CN116004562A - 一种转氨酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种转氨酶突变体在合成沙库必曲缬沙坦钠盐（LCZ696）关键手性中间体D‑4,4’‑联苯丙氨酸中的应用，属于生物催化合成技术领域。本发明所述的突变体是SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的四联突变体，转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。相比于野生型转氨酶母本，在保证产物手性纯度的情况下，单位酶活提高为约30倍，具有非常高的立体选择性和转化率，可进一步降低沙库必曲和LCZ696的工业生产成本，具有良好的工业应用价值。

Description

一种转氨酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物催化合成技术领域，具体而言，涉及一种转氨酶突变体在合成沙库必曲缬沙坦钠盐（LCZ696）关键手性中间体D-4,4’-联苯丙氨酸中的应用。

背景技术

LCZ696（商品名Entresto，式A）是一种双效血管紧张素受体脑啡肽酶（NEP）抑制剂，由美国诺华制药研发，由缬沙坦（Valsartan，式B）和沙库必曲（Sacubitril，也称为AHU377，式C）以1:1的摩尔比组成，于2015年7月7日获得FDA批准上市，用于治疗高血压和心脏衰竭。

式D（D-4,4’-联苯丙氨酸）作为制备沙库必曲的关键手性中间体，成为制约沙库必曲生产的关键因素（图1）。沙库必曲和式D及其类似物化学法制备工艺已在众多专利中给予了报道（WO 2007/083774、WO 2007/083776、WO 2008/031567、WO 2008/083967、WO 2008/120567、WO 2009/090251、WO 2010/081410、WO 2011/035569、WO 2011/088797、WO 2012/025501、WO 2012/025502、WO 2013/026773、WO 2014/032627、WO 2015/024991、WO 2015/037460、CN101362708、 CN102260177、CN103483201、CN104557600、CN104725256、CN104725279、CN105017082、 CN105061263、CN105085322、CN105152980、CN105168205、CN105198775、CN105237560、 CN105330569、CN105481622、CN105566194、CN105601524和CN105884656中），但是这些方法仍具有明显的缺点，如潜在危险的反应物或使用昂贵的催化剂和/或有限的立体选择性。因此，仍然对设计更优的制备方法以提供获得用于合成D-4,4’-联苯丙氨酸的廉价方式存在需求，这些方法适用于在经济和环境上更加有利的条件下进行工业规模生产并且提供以高化学纯度和高立体化学选择性的D-4,4’-联苯丙氨酸。

WO 2018/116203和CN 110088079使用( R)-选择性ω-转氨酶催化4,4’-联苯丙酮酸（底物），40-45℃反应17-18小时，底物转化率接近100%，后处理得到ee值＞99% 的D-4,4’-联苯丙氨酸，收率90%。展现了生物酶催化在该手性化合物合成上的巨大优势。但该转氨酶反应时间长，表明酶的催化效率仍有提升空间。寻找不同生物来源的转氨酶，并借助蛋白质工程方法对酶分子进行改造获得更加高效的转氨酶，是实现LCZ696关键手性中间体D-4,4’-联苯丙氨酸酶法工业化生产的努力方向。

发明内容

发明目的：针对现有合成法制备D-4,4’-联苯丙氨酸的不足，提供一种适合绿色化学工业化生产的制备工艺，进一步为社会提供质优价廉的原料药。

技术方案：本发明基于筛选获得的 Mycolicibacteriumagri菌株的天然转氨酶，在此基础上通过定向进化而获得的转氨酶突变体，利用该转氨酶突变体催化4,4’-联苯丙酮酸合成D-4,4’-联苯丙氨酸，反应式如下：

式中：PLP为5'-磷酸吡哆醛，是转氨酶的辅酶。

本发明提供了一种改进的转氨酶，即转氨酶突变体，该转氨酶突变体的酶催化活性显著高于野生型转氨酶。

本发明的技术方案是，一种转氨酶突变体，其是SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列（对应编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 2）的四联突变体，突变点位包括下列点位：第60位R突变为G、第72位D突变为A、第196位K突变为N和第199位Q突变为L。

