CN115927230A

CN115927230A - 一种亚胺还原酶突变体及其制备方法和在催化制备右美沙芬中间体的应用

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Publication number: CN115927230A
Application number: CN202211740456.2A
Authority: CN
Inventors: 祝俊; 徐飞; 钟锦潮; 张兴意; 刘启月; 李丹
Original assignee: Jiangsu Chengxin Pharmaceutical Co ltd; Jindawei Biotechnology Jiangsu Co ltd; Xiamen Kingdomway Group Co
Current assignee: Jiangsu Chengxin Pharmaceutical Co ltd; Jindawei Biotechnology Jiangsu Co ltd; Xiamen Kingdomway Group Co
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明提供一种亚胺还原酶突变体及其制备方法和在催化制备右美沙芬中间体的应用，所述亚胺还原酶突变体为发生了氨基酸突变的亚胺还原酶，所述亚胺还原酶包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述氨基酸突变的类型包括I122T、D212A或G228R中的任意一种或至少两种的组合。本发明通过在亚胺还原酶中引入突变，显著提高了酶的活性以及立体选择性，能够在温和条件下高收率反应合成右美沙芬中间体(S)‑1‑(4‑甲氧基苄基)‑1,2,3,4,5,6,7,8‑八氢异喹啉，大大降低了生产成本，适用于工业化生产。

Description

一种亚胺还原酶突变体及其制备方法和在催化制备右美沙芬中间体的应用

技术领域

本发明属于蛋白改造技术领域，涉及一种亚胺还原酶突变体及其制备方法和应用，特别是涉及一种亚胺还原酶突变体及其制备方法以及在催化制备右美沙芬中间体的应用。

背景技术

右美沙芬(Dextromethorphan，DM)，分子式为C₁₈H₂₅NO，为中枢性咳药，主要通过抑制脑干延髓中咳嗽中枢，阻断迷走神经的兴奋而发挥作用，其镇咳作用可以与可待因相比，甚至略强于可待因，因其中枢性镇咳作用具有非麻醉性和无成瘾性而被广泛用于临床上治疗咳嗽，其应用已有将近50年的历史。

右美沙芬最初由瑞士的罗氏公司开发，美国食品药品管理局(FDA)于1956年将右美沙芬列为非处方药，目前在美国境内销售的100多种非处方药成分中均含有右美沙芬，右美沙芬主要以氢溴酸盐的形式应用在药物中。此外，市场上常见的感冒镇咳药如美可、美酚伪麻片、白加黑感冒片、普兰西片、丽珠刻乐、帕尔克、健儿婴童咳水等均含有氢溴酸右美沙芬。

右美沙芬的不对称合成法中主要就是其中间体(+)-对甲氧基苄基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉及其衍生物的不对称合成，主要通过引入较大立体位阻的基团或金属配合物催化的对映选择性氢化来实现，Meyers等以异喹啉的还原产物为原料利用不对称合成方法合成了高光学纯度的右美沙芬中间体以及同系物，e.e值达到了98％以上，通过Grewe环化反应最终得到产物右美沙芬，该步骤环化反应收率较低，仅为45～50％，此外，反应中利用丁基锂的反应环境比较苛刻，操作复杂。M.Kitamura等报道了烯胺的选择性加氢还原反应，采用不对称合成法合成了右美沙芬，此类方法主要通过BINAP-Ru(Ⅱ)或其他过渡金属的配合物催化的对应选择性氢化来合成手性的中间体进而合成右美沙芬，该方法中采用的催化对映体选择性氢化的催化剂较为昂贵，增大了生产成本。

因此，在本领域中，期望能够开发一种可以实现在较为温和的反应条件下实现右美沙芬中间体制备的催化剂。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种亚胺还原酶突变体及其制备方法和在催化制备右美沙芬中间体的应用。本发明的亚胺还原酶突变体通过在原始序列基础上经过随机突变得到亚胺还原酶突变体，与原始亚胺还原酶相比发生了蛋白质的结构和功能的变化，立体选择性和酶活均得到提高，能够在温和条件下高收率反应合成右美沙芬中间体(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉((S)-2)，大大降低了生产成本，适用于工业化生产。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种亚胺还原酶突变体，所述亚胺还原酶突变体为发生了氨基酸突变的亚胺还原酶；

