下任一种：
M1)所述大肠杆菌突变体为对所述野生型大肠杆菌进行上述m1)-m5)的改造得到的大肠杆菌突变体(AQ06)；
M2)所述大肠杆菌突变体为对所述野生型大肠杆菌进行上述m1)-m4)的改造得到的大肠杆菌突变体(AQ08)；
M3)所述大肠杆菌突变体为对所述野生型大肠杆菌进行上述m1)和m2)的改造得到的大肠杆菌突变体(AQ02)；
M4)所述大肠杆菌突变体为对所述野生型大肠杆菌进行上述m3)和m4)的改造得到的大肠杆菌突变体(AQ04)；
M5)所述大肠杆菌突变体为对所述野生型大肠杆菌进行上述m1)的改造得到的大肠杆菌突变体 (AQ03)。
上述方法中，所述野生型大肠杆菌为大肠杆菌K12；具体为大肠杆菌K12菌株BW25113。
上述方法中，所述敲除是利用CRISPR-Cas9基因敲除技术进行基因敲除。
在本发明具体的实施方式中，所述谷氨酰胺合成酶的基因通过重组载体甲导入所述受体大肠杆菌中；
所述重组载体甲为将pYB1a载体的Xho I和EcoR I位点间的片段替换为谷氨酰胺合成酶基因后，且保持pYB1a载体其他序列不变得到的重组表达载体，例如可以为pYB1a-CgGlnA、pYB1a-CgglnA、 BpglnA、pYB1a-Bb1glnA、pYB1a-Bb2glnA。
在本发明具体的实施方式中，所述重组大肠杆菌的构建方法可以为如下P1)-P5)中任一种：
P1)提高受体大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶的基因的表达量和/或谷氨酰胺合成酶的含量和/或谷氨酰胺合成酶的活性，且降低所述受体大肠杆菌中谷氨酰胺酶A、谷氨酰胺酶B、同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶、PII-1蛋白、肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶的基因的表达量和/或谷氨酰胺酶A、谷氨酰胺酶B、同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶、PII-1蛋白、肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶的含量和/或谷氨酰胺酶A、谷氨酰胺酶B、同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶、PII-1蛋白、肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶的活性；
P2)提高受体大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶基因的表达量和/或谷氨酰胺合成酶的含量和/或谷氨酰胺合成酶的活性，且降低所述受体大肠杆菌中谷氨酰胺酶A、谷氨酰胺酶B、同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶和PII-1蛋白的基因的表达量和/或谷氨酰胺酶A、谷氨酰胺酶B、同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶和PII-1蛋白的含量和/或谷氨酰胺酶A、谷氨酰胺酶B、同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶和PII-1蛋白的活性；
P3)提高受体大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶的基因的表达量和/或含量和/或活性，且降低所述受体大肠杆菌中谷氨酰胺酶A和/或谷氨酰胺酶B的基因的表达量和/或谷氨酰胺酶A和/或谷氨酰胺酶B 的含量和/或谷氨酰胺酶A和/或谷氨酰胺酶B的活性；
P4)提高受体大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶的基因的表达量和/或含量和/或活性，且降低所述受体大肠杆菌中同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶和PII-1蛋白的基因的表达量和/或同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶和PII-1蛋白的含量和/或同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶和PII-1蛋白的活性；
P5)提高受体大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶的基因的表达量和/或谷氨酰胺合成酶的含量和/或谷氨酰胺合成酶的活性。
上述方法中，所述谷氨酰胺合成酶可为如下A1)-A8)任一所示的蛋白质：
A1)SEQ ID No.1所示的DNA分子编码的蛋白质；
A2)将A1)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
A3)SEQ ID No.2所示的DNA分子编码的蛋白质；
A4)将A3)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A3)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
A5)SEQ ID No.3所示的DNA分子编码的蛋白质；
A6)将A5)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A5)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
A7)SEQ ID No.4所示的DNA分子编码的蛋白质；
A8)将A7)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A7)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
所述谷氨酰胺酶A可为A9)或A10)所示：
A9)Genbank号为NC_000913.3的第511641-512573位所示的DNA分子编码的蛋白质；
A10)将A9)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A9)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
所述谷氨酰胺酶B可为A11)或A12)所示：
A11)Genbank号为NC_000913.3的第1612325-1613251位所示的DNA分子编码的蛋白质；
A12)将A11)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A11)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
所述同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶可为A13)或A14)所示：
A13)Genbank号为NC_000913.3的第3196801-3199641位所示的DNA分子编码的蛋白质；
A14)将A13)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A13)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
所述PII-1蛋白可为A15)或A16)所示：
A15)Genbank号为NC_000913.3的第2687070-2687408位所示的DNA分子编码的蛋白质；
A16)将A15)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A15)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
所述肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶可为A17)或A18)所示：
A17)Genbank号为NC_000913.3的第1939222-1940193位所示的DNA分子编码的蛋白质；
A18)将A17)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A17)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