本发明所述转氨酶突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO: 3所示，对应编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 4所示。

根据本发明的另一方面，提供了一种重组质粒，重组质粒上含有上述任一种基因的核苷酸序列，进一步地，质粒为pET-28a(+)、pET-28b(+)、pET-28c(+)、pET-5b(+)、pET-15b、pET-24a(+)、pET-24c(+)、pET-24d(+)、pET-25b(+)、pET-27b(+)、pET-28c(+)、pET-29a(+)、pET-29b(+)、pET-29c(+)、pET-30b(+)、pET-30c(+)、pET-30 Xa/LIC、pET-30 EK/LIC、pET-31b(+)、pET-32b(+)、pET-32c(+)、pET-32 EK/LIC、pET-32 Xa/LIC、pET-33b(+)、pET-37b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42b(+)、pET-42c(+)、pET-43.1a(+)、pET-43.1b(+)、pET-43.1c(+)、pET-43.1 EK/LIC、pET-44a(+)、pET-44b(+)、pET-44c(+)、pET-44 EK/LIC、pET-45b(+)、pET-46 EK/LIC、pET-47b(+)、pET-48b(+)、pET-49b(+)、pET-51b(+)、pET-52b(+)、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pBV220、pBV221、pCold-GST、pCold IV、pCold-GST或pTrcHis C。

根据本发明的另一方面，提供了一种宿主细胞，宿主细胞内含有上述任一种重组质粒，且所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞，原核细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。

根据本发明的另一方面，还提供了转氨酶突变体在制备D-4,4’-联苯丙氨酸中的应用，包括：在转氨酶突变体存在下，以4,4’-联苯丙酮酸为底物，经不对称转氨获得D-4,4’-联苯丙氨酸。

具体的，上述转氨酶突变体在制备D-4,4’-联苯丙氨酸中的应用，催化转氨反应应用磷酸盐缓冲溶液控制pH在7.5-9.5范围，优选8.0-9.0，反应过程中pH基本稳定，无需额外酸碱溶液调节。

反应过程中，pH低于7.5，或高于9.5，酶催化反应速度明显降低甚至底物无法反应完。

具体的，上述转氨酶突变体在制备D-4,4’-联苯丙氨酸中的应用，催化转氨反应温度控制在25-45℃，优选30-40℃。反应温度低于25℃或高于45℃，酶催化反应速度会有所降低甚至底物无法反应完。

附图说明

图1. 化学合成-转氨酶催化制备沙库必曲工艺流程图

图2. 本发明优选实施例6中转氨酶突变体的蛋白电泳检测结果图

图3. D-4,4’-联苯丙氨酸手性纯度HPLC图谱

有益效果：本发明技术方案通过在SEQ ID NO: 1所示的野生型转氨酶（对应编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示）的基础上，采用随机突变的分子生物学方法对转氨酶的母本基因进行突变，从而改变酶的氨基酸序列，实现酶结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的转氨酶四联突变体。使用该转氨酶突变体催化4,4’-联苯丙酮酸合成D-4,4’-联苯丙氨酸，相比于野生型转氨酶母本，在保证产物手性纯度的情况下，单位酶活提高为约30倍（实施例5）。具有非常高的立体选择性和转化率，表现在，0.01 wt转氨酶酶粉催化4,4’-联苯丙酮酸，反应4~8 h，底物转化率可达到100%，产物e.e.值达到99.9%，相比于现有公开的最优酶催化工艺（专利CN 110088079 酶催化反应18 h底物转化率100%，e.e值＞99%），本发明提供了一种新来源的转氨酶突变体和底物转化效率（在酶用量相当的条件下，反应4-8 h相对于反应17-18 h）更高的技术方案，可进一步降低沙库必曲和LCZ696的工业生产成本，具有良好的工业应用价值。

具体实施方式：下面结合具体实施实例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：获得 Mycolicibacteriumagri菌株的野生型转氨酶母本重组质粒