所述亚胺还原酶包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

所述氨基酸突变的类型包括I122T、D212A或G228R中的任意一种或至少两种的组合。

在本发明中，所述突变类型的组合包括I122T和D212A的组合、D212A和G228R的组合、I122T和G228R的组合以及I122T、D212A和G228R的组合。

SEQ ID NO.1：

MTEHGKTPVTVLGLGAMGTALVEALLAAGHPVTAWNRTASRAEGVAAKGA

SVASTVSEALAANKTVIACLLDYDSVHEVLDPVASGLEGRQLINLTNGTPGQA

REMSAWAEELGAEYLDGGIMAVPPMIGTPGAFIFYSGSGTVFGQARTALDTFG

GVNYLGADPGLAPLHDIALLSGMYGNFIGVIQAFALVGSAGVKAREFAPLLR

GWMDAMSGFLERTAELIDDGDYERGVVSNIGMQAAAFPNLAKAAEEQGISAELLAPLQPLMDKRVAAGHGAEDLVGVIELLKK。

本发明中，通过在亚胺还原酶中引入如上所述突变，显著提高了酶的活性以及立体选择性，能够在低温条件下温和反应合成右美沙芬中间体(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉((S)-2)，大大降低了生产成本，适用于工业化生产。

优选地，所述亚胺还原酶的编码序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.2：

ATGACCGAACATGGTAAAACCCCGGTTACCGTTCTGGGCCTGGGCGCAAT

GGGCACCGCACTGGTGGAAGCCCTGCTGGCAGCAGGTCATCCGGTTACCG

CCTGGAATCGCACCGCAAGCCGTGCAGAAGGCGTGGCCGCCAAAGGCGC

AAGTGTGGCAAGTACCGTGAGTGAAGCCCTGGCAGCAAATAAAACCGTGA

TTGCCTGTCTGCTGGATTATGATAGTGTGCATGAAGTGCTGGATCCGGTGG

CAAGCGGCCTGGAAGGTCGCCAGCTGATTAATCTGACCAATGGTACCCCG

GGCCAGGCACGCGAAATGAGTGCATGGGCCGAAGAACTGGGTGCCGAATA

TCTGGATGGCGGTATTATGGCCGTTCCGCCGATGATTGGTACCCCGGGTGCA

TTTATTTTTTATAGTGGCAGCGGCACCGTGTTTGGCCAGGCACGTACCGCC

CTGGATACCTTTGGTGGCGTGAATTATCTGGGTGCAGATCCGGGTCTGGCA

CCGCTGCATGATATTGCACTGCTGAGTGGTATGTATGGCAATTTTATTGGTG

TTATTCAGGCATTTGCACTGGTTGGTAGTGCCGGTGTTAAAGCACGCGAAT

TTGCACCGCTGCTGCGTGGCTGGATGGATGCAATGAGTGGCTTTCTGGAAC

GTACCGCCGAACTGATTGATGATGGTGATTATGAACGTGGCGTTGTTAGCA

ATATTGGTATGCAGGCCGCCGCATTTCCGAATCTGGCAAAAGCAGCCGAAG

AACAGGGCATTAGTGCCGAACTGCTGGCCCCGCTGCAGCCGTTAATGGATA

AACGTGTTGCCGCCGGCCATGGCGCCGAAGATCTGGTTGGCGTGATTGAACTGCTGAAAAAATAA。

优选地，所述亚胺还原酶来源于Amycolatopsis regifaucium。

第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的亚胺还原酶突变体。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。

第四方面，本发明提供了一种亚胺还原酶突变体转化子，所述亚胺还原酶突变体转化子为表达第一方面所述的亚胺还原酶突变体的基因工程菌株。

优选地，所述亚胺还原酶突变体转化子含有第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述亚胺还原酶突变体转化子含有第三方面所述的表达载体。

