CN105274069A - 一种醇脱氢酶及其在合成度罗西汀中间体中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的醇脱氢酶，以及使用该酶催化合成(S)-3-取代胺基-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇，进而进一步合成度罗西汀的酶-化学合成方法。还提供了编码该醇脱氢酶的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该醇脱氢酶的制备方法，以及该醇脱氢酶在催化羰基底物不对称还原中的用途。使用本发明方法所得的产物浓度高，不必额外添加昂贵的辅酶NADP⁺/NAD⁺，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点。

Description

一种醇脱氢酶及其在合成度罗西汀中间体中的应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种醇脱氢酶，含有编码该酶的核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及该醇脱氢酶作为催化剂在不对称合成度罗西汀中间体中的应用。

背景技术

抑郁症又称抑郁障碍，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的主要类型。抑郁症包括单相性抑郁症(即重性抑郁症和精神抑郁症)、适应性障碍、轻微抑郁症、季节情感性精神障碍(SAD)、经前期焦虑症(PMDD)、产后抑郁症、非典型抑郁症、双相性精神障碍及躁郁症等多种类型。抑郁症的发病机制尚未完全明确，目前研究认为与遗传、心理、神经内分泌等因素诱发中枢去甲肾上腺素或5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、乙酰胆碱(Ach)、神经肽等神经递质含量降低及其受体功能下降有关。近年来研究发现抑郁症还与谷氨酸(也是一种中枢神经递质)传导功能障碍有关。目前的抑郁症诊断标准都比较强调精神症状，相对忽视躯体症状。一项国际研究提示，69％的抑郁症患者存在躯体症状。77％主诉精神症状的抑郁症患者得到诊断，而仅有22％主诉躯体症状的抑郁症患者得到诊断。忽视躯体症状导致抑郁症被误诊或漏诊，使患者辗转于其他临床科室寻求治疗，既延误了患者的诊治，也浪费了医疗资源。世界卫生组织2005年统计，各种抑郁症的患病率约占全球人口的11％。在中国，目前抑郁症的患病率约为3％～5％，抑郁症患者估计有3600万人。与高发病率形成鲜明反差的是，目前全国地市级以上医院对抑郁症的识别率不到20％。而在现有抑郁症患者中，只有不到10％的人接受了相关药物治疗。抑郁症在我国造成的直接经济负担约为141亿元，间接经济损失约481亿元，总经济负担达到621亿元。据世界卫生组织(WHO)发表的《世界卫生报告》显示，抑郁症目前已成为世界第四大疾患，到2020年抑郁症可能成为仅次于心脏病的第二大疾病。

度罗西汀是礼来公司的主打产品，用于治疗成人抑郁障碍。度罗西汀是5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素再吸收双重抑制剂，能有效治疗抑郁症的情绪症状和躯体症状，弥补了当前主流抗抑郁药在躯体疼痛症状治疗方面的不足。该药于2004年底在美国首先上市，2006年全球销售额达到13.16亿美元，比2005年增长了近1倍。同年，度罗西汀在美国市场已超越所有抗抑郁药，成为市场增长份额最快的产品。2009年销售额为30.75亿美元，同比又增长了14％。该药物目前由美国礼来公司(EliLilly)和德国勃林格殷格翰公司(BoehringerIngelheim)联合在全球范围内营销，已在全球70多个国家上市，并于2007年4月进入我国，商品名为“欣百达”。