上述方法中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp 作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述方法中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述方法中，所述谷氨酰胺合成酶的基因可为下述B1)-B8)中的任一所示：
B1)编码序列为SEQ ID No.1所示的DNA分子；
B2)将SEQ ID No.1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.1具有相同功能的DNA分子；
B3)编码序列为SEQ ID No.2所示的DNA分子；
B4)将SEQ ID No.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.2具有相同功能的DNA分子；
B5)编码序列为SEQ ID No.3所示的DNA分子；
B6)将SEQ ID No.3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.3具有相同功能的DNA分子；
B7)编码序列为SEQ ID No.4所示的DNA分子；
B8)将SEQ ID No.4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.4具有相同功能的DNA分子；
所述谷氨酰胺酶A的基因可为如下B9)或B10)所示：
B9)编码序列为Genbank号为NC_000913.3的第511641-512573位所示的DNA分子；
B10)将Genbank号为NC_000913.3的第511641-512573位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与Genbank号为NC_000913.3的第511641-512573位具有相同功能的DNA分子；
所述谷氨酰胺酶B的基因可为如下B11)或B12)所示：
B11)编码序列为Genbank号为NC_000913.3的第1612325-1613251位所示的DNA分子；
B12)将Genbank号为NC_000913.3的第1612325-1613251位经过一个或几个核苷酸的取代和/ 或缺失和/或添加且与Genbank号为NC_000913.3的第1612325-1613251位具有相同功能的DNA分子；
所述同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶的基因可为如下B13)或B14)所示：
B13)编码序列为Genbank号为NC_000913.3的第3196801-3199641位所示的DNA分子；
B14)将Genbank号为NC_000913.3的第3196801-3199641位经过一个或几个核苷酸的取代和/ 或缺失和/或添加且与Genbank号为NC_000913.3的第3196801-3199641位具有相同功能的DNA分子；
所述PII-1蛋白的基因可为如下B15)或B16)所示：
B15)编码序列为Genbank号为NC_000913.3的第2687070-2687408位所示的DNA分子；
B16)将Genbank号为NC_000913.3的第2687070-2687408位经过一个或几个核苷酸的取代和/ 或缺失和/或添加且与Genbank号为NC_000913.3的第2687070-2687408位具有相同功能的DNA分子；
所述肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶的基因可为如下B17)或B18)所示：
B17)Genbank号为NC_000913.3的第1939222-1940193位所示的DNA分子；
B18)将Genbank号为NC_000913.3的第1939222-1940193位经过一个或几个核苷酸的取代和/ 或缺失和/或添加且与Genbank号为NC_000913.3的第1939222-1940193位具有相同功能的DNA分子。
上文中，Genbank号为NC_000913.3的update date为10-Oct-2019。
上述构建方法得到的重组大肠杆菌及其在制备L-谷氨酰胺中的应用也在本发明的保护范围之内。
在本发明的具体实施方式中，上述方法制备的重组大肠杆菌具体为将pYB1a-CgGlnA分别导入所述大肠杆菌突变体AQ02、AQ04、AQ06得到的重组大肠杆菌pYB1a-CgGlnA/AQ02、 pYB1a-CgGlnA/AQ04、pYB1a-CgGlnA/AQ06，将pYB1a-CgGlnA、pYB1a-CgglnA、pYB1a-Bb1glnA、 pYB1a-Bb2glnA导入所述大肠杆菌突变体AQ06得到的重组大肠杆菌pYB1a-CgGlnA/AQ06、 pYB1a-BpGlnA/AQ06、pYB1a-Bb1GlnA/AQ06、pYB1a-Bb2GlnA/AQ06。
本发明进一步公开了一种制备L-谷氨酰胺的方法。
本发明制备L-谷氨酰胺的方法，包括：利用上述重组大肠杆菌催化L-谷氨酸或谷氨酸可溶性盐反应得到L-谷氨酰胺。
具体的，所述重组大肠杆菌经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后重组大肠杆菌，用所述诱导后重组大肠杆菌催化L-谷氨酸或谷氨酸可溶性盐反应得到L-谷氨酰胺。
上述方法中，所述阿拉伯糖诱导培养是在含有阿拉伯糖的培养基中进行的，所述诱导培养的温度为30℃，时间为16h。
上述方法中，所述阿拉伯糖为L-阿拉伯糖。
上述方法中，所述L-谷氨酸可溶性盐可为L-谷氨酸钠。
上述方法中，所述催化的温度为30℃，时间为18h。
本发明通过在大肠杆菌中过表达从葡萄糖合成L-谷氨酰胺途径相关酶基因(谷氨酰胺合成酶基因)，同时阻断旁路途径(敲除谷氨酰胺合成酶亚基修饰相关基因和主要降解途径)，开发了一套高效合成游离L-谷氨酰胺的方法，L-谷氨酰胺产量最高达46.5mM，转化率最高为93.0％。通过该方法以廉价L-谷氨酸或谷氨酸钠为单一原料，不仅不仅操作简单，合成途径短、产率高，而且反应体系成分较单一，无其他氨基酸或立体异构体副产物的积累，产物中无其他氨基酸，减轻了后续分离纯化的成本，也为与其他氨基酸及其氨基酸衍生物的生产提供了一条新的思路。
附图说明
图1为pYB1a的物理图谱。
图2为重组质粒的PCR验证。其中，M：Marker，Cg：pYB1a-CgglnA，Bp：pYB1a-BpglnA，Bb1： pYB1a-Bb1glnA，Bb2：pYB1a-Bb2glnA。
图3为不同基因的表达情况。其中，s:上清样品，p:沉淀样品，M:Marker，Cg：pYB1a-CgGlnA/AQ06， Bp：pYB1a-BpGlnA/AQ06，Bb1：pYB1a-Bb1GlnA/AQ06，Bb2：pYB1a-Bb2GlnA/AQ06，BW25115: BW25115。
图4为在不同底盘中CgGlnA的表达情况；其中，s:上清样品，p:沉淀样品，1：pYB1a-CgglnA/BW， 2：pYB1a-CgglnA/AQ02，3：pYB1a-CgglnA/AQ04，4：pYB1a-CgglnA/AQ06，M:Marker。
图5为重组大肠杆菌的全细胞催化转化产物的HPLC图谱。
图6为不同旁路途径阻断的重组大肠杆菌合成L-谷氨酰胺产量；其中，BW：pYB1a-CgGlnA/BW、AQ02：pYB1a-CgGlnA/AQ02、AQ04：pYB1a-CgGlnA/AQ04、AQ06：pYB1a-CgGlnA/AQ06。