优选地，所述基因工程菌株包括大肠杆菌、毕氏酵母或枯草芽孢杆菌中的任意一种。

第五方面，本发明提供了一种第一方面所述的亚胺还原酶突变体的制备方法，所述制备方法包括：

构建表达载体，转化至受体细胞中，构建亚胺还原酶突变体转化子；

培养所述亚胺还原酶突变体转化子，收集培养物，得到所述亚胺还原酶突变体。

作为优选技术方案，本发明所述亚胺还原酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

以核苷酸序列SEQ ID NO：2为模板进行随机突变，经酶切重组到表达载体pET28a(+)，转化到宿主细胞BL21(DE3)中，获得随机突变库；

对随机突变库进行高通量筛选获得导致突变体的酶活力发生显著变化的突变体菌株，将所述突变体菌株置于LB液体培养基中培养，得到亚胺还原酶突变体酶液。

第六方面，本发明提供了一种利用如上所述亚胺还原酶突变体催化合成(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉((S)-2)的方法，包括如下步骤：

将1-(4-甲氧基苄基)-3,4,5,6,7,8-六氢异喹啉与亚胺还原酶突变体酶液混合，反应，得到所述(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉。

利用本发明所述的亚胺还原酶突变体进行(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的制备，其立体选择性高，产品的光学纯度在99％以上。

优选地，所述反应体系中1-(4-甲氧基苄基)-3,4,5,6,7,8-六氢异喹啉的浓度为10mM-100mM，例如10mM、20mM、30mM、50mM、80mM、90mM或100mM。

优选地，所述反应体系中亚胺还原酶突变体的用量为5-10U/mL，例如5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL或10U/mL。

优选地，所述反应体系中还含有葡萄糖脱氢酶、辅酶和葡萄糖；

优选地，所述反应体系中葡萄糖脱氢酶的用量为10-25U/mL，例如10U/mL、12U/mL、15U/mL、18U/mL、20U/mL、22U/mL或25U/mL。

优选地，所述辅酶为NADP+；

优选地，所述反应体系中辅酶的浓度为0.05mM-0.5mM，例如0.05mM、0.08mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM或0.5mM。

优选地，所述反应体系葡萄糖的浓度为50mM-500mM，例如50mM、80mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM。

优选地，所述反应的溶剂为Tris-HCl缓冲液，其浓度为10-100mM(例如10mM、20mM、30mM、50mM、80mM、90mM或100mM)，pH为8.0-8.5，例如8.0、8.2、8.4或8.5。

优选地，所述反应在pH 8.0-8.5(例如8.0、8.2、8.4或8.5)下进行。

优选地，所述反应的温度为20-25℃(例如20℃、22℃、24℃或25℃)，反应的时间为12-24小时(例如12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时)。

第七方面，本发明提供了第一方面所述的亚胺还原酶突变体或第四方面所述的亚胺还原酶突变体转化子或第六方面所述的方法在制备右美沙芬中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明的亚胺还原酶突变体与原始亚胺还原酶相比发生了蛋白质的结构和功能的变化，立体选择性和酶活均得到提高，能够在温和条件下高收率反应合成右美沙芬中间体(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉((S)-2)，产物光学纯度可高达90％以上，收率可高达53％以上，甚至高达80％以上，而且大大降低了生产成本，适用于工业化生产。

附图说明

图1为制备(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的反应原理示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1野生型亚胺还原酶表达菌株的构建

将全基因合成的亚胺还原酶IRED片段(序列如SEQ ID NO：2所示，由常州基宇生物技术有限公司合成)，经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ(购自New England Biolabs公司，根据说明书进行操作)酶切后重组到载体pET 28a(+)，转化到Tran5α感受态(购自全式金公司)，将E.coli Tran5α置于LB液体培养基中，37℃、160rpm转振荡培养过夜，提取重组质粒IRED-pET28a(+)，将该质粒转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞中(全式金公司)，得到表达野生型亚胺还原酶的重组大肠杆菌。

实施例2通过随机突变PCR构建IRED随机突变点库

以序列SEQ ID NO：2为模板，应用安捷伦GeneMorph II Random Mutagenesis Kit构建随机突变体库，正向引物IRED-NdeⅠ-F的序列如SEQ IDNO.3所示，反向引物MAON-XhoⅠ-R的序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.3：

5-GAATTCCATATGACCGAACATGGTAAAACCCCGG-3’