度罗西汀合成中的关键步骤是手性羟基中间体的构建。美国专利US5023269公开了一种合成度罗西汀的方法，将3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐用硼氢化钠还原，然后通过重结晶来构建。CN101391991公开了2-乙酰噻吩与多聚甲醛和二甲胺盐酸盐发生Mannich反应制备3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐的方法。CN103013898公开了N,N-二甲基-3-氧基-(2-噻吩)-1-丙胺盐酸盐在醇脱氢酶作用下转化为(S)-N,N-二甲基-3-羟基-2-(2-噻吩)-1-丙胺的方法，其光学纯度可达到97.5％。CN103421854公开了3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮在酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的组合作用下转化为(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法。上述方法或多或少存在反应收率低、原料成本昂贵、反应不完全、对应选择性不高或者添加了价格昂贵的辅酶的缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的不对称还原制备(S)-3-二甲氨基-1-噻吩基-1-丙醇反应中收率低、原料成本昂贵、反应不完全、对应选择性不高或者添加了价格昂贵的辅酶等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的醇脱氢酶，以及使用该醇脱氢酶催化合成(S)-3-取代胺基-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇，进而进一步合成度罗西汀的酶-化学合成方法。还提供了编码该醇脱氢酶的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该醇脱氢酶的制备方法，以及该醇脱氢酶在催化羰基底物不对称还原中的用途。

本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：

本发明的第一方面提供了一种醇脱氢酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)由SEQIDNo:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。

SEQIDNo:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质由环境DNA编码，具有醇脱氢酶的功能，是一种新的醇脱氢酶。

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有醇脱氢酶活性的蛋白质。

其中，所述的“几个”是指2个至100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明人发现这样的融合蛋白同样具有醇脱氢酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有醇脱氢酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的发明目的。根据本发明，在如SEQIDNo:2所示氨基酸序列的蛋白质(a)分子中进行1～5个氨基酸残基的突变，仍然保持醇脱氢酶活性。

(c)与(a)的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且具有醇脱氢酶活性的蛋白质。

SEQIDNo:2所示的醇脱氢酶和其他已知醇脱氢酶，如短小高加索乳杆菌醇脱氢酶之间的同一性为76％。本发明的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示的醇脱氢酶与已知醇脱氢酶的氨基酸序列的同一性低于80％，具有显著差异性。

在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBIBlastp程序进行比对，默认参数。

本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的醇脱氢酶。优选地，所述核酸是由SEQIDNo:1所示核苷酸序列组成的。

由SEQIDNo:1所示的核苷酸序列组成的核酸来源于环境基因组DNA，其可以从环境基因组中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。

本发明中，SEQIDNo:1所示的基因命名为BYK-CR，全长750bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第747个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo:2所示。

如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQIDNo:2的氨基酸序列的核酸序列不仅仅局限于SEQIDNo:1。本发明的醇脱氢酶基因的核酸序列也可以是编码序列表中SEQIDNo:2所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核酸序列SEQIDNo:1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或添加来制得。

SEQIDNo:1的同系物也指启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。

SEQIDNo:1的同系物还指在标准条件下能够与SEQIDNo:1所示序列的核酸进行杂交的核酸序列。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的方式进行：ColdSpringHarborLaboratoryPress，分子生物学中的通用方案(CurrentProtocolsinMolecularBiology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～8×SSC；20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液；杂交温度为50～70℃；在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS；当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。

本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的编码醇脱氢酶的核酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明所述的编码醇脱氢酶或其突变体的核酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET28a。较佳地，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的目的核酸片段与表达载体pET28a分别用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的编码醇脱氢酶的核酸序列的重组表达质粒pET28a-BYK-CR或含有编码其突变体的核酸序列的重组表达质粒。

本发明的第四个方面提供了一种包含本发明的重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌(E.coli)，更优选E.coliBL21(DE3)或E.coliDH5α。将前述重组表达质粒pET28a-BYK-CR或其突变体转化至E.coliBL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即E.coliBL21(DE3)/pET28a-BYK-CR或其突变体。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法，热击法等；较佳地选择热击法进行转化，热击条件较佳的是：42℃，热击90秒。

本发明的第五方面提供一种重组醇脱氢酶的制备方法，包括培养本发明所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组醇脱氢酶。

其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞得到。所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转化体生长并表达本发明的醇脱氢酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体生长并表达本发明的醇脱氢酶即可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行。对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵较佳地选用下述方法：将本发明的重组大肠杆菌(优选E.coliBL21(DE3)/pET21a-BYK-CR或其突变体)接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5～0.7(更佳地为0.6)时，加入终浓度为0.05～1.0mmol/L(更佳地是0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度10～37℃(更佳地是25℃)，即可高效表达本发明所述重组醇脱氢酶。