图7为不同来源谷氨酰胺合成酶的重组大肠杆菌合成L-谷氨酰胺产量；其中，Cg：pYB1a-CgGlnA/AQ06、Bp：pYB1a-BpGlnA/AQ06、Bb1：pYB1a-Bb1GlnA/AQ06、Bb2： pYB1a-Bb2GlnA/AQ06。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中大肠杆菌K12记载于文献“Baba T,Ara T,Hasegawa M,Takai Y,Okumura Y,Baba M, Datsenko KA,Tomita M,Wanner BL,Mori H:Construction ofEscherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keiocollection.Mol Syst Biol 2006,2:2006.0008.”中，是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短，容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌K12的全基因组序列的GenBankAccession 为NC_000913.3(update date为10-Oct-2019)(GI：545778205，update date是AUG 01，2014，version 是3)。公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的CRISPR-Cas9敲除技术所使用的质粒如质粒pTargetF和pCas质粒记载于文献“Jiang Y,Chen B,Duan C,et al.Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9 System[J].Applied and EnvironmentalMicrobiology,2015,81(7):2506-2514.”中，公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中pYB1a载体的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，包括如下片段：(1)araC-araBAD-MCS片段(含阿拉伯糖诱导启动子、多克隆位点)；(2)MCS-TrrnB片段(含多克隆位点、终止子TrrnB)；(3)RSF1030复制起始位点片段；(4)氨苄青霉素抗性基因Amp片段。pYB1a 载体图谱如图1所示。
实施例1、构建过表达谷氨酰胺合成酶的重组质粒
1、基因CgglnA(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)、BpglnA(核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示)、 Bb1glnA(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)、Bb2glnA(核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示)经南京金斯瑞生物科技有限公司合成。将基因片段分别插入经Xho I和EcoR IHF双酶切后插入pYB1a载体的 Xho I、EcoR I之间，连接产物转化Trans1-T1感受态细胞(北京全式金生物，产品目录号为CD501)，涂布含相应的氨苄青霉素抗性的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，采用引物对P1 (5’-cggcgtcacactttgctatg-3’)和P2(5’-cgtttcacttctgagttcggc-3’)进行PCR验证，正确的克隆送测序。将测序正确的重组质粒分别命名为重组质粒pYB1a-CgglnA、pYB1a-BpglnA、pYB1a-Bb1glnA、 pYB1a-Bb2glnA。
重组质粒pYB1a-CgglnA为将pYB1a载体的Xho I和EcoR I位点间的片段替换为SEQID No.1所示的谷氨酰胺合成酶基因后，且保持pYB1a载体其他序列不变得到的重组表达载体。其中，SEQ ID No.1所示的谷氨酰胺合成酶基因(Gene ID:1020166，update date为30-Jan-2018)编码的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列为Genbank号为WP_003859638.1(updatedate为19-JUN-2019)第1-477位。
重组质粒pYB1a-BpglnA为将pYB1a载体的Xho I和EcoR I位点间的片段替换为SEQID No.2所示的谷氨酰胺合成酶基因后，且保持pYB1a载体其他序列不变得到的重组表达载体。其中，SEQ ID No.2所示的谷氨酰胺合成酶基因(Gene ID:31668278,update date为31-Mar-2019)编码的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列为Genbank号为WP_007499421.1(updatedate为30-MAY-2019)第1-444位。
重组质粒pYB1a-Bb1glnA为将pYB1a载体的Xho I和EcoR I位点间的片段替换为SEQ ID No.3 所示的谷氨酰胺合成酶基因后，且保持pYB1a载体其他序列不变得到的重组表达载体。其中，SEQ ID No.3所示的谷氨酰胺合成酶基因(Gene ID:9888687,update date为6-Sep-2017)编码的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列为Genbank号为WP_003812280.1(update date为19-JUN-2019)第1-445位。
重组质粒pYB1a-Bb2glnA为将pYB1a载体的Xho I和EcoR I位点间的片段替换为SEQ ID No.4 所示的谷氨酰胺合成酶基因后，且保持pYB1a载体其他序列不变得到的重组表达载体。其中，SEQ ID No.4所示的谷氨酰胺合成酶基因(Gene ID:9888835,update date为1-Jun-2019)编码的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列为Genbank号为WP_003812616.1(update date为03-JUN-2019)第1-481位。
实施例2、构建产L-谷氨酰胺的大肠杆菌突变体AQ02、AQ04、AQ06
采用CRISPR-Cas9基因敲除技术对野生型大肠杆菌K12进行基因编辑，构建大肠杆菌突变体：敲除大肠杆菌K12菌株BW25113的Genbank号为NC_000913.3(update date为10-Oct-2019)的第 511641-512573位所示的谷氨酰胺酶A的编码基因(glsA)，得到大肠杆菌突变体AQ03，基因型为 BW△GlsA；敲除大肠杆菌K12菌株BW25113的Genbank号为NC_000913.3的第2687070-2687408 位所示的PII-1蛋白的编码基因(glnB)、Genbank号为NC_000913.3的第3196801-3199641位所示的 GlnE(同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性(ATase)和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性(ATd) 的双功能酶)的编码基因(glnE)，获得大肠杆菌突变体AQ02，基因型为BW△GlnEB；敲除大肠杆菌K12菌株BW25113的SEQ ID No.5所示的谷氨酰胺酶A的编码基因(glsA)和Genbank号为 NC_000913.3的第1612325-1613251位所示的的谷氨酰胺酶B的编码基因(glsB)，获得大肠杆菌突变体AQ04，基因型为BW△GlsAB；敲除大肠杆菌K12菌株BW25113的Genbank号为NC_000913.3的第511641-512573位所示的谷氨酰胺酶A的编码基因(glsA)、Genbank号为NC_000913.3的第 1612325-1613251位所示的谷氨酰胺酶B的编码基因(glsB)、Genbank号为NC_000913.3的第 1612325-1613251位所示的GlnE(同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性(ATase)和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性(ATd)的双功能酶)的编码基因(glnE)、Genbank号为NC_000913.3的第 2687070-2687408位所示的PII-1蛋白的编码基因(glnB)、Genbank号为NC_000913.3(update date为 10-Oct-2019)的第1939222-1940193位所示的肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶的编码基因(lpxM)，获得大肠杆菌突变体AQ06，基因型为BW△GlnEB△LpxM△GlsAB。
