CN110819601A

CN110819601A - 还原胺化酶、编码基因、重组载体、重组细胞及其应用

Info

Publication number: CN110819601A
Application number: CN201911064851.1A
Authority: CN
Inventors: 刘平; 许国超; 郭曼; 郑香玉; 陈玄皂; 薛佳钰; 倪晔; 窦哲; 孙泽文
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2039-11-04
Also published as: CN110819601B

Abstract

本发明公开了一种还原胺化酶、编码基因、重组载体、重组细胞及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的还原胺化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有还原胺化酶活性的氨基酸序列。本发明重组表达的可溶性SsRA酶具有表达水平高、酶活力高等优点，可用于高效制备(S)‑(4’‑氯苯基)‑(吡啶‑2’‑基)‑甲胺等目前生物催化难以制备的手性双芳基仲胺，经济性高，制备方法简单，反应条件温和，低耗能，对环境友好，副反应少，只需一步还原即可完成。

Description

还原胺化酶、编码基因、重组载体、重组细胞及其应用

技术领域

本发明涉及一种还原胺化酶、编码基因、重组载体、重组细胞及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

手性仲胺是一类非常重要的化合物，市售的药物中有40％含有手性仲胺基团。由于手性双芳基仲胺具有两个芳基，可以衍生获得更多具有药用价值的结构，其中手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲胺(CPMAm)可用于合成抗过敏药贝托斯汀。目前，贝托斯汀的合成主要通过(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，主要包括以下合成工艺：

(1)化学法：以(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮(CPMK)为原料， (S)-[Ru(BINAP)Cl₂]₂(NEt₃)为催化剂，加压，通氢气，还原得到(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇((S)-CPMA)(赵志全等.中国医药工业杂志.2006.37,726-727)。以手性BINAL-H为手性还原剂，定向合成单一构型(S)-CPMA。

(2)生物法：2007年，Truppo等筛选发现KRED124可以不对称还原CPMK 生成(R)-CPMA，ee值为94％(Org.Lett.,2007,9,335–338)；2009年，朱敦明等发现来源于Sporobolomyces salmonicolor的重组羰基还原酶SsCR不对称还原 CPMK生成(R)-CPMA，ee值为88％(Org.Lett.,2008,10,525–528)；2016年，淮阴师范大学许家兴等发现Cryptococcus sp.在10％[C₂mim][(MeO)HPO₂]存在时，产物(S)-CPMA的ee最高可达99％(Chem.Eng.J.,2017,316,919-927)； 2018年，本实验室对前期筛选得到的醇脱氢酶进行了分子改造，使其还原CPMK 的立体选择性提高至99.5％(R)及反转至97.8(S)，并在500mM水平进行了高效不对称还原(J.Am.Chem.Soc.,2018,140,12645-12654)。

上述合成方法中，化学法所需贵金属配位体成本较高、反应条件苛刻，生物法存在立体选择性不足、催化效率一般等瓶颈问题，并且均需要将羟基进一步经胺基衍生化获得带有手性胺的终产品。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种还原胺化酶，可催化CPMK的不对称还原胺化合成手性CPMAm，实现一步法由前手性酮底物合成手性双芳基胺。本发明提供了一种具有优异的不对称还原胺化活性、底物谱广、胺基供体范围宽、对环境友好的还原胺化酶及其编码基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，重组酶的制备方法，以及该重组酶在制备手性双芳基仲胺化合物中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种还原胺化酶(SsRA)，所述的还原胺化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有还原胺化酶活性的氨基酸序列。

进一步地，本发明所述还原胺化酶的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为：将编码所述还原胺化酶并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，经镍柱亲和层析分离纯化获得所述蛋白质。

进一步地，所述的还原胺化酶SsRA是NADPH依赖的，分子量大小为75～ 80kDa，是同源二聚体；该酶可以催化还原双芳基酮底物，最适反应pH为9.0，最适反应温度为50℃，该酶不依赖于金属离子发挥催化功能。