本发明中催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成光学活性手性醇的催化剂，可以是上述重组转化体的培养物，也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物中的醇脱氢酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。

本发明的第六个方面提供了一种本发明的醇脱氢酶或重组醇脱氢酶在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性醇中的应用。

所述前手性羰基化合物较佳地为氨基芳香酮类化合物，最佳地为3-取代-1-噻吩基-1-丙酮，即式I所示的化合物：

其中，

X选自离去基团、-NR₁R₂；R₁、R₂各自独立的选自H、碳链长度为1～8的烷基、苄基或含有1～8个碳原子的烷氧羰基。

在本发明中，离去基团可选自下列基团：卤素，如Cl、Br或I；甲苯磺酸酯基；甲磺酰基；酰氧基，优选具有1～6个碳原子的酰氧基，特别是乙酰氧基；苯乙酰氧基；烷氧基，优选具有1～6个碳原子的烷氧基；(杂)芳氧基，优选具有6～12个碳原子的(杂)芳氧基。

较佳地，

X为卤素、-N(CH₃)₂、-NHBn或-NHBoc。

更佳地，

X为Cl、-N(CH₃)₂、-NHBn或-NHBoc。

最佳地，X为-N(CH₃)₂，即式I是3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮(DKTP)。

本发明所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳地，所述应用包括下述步骤：在pH5.0～8.0的水溶液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP⁺/NAD⁺的存在下，在本发明所述的醇脱氢酶或重组醇脱氢酶的催化下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性醇。亦可在pH7.0～8.5的水溶液中，在异丙醇和NADP⁺/NAD⁺的存在下，在本发明所述的醇脱氢酶或重组醇脱氢酶的催化下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性醇。

其中所述的前手性羰基化合物在反应液中的较佳浓度为10～200g/L。本发明的醇脱氢酶用量为催化有效量，较佳地为50～300mL/L。葡萄糖脱氢酶的用量较佳地为0.01～1g/L。葡萄糖的用量较佳地为5～150g/L。额外加入的NADP⁺/NAD⁺的用量较佳地为0～1.0mmol/L。所述的水溶液可为本领域常规缓冲液，只要其pH范围在5.0～8.0即可，优选磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳地为0.05～0.1mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称还原反应较佳的是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳地为20～35℃，更佳地为25℃。所述的不对称还原反应的时间较佳地以反应过程中，产物浓度不再持续提高的时间为准。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性醇产物。

本发明中，使用粗酶液做催化剂，较佳地应添加辅酶。如果用静息细胞做催化剂则不需要加辅酶，只需利用细胞内所含有的辅酶即可。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明针对已经报道的反应收率低、原料成本昂贵、反应不完全、对应选择性不高或者添加了价格昂贵的辅酶等问题，提供了一种新的醇脱氢酶及利用重组醇脱氢酶结合辅酶再生不对称还原的方法。在催化浓度高达200g/L的底物时，产物的光学纯度仍高达99％以上，且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于其它不对称还原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，不必额外添加昂贵的辅酶NAD+，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点，因此具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1醇脱氢酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2醇脱氢酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。M为分子量标准，A泳道为诱导前，B泳道为诱导后。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

E.coliBL21(DE3)和E.coliDH5α感受态细胞购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

实施例1

从上海市奉贤区四团镇朱家村采集土壤样本并提取DNA(提取方法参照ChromaSpinTE-1000，ClontechLaboratories，Inc.，USA)，用Sau3AI部分酶切，电泳收集2～8kb的片段，回收并连接到pUC19的BamHI位点，得到质粒文库。将文库转化到E.coliDH5α并涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性克隆到加有500μLLB(100μg/mL氨苄青霉素)的96深孔孔板，37℃培养4小时后加1mMIPTG诱导，30℃继续培养过夜；然后各取50μL深孔培养物到加有50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)的新的96孔板，-80℃反复冻融使细菌裂解；加入1mM度罗西汀底物DKTP、10mM葡萄糖、1单位葡萄糖脱氢酶、0.002％(v/v)的酚红，30℃培养4小时，挑取变红最明显的孔所对应的深孔培养物，提取质粒并测序。用NCBI的ORFFinder分析其开放读码框(ORF)，得到ORF核苷酸序列SEQIDNO:1，并进一步得到其编码的氨基酸序列SEQIDNO:2。

