CN112779606A - 一种On-DNA曼尼希反应的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种On‑DNA曼尼希反应的方法，该方法以On‑DNA醛基化合物为底物，与活泼氢化合物和胺基化合物反应得到On‑DNA产物。该方法能够在有机溶剂/水相的混合溶剂中进行，环境友好；且能够大规模的引入醛、胺和含有活泼氢的化合物作为合成模块，适合使用多孔板的DNA编码化合物的合成。
Description
技术领域
本发明属于编码化合物库技术领域，具体涉及一种On-DNA曼尼希反应构建On-DNAβ-氨基羰基化合物的方法。
背景技术
在药物研发，尤其是新药研发中，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库技术(WO2005058479、WO2018166532、CN103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，并能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(Accounts of ChemicalResearch,2014,47,1247-1255)。
DNA编码化合物库通过组合化学快速产生巨型化合物库，并且能高通量地筛选出先导化合物，使得先导化合物的筛选变得前所未有的快捷和高效。构建DNA编码化合物库的挑战之一就是需要在DNA上高收率地合成具有化学多样性的小分子。由于DNA需要在一定的条件下(溶剂、pH、温度、离子浓度)才能维持稳定，同时应用于DNA编码化合物库构建的On-DNA反应还需要有较高的产率。因此DNA上进行的化学反应(简称On-DNA反应)的试剂种类、反应种类、反应条件直接影响到DNA编码化合物库的丰富度和可选择性。从而开发能够与DNA兼容的化学反应也成为目前DNA编码化合物库技术的长期探索和研究方向，也直接影响了DNA编码化合物库的应用及商业价值。
β-氨基-羰基化合物在天然产物和药物分子中广泛存在，因此在DNA编码化合物库中引入β-氨基-羰基化合物有着重要意义。目前还没有通过On-DNA醛基化合物构建On-DNAβ-氨基羰基化合物的方法，因此，需要开发On-DNA的水相曼尼希反应，以高效、快速地构建β-氨基羰基化合物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种On-DNA曼尼希反应构建β-氨基羰基化合物的方法，该方法反应条件温和、后处理简单，适合DNA编码化合物库的生产，能显著提高化合物库分子的多样性。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种On-DNA曼尼希反应的方法，所述反应是以On-DNA醛基化合物为原料，与活泼氢化合物和胺基化合物反应得到On-DNA产物；所述的On-DNA醛基化合物的结构式为DNA-R1-CHO，所述胺基化合物的结构式为R2R2 ’NH2，所述活泼氢化合物的结构式为
所述On-DNA产物的结构式为
其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与R1相连；所述DNA的长度为10～200bp。
其中，结构式中的DNA与R1通过一个化学键或多个化学键或基团连接；一个化学键时，是指结构式中的DNA与R1直接相连；多个化学键或基团时，指结构式中的DNA与R1之间间隔多个化学键相连，比如，DNA与R1之间通过一个亚甲基(-CH2-)相连，即通过两个化学键连接；或DNA与R1之间通过一个羰基(-CO-)连接DNA的氨基，也是通过两个化学键连接；或DNA与R1通过一个亚甲基羰基(-CH2CO-)连接DNA的氨基，即通过三个连续的化学键连接。
所述的R1为分子量1000以下与DNA和醛基碳原子直接相连的基团或无；
所述的R2、R2＇为氢或分子量1000以下与氨基氮原子直接相连的基团；
所述的R3、R3＇为氢或分子量1000以下与活泼氢所在碳原子直接相连的基团；
所述的EWG为分子量1000以下与碳原子直接相连的吸电子基团。
作为优选：所述的R1、R2、R2＇、R3、R3＇分别独立地选自烷基、取代烷基、5～10元芳基、取代5～10元芳基、5-10元芳杂环基、取代5-10元芳杂环基；其中，所述烷基为C1～C20烷基或C3～C8环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、羧基、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基中的一种或多种；取代5～10元芳基的取代基的数量为一个或多个，取代5～10元芳基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、三氟甲基中的一种或多种；取代5-10元芳杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代5-10元芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、三氟甲基中的一种或多种；
所述EWG为-NO2、-C(O)R、-CN、-C(O)OR、R-S(＝O)2-；
所述的R选自氢或C1～C12烷基；或R与R3或R3＇成环。
进一步地：所述的R1选自苯基、呋喃基、取代苯基；所述取代苯基的取代基选自卤素、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基；所述C1～C6烷氧基具体选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊烷氧基、己烷氧基；
所述的R2选自C1～C6烷基、5～10元芳基、取代5～10元芳基，所述C1～C6烷基具体选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述取代5～10元芳基的取代基选自C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、卤素；所述C1～C6烷氧基具体选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基；