其中，Genbank号为NC_000913.3的第511641-512573位所示谷氨酰胺酶A的编码基因(glsA) (Gene ID:946187,update date为30-May-2019)编码的谷氨酰胺酶A的氨基酸序列为genbank号为 NP_415018(update date为11-OCT-2018)第1-310位；Genbank号为NC_000913.3的第1612325-1613251 位所示谷氨酰胺酶B的编码基因(glsB)(Gene ID:944973,update date为30-May-2019)编码的谷氨酰胺酶B的氨基酸序列为genbank号为NP_416041(update date为11-OCT-2018)第1-308位；Genbank 号为NC_000913.3的第3196801-3199641位所示GlnE(同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性 (ATase)和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性(ATd)的双功能酶)的编码基因(glnE)(Gene ID:947552, update date为30-May-2019)编码的GlnE的氨基酸序列为genbank号为NP_417525(update date为 11-OCT-2018)第1-946位；Genbank号为NC_000913.3的第2687070-2687408位所示PII-1蛋白的编码基因(glnB)(Gene ID:947016,update date为30-May-2019)编码的PII-1蛋白的氨基酸序列为 genbank号为NP_417048(update date为11-OCT-2018)第1-112位；Genbank号为NC_000913.3(update date为10-Oct-2019)的第1939222-1940193位所示肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶的编码基因(lpxM)(Gene ID:945143,update date为30-May-2019)编码的肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶(LpxM)的氨基酸序列为genbank号为NP_416369(update date为11-OCT-2018)第 1-323位。
一、大肠杆菌突变体AQ03构建
敲除大肠杆菌BW25113中的glsA基因，获得大肠杆菌突变体AQ03，基因型为BW△GlsA。
1、pTarget-glsA的构建：以质粒pTargetF为模板，GlsA-gR和GlsA-gF为引物，PCR获得质粒 pTarget-glsA(约2100bp，环形质粒)。
2.打靶片段构建：以大肠杆菌BW25113的基因组DNA为模板，利用引物GlsA-upF和GlsA-upR 扩增获得glsA基因的约500bp的上游片段，利用引物GlsA-dF和GlsA-dR扩增获得glsA基因的约500bp 的下游片段，切胶回收上游片段和下游片段。以上游片段和下游片段为模板，利用引物GlsA-upF和 GlsA-dR进行Overlap PCR扩增获得约1kb的打靶片段，切胶回收获得glsA基因的打靶片段。
3、pCas/BW25113感受态的制备：将pCas质粒转化大肠杆菌BW25113，获得pCas/BW25113阳性克隆接种pCas/BW25113至含卡那霉素的LB液体培养基中，L-ara诱导至OD600～0.6，制备pCas/BW 电转感受态。
4.基因敲除：将步骤1、2获得的pTarget-glsA质粒和glsA基因的打靶片段电转转化至步骤3获得的pCas/BW电转感受态，30℃过夜培养。然后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定(采用GlsA-dF和GlsA-dR组成的引物对，如果PCR扩增产物仅有一种且大小约为1000bp，则回收PCR扩增产物并进行测序验证，如果缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsA基因编码区，该单克隆为阳性克隆)。
5、接种所得阳性克隆至含卡那霉素抗性的LB液体培养基，加入终浓度0.5mM的IPTG，30℃培养过夜，得到菌液。取菌液划线于含卡那霉素抗性的LB固体平板，30℃培养过夜，挑取单克隆点接至链霉素抗性LB固体平板，如单克隆在含链霉素LB平板上不长，说明pTargetF质粒已消除。
接种成功消除pTarget的单克隆至无抗LB液体培养基，42℃培养过夜，所得菌液划无抗性LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆点接至卡纳霉素抗性LB固体平板，如单克隆在卡纳霉素抗性LB固体平板不长，说明pCas质粒已消除。该单克隆即为同时消除质粒pCas和质粒pTargetF的单克隆，即获得大肠杆菌突变体AQ03，又称重组菌BW△GlsA，其基因型为BW△GlsA，与大肠杆菌BW25113相比，重组菌BW△GlsA的差异仅在于：缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsA基因编码区。
二、大肠杆菌突变体AQ04构建
敲除大肠杆菌突变体AQ03的glsB基因，获得突变株AQ04，基因型为BW△GlsAB。
1、pTarget-glsB的构建：以质粒pTargetF为模板，GlsA-gR和GlsA-gF为引物，PCR获得质粒 pTarget-glsB(约2100bp，环形质粒)。
2、打靶片段构建：以大肠杆菌BW25113的基因组DNA为模板，利用引物GlsB-upF和GlsB-upR 扩增获得glsB基因的约500bp的上游片段，利用引物GlsB-dF和GlsB-dR扩增获得glsB基因的约500bp 的下游片段，切胶回收上游片段和下游片段，以上游片段和下游片段为模板，利用引物GlsB-upF和 GlsB-dR进行Overlap PCR扩增获得约1kb的打靶片段，切胶获得glsB基因打靶片段。
3、pCas/AQ03感受态的制备：将pCas质粒转化大肠杆菌突变株AQ03，获得pCas/AQ03接种 pCas/AQ03至含卡那霉素的LB液体培养基中，L-ara诱导培养至OD600～0.6，制备得pCas/AQ03电转感受态。
4、基因敲除：电转转化质粒pTarget-glsB和glsB基因的打靶片段至pCas/AQ03电转感受态，30℃过夜培养，然后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定(采用GlsB-dF和GlsB-dR组成的引物对，如果PCR扩增产物仅有一种且大小约为1000bp，则回收PCR扩增产物并进行测序验证，如果缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsB基因编码区，该单克隆为阳性克隆)。
5、获得的阳性克隆进行步骤一第5步的操作，即获得大肠杆菌突变体AQ04，又称重组菌BW△GlsAB，其基因型为BW△GlsAB，与大肠杆菌BW25113相比，重组菌BW△GlsAB的差异仅在于：缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsA基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsB基因编码区。
三、大肠杆菌突变株AQ02的构建
叠加敲除大肠杆菌BW25113中的glnE、glnB基因，获得突变株AQ02，基因型为BW△GlnEB。
用GlnE-gF代替GlsA-gF，用GlnE-gR代替GlsA-gR，用GlnE-upF代替GlsA-upF，用GlnE-upR 代替GlsA-upR，用GlnE-dF代替GlsA-dF，用GlnE-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一，得到重组菌 BW△glnE。
用重组菌BW△glnE代替大肠杆菌BW25113，用GlnB-gF代替GlsA-gF，用GlnB-gR代替GlsA-gR，用GlnB-upF代替GlsA-upF，用GlnB-upR代替GlsA-upR，用GlnB-dF代替GlsA-dF，用GlnB-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一，得到重组菌BW△glnEB。
重组菌BW△GlnEB，已消除了质粒pCas和质粒pTargetF。