实施例2

合成引物对P1(核苷酸序列为SEQIDNO:3)和P2(核苷酸序列为SEQIDNO:4)。使用P1和P2克隆全长醇脱氢酶基因，PCR体系如下：10×KOD-PlusPCRbuffer2μL，25mMMgSO₄1.2μL，2mMdNTP2μL，KOD-PlusPCR高保真酶0.3μL，DNA模板0.5μL(含DNA模板0.1μg)，ddH₂O13μL，P1和P2各0.5μL(10mmol/L)。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)98℃，变性15s；(3)58℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收700～800bp区间的目标条带(见图1)，获得一条完整的基因序列，经DNA测序，全长750bp。

PCR产物切胶回收后，用NdeI/XhoI酶切后连接到pET28a原核表达载体，并转化到E.coliBL21(DE3)感受态细菌，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板培养，挑选阳性菌落(BYK-CR基因工程大肠杆菌)接种到100ml液体LB培养基中进行培养。过夜培养物转入1L新鲜的LB液体培养基，培养到OD₆₀₀达0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为100μM诱导重组蛋白表达，降温至30℃继续培养24小时。5000rpm离心收集菌体，用0.2MpH7.0的磷酸钠缓冲液洗一次，1g菌体重悬于5mL上述磷酸盐缓冲液中，超声波破碎后，SDS-PAGE检验表达水平，结果如图2。

实施例3

酶活测定：在2mL反应液中，加入2mMDKTP为底物，0.1mMNADH为辅因子，再加入20μL粗酶液，测定2分钟内OD₃₄₀的降低速度为ΔA₃₄₀。酶活计算公式：ΔA₃₄₀×1000/(6220×20)，即每mL裂解液的比酶活力。

实施例4

高密度发酵：将按照实施例2获得的BYK-CR基因工程大肠杆菌接种于装有200mLLB培养基的1L摇瓶中，于37℃，180～220rpm培养10～16h。将上述培养好的种子培养液按10％(v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基(M9培养基，含葡萄糖4g/L、磷酸氢二钠12.8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵1g/L、硫酸钠0.5g/L、氯化钙0.0152g/L、六水氯化镁0.41g/L)中，在20～30℃，300～800rpm，空气流量2～6L/min的条件下培养。培养6～10h后，以5～20mL/h的速率流加含60％甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至OD₆₀₀达到20～40时，添加0.1～1mMIPTG开始诱导。诱导10～20h后，放罐，5000rpm离心收集菌体。

实施例5

100gDKTP底物(或其盐酸盐)溶于100mL异丙醇，加入50mM磷酸钠缓冲液至700mL(用NaOH调pH7.0)，加入全菌裂解液300mL，30℃搅拌反应24小时，TLC检测反应进程。反应结束后调pH10.0，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，干燥旋干，得到粗产物，纯度95.0～97.0％，摩尔收率85～91％，ee值>99％。

TLC条件：二氯甲烷:甲醇:氨水＝7:0.55:2滴，碘缸显色。

HPLC条件：

HPLC：15％乙腈+50mMNa3PO4(NaOH调pH7.0)，流速1mL/min，AgilentZorbaxSBC18柱(4.6×250mm)，检测波长220和254nm；HPLC：Shimada，15C；进样20μL。

ee值测定：

ChiralpakAD-H柱，正己烷:乙醇(0.1％DEA)＝90:10，0.8mL/min，220nm，Agilent1260。

实施例6～8

基本按照实施例5的方法转化表1中的底物。

表1各种底物的转化

实施例9

100gDKTP底物(或其盐酸盐)溶于200mL水，用1M的NaOH调pH6.0，加入全菌裂解液300mL，加入500mL水，加入葡萄糖70g和葡萄糖脱氢酶5000U，0.5mMNAD⁺，30℃搅拌反应16小时，1MNaOH控制反应pH在5.8～6.0之间，TLC检测反应进程。反应结束后调pH10.0，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，干燥旋干，得到粗产物，纯度95.0～97.0％，摩尔收率88～92％，e.e.值>99％。