所述的R2＇选自C1～C6烷基、5～10元芳基、取代5～10元芳基，所述C1～C6烷基具体选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述取代5～10元芳基的取代基选自C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、卤素；所述C1～C6烷氧基具体选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基；
所述的R3选自C1～C6烷基、C1～C6烷氧基，所述C1～C6烷基具体选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述C1～C6烷氧基具体选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基。
所述的R3＇选自C1～C6烷基、C1～C6烷氧基，所述C1～C6烷基具体选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述C1～C6烷氧基具体选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基。
更具体地：
所述的On-DNA醛基化合物选自：
所述的胺基化合物选自：
所述的活泼氢化合物选自：
本发明的提供的On-DNA曼尼希反应方法包括以下步骤：向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mM的On-DNA醛基化合物溶液中，加入10-1000倍摩尔当量的胺基化合物和0-100倍摩尔当量的催化剂，反应0.5-2小时，再加入10-1000倍摩尔当量的活泼氢化合物，在5℃～100℃下反应1-24小时。
优选地，所述反应在溶剂中进行，溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、N,N-二甲基乙酰胺，二甲亚砜、NMP、THF、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂。优选地，所述溶剂含有PBS缓冲液、BBS缓冲液或MES溶液。
优选地，所述的催化剂选自对甲基苯磺酸、L-脯氨酸或D-脯氨酸。
优选地，On-DNA醛基化合物的摩尔当量为1，所述胺基化合物的摩尔当量为20当量、50当量、100当量、200当量、300当量、400当量、500当量、600当量、800当量；所述催化剂的摩尔当量为0当量、1当量、2当量、5当量、10当量、20当量、50当量；所述活泼氢化合物的摩尔当量为20当量、50当量、100当量、200当量、300当量、400当量、500当量、600当量、800当量。
优选地，所述1-24小时的反应时间为2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、18小时或20小时。
优选地，所述0.5-2小时的反应时间为0.6小时、0.8小时、1.0小时、1.2小时、1.4小时、1.6小时、1.8小时。
优选地，所述反应的反应温度为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。
进一步地，上述方法用于单孔(单管)或批量的多孔板操作。
进一步地，上述方法用于多孔板的DNA编码化合物或化合物库的合成。
本发明方法可以实现在DNA编码化合物库构建中通过水相多组分曼尼希反应构建β-氨基羰基化合物，可大规模的引入醛、胺和含有活泼氢的化合物作为合成模块。该方法高效，产物单一，能够在有机溶剂/水相的混合水相中进行，操作简单，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(Ca～Cb)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，C1～C12烷基是指包含1～12个碳原子的直链或支链的烷基。
烷基是指烷烃分子中直链或支链的烃基，例如甲基-CH3、乙基-CH2CH3、亚甲基-CH2-；烷基基团也可以是其他基团的一部分，所述其他基团例如为C1～C6烷氧基，C1～C6烷基氨基。
环烷基：是指具有多个碳原子且没有环杂原子，且具有单个环或多个环(包括稠合、桥连和螺环体系)的饱和或部分饱和的环状基团。
所述卤素为氟、氯、溴或碘。
烷氧基：是指烷基与氧原子连接形成取代基，例如甲氧基为-OCH3。
卤代苯基：是指苯基上的H被卤素取代而形成的基团。
烷基苯基：是指苯基上的H被烷基取代而形成的基团。
芳基：是指不含杂原子，由C原子构成的芳香性单一环状或多个环状基团。
芳杂环基是由C、O、S、N等原子构成具有芳香性的单一环状或多个环状基团。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明：
图1为实施例1中化合物2的LC-Ms谱图和Ms谱图。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案进行完整的，清楚的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
本发明中DNA-NH2或者
是单链或双链DNA与接头基团形成的带有-NH2接头的DNA结构，例如WO2005058479中“compound1”的DNA-NH2结构。也例如下述的DNA结构：
其中，A为腺嘌呤，T为胸腺嘧啶，C为胞嘧啶，G为鸟嘌呤。
本发明中，“室温”指20～30℃。
HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。DIPEA：N,N-二异丙基乙胺；CAS：7087-68-5。DMSO：二甲基亚砜溶液；DMA：二甲基乙酰胺。MES：2-(N-吗啉代)乙磺酸。BBS buffer：硼酸盐缓冲溶液。NMP：N-甲基吡咯烷酮。THF：四氢呋喃。PBS buffer：磷酸缓冲盐溶液。
实施例1、化合物2的合成