通过NCBI Protien数据库获得 Mycolicibacteriumagri菌株的转氨酶母本氨基酸序列（NCBI Reference Sequence: WP_097938638.1，SEQ ID NO: 1）和基因序列（NCBIReference Sequence: NZ_PDCP01000006.1，碱基序列位置40721~41737，SEQ ID NO: 2），经密码子优化并委托服务商人工合成全长基因至pET28a(+)表达质粒，后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有50 mg/L 硫酸卡那霉素的LB琼脂平皿中，37°C培养过夜。挑选数个单菌落至LB培养基（含50 mg/L 硫酸卡那霉素），37°C培养过夜后使用质粒小提试剂盒提取重组质粒，进行PCR和测序验证，获得野生型海茵酶母本的重组质粒。

根据实施例1所述内容，以含 Mycolicibacteriumagri菌株的转氨酶母本编码基因的重组质粒为模板，并根据转氨酶母本编码基因用Primer 5.0设计并合成两端引物（表1），使用易错PCR技术（物料及浓度见表2，反应条件见表3）获得含有大量碱基突变的线性基因片段，将这些PCR产物和pET28a(+)表达质粒分别进行酶切、切胶回收、连接和转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有50 mg/L 硫酸卡那霉素的LB琼脂平皿中，37°C培养过夜。详见表1-表3。

为了便于转氨酶突变体的克隆、表达及鉴定，在其基因的5’和3’末端设计了兼容的限制内切酶位点，可以采用 Nco I和 Xho I限制性内切酶分别将目的基因和pET28a(+)（其它可以在大肠杆菌中表达蛋白质的表达质粒也可使用）同时进行酶切和DNA切胶回收，回收后的目的基因和质粒的较大片段用T4 DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，然后将转化后的感受态细胞涂布于含有50 mg/L 硫酸卡那霉素的LB琼脂平皿中，37°C培养过夜。

挑取上述培养皿上长出的单菌落接种于含有50 mg/L 硫酸卡那霉素的LB 液体培养基中，37°C振荡培养过夜，收集菌体进行质粒提取、PCR 鉴定和双酶切鉴定后，将正确的重组质粒命名为pET28a(+)-A-N，并将含有正确的重组质粒的大肠杆菌进行后续的诱导表达。将上述菌液转接于500 mL含100 mg/L 氨苄青霉素的LB 液体培养基中，37°C振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8 时，加入IPTG 至终浓度分别为0.05～0.5 mM，在22～25°C下进行诱导表达12～16 h后，取出菌液，6000 ×g 离心20 min收集菌体，于-20°C冻存备用。

根据实施例2和实施例3所述内容，挑取上述LB琼脂培养基上的单克隆菌落接种于48深孔板中，每孔预先加入1 mL含有50 mg/L 硫酸卡那霉素的LB培养基，于37°C，220 rpm振荡培养3 h后，加入一定量的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，终浓度为0.15mM），25°C，220 rpm诱导培养15 h，6000 ×g离心20 min收集菌细胞，倒掉离心上清液后使用0.5 mL磷酸钾缓冲液（100 mM，pH 8.5）重悬菌体，加入0.1 mL 4,4’-联苯丙酮酸溶液（2mM）、0.2 mL 70%异丙胺溶液、0.2 mL PLP溶液（2 mM），总反应体积为1.0ml，40℃反应22h，加入1mL的甲醇终止反应，震荡离心后，取出上清送HPLC检测转化率。

（1）转氨酶突变体酶液的制备

将实施例4中酶活高于母本的突变体菌株分别以0.1%接种量接种于10-20瓶500mL含有100 mg/L 氨苄青霉素的LB培养基，于37℃，220 rpm振荡培养5~6 h，加入一定量的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，终浓度为0.1 mM），25℃，220 rpm诱导培养16 h，6000 ×g离心20 min收集菌体。使用100 mM磷酸钾缓冲液（pH 8.5）将菌体制成200 g/L全细胞的重悬菌液，用高压均质破碎机（800~900 bar）将菌体细胞壁破裂，破碎液于4℃，10000 ×g离心30 min获得上清液，上清液，即转氨酶突变体粗酶液。