SEQ ID NO.4：

5’-CCGCTCGAGTTATTTTTTCAGCAGTTCAATCACG-3’。

50μLPCR体系包括：5μL of 10×Mutazyme II reaction buffer，1μL of 40mMdNTP mix(200μM each final)，引物IRED-NdeⅠ-F和IRED-XhoⅠ-R(10μM)各1μL，1μL ofMutazyme II DNA polymerase(2.5U/μL)，50ng IRED-pET28a(+)补水至50μL。

PCR程序为95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min30s；30个循环，72℃10min。

扩增结束后进行凝胶电泳检测，胶回收1.5kb随机突变片段，经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ(购自New England Biolabs公司，根据说明书进行操作)酶切后重组到载体pET 28a(+)中，大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞中(全式金公司)，得到随机突变库。

实施例3突变文库的高通量筛选及酶活测定

用牙签选取突变体库的转化子，接种到含300μLLB培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含50mg/L硫酸卡那霉素，37℃，220rpm振荡培养过夜，吸取50μL一级种子液转接至含600μL LB培养基二级板中培养，37℃培养3小时至OD600约1.0时，加入终浓度为0.2mM降温至25℃，培养过夜，离心收集菌体(3500rpm，10min)，每孔加入200μL裂解液(100mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0，含750mg/L溶菌酶和12mg/L DNA酶)，振荡使细胞悬浮均匀，然后放置于37℃，200rpm条件下保温2小时破碎细胞，在4℃条件下，3500rpm离心30min后取上清于酶标板中检测其活力。酶标板的测活体系(200μL)：1mM底物1-(4-甲氧基苄基)-3,4,5,6,7,8-六氢异喹啉，1％(V/V)助溶剂DMSO，0.15Mm NADPH、100mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)，通过利用辅酶NADPH的吸光值降低来判定活力的高低。从随机突变库中，通过对约10个反应酶活较高突变体克隆测序，经测序发现，这些位点氨基酸的替换会的显著变化：I122T、D212A、G228R，并通过点突变对氨基酸位点进行突变，获得如下表1所示突变菌株。

表1

突变株	突变位点	相对活性
			IRED	--	100％
IRED-M1	I122T	150％
			IRED-M2	D212A	200％
IRED-M3	G228R	150％
			IRED-M4	I122T+D212A	250％
IRED-M5	D212A+G228R	350％
			IRED-M6	I122T+G228R	300％
IRED-M7	I122T+D212A+G228R	1200％

实施例4重组IRED及其突变体的酶活力测定

将含有IRED-pET28a及其突变体重组质粒的E.coli BL21(DE3)接种至50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，于37℃，200rpm转速的恒温摇床中培养过夜。取培养液1％的接种量接种至新鲜的含50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，在37℃，200rpm转速的恒温摇床中培养至OD600＝0.8时，加入终浓度为0.1mmol的IPTG，25℃继续培养16小时，诱导IRED及其突变体的表达。

于4℃、10000rpm离心10min收集菌泥，重悬于磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.5)中，冰浴中超声破碎细胞(工作4s、间歇4s，超声10min)，4℃10000rpm离心10min收集上清酶液，使用Ni-NTA亲和层析法(上海生工)纯化IRED及其突变体，获得纯酶液。

酶活测定(1mL)：底物1-(4-甲氧基苄基)-3,4,5,6,7,8-六氢异喹啉的二甲基亚砜(DMSO)溶液(10μL，底物终浓度为1mmol/L)，NADPH(10μL，终浓度为0.15mmol/L)、10μL酶液及970μL 100mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)，在25℃条件下检测340nm处吸光值的变化，酶活力(U)单位定义为：在上述条件下，每分钟氧化1μmolNADPH所需的酶量。IRED原始酶活为5U/mL。

测定结果如表2所示。

表2

突变株	相对活性
		IRED	100％
IRED-M1	150％
		IRED-M2	200％
IRED-M3	150％
		IRED-M4	250％
IRED-M5	350％
		IRED-M6	300％
IRED-M7	1200％

由表2可以看出，相比于原始的亚胺还原酶，突变体的酶活均有显著提升，相对酶活均在150％以上，甚至高达1200％。上述结果表明本发明通过在亚胺还原酶中引入突变，成功提高了酶的反应活性，具有重要的实际应用价值。