预先混合分别放置于-20℃中降温5分钟的羧酸(10μL，100当量，200mM的DMA溶液)，HATU(5μL，100当量，400mM的DMA溶液)和DIPEA(5μL，100当量，400mM的DMA溶液)，然后放置于4℃中保存5分钟；将化合物DNA-NH2(10μL)溶于硼酸盐缓冲溶液(10μL，pH＝9.4,250mM)中，配成1mM的起始浓度；将上述混合物加入到DNA-NH2缓冲溶液中，再将反应液充分混匀，置于室温条件下反应12小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL的5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，得到化合物1，该化合物理论分子量为5316.0，实测分子量为5315.9。
将化合物1(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与对甲氧基苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物2，转换率为63％。理论分子量为5509.0，实测分子量为5508.7。
实施例2、化合物2的合成
将化合物1(20μL，1当量，1mM的PBS溶液)，对甲氧基苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)和L-脯氨酸(1μL，5当量，100mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时，活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，200当量，400mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物2，转换率为58％。理论分子量为5509.0，实测分子量为5508.9。
实施例3、化合物2的合成
将化合物1(20μL，1当量，1mM的PBS溶液)，对甲氧基苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)和对甲基苯磺酸(1μL，5当量，100mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，200当量，400mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物2，转换率为58％。理论分子量为5509.0，实测分子量为5508.9。
实施例4、化合物2的合成
将化合物1(20μL，1当量，1mM的MES溶液)和对甲氧基苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，200当量，400mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物2，转换率为65％。理论分子量为5509.0，实测分子量为5508.9。
实施例5、化合物2的合成
将化合物1(20μL，1当量，1mM的MES溶液)和对甲氧基苯胺(10μL，50当量，100mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，50当量，100mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物2，，转换率为71％。理论分子量为5509.0，实测分子量为5509.1。
实施例6、化合物2的合成
将化合物1(20μL，1当量，1mM的MES溶液)和对甲氧基苯胺(10μL，200当量，400mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，200当量，400mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物2，，转换率为95％。理论分子量为5509.0，实测分子量为5509.2。
实施例7、化合物2的合成
将化合物1(20μL，1当量，1mM的MES溶液)和对甲氧基苯胺(10μL，400当量，800mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时，活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，400当量，800mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物2，转换率为94％。理论分子量为5509.0，实测分子量为5509.1。
实施例8、化合物2的合成
将化合物1(20μL，1当量，1mM的MES溶液)和对甲氧基苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液在40℃条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物2，转换率为88％。理论分子量为5509.0，实测分子量为5509.1。
实施例9、化合物4的合成
预先混合分别放置于-20℃中降温5分钟的羧酸(10μL，100当量，200mM的DMA溶液)，HATU(5μL，100当量，400mM的DMA溶液)和DIPEA(5μL，100当量，400mM的DMA溶液)，然后放置于4℃中保存5分钟；将化合物DNA-NH2(10μL)溶于硼酸盐缓冲溶液(10μL，pH＝9.4,250mM)中，配成1mM的起始浓度；将上述混合物加入到DNA-NH2缓冲溶液中，再将反应液充分混匀，置于室温条件下反应12小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL的5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，得到化合物3，理论分子量为5334.0，实测分子量为5334.7。
将化合物3溶解到去离子水(10μL)中，配制成2mM的起始浓度，将化合物3(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与对甲氧基苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物4，转换率为66％。理论分子量为5527.0，实测分子量为5526.7。
