CN117230091B

CN117230091B - 一种亚胺还原酶ir11或其突变体及应用

Info

Publication number: CN117230091B
Application number: CN202311528667.4A
Authority: CN
Inventors: 贾知军; 魏涛; 张国庆; 李茹
Original assignee: West China Second University Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Second University Hospital of Sichuan University
Priority date: 2023-11-16
Filing date: 2023-11-16
Publication date: 2024-01-19
Anticipated expiration: 2043-11-16
Also published as: CN117230091A

Abstract

本发明涉及一种亚胺还原酶IR11或其突变体及应用，属于酶工程领域。它的基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供了一种亚胺还原酶突变体，以及一种合成((S,S)‑2,8‑二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物的方法。本发明通过使用亚胺还原酶对亚胺进行还原对其实现手性控制，可最大程度解决手性拆分过程中原料浪费的问题，能够以更高的收率得到莫西沙星关键中间体。通过酶在催化反应中具有专一性及选择性强的特点，使用亚胺还原酶的催化，可以避免使用手性原料，从简单的消旋体直接实现手性的控制，可降低成本；还避免用大量硼氢化钠或氢化铝锂等还原剂，反应后处理简单，对环境污染较小。

Description

一种亚胺还原酶IR11或其突变体及应用

技术领域

本发明提供了一种亚胺还原酶IR11或其突变体及应用，具体地，是在合成(S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物中的应用，属于酶工程领域。

背景技术

莫西沙星原研是德国拜耳公司，2002年在中国获批上市，至2018年中国公立医疗机构莫西沙星终端超过40亿元市场规模，同比增长率29.9%。为第四代喹诺酮类广谱抗菌药，莫西沙星在体外显示出对革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌、抗酸菌和非典型微生物如支原体、衣原体和军团菌有广谱抗菌活性。抗菌机制为干扰Ⅱ、Ⅳ拓扑异构酶。莫西沙星具有广谱、高效、抗耐药性强、副作用较小等优势，得到广泛的临床应用，具有很好的发展前景。

其中((S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷为最为重要的莫西沙星关键中间体。分子结构有哌啶和呲咯烷两个骨架结构和两个手性中心，已报道的制备方法主要分为两种合成路线:哌啶路线和吡咯烷路线。

目前该关键中间体在工业上主要以吡啶-2,3- 二酸为原料来制备, 经醋酐脱水，与苄胺环合后用钯碳催化加氢还原吡啶环，氢化铝锂还原酰亚胺，经 D-(-) 酒石酸拆分，在甲醇中氢解脱苄得化合物。该路线主要缺点是还原剂氢化铝锂价格昂贵，生产成本较高。另外一种路线以吡啶-2,3- 二酸为起始原料，经甲醇酯化、还原酯基后氯代，与对甲苯磺酰胺环合，用钯碳催化加氢还原吡啶环，经Ｒ-(-) -扁桃酸拆分后用氢溴酸在苯酚和乙酸中脱去对甲苯磺酰基得。该路线的主要缺点是反应步骤长，且使用工业上禁用的苯酚等试剂，反应条件苛刻，生产成本高。

也有采用N-二甲氨基丙烯亚胺和 N-甲基顺丁烯亚胺为原料合成，在该种方法中同样存在原料不易得，同时中途也会存在手性拆分的问题，造成一定的原料浪费。

另外一种手性合成路线，以4-取代的-3-吡咯烷酮为原料，通过手性苯乙胺诱导构建手性中心，然后通过转化得到(S ,S)-2 ,8-二氮杂双环 [4 ,3 ,0]壬烷。该路线起始原料的合成也不容易，手性诱导的效果也不是很好，还需要后续的结晶等进一步纯化。

目前国内外文献报道的适合工业化生产的莫西沙星关键中间体制备路线主要有下述四条：

路线一：以2，3-吡啶二甲酸为起始原料，在醋酐中与苄胺脱水环合，然后催化氢化还原吡啶，接着在NaBH4 /BF3体系还原羰基，再经酒石酸拆分和氢化脱苄得到(S ,S)-2 ,8-二氮杂双环[4,3,0]壬烷。此路线合成文献报道较多也是目前使用最广泛的路线。还原羰基时会使用大量的价格较高的还原剂NaBH4，从而导致成本较高，且后处理繁琐，同时会产生大量的固废不环保。