本发明的第二个目的是提供所述的还原胺化酶的编码基因，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或对SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的一个或多个碱基进行替换、缺失或增加得到的编码具有所述的还原胺化酶活性的核苷酸序列。

进一步地，本发明的还原胺化酶的编码基因来源于稀疏链霉菌 (Streptomycessparsogenes DSM 40356)，命名为ssrah，基因全长为873bp，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第873个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，序列内无内含子。

进一步地，所述的还原胺化酶的编码基因制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳地包括：从自然界中提取天然存在的编码还原胺化酶的核酸分子，通过基因克隆技术获得编码还原胺化酶编码基因的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码还原胺化酶的核酸分子。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述的还原胺化酶编码基因的表达载体。

进一步地，所述的表达载体是将本发明所述的还原胺化酶基因的编码基因连接于载体上构建而成。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，本发明所述载体优选地为pET28a(+)。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述的还原胺化酶的重组细胞。

进一步地，所述的重组细胞的宿主为细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞。

进一步地，所述的重组细胞是将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的还原胺化酶基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠杆菌(Escherichia coli)，更加的为大肠杆菌BL21(DE3)将前述重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法或电转法。

本发明的第五个目的是提供一种利用所述的重组细胞制备还原胺化酶的方法，包括如下步骤：将上述重组大肠杆菌接种至含有卡那霉素(50μg/mL)的 LB培养基中，35～38℃，150～200rpm培养，培养液的吸光密度OD₆₀₀达到0.5～1.0 (优选0.8)，加入0.05～1.0mmol/L(优选地为0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为16～30℃(优选25℃)，诱导 6～12小时即可得到高效表达的重组还原胺化酶。

本发明的第六个目的是提供所述的还原胺化酶或重组细胞在催化合成手性双芳基胺中的应用。

进一步地，所述的应用具体是以还原胺化酶或重组细胞作为催化剂，在氨基供体和NADP⁺存在的情况下，催化潜手性双芳基酮合成手性双芳基胺；

所述的手性双芳基酮为如式1、式2或式3所示的化合物：

式1：

式2：式3：

其中R₁为2’-Cl，3’-Cl及4’-Cl、；R₂为2’-Cl，3’-Cl及4’-Cl、；R₃为H 及4’-Cl；R为phenyl，benzyl及furyl；

所述的氨基供体为如式4所示的化合物：

式4：R₀-NH₂；其中，R₀为H，CH₃，CH₃CH₂，CH₃(CH₂)₂，CH₃(CH₂)₃， propargyl，allyl或者cyclopropyl。

进一步地，在所述的应用中，所述的潜手性双芳基酮的含量为10～100 mmol/L，所述的还原胺化酶的用量为1～10kU/L，所述的NADP⁺的用量为 0.1～1.0mmol/L，反应温度为20～35℃。

进一步地，在所述的应用中，还包括以Tris-HCl为缓冲液，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH 9.0。

进一步地，NADPH采用葡萄糖脱氢酶和葡萄糖反应提供，葡萄糖脱氢酶的用量为1～10kU/L；葡萄糖的用量为20～200mmol/L。

本发明的有益效果是：

本发明重组表达的可溶性SsRA酶具有表达水平高、酶活力高等优点，可用于高效制备(S)-(4’-氯苯基)-(吡啶-2’-基)-甲胺等目前生物催化难以制备的手性双芳基仲胺，经济性高，制备方法简单，反应条件温和，低耗能，对环境友好，副反应少，只需一步还原即可完成。

附图说明

图1为重组表达质粒pET28-ssra的构建示意图；

图2为重组还原胺化酶SsRA的蛋白电泳图；其中，M，Marker；泳道1 和2分别为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-ssra诱导后细胞破碎上清和沉淀部分。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

除非另有注明具体条件，各实施例中的试验方法均按照常规方法和条件或按照试剂说明书进行。除非另有明确标注，各组分的含量均以质量/体积(w/v)含量表示。表达质粒pET28a购于上海Novagen公司。限制性内切酶、PrimeSTAR 和T4DNA连接酶购于大连宝生物有限公司，E.coli BL21(DE3)感受态细胞、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒均购自上海捷瑞生物工程有限公司。