实施例10、化合物6的合成
预先混合分别放置于-20℃中降温5分钟的羧酸(10μL，100当量，200mM的DMA溶液)，HATU(5μL，100当量，400mM的DMA溶液)和DIPEA(5μL，100当量，400mM的DMA溶液)，然后放置于4℃中保存5分钟；将化合物DNA-NH2(10μL)溶于硼酸盐缓冲溶液(10μL，pH＝9.4,250mM)中，配成1mM的起始浓度；将上述混合物加入到DNA-NH2缓冲溶液中，再将反应液充分混匀，置于室温条件下反应12小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL的5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，得到化合物5，理论分子量为5306.0，实测分子量为5306.8。
将化合物5溶解到去离子水(10μL)中，配制成2mM的起始浓度。将化合物5(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与对甲氧基苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物6，转换率为52％。理论分子量为5499.0，实测分子量为5499.3。
实施例11、化合物8的合成
预先混合分别放置于-20℃中降温5分钟的羧酸(10μL，100当量，200mM的DMA溶液)，HATU(5μL，100当量，400mM的DMA溶液)和DIPEA(5μL，100当量，400mM的DMA溶液)，然后放置于4℃中保存5分钟；将化合物DNA-NH2(10μL)溶于硼酸盐缓冲溶液(10μL，pH＝9.4,250mM)中，配成1mM的起始浓度；将上述混合物加入到DNA-NH2缓冲溶液中，再将反应液充分混匀，置于室温条件下反应12小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL的5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，得到化合物7，理论分子量为5334.0，实测分子量为5334.2。
将化合物7溶解到去离子水(10μL)中，配制成2mM的起始浓度，将化合物7(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与对丙基苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物8，转换率为80％。理论分子量为5539.0，实测分子量为5538.9。
实施例12、化合物10的合成
预先混合分别放置于-20℃中降温5分钟的羧酸(10μL，100当量，200mM的DMA溶液)，HATU(5μL，100当量，400mM的DMA溶液)和DIPEA(5μL，100当量，400mM的DMA溶液)，然后放置于4℃中保存5分钟；将化合物DNA-NH2(10μL)溶于硼酸盐缓冲溶液(10μL，pH＝9.4,250mM)中，配成1mM的起始浓度；将上述混合物加入到DNA-NH2缓冲溶液中，再将反应液充分混匀，置于室温条件下反应12小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL的5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，得到化合物9，理论分子量为5346.0，实测分子量为5345.8。
将化合物9溶解到去离子水(10μL)中，配制成2mM的起始浓度，将化合物9(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与对丙基苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物10，转换率为53％。理论分子量为5551.0，实测分子量为5550.6。
实施例13、化合物12的合成
预先混合分别放置于-20℃中降温5分钟的羧酸(10μL，100当量，200mM的DMA溶液)，HATU(5μL，100当量，400mM的DMA溶液)和DIPEA(5μL，100当量，400mM的DMA溶液)，然后放置于4℃中保存5分钟；将化合物DNA-NH2(10μL)溶于硼酸盐缓冲溶液(10μL，pH＝9.4,250mM)中，配成1mM的起始浓度；将上述混合物加入到DNA-NH2缓冲溶液中，再将反应液充分混匀，置于室温条件下反应12小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL的5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，得到化合物11，理论分子量为5346.0，实测分子量为5346.3。
将化合物11溶解到去离子水(10μL)中，配制成2mM的起始浓度，将化合物11(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与对丙基苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物12，转换率为44％。理论分子量为5551.0，实测分子量为5551.0。
实施例14、化合物13的合成
将化合物3(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与对丙基苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物13，转换率为90％。理论分子量为5539.0，实测分子量为5538.7。
实施例15、化合物14的合成
将化合物3(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与5-氨基茚旦(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物14，转换率为74％。理论分子量为5537.0，实测分子量为5536.7。
实施例16、化合物15的合成
