CN101565697A - 一种耐高温和有机溶剂的醛缩酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型醛缩酶基因克隆及其编码的多肽序列，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种氨基酸序列为SEQ ID NO.2，或其保守性变异多肽的醛缩酶，以及该醛缩酶的纯化制备方法。本发明的醛缩酶具备很好的耐高温及耐有机溶剂稳定性。基于本发明醛缩酶的稳定性，本发明还提供了该醛缩酶在制备他汀类药物中间体中的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体的说，本发明涉及新的耐热及耐有机溶剂醛缩酶的基因及其编码的多肽序列。本发明还涉及该醛缩酶的制备和在他汀类药物中间体合成中的用途。
背景技术
醛缩酶作为催化碳碳原子立体成键的酶，可以广泛的应用在有机化学合成中，它可以方便的以小分子为起点向大的复杂分子方向进行不对称催化合成，这个过程在碳水化合物为底物的反应中意义尤为突出。应用酶的高区域选择性，能够容易避开对碳水化合物中的活泼的羟基的保护，更为突出的是在催化碳碳键合成的同时醛缩酶可以引入新的手性中心。正是这种能够高效引入手性碳原子的能力，使得醛缩酶在药物分子合成领域中有着广泛的应用，尤其值得一提的是醛缩酶可以用于2，4，6-三脱氧己糖化合物的合成(Scheme 1)，该化合物是多种他汀类药物合成的关键中间体，采用酶催化此中间体的合成，与化学工艺相比，具有明显优势，如：避免了有毒有害催化剂的使用，减少了有机溶剂的使用量，使反应由原来的苛刻超低温-70℃变为常温条件进行。从替代传统化学合成工艺催化剂的角度，该酶催化的反应具有很强的绿色属性，对传统化学工艺的绿色化学改造有着重要意义，因而该酶具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的醛缩酶及其纯化制备方法。该新的醛缩酶与常规醛缩酶相比具有很好的耐高温、耐有机溶剂的稳定性。本发明的另一个目的是提供上述醛缩酶在制备他汀类药物中间体过程中的应用。
为实现上述目的，本发明公开了一种醛缩酶，其特征在于，其氨基酸序列是SEQ.ID NO.2。
经实验证明，上述结构的蛋白质具有很好的耐高温、耐有机溶剂的稳定性。不难想到的是，在不改变蛋白质特性的情况，适当改变氨基酸序列，仍具有本发明醛缩酶特性。比如，氨基酸序列SEQ ID NO.2的保守性变异多肽，或其活性片段、或其衍生物。
本发明的耐高温、耐有机溶剂的醛缩酶的制备方法为：
1、DERA基因全长的cDNA合成与克隆：根据DERA基因的核苷酸序列，进行全基因合成，获得SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的醛缩酶基因。
2、含目的基因的表达载体的构建：将步骤1得到的醛缩酶基因克隆至中间载体。
3、将步骤2得到的表达载体转入宿主细胞中，如大肠杆菌(Escherichiacoli)BL 21，在适合表达醛缩酶的条件下，培养所述宿主细胞。
4、从步骤2的培养物中分离出醛缩酶。
本发明的醛缩酶，因具有耐高温和耐有机溶剂的氨基酸序列，与现有醛缩酶相比，更适于应用于制备他汀类药物中间体。下面以合成2，4，6-三脱氧-D-赤式-六吡喃糖苷为例，其过程如下：
在100mM醋酸钠Buffer pH5.5中，300mM乙醛在醛缩酶浓度为1.84mg/ml连续暗反应4天，放置冰上终止反应，离心去酶后，最后反应液进行薄层色谱分析。按上述方法，经过在不同温度环境下进行实验证明，在高温条件下，本发明醛缩酶的活性丧失较少。
附图说明
图1是Hyperthermus butylicus的醛缩酶表达结果(M：marker；1：DERA)。
图2是Hyperthermus butylicus的醛缩酶连续醛缩反应结果(S：E.Coli；1：H.butylicus)。
图3不同温度处理下DERA的相对活力。
具体实施方案
下面通过具体实验过程对本发明进行进一步的说明。
1、DERA基因全长的cDNA合成与克隆。
根据NCBI中的来自Hyperthermus butylicus的DERA基因的核苷酸序列，交上海生工生物工程技术有限公司进行全基因合成，成功获得SEQ ID NO.1所示核苷酸的序列。含目的基因的表达载体的构建，根据Hyperthermus butylicus的DERA基因编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以基因合成的产物为模板，经PCR扩增后，将Hyperthermusbutylicus的DERA克隆至中间载体(如pET303/CT)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入E.Coil BL21中。
2、DERA蛋白的表达。