反应过程中取样检测：取100μL反应液，加入500μL乙酸乙酯，震荡2min， 12000rpm离心5min，取上清到离心管中，待有机相自然会发完全，加入500 μL分析纯的乙醇，进行液相分析转化率和ee值，具体条件如：Daicel Chiralcel OB-H(5μm，250mm×4.6mm)液相色谱柱，流动相为正己烷:乙醇:乙醇胺 (90:10:0.01，v/v/v)，流速0.8mL/min，柱温30℃，紫外检测波长254nm，进样量10μL，保留时间：(S)-(4’-氯苯基)-(吡啶-2’-基)-甲胺8.67min，(R)-(4’- 氯苯基)-(吡啶-2’-基)-甲胺9.37min。

产物光学纯度通过对映体过量值(ee)来评价:

A_S：液相色谱分析获得的(S)-CPMAm的摩尔浓度；A_R：液相色谱分析获得的(R)-CPMAm摩尔浓度。

实施例1：还原胺化酶基因的克隆

采用基因挖掘的策略克隆了10个来源于不同放线菌的假定蛋白，通过活性测定和比较后发现来源于稀疏链霉菌具有最高的催化活性。具体操作如下：

(1)首先使用高氏一号培养基，于30℃下过夜培养上述放线菌，离心获得菌体后使用常规细菌基因组提取试剂盒获得基因组总DNA。

(2)以上述基因组DNA为模板进行PCR，体系如下：ddH₂O 21μL，5× PrimeSTARBuffer10μL，上游引物SEQ ID NO.3(GGGAATTCCATATGAGC AACACCCCCGTGAC)1μL，下游引物SEQ ID NO.4(CGCGGATCCCTAG GCCCGGGTGCGGAGCA)1μL，基因组DNA 1μL，dNTP 5μL，PrimeSTAR DNA聚合酶1.0μL。PCR程序为：95℃预变性10min，95℃裂解30s，55℃ 退火30s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，并利用琼脂糖胶回收试剂盒回收目的条带(图1)，即还原胺化酶基因。所得还原胺化酶基因命名为ssra，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：全长873bp，其起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。序列中无内含子，编码序列从第1个核苷酸起至873个核苷酸止，所编码的蛋白质序列如SEQ IDNo.2所示。

实施例2：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-ssra的构建及培养

将实施例1回收的基因ssra与质粒pET28a分别用限制性内切酶NdeI和 BamH I于37℃水浴中过夜双酶切，次日经琼脂糖凝胶电泳纯化并利用琼脂糖回收试剂盒回收目标片段。4℃下，使用T₄ DNA连接酶过夜连接酶切过的基因 ssra与质粒pET28a，即得重组表达载体pET28a-ssra(图1)。将构建好的重组表达载体pET28a-ssra热转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，涂布Kan抗性LB 固体平板，过夜培养后进行菌落PCR验证，阳性克隆子即为重组大肠杆菌 BL21(DE3)/pET28a-ssra。挑取阳性克隆子于LB培养基中过夜培养，次日按2％转接量转接入新鲜LB培养中，培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入0.2mM IPTG，30℃诱导培养6小时后，4℃、8000r/min离心10min收集菌体。将收集好的菌体悬浮于磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.0)中，超声破碎，并通过 SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(图2)。由图2可知，上清液中目标位置有蛋白可溶高表达，说明重组还原胺化酶在大肠杆菌中得到成功表达。

实施例3：还原胺化酶的分离纯化

悬浮培养好的重组细胞于A液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl， 20mmol·L^-1咪唑，pH 7.4)中，超声波破碎离心后获得粗酶液。纯化所使用的柱子为亲和柱HisTrapFF crude(镍柱)，利用重组蛋白上的组氨酸标签进行亲和结合来完成。首先使用A液将镍柱平衡，粗酶液上样，继续使用A液将穿透峰洗脱下来，待平衡后用B液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，1000 mmol·L^-1咪唑，pH 7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得重组还原胺化酶。对纯化后的蛋白进行酶活力测定(CPMK为底物，NADPH 为辅酶)及SDS-PAGE分析。纯化各项参数如表1。镍柱纯化后，在40kDa左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明镍柱纯化效果较好。之后使用HiTrap Desalting脱盐柱(GEHealthcare)将纯化后的还原胺化酶置换到Tris–HCl(100 mmol·L^-1，pH 9.0)缓冲液中，进行下一步酶学性质分析。