（2）转氨酶催化4,4’-联苯丙酮酸制备D-4,4’-联苯丙氨酸的反应

向20 mL反应瓶中加入主原料4,4’-联苯丙酮酸0.2 g，三水合磷酸氢二钾 1.0 g、50 mM（pH 8.5）磷酸钾缓冲液10 mL、70%异丙胺溶液 1.0 mL、30%吐温-20溶液 1.0 mL、辅酶磷酸吡哆醛溶液（2 mM） 0.4 mL混合成反应体系，温度升至35℃，加入转氨酶突变体酶液50 mg（0.25wt），采用2 mol/L NaOH溶液调节反应pH 8.5-9.0，反应16小时结束反应，HPLC分析其转化率及e.e值。

对照例：分别向两个20 mL反应瓶中各加入主原料4,4’-联苯丙酮酸0.2 g，三水合磷酸氢二钾 1.0 g、50 mM（pH 8.5）磷酸钾缓冲液10 mL、70%异丙胺溶液 1.0 mL、30%吐温-20溶液 1.0 mL、辅酶磷酸吡哆醛溶液（2 mM） 0.4 mL混合成反应体系，温度升至35℃，分别加入转氨酶母本酶液50 mg（0.25 wt）和500 mg（2.50 wt），采用2 mol/L NaOH溶液调节反应pH 8.5-9.0，反应16小时结束反应，HPLC分析其转化率及e.e值。

（3）转氨酶催化反应中控转化率的测定

反应体系经溶剂〔0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(含0.1%磷酸) –乙腈(50:50)〕稀释处理，膜过滤后HPLC直接进样分析。HPLC条件为：

仪器：Thermo U3000 system HPLC

色谱柱：Agilent ZOBAX SB-phenyl，4.6mm×250mm，5μm

流动相：以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH至3.0)为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行线性梯度洗脱；

检测波长：255 nm；

流速：1.0 mL/min；

柱温：30℃；

进样体积：10μL。

转化率计算公式：

式中，A（P）为D-4,4’-联苯丙氨酸峰面积；

A（S）为起始物料4,4’-联苯丙酮酸峰面积。

（4）转氨酶催化产物光学纯度鉴定

取产品适量，用溶剂超声溶解并稀释制成每1ml约含2mg的溶液，量取1ml，置5ml离心管中，依次加入0.5ml硼酸盐缓冲液和0.5ml FMOC-Cl溶液，振摇1分钟，然后再加入50μl乙酸，摇匀。

HPLC条件为：

仪器：Thermo U3000 system HPLC

色谱柱：Chiralcel OJ-RH，4.6mm×150mm，5μm

流动相：0.1%三氟乙酸乙腈溶液为流动相A，0.1%三氟乙酸水溶液为流动相B

检测波长：263 nm；

流速：0.7mL/min；

柱温：25℃；

进样体积：3μL。

R型产物光学纯度计算公式：

式中，A（R）为目标产物D-4,4’-联苯丙氨酸峰面积；

A（S）为对映异构体L-4,4’-联苯丙氨酸峰面积。

选取催化活性优于母本的突变体进行测序，分析突变位点，确定四联突变体R60G-D72A-K196N-Q199L（SEQ ID NO: 3，对应编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 4）的催化活性比本方案母本显著提高，且产物e.e.值未出现下降。复筛反应结果如表4所示。

注：表4中的^*指转化1 g底物所需各转氨酶酶液质量（g）。0.25wt指转化1 g主原料需要0.25 g转氨酶突变体酶液。

表4结果说明：R60G-D72A-K196N-Q199L四联突变体对4,4’-联苯丙酮酸的催化效率为野生型转氨酶母本的约30倍，且产物有e.e.值和母本均可高达99.9%。