实施例10～12

基本按照实施例9的方法转化表2中的底物。

表2各种底物的转化

Claims (24)

1.一种醇脱氢酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)由SEQIDNo:2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有醇脱氢酶活性的蛋白质；

(c)与(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性且具有醇脱氢酶活性的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的醇脱氢酶的分离的核酸。

3.根据权利要求2所述的核酸，其是由SEQIDNo:1所示核苷酸序列组成的。

4.包含权利要求2或3所述的核酸的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其选自质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其是pET28a。

7.包含权利要求4-6任一项所述的重组表达载体的重组表达转化体。

8.根据权利要求7所述的重组表达转化体，其是大肠杆菌。

9.根据权利要求8所述的重组表达转化体，其是E.coliBL21(DE3)或E.coliDH5α。

10.一种重组醇脱氢酶的制备方法，包括培养权利要求7-9任一项所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组醇脱氢酶。

11.一种催化羰基化合物进行不对称还原反应形成光学活性羟基化合物的催化剂，其选自权利要求7-9任一项所述的重组表达转化体的培养物，或通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。

12.权利要求1所述的醇脱氢酶，权利要求10所述的方法制备的重组醇脱氢酶，或权利要求11所述的催化剂在催化羰基化合物进行不对称还原反应形成光学活性羟基化合物中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，所述的前手性羰基化合物选自以下化合物：

其中，

X选自离去基团、-NR₁R₂；R₁、R₂各自独立地选自H、碳链长度为1～8的烷基、苄基或含有1～8个碳原子的烷氧羰基。

14.根据权利要求13所述的应用，其中所述离去基团选自卤素、甲苯磺酸酯基、甲磺酰基、酰氧基、苯乙酰氧基、烷氧基、(杂)芳氧基。

15.根据权利要求13所述的应用，其中X选自卤素、-N(CH₃)₂、-NHBn或-NHBoc。

16.根据权利要求15所述的应用，其中X选自Cl、-N(CH₃)₂、-NHBn或-NHBoc。

17.根据权利要求16所述的应用，其中X为-N(CH₃)₂。

18.根据权利要求13-17任一项所述的应用，其中所述不对称还原反应在含有氢氧化钠的pH5.0～8.0的异丙醇水溶液中进行，任选地，所述异丙醇溶液中还添加0～1.0mM的NADP⁺或NAD⁺。

19.根据权利要求13-17任一项所述的应用，其中所述不对称还原反应在含有葡萄糖脱氢酶、葡萄糖的pH5.0～8.0的水溶液中进行，任选地，所述水溶液中还添加0～1.0mM的NADP⁺或NAD⁺。

20.根据权利要求19所述的应用，其中，葡萄糖的含量为5～200g/L，葡萄糖脱氢酶的含量为0.01～1g/L。

21.根据权利要求18-20任一项所述的应用，其中，在反应液中前手性羰基化合物的浓度为1～200g/L，醇脱氢酶或重组醇脱氢酶的用量为0.01～10g/L，反应在振荡或搅拌条件下进行，反应温度为20～35℃。

22.一种合成(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法，包括使用权利要求1所述的醇脱氢酶，权利要求10所述的方法制备的重组醇脱氢酶，或权利要求11所述的催化剂催化3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮进行不对称还原反应。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述不对称还原反应的反应液中含有100g/L的3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮、0.01～1g/L的葡萄糖脱氢酶、5～200g/L的葡萄糖、0～1.0mmol/L的NADP+，反应pH为5.5～7.5，反应温度为20～35℃。

24.一种合成度罗西汀的方法，包括使用权利要求22或23所述的方法合成手性羟基中间体(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇。