CN102250847A - 一种嗜热微生物来源的醇脱氢酶及其纯化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种嗜热微生物来源的醇脱氢酶基因及其编码的多肽序列，属于生物工程技术领域。具体的说，本发明公开了一种氨基酸序列为SEQ ID NO.2，或其保守性变异多肽的醇脱氢酶，并且提供了该酶的纯化制备方法，以及该酶的酶活性质及底物谱分析过程。本发明所述的醇脱氢酶属于typeⅢ醇脱氢酶，依赖于NADP⁺而非NAD⁺，且对多种醇例如1，3-丙二醇具有很高的活性。

Description

一种嗜热微生物来源的醇脱氢酶及其纯化制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体的说，本发明涉及新的嗜热微生物来源的醇脱氢酶基因的核苷酸序列及其编码的多肽序列。

背景技术

手性是很多药物起作用的关键结构单元，药物中间体的单一对映异构体在医药工业上发挥着越来越重要的作用。单一对映异构体药物可以通过化学或者生物酶法合成。化学合成的难点在于对映体的分离纯化。生物酶法合成中酶催化反应的高度立体异构选择性和对映体过量的特性正可以弥补此缺点，另外酶催化具有反应条件温和，副反应少、光学纯度高及环境友好等优点。因此，生物酶法合成手性化合物越来越受到重视。

醇脱氢酶广泛存在于各种微生物中，催化醇、醛和酮之间的相互转换，有着广泛的底物特异性，在微生物的生理过程起着广泛的作用。多种微生物来源的醇脱氢酶能将前手性酮还原成手性醇，而带手性羟基的化合物在药物中间体合成上有着广泛的应用。如红平红球菌来源的醇脱氢酶用于合成抗HIV的蛋白酶抑制剂阿扎那韦的中间体(1S，2R)-3-氯-2-羟基-1-(苯甲基)丙基氨基甲酸；赖氏菌属的醇脱氢酶能还原双乙酰基酮，生成相应的手性醇，用于合成降血脂药他汀类共同手性侧链。热微生物来源的酶具有很高的热稳定性，且热稳定性与有机溶剂等变性剂条件下的稳定性是正相关的，嗜热微生物来源的醇脱氢酶因为在较高的温度仍具有较高的活性。因此，在对有机化学底物有较好的耐受性，不易失活且可多次循环使用，在精细化工中具有较宽广的应用。因此，对嗜热微生物来源的醇脱氢酶研究具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是基于醇脱氢酶的应用价值，提供一种新型的嗜热微生物来源的醇脱氢酶，并进一步给出该酶的纯化制备方法，以及酶活性质的测定方法。

为实现上述目的，本发明公开了一种嗜热微生物来源的醇脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列是SEQ.ID NO.2。

经实验证明，上述结构的蛋白质属于typeIII醇脱氢酶，依赖于NADP⁺而非NAD⁺，且对多种醇例如1，3-丙二醇具有很高的活性。不难想到的是，在不改变蛋白质特性的情况，适当改变氨基酸序列，仍具有本发明醇脱氢酶特性。比如，氨基酸序列SEQ ID NO.2的保守性变异多肽，或其活性片段、或其衍生物。

本发明的嗜热微生物来源的醇脱氢酶的制备方法包括如下四步：

1、嗜热微生物来源的醇脱氢酶基因(TlADH)全长的DNA克隆：根据TlADH基因的核苷酸序列的编码区，设计引物，以DNA为模板进行PCR，产物回收亚克隆并测序，获得SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的醇脱氢酶基因。

2、含目的基因的表达载体的构建：将步骤1得到的醇脱氢酶基因克隆至中间载体。

3、将步骤2得到的表达载体转入宿主细胞中，如大肠杆菌(Escherichia coli)BL 21codon plus，在适合表达TlADH的条件下，培养所述宿主细胞。

4、从步骤2的培养物中分离出TlADH。

附图说明

图1Thermotoga lettingae的醇脱氢酶诱导表达结果(M：marker；4：TlADH纯化后)。

图2TlADH的最适pH值(○：还原反应；▲：氧化反应)。

图3TlADH的最适反应温度。

图4TlADH的热稳定性。

具体实施方案

下面通过具体实验过程对本发明做进一步的说明。

1、TLADH基因全长的克隆。

根据NCBI中的来自Thermotoga lettingae的ADH基因的核苷酸序列，设计一对引物，以DNA为模板进行高保真PCR反应，PCR产物进行回收并亚克隆，测序分析，成功获得SEQ ID NO.1所示核苷酸的序列。含目的基因的表达载体的构建，根据Thermotoga lettingae的TLADH基因编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以基因合成的产物为模板，经PCR扩增后，将TLADH基因克隆至中间载体pET303/CT，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入E.CoilBL21codon plus中。

2、TLADH蛋白的诱导表达与纯化。

将第1步中获得的E.Coil BL21codon plus/pET 303CT/TlADH在含100mL100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中摇床过夜培养。将10ml过夜培养后的菌液倒入1L 100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养，直到菌液OD₆₀₀达到0.6-0.8时加入IPTG终浓度为0.5mM，28℃诱导16h后，离心收集菌体，菌体用25ml磷酸缓冲液pH7.4使其重悬浮，超声破碎细胞。离心取上清，含TLADH的上清用0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤后镍柱亲和层析进行纯化获得TLADH纯酶。每升LB培养基中TLADH thermo酶的表达量达到89.4mg/L，参见图1。

3、TlADH的酶活性质分析。

为评估TlADH活性，在50℃下测定TLADH对醇或醛的活性。TlADH的最适反应缓冲液分析：100mM缓冲液为：PBS(pH 6.4，6.9，7.4)，Tris-HCl(pH 7.4，7.9，8.4，8.9，9.4)and Glycine-NaOH(pH 9.4，9.9，10.4，10.9，11.4)，氧化反应体系为：100mMbuffer，0.125mM NADP，1mM DTT，10mM丁醇和一定量的酶；还原反应体系为：100mM buffer，1mM NADPH，1mM DTT，10mM丁醛和一定量的酶；在50℃下340nm处监测紫外吸收值的变化。结果表明：TlADH的最适丁醇氧化反应体系为pH 11.9和最适丁醛还原反应体系为pH 6.0，参见图2。

TlADH最适反应温度分析：选择氧化反应体系的最适pH缓冲液，采用氧化反应体系，在30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃下反应，在50℃下340nm处监测紫外吸收值的变化。结果表明：TlADH最适反应温度为80℃，如图2所示。

TlADH的热稳定性分析：3.0mg/ml TlADH与1mM DTT在100mM Tris-HCl(pH 7.4)中分别在85℃和95℃.温浴。然后去一定量的酶(60ug/mL)进行氧化反应体系进行反应，每隔1小时取样分析一次。结果表明：TlADH在85℃温浴1h左右活性下降50％，在95℃温浴1h后活性下降约80％，参见图4。

TlADH底物谱分析：在氧化反应体系中，将各种醇类底物替代丁醇，进行活性分析；在还原反应体系中，将各种醛类底物替代丁醛，进行活性分析。结果表明：TlADH对1，3-丙二醇具有最高的活性，为56.9U mg^-1，其他底物，如：丁醇、3-甲基-1-丁醇、辛醇、乙醇、1，2-丙二醇的活性分别为：16.2，14.3，14.2，10.1和4.32U mg-1；TlADH对丁醛具有最高的还原活性，为131.5U mg^-1，其他醛类如乙醛、苯乙醛、甲醛的活性分别为67.1，21.7，11.0U mg^-1。在分析的底物中，此酶具有较高的活性。