将第1步中获得的E.Coil BL21/pET 303CT/DERA thermo在含100mL100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中摇床过夜培养。将10ml过夜培养后的菌液倒入1L 100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养，直到菌液OD600达到0.6-0.8时加入IPTG终浓度为0.5mM，37℃诱导5h后，离心收集菌体，菌体用25ml磷酸缓冲液pH7.4使其重悬浮，加入溶菌酶，溶菌酶终浓度为1mg/ml，并反复冻融使细胞破碎。离心取上清，含DERA thermo的上清用0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤后镍柱亲和层析进行纯化获得DERA thermo纯酶。每升LB培养基中DERA thermo酶的表达量达到108mg/L(图1)。
3、DERA连续醛缩反应。
采用Bradford法测实施例2获得的DERA thermo纯酶的浓度。取一定量的DERA thermo纯酶，使用100mM醋酸钠Buffer pH5.5溶解后，配置成终浓度为1.84mg/ml，加入300mM乙醛，连续暗反应4天，放置冰上终止反应，离心去除蛋白(Microcon YM-30；Millipore，Tokyo)，取2μL滤液进行薄层色谱分析2，4，6-三脱氧-D-赤式-六吡喃糖苷的产生。展开剂是1-正丁醇、醋酸、水，体积比为4∶1∶1，显色剂用茴香醛、浓硫酸、甲醇，体积比为1∶2∶17。以大肠杆菌K12的醛缩酶为对照，进行相同的对照反应。TLC结果显示来自Hyperthermus butylicus的DERA thermo具有合成2，4，6-三脱氧-D-赤式-六吡喃糖苷的能力，且比来自E.Coil K-12的DERA合成2，4，6-三脱氧-D-赤式-六吡喃糖苷的量多(图2)。
4、DERA的热稳与耐有机溶剂稳定性。
为评估DERA活性，可在室温或25℃下测定DERA天然底物反应，2-脱氧-D-核糖-5-磷酸酯向乙醛和D-甘油醛-3-磷酸酯的醛醇分解中的起始活性。将DERA酶液使用50mM三乙醇胺缓冲液(pH 7.5)配制成0.2mg/mL，与底物的混合溶解(0.2mM NADH，0.5mM 2-脱氧-D-核糖-5-磷酸酯，7.5U/mL丙糖磷酸异构酶，2.5U/mL甘油磷酸脱氢酶)测定分解实验。通过测量样品在340nm波长的UV吸收来检测动力学曲线以分析测定DERA的天然底物分解活性。一分子NADH的消耗对应一分子2-脱氧-D-核糖-5-磷酸酯的分解。
将DERA thermo在50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃下处理10min，与反应液混合，进行不同温度下活性分析。以未处理的DERA thermo在相同条件下进行活性测定所得的活性为100％，不同温度下所测得的剩余活性与未处理的活性之比为相对活性。结果表明来自Hyperthermus butylicus的DERA酶具很高的热稳定性，随着处理温度的升高，酶的相对活性未有较大的变化(图3)。DERA酶在80℃孵育48h后，剩余活力仍为未处理的78％，说明来自H.butylicus的DERA酶在高温处理下长时间内均具有很高的热稳定性。
将DERA thermo与300mM氯乙醛在25℃下孵育不同时间段后，反复离心去除蛋白(Microcon YM-30；Millipore，Tokyo)，使用50mM三乙醇胺缓冲液(pH 7.5)重新溶解酶，采用上述方法测定其天然底物分解活性。结果表明，来自H.butylicus的DERA酶具很高的氯乙醛耐受，在24h处理后，剩余酶活力仅下降22％，48h后，相对酶活力仍为76.8％。
在本发明中，所述核苷酸序列SEQ ID NO.1和氨基酸序列SEQ ID NO.2的详细信息见序列表。
序列表
<110>杭州师范大学
<120>一种耐高温和有机溶剂的醛缩酶及其制备方法和应用
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>714
<212>DNA
<213>Hyperthermus butylicus
<400>1
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<210>2
<211>237
<212>PRT
<213>Hyperthermus butylicus
<400>2
Met Ser Glu Ser Phe Phe Cys Arg Phe Gly Val Ser Glu Ile Ala Ser
1 5 10 15
Arg Ile Asp His Ala Val Leu Lys Pro Trp Ser Ser Val Ser Glu Leu
20 25 30
Glu Lys Ala Ile Arg Glu Leu Glu Glu Leu Asn Leu Arg Cys Leu Ile
35 40 45
Ile Ser Pro Thr His Leu Arg Leu Ala Arg Glu Lys Thr Asn Lys Cys