实施例5突变体亚胺还原酶的发酵

A)摇瓶发酵

摇瓶种子培养基成分：酵母提取物：5g/L；蛋白胨：10g/L，NaCl：10g/L；卡那霉素(简称卡那)50ug/mL。

摇瓶种子培养基制备：取5g酵母粉提取物，10g蛋白胨，10gNaCl，溶解在800mL蒸馏水中，调节pH到7，用蒸馏水定容至1000mL，121℃保持15min，溶液冷却到60℃以下后加入卡那霉素至终浓度50ug/mL。

发酵步骤：

取原种菌种在LB平板上划线，37℃，倒置培养过夜。在平板上挑取单克隆接种于至3mL种子培养基(10mL试管)中，37℃，200rpm振荡培养18小时后OD600长到1.8左右。以1％接种量接种至300mL种子培养基(1L三角瓶)中，37℃，200rpm振荡培养6小时后OD600长到1.5左右。

B)发酵培养

培养基分为发酵培养基和流加培养基。

发酵培养基为M9培养基成分如下：Na₂HPO₄ 6g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O0.246g/L，(NH₄)₂SO4 2.24g/L，NaCl 0.5g/L，葡萄糖20g/L。

发酵培养基配置：Na₂HPO₄、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、(NH₄)₂SO4、NaCl、葡萄糖搅拌溶解，121℃下保持30min，冷却后待用，卡那霉素采用无菌膜过滤除菌，然后将无菌的卡那霉素加入发酵培养基中。

流加培养基成分如下：葡萄糖600g/L。

流加培养基配置：葡萄糖加水溶解，115℃保持30min，冷却后待用。

发酵罐发酵控制：整个过程控制DO 20％以上，通风比为1:3(VVM)，发酵培养控温37℃，pH7.0，培养8小时溶氧突变，开始补料，OD600＝30左右诱导，IPTG终浓度为1mM，诱导温度控制25℃，培养21小时放罐。

实施例6亚胺还原酶全细胞和酶液制备

发酵完毕后，5000g，30min离心收集得到亚胺还原酶细胞。将发酵离心菌体悬浮于3倍体积的50mmolPBNa(pH7.5)缓冲液中，然后使用超声波裂解细菌细胞离心(4℃，10000g，10min)并收集上清液，即为亚胺还原酶液。

应用例1

在应用例中，通过如下方法来制备(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉，反应原理示意图如图1所示，具体包括以下步骤：

取实施例6制备得到的IRED-M7酶液(50U/mL)10mL于100mLTris-HCl缓冲液(100mM，pH8.5)，加入葡萄糖1g，NADP+5mg，GDH酶液1mL、1-(4-甲氧基苄基)-3,4,5,6,7,8-六氢异喹啉1g，使用10％的碳酸钠溶液控制pH8.5，于25℃氮气保护反应24小时，HPLC检测显示反应完全(使用可变紫外检测器，检测波长为210nm，色谱柱为菲罗门C18柱(4.6mm×50mm，5μm)，流动相A:0.1％磷酸缓冲液，流动相B:乙腈，流速0.8mL/min。纯度由HPLC色谱的峰面积比计算。)，5.0MNaOH溶液调节pH至11，甲基叔丁酯萃取(100mL×3)，无水硫酸钠干燥后旋干，经柱层析分离纯化得到0.8g(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉，收率为80％，e.e值为99.5％。

手性检测方法为采用高效液相色谱法进行定量分析，使用可变紫外检测器，检测波长为230nm，色谱柱为大赛璐CHIRALPAK IC柱(4.6mm×250mm，5μm),流动相：正己烷-乙醇-二乙胺(50:50:0.05)，流速1mL/min。

e.e＝([S]-[R]/[S]+[R])×100％，其中[S]代表(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉，[R]代表(R)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉。

应用例2

取实施例6制备得到的IRED-M7酶液(50U/ml)20ml于100mLTris-HCl缓冲液(100mM，pH8.5)，加入葡萄糖3g，NADP+10mg，GDH酶液3mL、1-(4-甲氧基苄基)-3,4,5,6,7,8-六氢异喹啉3g，使用10％的碳酸钠溶液控制pH8.5，于25℃氮气保护反应24小时，HPLC检测显示反应完全，5.0MNaOH溶液调节pH至11，甲基叔丁酯萃取(150mL×3)，无水硫酸钠干燥后旋干，经柱层析分离纯化得到2.46g(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉，收率为82％，e.e值为99.4％。