在本发明中，所述核苷酸序列SEQ ID NO.1和氨基酸序列SEQ ID NO.2的详细信息见序列表。

序列表

<110>杭州师范大学

<120>一种嗜热微生物来源的醇脱氢酶及其纯化制备方法

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1089

<212>DNA

<213>Thermotoga lettingae

<400>1

atgtggcaat attttatgcc cacaaaggta attttttcaa agaatgtact ggaaaaaaac   60

attgatttgt tcaagaattt tggatcgaaa gctctgataa ttaccggaaa gcattcatct  120

aaaaagaatg gatctttgca agatttagaa aaatctcttc aatctgctgg tgtttattat  180

gaaatctacg ataaaattga agaaaatcca acatactctc ttatacgtga agcagtgtat  240

tcgcttcgag atcgtaattt cgatttcata ataggtcttg gtggtggtag cccgcttgat  300

tctgcaaagg ccatagcggt gcttttaaaa aacaaagata tgaacgtgga agatctttac  360

aacgcatcaa aatacgaaca atcacttcca atatgtgcaa ttcctactac ttccggtacg  420

ggaagtgagg tgacgcagta ctcagtattg acggatgata gtggttataa aaaagggttt    480

gctcatcttt ctatttttcc tgcgctcgcc ttgatcgatc cgatttatac aataagtatg    540

aatgcttctc tgaccagatc aactggtctg gatgcactgt gccatgctgt agaggggttt    600

gtctcgaaac gagccacacc tgtttctgat ctgtacgcag tgcgggcaat ggaattgata    660

aaggaaaatt taccaaaggc tctggaaaat cctgaagatt taggcgccag ggaaaatatg    720

gcgtgtgcat cctgcttggc cggaatggtc ataagccaga ccagcacgac tcttgcccat    780

gttttgggat atcctttgag tactttcaag ggtataaggc atggtgacgc tacagcgctg    840

tttcttgatt caatagttaa ccaagctgaa aaagaaattc ctgaaaagat tgcaacaatt    900

aaaaagattt tcacagatat tggtgaattt atcgcatcag ttggtctgaa ggtgtcagtt    960

caaataacag acgaagagct tgaatcgtgg gtaaatagag ccaaacaggc tgctcacaat   1020

caatggacaa gaggtatttt tgatgaaaaa ttgctgaggc atttgtatga aagggtgaaa   1080

aaagattag                                                           1089

<210>2

<211>362

<212>PRT

<213>Thermotoga lettingae

<400>2

Met Trp Gln Tyr Phe Met Pro Thr Lys Val Ile Phe Ser Lys Asn Val

1               5                   10                  15

Leu Glu Lys Asn Ile Asp Leu Phe Lys Asn Phe Gly Ser Lys Ala Leu

            20                  25                  30

Ile Ile Thr Gly Lys His Ser Ser Lys Lys Asn Gly Ser Leu Gln Asp

        35                  40                  45

Leu Glu Lys Ser Leu Gln Ser Ala Gly Val Tyr Tyr Glu Ile Tyr Asp

    50                  55                  60

Lys Ile Glu Glu Asn Pro Thr Tyr Ser Leu Ile Arg Glu Ala Val Tyr

65                  70                  75                  80

Ser Leu Arg Asp Arg Asn Phe Asp Phe Ile Ile Gly Leu Gly Gly Gly

                85                  90                  95

Ser Pro Leu Asp Ser Ala Lys Ala Ile Ala Val Leu Leu Lys Asn Lys

            100                 105                 110

Asp Met Asn Val Glu Asp Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Tyr Glu Gln Ser

        115                 120                 125

Leu Pro Ile Cys Ala Ile Pro Thr Thr Ser Gly Thr Gly Ser Glu Val

    130                 135                 140

Thr Gln Tyr Ser Val Leu Thr Asp Asp Ser Gly Tyr Lys Lys Gly Phe

145                 150                 155                 160

Ala His Leu Ser Ile Phe Pro Ala Leu Ala Leu Ile Asp Pro Ile Tyr

                165                 170                 175

Thr Ile Ser Met Asn Ala Ser Leu Thr Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala

            180                 185                 190

Leu Cys His Ala Val Glu Gly Phe Val Ser Lys Arg Ala Thr Pro Val

        195                 200                 205

Ser Asp Leu Tyr Ala Val Arg Ala Met Glu Leu Ile Lys Glu Asn Leu

    210                 215                 220

Pro Lys Ala Leu Glu Asn Pro Glu Asp Leu Gly Ala Arg Glu Asn Met

225                 230                 235                 240

Ala Cys Ala Ser Cys Leu Ala Gly Met Val Ile Ser Gln Thr Ser Thr

                245                 250                 255

Thr Leu Ala His Val Leu Gly Tyr Pro Leu Ser Thr Phe Lys Gly Ile

            260                 265                 270

Arg His Gly Asp Ala Thr Ala Leu Phe Leu Asp Ser Ile Val Asn Gln

        275                 280                 285

Ala Glu Lys Glu Ile Pro Glu Lys Ile Ala Thr Ile Lys Lys Ile Phe

    290                 295                 300

Thr Asp Ile Gly Glu Phe Ile Ala Ser Val Gly Leu Lys Val Ser Val

305                 310                 315                 320

Gln Ile Thr Asp Glu Glu Leu Glu Ser Trp Val Asn Arg Ala Lys Gln

                325                 330                 335

Ala Ala His Asn Gln Trp Thr Arg Gly Ile Phe Asp Glu Lys Leu Leu

            340                 345                 350

Arg His Leu Tyr Glu Arg Val Lys Lys Asp

        355                 360

Claims (7)

1.一种嗜热微生物来源的醇脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列是SEQ ID NO.2，或其保守性变异多肽。

2.根据权利要求1所述的嗜热微生物来源的醇脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列是SEQ ID NO.2。

3.一种嗜热微生物来源的醇脱氢酶基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的醇脱氢酶。

4.根据权利要求3所述的嗜热微生物来源的醇脱氢酶基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

5.一种载体，其特征在于，其含有权利要求3所述的醇脱氢酶基因。

6.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求5所述的载体。

7.一种权利要求1所述的醇脱氢酶的纯化制备方法，其特征在于，在适合表达醇脱氢酶的条件下，培养的权利要求6所述的宿主细胞，然后从培养物中分离出重组的醇脱氢酶。

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