路线一的工艺流程为：

。

该路线需要使用手性拆分试剂，造成原料浪费。原料2-丙烯醛-二甲基腙不易得到，不易于工业生产。

路线二：通过不对称合成的方法，以3-吡咯烷酮化合物为原料，与1-氯-3-碘丙烷进行取代反应，得到的化合物酸性条件下脱去酯基，然后和(R)-1-苯乙胺进行还原氨化，再分子内缩合环化，最后催化加氢脱去保护基即可得到(S ,S)-2 ,8-二氮杂双环 [4,3,0]壬烷。此路线合成较为繁琐，原料价格昂贵，生产成本较高。

路线二的工艺流程为：

该线路中起始物料不易购买，不易于工业生产。需使用两次氢化过程，合成路线较为繁琐。

路线三：另有一篇专利公布了一种吡咯烷路线的不对称合成方法，该路线采用 R-苯乙胺手性诱导、氢化的方法构建两个手性中心,然后发生分子内关环、脱除手性辅基及保护基得到目标产物。

路线三的工艺流程为：

。

该路线中需要使用手性原料控制手性，手性原料较贵。起始物料不易购买，不易于工业生产。

当前技术缺陷在于关键手性中间体合成过程中利用手性拆分方式实现，会造成原料浪费，除此之外会使用价格较高的硼氢化钠作为还原剂，或者另外合成路线也较为繁琐，对环境污染较大。

发明内容

为了克服上述技术难题，本发明提供了一种亚胺还原酶或其突变体及应用，具体地，是在合成(S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物中的应用。

本发明提供了一种亚胺还原酶IR11，它的基因序列如SEQ ID No.2所示。它的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。

本发明还提供了一种亚胺还原酶突变体，它是所述的亚胺还原酶IR11的突变体，其包含在SEQ ID No.12所示氨基酸序列中具有下组之一或任意两种以上的组合的氨基酸取代：

将第70位的亮氨酸(L)取代为组氨酸(H)；

将第97位的天冬氨酰(N)取代为谷氨酰胺(Q)；

将第176位的亮氨酸(L)取代为丝氨酸(S)；

将第179位的甲硫氨酸(M)取代为半胱氨酸(C)；

将第214位的甲硫氨酸(M)取代为丙氨酸(A)。

本发明提供亚胺还原酶或亚胺还原酶突变体在催化合成(S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物中的应用。

其中，所述的催化合成((S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物的底物为：或/>，n=0，1，2，3…；

R可以为以下基团：乙氧羰基、甲氧羰基、叔丁氧羰基、乙酰基、苄氧羰基、9-芴基甲氧基羰基、烯丙氧羰基、2-(三甲基甲硅烷基）乙氧基羰基、对甲苯磺酰基、三氟乙酰基、三苯甲基、对甲氧基苄基。

本发明提供了一种合成((S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物的方法，它是由式I或式II的底物，与所述的亚胺还原酶或亚胺还原酶突变体，经酶法合成(S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物，其中，

所述的底物为：或/>，n=0，1，2，3…；R可以为以下基团：乙氧羰基、甲氧羰基、叔丁氧羰基、乙酰基、苄氧羰基、9-芴基甲氧基羰基、烯丙氧羰基、2-(三甲基甲硅烷基）乙氧基羰基、对甲苯磺酰基、三氟乙酰基、三苯甲基、对甲氧基苄基。