与大肠杆菌BW25113相比，重组菌BW△GlsEB的差异仅在于：缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glnE基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glnB基因编码区。重组菌 BW△GlnEB，又称为重组菌AQ02或大肠杆菌突变株AQ02。
四、大肠杆菌突变体AQ06的构建
叠加敲除突变株AQ02中的glsA、glsB、lpxM，获得大肠杆菌突变体AQ06，基因型为BW△GlnEB△LpxM△GlsAB。
用重组菌BW△GlsAB代替大肠杆菌BW25113，用GlnE-gF代替GlsA-gF，用GlnE-gR代替GlsA-gR，用GlnE-upF代替GlsA-upF，用GlnE-upR代替GlsA-upR，用GlnE-dF代替GlsA-dF，用GlnE-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一，得到重组菌BW△GlnE△GlsAB。
用重组菌BW△GlnE△GlsAB代替大肠杆菌BW25113，用GlnB-gF代替GlsA-gF，用GlnB-gR代替 GlsA-gR，用GlnB-upF代替GlsA-upF，用GlnB-upR代替GlsA-upR，用GlnB-dF代替GlsA-dF，用GlnB-dR 代替GlsA-dR，其他同步骤一，得到重组菌BW△GlnEB△GlsAB。
用重组菌BW△GlnEB△GlsAB代替大肠杆菌BW25113，用LpxM-gF代替GlsA-gF，用LpxM-gR代替 GlsA-gR，用LpxM-upF代替GlsA-upF，用LpxM-upR代替GlsA-upR，用LpxM-dF代替GlsA-dF，用LpxM-dR 代替GlsA-dR，其他同步骤一，得到重组菌BW△GlnEB△GlsAB△LpxM。
重组菌BW△GlnEB△GlsAB△LpxM，已消除了质粒pCas和质粒pTargetF。
与大肠杆菌BW25113相比，重组菌BW△GlnEB△GlsAB△LpxM的差异仅在于：缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsA基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsB基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glnE基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glnB基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的lpxM基因编码区。重组菌
BW△GlnEB△GlsAB△LpxM，又称为重组菌AQ06或大肠杆菌突变体AQ06。
上述大肠杆菌突变体构建过程中需要的引物序列如表1所示：
表1构建突变体用到的引物
Figure RE-GDA0002442167540000121
Figure RE-GDA0002442167540000131
实施例3、构建产L-谷氨酰胺的重组大肠杆菌
按照表2所示将实施例1制备的重组质粒分别利用氯化钙法转化实施例2构建的大肠杆菌突变体 AQ02、AQ04、AQ06和大肠杆菌BW25113，在氨苄青霉素(氨苄青霉素的浓度为50μg/ml)抗性的 LB平板上筛选阳性克隆子(能在平板上生长的克隆)，得到如表2所示的重组大肠杆菌。
上述L-谷氨酰胺产量检测中用到的各重组大肠杆菌的信息如表2所示。
表2、各重组大肠杆菌的信息
重组质粒 宿主菌 重组大肠杆菌
pYB1a-CgGlnA 大肠杆菌K12菌株BW25113 pYB1a-CgGlnA/BW
pYB1a-CgGlnA 大肠杆菌突变体AQ02 pYB1a-CgGlnA/AQ02
pYB1a-CgGlnA 大肠杆菌突变体AQ04 pYB1a-CgGlnA/AQ04
pYB1a-CgGlnA 大肠杆菌突变体AQ06 pYB1a-CgGlnA/AQ06
pYB1a-BpGlnA 大肠杆菌突变体AQ06 pYB1a-BpGlnA/AQ06
pYB1a-Bb1GlnA 大肠杆菌突变体AQ06 pYB1a-Bb1GlnA/AQ06
pYB1a-Bb2GlnA 大肠杆菌突变体AQ06 pYB1a-Bb2GlnA/AQ06
pYB1a-CgGlnA 大肠杆菌突变体AQ06 pYB1a-CgGlnA/AQ06
根据实施例5中“一、重组大肠杆菌的自诱导培养”方法获得诱导后的重组大肠杆菌，根据重组大肠杆菌的菌液的生长情况，取6OD菌体，低温离心收集菌体；去上清，加入600ml ddH2O冲悬菌体，超声破碎细胞(总时长5min，5s/7s，最大功率的30％，保护温度30℃)；破碎完成后，最大转速离心2min，吸取上清20uL，加入20uL 2x buffer，即上清样品；去上清，沉淀用600uL ddH2O冲悬，取 20uL加入20uL 2x buffer，即沉淀样品，所得蛋白样品沸水浴10min。制备好的样品，进行SDS-PAGE 分析，上样量10uL，观察蛋白表达情况。
检测导入不同的基因至相同受体大肠杆菌AQ06的重组大肠杆菌pYB1a-CgGlnA/AQ06中CgGlnA、 pYB1a-BpGlnA/AQ06中BpGlnA、pYB1a-Bb1GlnA/AQ06中Bp1GlnA、pYB1a-Bb2GlnA/AQ06中 Bb2GlnA的表达情况，结果如图3所示，CgGlnA的条带在65kD左右，存在大量包涵体；BpGlnA的条带在50kD左右，主要为可溶性表达；Bb1GlnA的条带在64kD左右，包涵体略微较可溶蛋白多，整体表达良好；Bb2GlnA的条带在64kD左右，主要以包涵体的形式存在。
检测导入相同的重组载体pYB1a-CgglnA至不同受体大肠杆菌的重组大肠杆菌pYB1a-CgglnA/BW、pYB1a-CgglnA/AQ02、pYB1a-CgglnA/AQ04和pYB1a-CgglnA/AQ06中CgglnA 的表达情况，结果如图4所示，CgGlnA在不同重组大肠杆菌中表达量差异不大。
实施例4、不同重组大肠杆菌合成L-谷氨酰胺产量比较
一、不同旁路途径阻断的重组大肠杆菌合成L-谷氨酰胺产量检测
利用实施例3制备得到的重组大肠杆菌pYB1a-CgGlnA/AQ02、pYB1a-CgGlnA/AQ04、pYB1a-CgGlnA/AQ06和pYB1a-CgglnA/BW通过实施例5中“重组大肠杆菌的自诱导培养”和“全细胞催化以L-谷氨酸为单一底物产L-谷氨酰胺”的方法检测L-谷氨酰胺的产量，结果如图6所示：对应谷氨酰胺酶A的基因敲除、谷氨酰胺酶B的基因敲除、同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶、PII-1蛋白和/或肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶的基因的重组大肠杆菌能够一定程度提高L-谷氨酰胺的产量。转化18h，pYB1a-CgglnA/BW(图中以“BW”表示)的L-谷氨酰胺产量仅为22.4mM，pYB1a-CgGlnA/AQ02(图中以“AQ02”表示)的L-谷氨酰胺的产量和pYB1a-CgGlnA/AQ04(图中以“AQ04”表示)的L-谷氨酰胺的产量分别为27.8mM和33.8mM， pYB1a-CgGlnA/AQ06(图中以“AQ06”表示)的L-谷氨酰胺的产量最高，达46.5mM，对转化率(转化率＝产量x 100％/底物的量)进行计算，pYB1a-CgGlnA/AQ06的转化率可达93.0％。
二、不同来源谷氨酰胺合成酶的重组大肠杆菌合成L-谷氨酰胺产量检测
利用实施例3制备得到的重组大肠杆菌pYB1a-CgGlnA/AQ06、pYB1a-BpGlnA/AQ06、pYB1a-Bb1GlnA/AQ06、pYB1a-Bb2GlnA/AQ06和pYB1a-CgglnA/BW通过实施例5所述的以谷氨酸为单一底物合成L-谷氨酰胺的方法，结果如图7所示：不同来源的谷氨酰胺合成酶的重组大肠杆菌均能够合成L-谷氨酰胺，但产量具有显著性的差异，pYB1a-BpGlnA/AQ06(图中以“Bp”表示)、 pYB1a-Bb1GlnA/AQ06(图中以“Bb1”表示)、pYB1a-Bb2GlnA/AQ06(图中以“Bb2”表示)明显低于 pYB1a-CgGlnA/AQ06(图中以“Cg”表示)的L-谷氨酰胺产量，其中，pYB1a-CgGlnA/AQ06转化18h， L-谷氨酰胺的产量最高，达46.5mM，对转化率(转化率＝产量x100％/底物的量)进行计算， pYB1a-CgGlnA/AQ06的转化率可达93.0％。