还原胺化酶的酶活力单位1U定义为：在一定条件下，每分钟催化氧化1 μmol NAD(P)H或每还原1μmol NADP⁺所需要的酶量。总反应体系为200μL，包括：0.5mmol·L^-1NADPH，5mmol·L^-1酮类底物，Tris-HCl缓冲液(100 mmol·L^-1，pH 9.0)，充分混匀，30℃保温2min，加入适量的酶液，检测340 nm下吸收值的变化。

表1蛋白纯化后酶活力测定

实施例4：最适反应pH

配制100mmol·L^-1不同pH的缓冲液:柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0～6.0)、磷酸钠缓冲液(pH 6.0～8.0)、Tris-HCl缓冲液(pH 8.0～10.0)。然后分别以CPMK 为底物，测定SsRA在不同pH缓冲液中的酶活力。最高酶活力定为100％，其他pH下测得的酶活力以相对于最高活力的百分比计算。结果分析所示，还原胺化反应的最适pH为9.0。

实施例5：最适反应温度

分别以CPMK为底物，测定SsRA在不同温度(4～60℃)下的酶活力，测得的最高酶活力定为100％，其他温度下测得的酶活力以相对于最高活力的百分比计算。结果分析显示，SsRA的最适温度为50℃。

实施例6：动力学参数分析

测定SsRA在不同底物浓度和辅酶浓度情况下的活力，并根据活力和底物浓度的倒数做出双倒数曲线，计算动力学参数。动力学参数如下表所示：

表2还原胺化酶SsRA的动力学参数

实施例7：金属离子和添加剂对酶活力的影响

将终浓度为1mmol·L^-1的氯化盐或者硫酸盐形式的金属离子加入到纯化后酶液中，于30℃下温育30min后，在Tris-HCl缓冲液(100mmol·L^-1，pH 9.0) 中以CPMK为底物测定其残余酶活。同等条件下，不加任何金属离子测得的酶活力定为100％对照，加入金属离子测得的酶活力以对照的百分比换算。结果如表4所示。

表3金属离子及添加剂对SsRA催化活性的影响

没有发现具有显著激活SsRA活力的金属离子。Mg²⁺、Ni²⁺、Ba²⁺、Co²⁺、 Mn²⁺、Ca²⁺、Li⁺等离子对SsRA的活力具有轻微的激活作用；Zn²⁺、Al³⁺、Cu²⁺、 Ag²⁺、Fe²⁺等离子对SsRA的还原活力都具有严重的抑制作用。EDTA的添加并没有使酶活力降低，从另一方面说明SsRA不是金属离子依赖性酶。蛋白变性剂SDS的添加导致酶解聚成单体，而单体仅保留有8％的相对活力，说明SsRAH 的活性依赖于多聚体。吐温20、DTT、β-巯基乙醇的添加可在一定程度上促进 SsRA的催化活力。

实施例8：还原胺化酶SsRA不对称还原前酮的转化率及选择性分析

测定还原胺化酶SsRA不对称还原不同前手性酮底物的效果，其中底物浓度为10mmol/L，重组还原胺化酶的用量为100U/L(酶活力定义见实施例3)，葡萄糖的用量为20mmol/L，葡萄糖脱氢酶的用量为100U/L，NADP⁺的用量为 0.1mmol/L，Tris-HCl缓冲液的浓度为100mmol·L^-1，pH 9.0。不对称还原反应的温度为30℃，反应12小时。转化率及选择性分析方法如下：取100μL反应液，加入500μL乙酸乙酯，震荡2min，12000rpm离心5min，取上清到离心管中，待有机相自然会发完全，加入500μL分析纯的乙醇，进行液相分析转化率和ee值，具体条件如：Daicel Chiralcel OB-H(5μm，250mm×4.6mm)液相色谱柱，流动相为正己烷:乙醇:乙醇胺(90:10:0.01，v/v/v)，流速0.8mL/min，柱温30℃，紫外检测波长254nm，进样10μL。结果如表4所示。