应用例3

取实施例6制备得到的IRED-M7酶液(50U/ml)50ml于500mLTris-HCl缓冲液(100mM，pH8.5)，加入葡萄糖10g，NADP+20mg，GDH酶液5mL、1-(4-甲氧基苄基)-3,4,5,6,7,8-六氢异喹啉10g，使用10％的碳酸钠溶液控制pH8.5，于25℃氮气保护反应24小时，HPLC检测显示反应完全，5.0MNaOH溶液调节pH至11，甲基叔丁酯萃取(250mL×3)，无水硫酸钠干燥后旋干，经柱层析分离纯化得到8.60g(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉，收率为86％，e.e值为99.6％。

应用例4

与应用例1的区别仅在于，将IRED-M7替换为IRED-M1，其余材料及制备条件与应用例1相同。

应用例5

与应用例1的区别仅在于，将IRED-M7替换为IRED-M2，其余材料及制备条件与应用例1相同。

应用例6

与应用例1的区别仅在于，将IRED-M7酶液替换为IRED-M3，其余材料及制备条件与应用例1相同。

应用例7

与应用例1的区别仅在于，将IRED-M7替换为IRED-M4，其余材料及制备条件与应用例1相同。

应用例8

与应用例1的区别仅在于，将IRED-M7替换为IRED-M5，其余材料及制备条件与应用例1相同。

应用例9

与应用例1的区别仅在于，将IRED-M7替换为IRED-M6，其余材料及制备条件与应用例1相同。

对比例1

与应用例1的区别仅在于，将IRED-M7替换为IRED，其余材料及制备条件与应用例1相同。

应用例1～9以及对比例1中产物(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的收率和e.e值的统计结果如表3所示。

表3

组别	收率(％)	e.e值(％)
			应用例1	80	99.5
应用例2	82	99.4
			应用例3	86	99.6
应用例4	53	95.2
			应用例5	61	94.1
应用例6	55	94.6
			应用例7	64	90.4
应用例8	71	95.6
			应用例9	68	92.8
对比例1	42	90.2

由表3可以看出，本发明在原始亚胺还原酶的基础上引入突变，显著提高了酶活，在制备(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉时提高了立体选择性和产物收率。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于，所述亚胺还原酶突变体为发生了氨基酸突变的亚胺还原酶；

所述亚胺还原酶包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

2.根据权利要求1所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于，所述亚胺还原酶的编码序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

优选地，所述亚胺还原酶来源于Amycolatopsis regifaucium。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变体。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求3所述的核酸分子。

5.一种亚胺还原酶突变体转化子，其特征在于，所述亚胺还原酶突变体转化子为表达如权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变体的基因工程菌株；

优选地，所述亚胺还原酶突变体转化子含有权利要求3所述的核酸分子；

优选地，所述亚胺还原酶突变体转化子含有权利要求4所述的表达载体；

6.一种权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

7.一种利用如权利要求1或2所述亚胺还原酶突变体催化合成(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应体系中1-(4-甲氧基苄基)-3,4,5,6,7,8-六氢异喹啉的浓度为10mM-100mM；

优选地，所述反应体系中亚胺还原酶突变体的用量为5-10U/mL；

优选地，所述反应体系中葡萄糖脱氢酶的用量为10-25U/mL；

优选地，所述辅酶为NADP+；

优选地，所述反应体系中辅酶的浓度为0.05mM-0.5mM；

优选地，所述反应体系葡萄糖的浓度为50mM-500mM。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述反应的溶剂为Tris-HCl缓冲液，其浓度为10-100mM，pH为8.0-8.5；

优选地，所述反应在pH 8.0-8.5下进行；

优选地，所述反应的温度为20-25℃，反应的时间为12-24小时。

10.根据权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变体或权利要求5所述的亚胺还原酶突变体转化子或权利要求7-9中任一项所述的方法在制备右美沙芬中的应用。