将实施例5中突变体菌株以0.01%接种量接种于（500 mL/瓶*30瓶）含有50 mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基，于37°C，220 rpm振荡培养5~6 h，加入一定量的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，终浓度为0.15 mM），25°C，220 rpm诱导培养16 h，6000 ×g离心收集菌体。所得90~100 g菌细胞使用200 mL 50 mM磷酸钾缓冲液（pH 8.5）重悬混匀后用高压均质机破碎细胞（800~900 bar），4°C，6000 ×g离心20 min获得上清液，转氨酶突变体上清液蛋白表达SDS-PAGE图谱见图2。上清液于-80℃预冻后，在SCIENTZ-25T型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）中进一步冻干制成转氨酶酶粉，2~8℃冷藏备用。

将4,4’-联苯丙酮酸 10 g、三水合磷酸氢二钾 8g、50mmol/L（pH 8.5）磷酸钾缓冲液50 g、70%异丙胺溶液 3.51g、30%吐温-20溶液 5g、辅酶磷酸吡哆醛 67mg混合成反应体系，磁力搅拌下将温度升至35℃，加入四联转氨酶突变体酶粉0.1g（0.01 wt），采用2 mol/LNaOH溶液调节反应pH 8.5，HPLC中控跟踪反应至6.5 h时，底物4,4’-联苯丙酮酸残留0.08%（HPLC，峰面接归一化法），停止反应。反应体系抽滤，对滤饼先后采用50 mM（pH 8.5）磷酸钾缓冲液50 mL和纯化水 50 mL淋洗。滤饼再使用甲醇50 mL于65℃热处理1小时，抽滤烘干获得产品9.34 g，收率93.1%，HPLC有关纯度99.47%，e.e.值99.82%。

将4,4’-联苯丙酮酸 10g、三水合磷酸氢二钾 8g、50mmol/L（pH 8.5）磷酸钾缓冲液136.7g、70%异丙胺溶液 3.0g、30%吐温-20溶液 5g、辅酶磷酸吡哆醛 67mg混合成反应体系，温度升至40℃，加入四联转氨酶突变体酶粉0.1g，采用2 mol/L NaOH溶液调节反应pH8.0，HPLC中控跟踪反应至底物4,4’-联苯丙酮酸残留≤0.1%（HPLC，峰面接归一化法）反应结束。对滤饼先后采用50 mM（pH 8.5）磷酸钾缓冲液50 mL和纯化水 50 mL淋洗。滤饼再使用甲醇50 mL于65℃热处理1小时，抽滤烘干获得产品9.17g，收率91.43%，HPLC有关纯度99.25%，光学纯度99.88%。

将4,4’-联苯丙酮酸 10g、三水合磷酸氢二钾 8g、50mmol/L（pH 8.5）磷酸钾缓冲液136.7g、70%异丙胺溶液 3.51g、30%吐温-20溶液 5g、辅酶磷酸吡哆醛 67mg混合成反应体系，温度升至30℃，加入四联转氨酶突变体酶粉0.1g（0.01 wt），采用2 mol/L NaOH溶液调节反应pH 9.0，HPLC中控跟踪反应至底物4,4’-联苯丙酮酸残留≤0.1%（HPLC，峰面接归一化法）反应结束，反应8小时结束反应。对滤饼先后采用50 mM（pH 8.5）磷酸钾缓冲液50mL和纯化水 50 mL淋洗。滤饼再使用甲醇50 mL于65℃热处理1小时，抽滤烘干获得产品9.19g，收率91.64%，HPLC有关纯度99.42%，光学纯度99.85%。

将4,4’-联苯丙酮酸 10g、三水合磷酸氢二钾 8g、50mmol/L（pH 8.5）磷酸钾缓冲液136.7g、70%异丙胺溶液 3.0g、30%吐温-20溶液 5g、辅酶磷酸吡哆醛 67mg混合成反应体系，温度升至45℃，加入四联转氨酶突变体酶粉0.1g（0.01 wt），采用2 mol/L NaOH溶液调节反应pH 9.5，HPLC中控跟踪反应至底物4,4’-联苯丙酮酸残留≤0.1%（HPLC，峰面接归一化法）反应结束，反应8小时结束反应。反应体系抽滤后，对滤饼先后采用pH 8.5 0.05mol/L磷酸钾缓冲液50 mL和纯化水 50 mL淋洗。滤饼使用甲醇50 mL于65℃热处理1小时，抽滤烘干获得产品8.99g，收率89.54%，HPLC有关纯度99.15%，光学纯度99.82%。