进一步地，它包括如下步骤：

a、取重组质粒转化、诱导表达亚胺还原酶（IRED）或亚胺还原酶（IRED）突变体、葡萄糖脱氢酶（GDH）；

b、加入葡萄糖、NADP钠盐、底物，在室温下振荡反应，即得。

其中，所述的底物的合成路线是：

。

本发明的有益效果是：

本发明利用生物信息学方法在蛋白数据库中获得的亚胺还原酶，基因合成后利用大肠杆菌作为宿主，成功高效表达了这些亚胺还原酶。利用这些亚胺还原酶及其突变体酶重组菌作为生物催化剂，以化学合成的中间体6为底物，获得高对映体选择性的目标产物莫西沙星手性侧链(S ,S)-2,8-二氮杂双环 [4，3，0]壬烷，而且转化时间短，所用生物催化剂用量少，制备方法简单方便、条件温和、环境友好。此外，本发明莫西沙星手性中间体合成路线步骤少，中间体6合成过程中使用的原料价格便宜易从市场获得。本发明通过使用亚胺还原酶对亚胺进行还原对其实现手性控制，可最大程度解决手性拆分过程中原料浪费的问题，能够以更高的收率得到莫西沙星关键中间体。通过酶在催化反应中具有专一性及选择性强的特点，使用亚胺还原酶的催化，可以避免使用手性原料，从简单的消旋体直接实现手性的控制，可降低成本；还避免用大量硼氢化钠或氢化铝锂等还原剂，反应后处理简单，对环境污染较小。

具体实施方式

本发明是通过化学法和酶法两个步骤实现的，其中化学方法用于为酶促反应提供底物。酶促反应使用的10种亚胺还原酶编号及对应的物种来源、氨基酸序列编号、基因序列编号如下表所示。

酶编号	物种来源	基因序列编号	氨基酸序列编号
				IR1	Aspergillus lentulus	SEQ ID No.1	SEQ ID No.11
IR11	Amycolatopsis regifaucium	SEQ ID No.2	SEQ ID No.12
				IR3	Myxococcus fulvus 124B02	SEQ ID No.3	SEQ ID No.13
IR4	Streptomyces viridochromogenes	SEQ ID No.4	SEQ ID No.14
				IR5	Streptomyces toyocaensis	SEQ ID No.5	SEQ ID No.15
IR6	Paenibacillus beijingensis	SEQ ID No.6	SEQ ID No.16
				IR7	Streptomyces viridochromogenes	SEQ ID No.7	SEQ ID No.17
IR8	Streptomyces coelicoflavus ZG0656	SEQ ID No.8	SEQ ID No.18
				IR9	Micromonospora	SEQ ID No.9	SEQ ID No.19
IR10	Myxococcus stipitatus	SEQ ID No.10	SEQ ID No.20

其中，SEQ ID No.2的序列表如下：

ATGACGGAAC ACGGTAAAAC TCCTGTTACG GTGCTGGGCC TGGGTGCAAT GGGTACCGCGCTGGTGGAAG CGCTGCTGGC AGCGGGTCAC CCTGTGACGG CTTGGAACCG TACCGCAAGC CGTGCTGAAGGTGTAGCAGC TAAGGGCGCG TCTGTCGCTA GCACCGTGTC CGAAGCGCTG GCGGCGAATA AAACTGTTATCGCCTGCCTG CTGGACTACG ACTCCGTACA CGAAGTGCTG GATCCGGTTG CAAGCGGCCT GGAAGGTCGCCAGCTGATTA ACCTGACCAA CGGCACGCCT GGTCAAGCCC GTGAAATGTC TGCATGGGCA GAAGAGCTGGGCGCAGAATA CCTGGACGGT GGTATTATGG CGGTACCTCC AATGATCGGC ACCCCGGGTG CCTTCATTTTTTACTCCGGC TCTGGCACCG TATTCGGTCA GGCGCGTACT GCACTGGACA CCTTCGGCGG CGTCAACTACCTGGGTGCGG ATCCGGGCCT GGCACCTCTG CATGATATCG CGCTGCTGTC TGGCATGTAC GGTAACTTCATCGGTGTGAT CCAAGCATTC GCGCTGGTTG GTTCTGCTGG CGTCAAAGCG CGTGAATTCG CCCCGCTGCTGCGTGGTTGG ATGGATGCGA TGTCCGGCTT CCTGGAACGT ACCGCAGAAC TGATCGACGA TGGCGACTACGAACGCGGCG TAGTGTCCAA CATCGGCATG CAGGCGGCTG CTTTTCCGAA CCTGGCGAAG GCTGCTGAAGAACAGGGCAT CTCTGCTGAA CTGCTGGCGC CTCTGCAGCC GCTGATGGAT AAACGTGTAG CTGCGGGTCACGGTGCAGAA GACCTGGTTG GTGTGATCGA ACTGCTGAAA AAA