实施例5、利用产L-谷氨酰胺的重组大肠杆菌以谷氨酸为单一底物合成L-谷氨酰胺
一、重组大肠杆菌的自诱导培养
以pYB1a-CgGlnA/AQ02、pYB1a-CgGlnA/AQ04、pYB1a-CgGlnA/AQ06、pYB1a-BpGlnA/AQ06、 pYB1a-Bb1GlnA/AQ06、pYB1a-Bb2GlnA/AQ06
这6株菌中的任一菌株单独为重组大肠杆菌，均同时进行如下实验：将产L-谷氨酰胺的重组大肠杆菌划线到含有质量百分比浓度为1.5g/100ml的琼脂、50μg/mL的氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12h。挑取平板上所长的单克隆，接种到含有50μg/mL的氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，转速为220rpm；将过夜培养物以体积百分比为1％的接种量接种至含50μg/mL的氨苄青霉素的自诱导培养基ZYM-5052中，30℃振荡培养，转速220rpm，培养时间为16h，得到诱导后的重组大肠杆菌。
自诱导培养基ZYM-5052配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E(以下均为质量百分比浓度，即％表示g/100ml)；
A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；
B.50×M：1.25M Na2HPO4，1.25M KH2PO4，2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4；
C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％L-阿拉伯糖；
D.500×MgSO4：1M MgSO4
E.1000×微量元素：50mM FeCl3，20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，CoCl2、NiCl2、 Na2MoO4、Na2SeO3和H3BO3各2mM。
二、全细胞催化以L-谷氨酸为单一底物产L-谷氨酰胺
将步骤一诱导后的重组大肠杆菌，根据菌液的生长情况，取一定量菌体，于4℃，4000rpm离心 10min后，用1mL生理盐水(0.85％氯化钠水溶液)洗涤一次，弃上清后，再次重悬于1mL转化底物液(转化底物液：1ml 50mM MOPS buffer(pH7.0)体系包含50mM gluNa，100mM NH4Cl，10mM MgCl2，50mM glucose，30OD新鲜菌体，用0.22μm滤膜(MilLipore公司)过滤除菌)中，使其最终OD600值为30，得到重悬后的菌液；将重悬后的菌液置于小试管中，于30℃，220rpm的摇床中振荡反应，反应18h，得到转化反应液；将转化反应液于12000rpm离心5min，取上清，得到转化液。
将转化液用蒸馏水稀释10倍，经FMOC衍生后，先用0.22μm滤膜过滤后，再用HPLC检测L- 谷氨酰胺产量。HPLC采用Agilent 1200高效液相色谱仪(配四元泵、RID检测器和工作站)。衍生方法：于1.5mL EP管中加入350ul 50mM硼酸钠buffer(10.2)、100ul sample、50ulFMOC(5mg/ml乙腈溶解)涡旋混匀，40℃衍生10min。色谱条件：Agilent Eclipse XDB-C18柱；流动相流动相A为乙腈，流动相B为50mM NaAc，0-20min 20％流动相A：80％流动相B渐变至60％流动相A:40％流动相， 20-23min 60％流动相A:40％流动相渐变至20％流动相A：80％流动相B，流速：0.6mL min-1，柱温： 40摄氏度；进样量：10μL，DAD检测器检测。以L-谷氨酰胺标准品(Sigma公司)保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析。实验设置三次重复，结果取平均值。
转化物产物的HPLC图谱如图5所示，从图中可见，L-谷氨酸和L-谷氨酰胺标准品的保留时间分别为12.6min、14.7min。
计算L-谷氨酰胺的产量，结果如图6和7所示，经计算可知，pYB1a-CgGlnA/AQ02(图中以“AQ02”表示)转化18h，可产生27.8mM L-谷氨酰胺，转化率为55.6％；pYB1a-CgGlnA/AQ04(图中以“AQ04”表示转化18h，可产生33.8mM L-谷氨酰胺，转化率为67.6％；pYB1a-CgGlnA/AQ06(图中以“Cg”或“AQ06”表示)转化18h，可产生46.5mM L-谷氨酰胺，转化率达到93.0％；pYB1a-BpGlnA/AQ06 (图中以“Bp”表示)转化18h，可产生18.4mM L-谷氨酰胺，转化率为36.8％；pYB1a-Bb1GlnA/AQ06 (图中以“Bb1”表示)转化18h，可产生5.7mM L-谷氨酰胺，转化率为10.4％；pYB1a-Bb2GlnA/AQ06 (图中以“Bb2”表示)转化18h，可产生13.1mM L-谷氨酰胺，转化率为26.2％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 产L-谷氨酰胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
<130> GNCFY192233
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcgttcg agaccccgga ggaaatcgtg aagtttatta aagacgagaa cgttgagttc 60
gtggacgttc gttttaccga tctgccgggc accgaacagc acttcagcat cccggcggcg 120
agctttgacg cggataccgt tgaggaaggc ctggcgttcg acggtagcag catccgtggc 180
tttaccacca ttgacgagag cgatatgaac ctgctgccgg acctgggcac cgcgaccctg 240
gatccgttcc gtaaggcgaa aaccctgaac gtgaagttct ttgttcacga cccgttcacc 300
cgtgaggcgt ttagccgtga tccgcgtaac gtggcgcgta aagcggaaca gtacctggcg 360
agcaccggta ttgcggacac ctgcaacttt ggtgcggagg cggagttcta cctgtttgat 420
agcgttcgtt atagcaccga gatgaacagc ggtttttatg aagtggacac cgaggaaggt 480
tggtggaacc gtggcaagga gaccaacctg gatggcaccc cgaacctggg cgcgaagaac 540
cgtgtgaaag gtggctactt cccggttgcg ccgtatgacc aaaccgtgga tgttcgtgac 600
gatatggttc gtaacctggc ggcgagcggt tttgcgctgg agcgttttca ccacgaagtg 660
ggtggcggtc agcaagaaat caactaccgt ttcaacacca tgctgcacgc ggcggacgat 720
atccagacct tcaagtacat catcaagaac accgcgcgtc tgcacggtaa agcggcgacc 780
ttcatgccga aaccgctggc gggtgacaac ggtagcggta tgcacgcgca ccaaagcctg 840
tggaaggacg gtaaaccgct gtttcacgat gaaagcggct acgcgggtct gagcgatatc 900
gcgcgttact atatcggcgg tattctgcac cacgcgggtg cggttctggc gttcaccaac 960
gcgaccctga acagctatca tcgtctggtg ccgggttttg aggcgccgat caacctggtt 1020
tatagccaac gtaaccgtag cgcggcggtg cgtatcccga ttaccggtag caacccgaag 1080