将4,4’-联苯丙酮酸 10g、三水合磷酸氢二钾 8g、50mmol/L（pH 8.5）磷酸钾缓冲液123.0g、70%异丙胺溶液 3.51g、30%吐温-20溶液 5g、辅酶磷酸吡哆醛 67mg混合成反应体系，温度升至25℃，加入四联转氨酶突变体酶粉0.1g（0.01 wt），采用2 mol/L NaOH溶液调节反应pH 7.5，HPLC中控跟踪反应至底物4,4’-联苯丙酮酸残留≤0.1%（HPLC，峰面接归一化法）反应结束，反应8小时结束反应。反应体系抽滤后，对滤饼先后采用pH 8.50.05mol/L磷酸钾缓冲液50 mL和纯化水 50 mL淋洗。滤饼使用甲醇50 mL于65℃热处理1小时，抽滤烘干获得产品8.95g，收率89.14%，HPLC有关纯度99.08%，光学纯度99.85%。

向3 L圆底三口烧瓶中加入4,4’-联苯丙酮酸 200.0 g、三水合磷酸氢二钾 160.1g、50mmol/L（pH 8.5）磷酸钾缓冲液0.8 kg、异丙胺50.0 g和吐温-20 30.2 g，250 rpm机械搅拌下，将反应体系温度升至35℃，加入四联转氨酶突变体酶粉2.0 g（0.01 wt）和PLP一水合物 1.3 g，采用2 mol/L NaOH溶液调节反应pH 8.5-9.0，HPLC中控跟踪反应至8.0 h时，底物4,4’-联苯丙酮酸未检出，停止反应。反应体系抽滤，将滤饼先后采用50 mM（pH 8.5）磷酸钾缓冲液500 mL和纯化水 500 mL淋洗。滤饼再使用甲醇500 mL于65℃回流热处理1小时，降至室温后抽滤，所得滤饼于60℃烘干获得产品190.8g，收率95.2%，产物HPLC有关纯度99.54%，e.e.值99.91%（图3）。

结果表明，SEQ ID NO:2所示的转氨酶四联突变体在酶催化4,4’-联苯丙酮酸中，即0.01 wt R60G-D72A-K196N-Q199L四联突变体转氨酶的反应体系中，反应8 h，转化率可达到100%，产物e.e.值达到99.9%，筛选出的R60G-D72A-K196N-Q199L四联转氨酶突变体在酶法制备D-4,4’-联苯丙氨酸中均表现出了极高的立体选择性和高效性。

Claims (7)

1.一种转氨酶突变体，其特征在于：所述的转氨酶突变体是SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的四联突变体，突变点位包括第60位R突变为G、第72位D突变为A、第196位K突变为N和第199位Q突变为L，转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。

2.根据权利要求所述的转氨酶突变体，其特征在于所述的转氨酶突变体相对应的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示。

3.一种制备沙库巴曲中间体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

S1 将4,4’-联苯丙酮酸、三水合磷酸氢二钾、pH 8.5 0.05mol/L磷酸钾缓冲液、70%异丙胺溶液和30%吐温-20溶液加入到反应体系中，将体系反应温度升至25-45℃，加入转氨酶突变体酶液和PLP一水合物，采用NaOH溶液调节反应pH 7.5-9.5，通过HPLC分析其转化率，确定反应结束；

S2 反应体系抽滤后，对滤饼先后采用pH8.5 50mmol/L磷酸钾缓冲液和纯化水淋洗，滤饼使用甲醇于65℃热处理1小时，抽滤烘干获得产品。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的S1中体系反应温度控制在30-40℃，调节反应pH在8.0-9.0范围。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的S1中的加入转氨酶突变体的量为0.01wt。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的S1中NaOH溶液的浓度为2mol/L。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的S1中体系反应温度控制在30-40℃，调节反应pH在8.0-9.0范围。

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