表4还原胺化酶SsRA不对称还原酮底物的转化率分析

实施例9：重组还原胺化酶SsRA催化CPMK的不对称还原胺化反应

于10mL Tris-HCl缓冲液(100mmol·L^-1，pH7.0)中加入实施例2所得的菌体10kU/L，100mmol·L^-1的CPMK(溶解于乙醇)500μL，在30℃，200rpm 反应12h。

每隔一段时间取样100μL，加入400μL PBS(100mmol·L^-1，pH 7.0)缓冲液和500μL乙酸乙酯萃取，取出上层有机相，待有机相自然挥发完全，加入 HPLC级的乙醇，进行正相HPLC检测。具体条件如：Daicel Chiralcel OB-H液相色谱柱，流动相为正己烷:乙醇:乙醇胺(90:10:0.01，v/v/v)，流速0.8mL/min，柱温30℃，紫外检测波长254nm，进样量10μL。由表5可以看出，反应10 小时，转化率达到99.8％，从开始反应到反应结束，产物ee值都保持在82.3％。

表5重组还原胺化酶SsRA催化CPMK不对称还原胺化反应进程表

反应时间/h	转化率/％	ee/％
			0.5	19.5	82.3
1	37.2	82.3
			2	59.4	82.3
3	82.5	82.3
			4	92.8	82.3
5	96.2	82.3
			6	98.5	82.3
8	99.6	82.3
			10	99.8	82.3

反应结束后用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠，干燥过夜，减压旋转蒸发获得(S)-CPMAm。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 还原胺化酶、编码基因、重组载体、重组细胞及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 873

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgagcaaca cccccgtgac cgtcctcggc ctgggcgaca tgggcagggc actggcccgc 60

gccctgctga aggcgggaca ccgcaccacc gtctggaacc gcacggccgc caaggccgaa 120

gcgctcgtcg ccgagggcgc gctgcgcgcg gagacggtcg ccgaggccgt cgcggcgagc 180

ccgctggtgg tggtgtgcct gctggactac gactccgtgc ggcagaccct cgacccggtg 240

gccggggcgc tgtccggcac ggccgtggcc aacctgacca gcggaacccc gcgccaggcc 300

cgcgagatgg ccgcatgggc ggcggagcgc ggcgccgact acctcgacgg cggcatcatg 360

gccgtccccc cgatgatcgc cacccccgcc gccttcgtgc tctacagcgg atcgcggagc 420

gtcttcgaga cccaccgggc ggcgctcgac gccctggcgc agagccacta cctgggcgag 480

gacgccgcgc tggcccccct tcaggacatc gccctgctca gcgggatgta cggcatgttc 540

tccggcatcc tgcacgcctt cgcgctcacc ggcagcgagg gcatcaaggc ggccgacttc 600

gcgccgatgc tccagcgctg gctgaacagc atgtcgggcg ccgtggccgg cttcgccgcg 660

cagatcgaca gcggcgacca cgcccagggc gtggtctcca acctcgccat gcaggcggcc 720

gcctaccacc acctcctgga ggccgcggag gagcagggcg tcagccccga actcctcgcc 780

ccgctcgggc cgctcatggc ccgccgcgtc gcggacggcc acggccacga ggacctgtcg 840

ggcctggtgc acctgctccg cacccgggcc tag 873

<210> 2

<211> 290

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Met Ser Asn Thr Pro Val Thr Val Leu Gly Leu Gly Asp Met Gly Arg

1 5 10 15

Ala Leu Ala Arg Ala Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Thr Thr Val Trp