SEQ ID No.12的序列表如下：

MTEHGKTPVT VLGLGAMGTA LVEALLAAGH PVTAWNRTAS RAEGVAAKGA SVASTVSEALAANKTVIACL LDYDSVHEVL DPVASGLEGR QLINLTNGTP GQAREMSAWA EELGAEYLDG GIMAVPPMIGTPGAFIFYSG SGTVFGQART ALDTFGGVNY LGADPGLAPL HDIALLSGMY GNFIGVIQAF ALVGSAGVKAREFAPLLRGW MDAMSGFLER TAELIDDGDY ERGVVSNIGM QAAAFPNLAK AAEEQGISAE LLAPLQPLMDKRVAAGHGAE DLVGVIELLK K

本发明提供了亚胺还原酶催化底物中间体5的合成路线。

该合成路线包括以下步骤：（1）使用丙烯酸乙酯和甘氨酸乙酯盐酸盐为原料，通过迈克尔加成得到中间体2；（2）随后使用苄基对氮原子保护得中间体3；（3）中间体3在碱的作用下关环得中间体4；（4）随后与N-Boc溴丙胺加成得中间体5；（5）最后在浓盐酸条件下，脱除酯基和叔丁氧羰基可得亚胺/烯胺混合物6。该烯胺混合物6，通过亚胺还原酶实现手性控制得到中间体7。

具体实施过程：

中间体2的合成：称取4.187克甘氨酸乙酯加入反应瓶，随后加入乙醇35毫升，冰浴下搅拌10分钟，加入8.34毫升三乙胺，室温下搅拌10分钟，随后加入丙烯酸乙酯3.91毫升，室温下反应，反应完成后，浓缩反应液，加入水15毫升，乙醚15毫升，萃取三次，浓缩有机层，依次用5%柠檬酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，浓缩有机层得中间体2。收率96.8%。

中间体3的合成：称取2.856克中间体2溶于20毫升乙腈，依次加入2.318克碳酸钾，23.24毫克碘化钾搅拌。另取10毫升乙腈溶解2.116克苄氯，滴加，室温反应。反应完成后，过滤，浓缩反应液，加入60毫升水和60毫升乙酸乙酯，调节pH至7萃取，浓缩有机层得中间体3，收率82.4%。

中间体4的合成：称取7克中间体3溶于25毫升四氢呋喃中，冰浴下搅拌，在氮气条件下，分批次加入3.212克叔丁醇钾。随后移至室温反应，反应完成后，过滤，浓缩得粗品，无需进一步纯化直接投入下一步反应。

中间体5的合成：称取1克中间体4用15毫升四氢呋喃溶解，依次加入614毫克碳酸钾，25.79毫克四丁基溴化铵，1.06克N-Boc溴丙胺，45摄氏度下反应。反应完成后柱层析得中间体4，收率32%。

中间体6的合成：称取677mg中间体5，加入10毫升浓盐酸，110℃下回流反应，反应完成后浓缩反应液得黑色固体为中间体6-A和中间体6-B混合物。

与6-A和6-B类似的底物也有相同的反应情况：

或/>

n=0，1，2，3…；R可以为以下基团：

乙氧羰基	COOEt
		甲氧羰基	COOMe
叔丁氧羰基	Boc
		乙酰基	Ac
苄氧羰基	Cbz
		9-芴基甲氧基羰基	Fmoc
烯丙氧羰基	Alloc
		2-(三甲基甲硅烷基）乙氧基羰基	SEM
对甲苯磺酰基	Ts
		三氟乙酰基	Tfa
三苯甲基	Trt
		对甲氧基苄基	PMB

以上化合物均可通过一步简单的氮原子上保护基实现。

手性产物(S ,S)-2 ,8-二氮杂双环 [4,3,0]壬烷的酶法合成：

1：亚胺还原酶基因的合成和基因工程菌的构建

1.1亚胺还原酶基因的合成

根据现有已公开的基因数据，包括数据库及已发表文献，构建了包含10个不同来源的亚胺还原酶的基因库。根据其编码蛋白序列，优化密码子使其易于在大肠杆菌工程菌株（BL21(DE3)）中表达，将合成后的基因构建到表达载体pET28a（+）中，基因插入位点为NdeI和XhoI。

1.2 重组质粒的转化

(1)取1mL重组质粒加入到50mL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置30min。

(2)42℃水浴热激45-60s，迅速转移至冰浴中，静置2min。

(3)加入不含抗生素的LB液体培养基500mL，200rpm，37℃复苏60min。

(4)取100mL菌液涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基表面，平板倒置，37℃培养12～16h至单菌落出现。

2：工程菌的诱导表达

用接种环挑取亚胺还原酶IRED基因工程菌单菌落接种到50mL培养基中，培养基为LB液体培养基(配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10 g/L)。接种后的种子液在37℃，200rpm培养10-16小时。将培养后的种子液以5%的接种比例转接到TB培养基（配方为：胰蛋白胨12g/L，酵提取物24g/L， K₂HPO₄9.4g/L、KH₂PO₄2.2g/L，甘油4mL/L）中，22℃，200 rpm培养20h。培养液4000rpm离心20min，弃掉上清，收集菌体。

包含pET21b-GDH载体的大肠杆菌工程菌（BL21(DE3)）用于表达葡萄糖脱氢酶（GDH），该葡萄糖脱氢酶基因来源于Bacillus megaterium，密码子优化的核酸序列为SEQID No.21，氨基酸序列为SEQ ID No.22。同样地，用接种环挑取葡萄糖脱氢酶基因工程菌单菌落接种到50mL培养基中，培养基为LB液体培养基。接种后的种子液在37℃，200 rpm培养10-16h。将培养后的种子液以5%的接种比例转接到TB培养基中，22℃，200rpm培养20h。培养液4000rpm离心20min，弃掉上清，收集菌体。

3：亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共同作用转化莫西沙星手性中间体的方法

按照上述2中的方法分别诱导表达亚胺还原酶（IRED）和葡萄糖脱氢酶（GDH），离心后收获大肠杆菌细胞并分别用Kpi buffer (用K₂HPO₄ 和KH₂PO₄配制_，pH7.0)重悬，调整菌液重悬液的浓度至OD₆₀₀≈30，GDH菌液用高压匀质仪破碎（压力700bar，破碎时间10min）。催化反应时在1mL反应体系中的组分浓度如下表：

	IRED酶液	GDH酶液	葡萄糖	NADP钠盐	底物6
						浓度	OD₆₀₀≈10	OD₆₀₀≈10	50mM	0.5mM	5mM

反应在pH7.0, 30℃条件下进行，600rpm振荡反应12h，反应结束后取样，用三倍体积乙醇稀释后在LC-MS上检测反应情况。

10个亚胺还原酶中有3个表现出催化底物6生成产物7的活性，其中IR11催化底物6生成产物7的产率达到46%，ee值(即对映体过量,enantiomeric excess)达到99%；IR3和IR9虽然也有较好产物选择性，但是催化活性较低（≤10%），其余的酶则完全无法检测到催化活性，如下表所示：

	产率	ee
			IR1	N/A	N/A
IR3	7%	>99%
			IR4	N/A	N/A
IR5	N/A	N/A
			IR6	N/A	N/A
IR7	N/A	N/A
			IR8	N/A	N/A
IR9	10%	>99%
			IR10	N/A	N/A
IR11	46%	>99%

“N/A”表示对应数据无法检测或计算得到

4：亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共同作用转化莫西沙星手性中间体的方法

按照上述2中的方法分别诱导表达亚胺还原酶（IRED）和葡萄糖脱氢酶（GDH），离心后收获大肠杆菌细胞并分别用Kpi buffer (用K₂HPO₄和KH₂PO₄配制_，pH7.0)重悬，调整菌液重悬液的浓度至20mg/ml，GDH菌液用高压匀质仪破碎（压力700bar，破碎时间10min）。催化反应时：在三角玻璃瓶中加加入IRED酶液50mL，GDH酶液50mL，葡萄糖0.9g，NADP钠盐38mg，最后投入100mg底物6。在温度30℃下，250rpm振荡反应12h，反应结束后将反应液调节pH至9.0，用乙酸乙酯萃取，过柱分离并旋干后得到产物，3种IRED酶的催化分离产率如下表：