gcgaaacgta ttgagttccg tgcgccggac ccgagcggta acccgtacct gggctttgcg 1140
gcgatgatga tggcgggcct ggatggtatc aagaaccgta ttgaaccgca tgcgccggtg 1200
gacaaggacc tgtatgaact gccgccggag gaagcggcga gcatcccgca ggcgccgacc 1260
agcctggagg cgagcctgaa ggcgctgcaa gaggacaccg atttcctgac cgaaagcgac 1320
gtttttaccg aggatctgat cgaagcgtac atccagtaca agtacgacaa cgaaattagc 1380
ccggtgcgtc tgcgtccgac cccgcaagag ttcgaactgt attttgattg ctaa 1434
<210> 2
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcaaagt acactagaga agatatcgta aaattagtaa atgaggaaaa cgtaaagtac 60
atccgtctgc aatttacaga cattctcgga acaattaaaa atgttgagat tcctgtgagc 120
cagttagaaa aagctctcga taacaaatgt atgtttgatg gttcatctat tgaagggttt 180
gtacgtatcg aagaatcaga tatgtaccta tatccagatc taaacacgtt tgttattttc 240
ccttggacag cagaaaaagg taaagttgca cgctttattt gtgacattta taagccagac 300
ggaacaccat ttgatggaga ccctcgtaac aacttaaagc gtatcttgaa ggaaatggaa 360
gaactaggat ttagtgattt caaccttgga cctgagccag aattcttctt atttaaatta 420
gacgaaaaag gcgagccaac gctcgaacta aacgataaag gtggatactt tgaccttgca 480
ccaacagatt taggtgaaaa ctgccgccgt gacatcgtgc ttgagcttga agaaatgggc 540
tttgaaattg aagcttctca ccacgaagta gcacctggtc agcatgaaat tgatttcaaa 600
tatgcaggcg ccatccgttc ttgtgatgac attcaaacgt tcaagcttgt tgtgaaaaca 660
atcgctagaa agcacggtct tcatgcgaca ttcatgccaa aaccattgtt cggtgtaaac 720
ggatctggta tgcactgtaa cctatcatta tttaaaaatg gtaaaaacgc attctttgat 780
gagaaagcag acttacaatt aagcgagacg gctagacact ttatcgcagg tattgtgaag 840
cacgcaacaa gcttcacagc ggtcacaaac ccgacggtga actcttacaa acgtcttgtt 900
cctggctatg aagcaccttg ctacgtagca tggagtgcac aaaaccgcag cccattgatt 960
cgtattccag catcacgcgg cattagcaca cgtgtagaag tacgcagtgt agacccatct 1020
gcaaacccat accttgcact aagcgtatta cttgcagcag gtctagacgg aatcaaaaac 1080
aaactagacg caccagcgcc aatcgacaga aacatctatg tcatggacaa agaagagcgc 1140
cttgaaaacg gcatcgctga cttacctgca acacttgcag aagcacttga gctgctcaag 1200
tcaaacgaag tcatgatcaa cgcactaggc gaccacttat tcgagcactt catcgaatca 1260
aaagaaatcg aatgggatat gttccgcacc caagtacacc catgggaacg cgaacagtat 1320
atgtctcagt attaa 1335
<210> 3
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggataagc agcaagagtt tgccctgcgc acggttgagg aacgcgacgt gcgctttatt 60
cggttgtggt tcactgacgt gctgggcacg ttgaaatccg tggccatcgc gcccgccgag 120
ttggaggcgg cgttcgagga ggggcttggc ttcgacggtt ccgccatcga gggaatgacg 180
cgcgtgtcgg aggacgacat gatcgtgcag cccgacccgt ccacgttcca gatactgccg 240
tggcgtggcg gcccgcaggg taccgctcgc atgttctgcg acattctcac gcccgacggc 300
gagccgtccc tgggtgaccc gcgccacgtg ctcaagcgtg cgctcgccaa ggcgaaggag 360
aagggtttca cgttctacgt gcacccggag attgagttct atctgttcga gaaccagacc 420
gactggtcga aggcgccgac tccaatcgac gagggcggct atttcgacca tgtgccgcgc 480
agcccgggca tggacttccg ccgcgccacc gtcaacatgc tggagcagat gggcatctcc 540
gtcgaatact cgcaccatga ggcgggtccc ggccagaacg agatcgacct gcggtatgcc 600
gacgcgctga ccacggccga caacatcatg acgttccgca cggtcgtcaa ggaaatctcg 660
ctggagcgcg gcatccacgc cagcttcatg cccaagccgc tcgccgacgc gcccggttcc 720
ggcatgcaca cgcacctgag cctgttcgag ggtgattcca acgcgttcta cgaggccggc 780
caggagttca acatgtccct gaccgcccga cagttcgccg cgggcatcct gcatcatgcg 840
gcggagatct gcgcggtcac cgaccagttc gtgaactcgt acaagcgact gtggggtggt 900
gctgaggcgc cgagctacat ctgctggggt cacaacaacc ggtccgcgtt gctgcgcatc 960
ccgcagtaca agcccggcaa gggcaactcc gcgcgtatgg agttccgtgg actcgacccg 1020
gtggcgaacc cgtatctggc gtattcggtg ctgctcgccg ccggtctgga cggcatcgaa 1080
cagcagatga cgctgggcga gccgaccagc gacgacgtgt gggagctgac cgacgccgaa 1140
cgtcaggcga tgggcatcga gccgctgccg gattcgctgg acgccgcact gaagatcatg 1200
gagaagtccg atttcgtcgc ggacgtgctc ggcgagcatg cgttcgagta tttcctgcgc 1260
aacaagcatc aggaatggga cgaataccgt ggccaggtca cgccgtacga gttgaagaag 1320
tacctgccca agctctaa 1338
<210> 4
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggcagaga ataagatttt cgcccacacg cctgaagagg tcgaagcact gatcaacaag 60
gaaggcatcg agtacgtctc cgtgcgtttc accgatctga tcggcgttca gcagcacttc 120
accgtcccgg ccagcgaatt cattgacaac gccttcaccg acggcatgcc gttcgatggt 180
tcgtccgtgc agggtttcca ggccatcaac gagtccgaca tgaagctgat cccggatgtc 240
acgaccgcct tcgtcgaccc gttccgcaag cacaagaccc tcgacgtggc cttctccatc 300
gtcgacccgc tgaccgacga gccgtactcc cgcgacccgc gccaggtcgc cggcaaggcc 360
gaagcctacc tgaagtccac cggcatcgcc gacaccgctt ccttcgctcc cgaagccgag 420
ttcttcatct tcgacaaggt gcgctacgag aactccatgc agcgctcctt ctacgaggtc 480
gacaccattg aggctccgtg gaactccggc gtcgacaccg aagaggacgg caccccgaac 540
atcggcttca agaaccgcat caagaagggc tacttcccgg ttccgccgtg cgaccactac 600
caggacctgc gcgacgacat ggtcgccaac ctgcagaagg tcggcctgca gctggagcgc 660
tcccaccacg aggtggccgg cgccggtcag caggagatca actaccgctt caacaccctg 720
cagcacgctg gcgacgacct gatgaagtac aagtacgtcg tccacgagac cgcagcgctc 780
gccggcaagg ccgtgacctt catgcccaag ccgatcgcag gcgacaacgg taccggcatg 840
cactgccacc agtccctgtg gaaggacggc aagccgctgt tctacgacga gcagggctac 900
ggcggcctgt ccaacatcgc ccgctggtac atcggcggtc tgatcaagca ctcctccgca 960
gtggtcgcgt tcacgaaccc gtcgctgaac tcttaccacc gtctggtgcc gggcttcgaa 1020
gctccggttt cgctggtcta ctccgcccgt aaccgttccg tcgccatccg tatcccgctg 1080
gccggaacct cccccgcttc caagcgcatc gagttccgtg caccggatcc gtcctgcaac 1140
ccgttcctcg ccttctccgc ccagatgatg gcaggcctcg acggcatcct gaaccacatc 1200
gagcccccgg agccggtcga caaggatctc tacgagctgc cgcccgaaga gcacgccaac 1260
atcaagcagg tgccgggctc cctcgacgcg gccctgaacg ccctggaaga ggaccacgac 1320
ttcctgaccg ccggcgacgt gttcaccgac gatctgatcg agacctggct tgacctcaag 1380
cgcggcgaaa tcgaccaggc tcgcctggcc ccgaccccgc tggagtacga gctgtattcc 1440
acatcttaa 1449

Claims (6)

1.一种用于谷氨酰胺合成的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌与受体大肠杆菌相比，所述重组大肠杆菌中下述蛋白质的基因的表达量降低和/或所述蛋白质的含量降低和/或所述蛋白质的活性降低：
所述蛋白质为：
1）谷氨酰胺酶A；
2）谷氨酰胺酶B；
3）同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶；
4）肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶；
5）PII-1蛋白；
所述重组大肠杆菌与受体大肠杆菌相比，所述重组大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶的基因表达量增加和/或所述谷氨酰胺合成酶的含量增加和/或所述谷氨酰胺合成酶的活性增加；
所述谷氨酰胺合成酶为SEQ ID No.1所示的DNA分子编码的蛋白质；
所述谷氨酰胺酶A为Genbank号为NC_000913.3的第511641-512573位所示的DNA分子编码的蛋白质；
所述谷氨酰胺酶B为Genbank号为NC_000913.3的第1612325-1613251位所示的DNA分子编码的蛋白质；
所述同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶为Genbank号为NC_000913.3的第3196801-3199641位所示的DNA分子编码的蛋白质；
所述PII-1蛋白为Genbank号为NC_000913.3的第2687070-2687408位所示的DNA分子编码的蛋白质；
所述肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶为Genbank号为NC_000913.3的第1939222-1940193位所示的DNA分子编码的蛋白质；
所述大肠杆菌为大肠杆菌K12。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌K12为大肠杆菌K12菌株BW25113。
3.权利要求1所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括对受体大肠杆菌的基因型进行下述m1）- m6）全部的改造，所述受体大肠杆菌为大肠杆菌突变体或野生型大肠杆菌：
m1）将谷氨酰胺酶A的基因敲除；
m2）将谷氨酰胺酶B的基因敲除；
m3）将具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶的基因敲除；
m4）将PII-1蛋白的基因敲除；
m5）将肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶的基因敲除；
m6）导入谷氨酰胺合成酶的基因；
所述谷氨酰胺合成酶为SEQ ID No.1所示的DNA分子编码的蛋白质；
所述谷氨酰胺酶A为Genbank号为NC_000913.3的第511641-512573位所示的DNA分子编码的蛋白质；
所述谷氨酰胺酶B为Genbank号为NC_000913.3的第1612325-1613251位所示的DNA分子编码的蛋白质；
所述同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶为Genbank号为NC_000913.3的第3196801-3199641位所示的DNA分子编码的蛋白质；
所述PII-1蛋白为Genbank号为NC_000913.3的第2687070-2687408位所示的DNA分子编码的蛋白质；
所述肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶为Genbank号为NC_000913.3的第1939222-1940193位所示的DNA分子编码的蛋白质；
所述大肠杆菌为大肠杆菌K12。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述大肠杆菌K12为大肠杆菌K12菌株BW25113。
5.权利要求1或2所述的重组大肠杆菌在制备L-谷氨酰胺中的应用。
6.制备L-谷氨酰胺的方法，其特征在于：包括利用权利要求1或2所述的重组大肠杆菌催化L-谷氨酸或L-谷氨酸可溶性盐反应得到L-谷氨酰胺。
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