20 25 30

Asn Arg Thr Ala Ala Lys Ala Glu Ala Leu Val Ala Glu Gly Ala Leu

35 40 45

Arg Ala Glu Thr Val Ala Glu Ala Val Ala Ala Ser Pro Leu Val Val

50 55 60

Val Cys Leu Leu Asp Tyr Asp Ser Val Arg Gln Thr Leu Asp Pro Val

65 70 75 80

Ala Gly Ala Leu Ser Gly Thr Ala Val Ala Asn Leu Thr Ser Gly Thr

85 90 95

Pro Arg Gln Ala Arg Glu Met Ala Ala Trp Ala Ala Glu Arg Gly Ala

100 105 110

Asp Tyr Leu Asp Gly Gly Ile Met Ala Val Pro Pro Met Ile Ala Thr

115 120 125

Pro Ala Ala Phe Val Leu Tyr Ser Gly Ser Arg Ser Val Phe Glu Thr

130 135 140

His Arg Ala Ala Leu Asp Ala Leu Ala Gln Ser His Tyr Leu Gly Glu

145 150 155 160

Asp Ala Ala Leu Ala Pro Leu Gln Asp Ile Ala Leu Leu Ser Gly Met

165 170 175

Tyr Gly Met Phe Ser Gly Ile Leu His Ala Phe Ala Leu Thr Gly Ser

180 185 190

Glu Gly Ile Lys Ala Ala Asp Phe Ala Pro Met Leu Gln Arg Trp Leu

195 200 205

Asn Ser Met Ser Gly Ala Val Ala Gly Phe Ala Ala Gln Ile Asp Ser

210 215 220

Gly Asp His Ala Gln Gly Val Val Ser Asn Leu Ala Met Gln Ala Ala

225 230 235 240

Ala Tyr His His Leu Leu Glu Ala Ala Glu Glu Gln Gly Val Ser Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Ala Pro Leu Gly Pro Leu Met Ala Arg Arg Val Ala Asp

260 265 270

Gly His Gly His Glu Asp Leu Ser Gly Leu Val His Leu Leu Arg Thr

275 280 285

Arg Ala

290

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

gggaattcca tatgagcaac acccccgtga c 31

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

cgcggatccc taggcccggg tgcggagca 29

Claims

1.一种还原胺化酶，其特征在于，所述的还原胺化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有还原胺化酶活性的氨基酸序列。

2.一种权利要求1所述的还原胺化酶的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或对SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的一个或多个碱基进行替换、缺失或增加得到的编码具有所述的还原胺化酶活性的核苷酸序列。

3.一种携带权利要求2所述的还原胺化酶编码基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。

5.一种表达权利要求1所述的还原胺化酶的重组细胞。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述的重组细胞的宿主为细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞。

7.一种利用权利要求5所述的重组细胞制备还原胺化酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述的重组细胞接种至含有卡那霉素的LB培养基中，35～38℃，150～200rpm培养，培养液的吸光密度OD₆₀₀达到0.5～1.0，加入0.05～1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导，诱导温度为16～30℃，诱导6～12小时得到还原胺化酶。

8.权利要求1所述的还原胺化酶或权利要求5所述的重组细胞在催化合成手性双芳基胺中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用具体是以还原胺化酶或重组细胞作为催化剂，在氨基供体和NADP⁺存在的情况下，催化潜手性双芳基酮合成手性双芳基胺；

所述的手性双芳基酮为如式1、式2或式3所示的化合物：

式1：

式2：

式3：

其中R₁为2’-Cl，3’-Cl及4’-Cl、；R₂为2’-Cl，3’-Cl及4’-Cl、；R₃为H及4’-Cl；R为phenyl，benzyl及furyl；

所述的氨基供体为如式4所示的化合物：

式4：R₀-NH₂；其中，R₀为H，CH₃，CH₃CH₂，CH₃(CH₂)₂，CH₃(CH₂)₃，propargyl，allyl或者cyclopropyl。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在所述的应用中，所述的潜手性双芳基酮的含量为10～100mmol/L，所述的还原胺化酶的用量为1～10k U/L，所述的NADP⁺的用量为0.1～1.0mmol/L，反应温度为20～35℃。