	产率	ee
			IR11	50%	>99%
IR3	11%	95%
			IR9	8%	>99%

5：亚胺还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共同作用转化莫西沙星手性中间体的方法

通过技术手段对酶进行改造，优化其功能，甚至创造全新的、自然界中不存在的功能，具有重要的研究价值和社会效益。实现此目标的策略中最突出的就是定向进化（Directed Evolution）。这里用定向进化方法对所筛选到的亚胺还原酶（IRED）进行定向改造，以提高其催化活性。选择活性和选择性最好的IR11做进一步的改造，首先利用AlphaFold2蛋白结构预测工具对亚胺还原酶IR11的三维结构进行了预测，并用分子对接技术对酶和底物以及NADPH进行了对接，根据对接所得空间分布，分析了可能与催化活性有关的残基位点（最终获得23个候选位点：MET17/CYS69/LEU70/LEU95/THR96/ASN97/GLY98/GLY120/GLY121/ILE122/MET123/ALA124/VAL125/ASP172/LEU176/MET179/TYR180/PHE183/TRP210/MET214/SER236/MET240/GLN241）。进一步地，对这些位点进行点饱和突变构建突变体文库，并对各突变体再次进行催化活性鉴定，突变体文库包含约2300个突变子。

按照上述2中的方法分别诱导表达各亚胺还原酶（IRED）突变体和葡萄糖脱氢酶（GDH），离心后收获大肠杆菌细胞并分别用Kpi buffer (用K₂HPO₄和KH₂PO₄配制_，pH7.0)重悬，GDH菌液用高压匀质仪破碎（压力700bar，破碎时间10min）。催化反应时600mL反应体积中各组分浓度分别为IRED酶液OD600≈10，GDH酶液OD600≈10，葡萄糖50mM，NADP钠盐0.5mM，底物6浓度5mM。在温度30℃下，250rpm振荡反应12h，反应结束后取样，用三倍体积乙醇稀释后在LC-MS上检测反应情况。

在含约2300个突变体的库中，大多数位点突变对于IR11的活性没有提高，其中有些突变会导致酶活性降低或者完全失活，有一些突变体与亲本相比活性基本不变或者变化不显著；只有部分位点中的少数突变体会使酶活性有较显著的提高，如下表所示：

综上所述，本发明通过特定的亚胺还原酶突变体，可实现手性控制，产率高，成本低。

Claims

1.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于：它是在SEQ ID No.12所示氨基酸序列的基础上进行如下六种方式氨基酸取代得到的突变体：

将第70位的亮氨酸取代为组氨酸、

将第97位的天冬氨酰取代为谷氨酰胺、

将第176位的亮氨酸取代为丝氨酸、

将第179位的甲硫氨酸取代为半胱氨酸、

将第214位的甲硫氨酸取代为丙氨酸或

将第70位的亮氨酸取代为组氨酸并同时将第179位的甲硫氨酸取代为半胱氨酸。

2.亚胺还原酶IR11或权利要求1所述的亚胺还原酶突变体在催化合成(S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物中的应用；所述的催化合成((S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物的底物为：

和/>；所述的亚胺还原酶IR11的氨基酸序列如SEQ ID No .12所示。

3.一种合成((S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物的方法，其特征在于：它是由权利要求2中所述的式6-A和式6-B为底物，与亚胺还原酶IR11或权利要求1所述的亚胺还原酶突变体，经酶法合成(S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物。

4.根据权利要求3所述的合成((S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

a、取重组质粒转化、诱导表达亚胺还原酶或亚胺还原酶突变体、葡萄糖脱氢酶；

5.根据权利要求3或4所述的合成((S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物的方法，其特征在于：所述的底物的合成路线是：

。