50 55 60
Leu Gly Val Val Val Gly Phe Pro Phe Gly Tyr Ser Thr Ile Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Lys Glu Leu Glu Asp Ser Ile Ala Leu Gly Ala Gln Glu Ile
85 90 95
Asp Tyr Val Ala Asn Thr Gln Leu Leu Leu Ala Gly Arg Thr Glu Glu
100 105 110
Tyr Leu Asn Glu Ile Arg Ala Ala Ile Thr Ile Cys Arg Asp Ser Gly
115 120 125
Val Lys Cys Lys Val Ile Ile Glu Ala Pro Ala Leu Pro Arg Asn Leu
130 135 140
Leu Val Glu Ile Val Glu Lys Ile Ala Met Met Asp Pro His Pro Asp
145 150 155 160
Tyr Ile Lys Thr Ser Thr Gly Tyr Gly Pro Arg Pro Thr Tyr Val Glu
165 170 175
Asp Val Tyr Leu Ile Asp Gln Thr Leu Arg Arg Ile Gly Lys Arg Asp
180 185 190
Glu Ile Gly Ile Lys Ala Ala Gly Gly Ile Arg Glu Gly Leu Gln Ala
195 200 205
Ala Ala Met Leu Leu Ala Gly Ala Asp Val Ile Gly Thr Ser Thr Pro
210 215 220
Arg Gln Val Ile Glu Thr Tyr Lys Glu Leu Cys Arg Ile
225 230 235
Claims (8)
1.一种耐高温和有机溶剂的醛缩酶，其特征在于，其氨基酸序列是SEQ ID NO.2，或其保守性变异多肽。
2.根据权利要求1所述的耐高温和有机溶剂的醛缩酶，其特征在于，其氨基酸序列是SEQ ID NO.2。
3.一种醛缩酶基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的醛缩酶。
4.根据权利要求3所述一种醛缩酶基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1。
5.一种载体，其特征在于，其含有权利要求3所述的醛缩酶基因。
6.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求5所述的载体。
7.一种权利要求1所述的耐高温和有机溶剂的醛缩酶的制备方法，其特征在于，在适合表达醛缩酶的条件下，培养本发明上述的宿主细胞；然后从培养物中分离出醛缩酶。
8.一种他汀类药物中间体的制备方法，其特征在于，用权利要求1所述的醛缩酶催化乙醛或乙醛衍生物，进行连续醛缩反应，生成该中间体。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN101892218A (zh) * | 2010-06-23 | 2010-11-24 | 杭州师范大学 | 一种醛缩酶的微波辅助固定化方法 |
| CN101921789A (zh) * | 2010-05-19 | 2010-12-22 | 杭州师范大学 | 一种醛缩酶、编码基因、载体、工程菌及其应用 |
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| CN102250847A (zh) * | 2010-05-20 | 2011-11-23 | 杭州师范大学 | 一种嗜热微生物来源的醇脱氢酶及其纯化制备方法 |
| CN102329764A (zh) * | 2010-03-23 | 2012-01-25 | 杭州师范大学 | 一种重组耐热醛缩酶基因工程菌及其应用 |
| CN102559723A (zh) * | 2012-03-12 | 2012-07-11 | 杭州师范大学 | 一种高表达、嗜热、高酶活力的醛缩酶及其应用 |
-
2009
- 2009-06-08 CN CNA2009100990617A patent/CN101565697A/zh active Pending
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| CN101921789A (zh) * | 2010-05-19 | 2010-12-22 | 杭州师范大学 | 一种醛缩酶、编码基因、载体、工程菌及其应用 |
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