将化合物3(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与4-氟苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物15，转换率为36％。理论分子量为5515.0，实测分子量为5514.7。
实施例17、化合物16的合成
将化合物1(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物16，转换率为59％。理论分子量为5479.0，实测分子量为5478.7。
实施例18、化合物17的合成
将化合物7(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与5-氨基茚旦(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物17，转换率为98％。理论分子量为5537.0，实测分子量为5537.2。
实施例19、化合物18的合成
将化合物7(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与4-氟苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物18，转换率为29％。理论分子量为5515.0，实测分子量为5515.1。
实施例20、化合物19的合成
将化合物9(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与5-氨基茚旦(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物19，转换率为51％。理论分子量为5549.0，实测分子量为5548.9。
实施例21、化合物20的合成
将化合物9(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与4-氟苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物20，转换率为43％。理论分子量为5527.0，实测分子量为5527.1。
实施例22、化合物21的合成
将化合物11(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与5-氨基茚旦(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物21，转换率为44％。理论分子量为5549.0，实测分子量为5549.0。
实施例23、化合物22的合成
将化合物11(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与4-氟苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入1-甲氧基-2-丙酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物22，转换率为28％。理论分子量为5527.0，实测分子量为5527.1。
实施例24、化合物23的合成
将化合物1(20μL，1当量，1mM的MES溶液)与对甲氧基苯胺(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)预先混合均匀，将反应液置于室温条件下活化1小时。活化完毕后，加入环己酮(10μL，100当量，200mM的DMSO溶液)，将反应液充分混匀，然后将反应液室温条件下反应16小时。
反应完毕后进行：乙醇沉淀，向溶液中加入4μL，5M的氯化钠溶液，然后继续加入120μL无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在高速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物23，转换率为59％。理论分子量为5509.0，实测分子量为5509.0。
Claims (10)
1.一种On-DNA曼尼希反应的方法，其特征在于：所述反应是以On-DNA醛基化合物为原料，与活泼氢化合物和胺基化合物反应得到On-DNA产物；所述的On-DNA醛基化合物的结构式为DNA-R1-CHO，所述胺基化合物的结构式为R2R2 ’NH，所述活泼氢化合物的结构式为
所述On-DNA产物的结构式为
其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与R1相连；
所述的R1为分子量1000以下与DNA和醛基碳原子直接相连的基团或无；
所述的R2、R2＇为氢或分子量1000以下与氨基氮原子直接相连的基团；
所述的R3、R3＇为氢或分子量1000以下与活泼氢所在碳原子直接相连的基团；
所述的EWG为分子量1000以下与碳原子直接相连的吸电子基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的R1、R2、R2＇、R3、R3＇分别独立地选自烷基、取代烷基、5～10元芳基、取代5～10元芳基、5-10元芳杂环基、取代5-10元芳杂环基；其中，所述烷基为C1～C20烷基或C3～C8环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、羧基、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基中的一种或多种；取代5～10元芳基的取代基的数量为一个或多个，取代5～10元芳基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、三氟甲基中的一种或多种；取代5-10元芳杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代5-10元芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、三氟甲基中的一种或多种；
所述EWG为-NO2、-C(O)R、-CN、-C(O)OR、R-S(＝O)2-；
所述的R选自氢或C1～C12烷基；或R与R3或R3＇成环。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的R1选自苯基、呋喃基、取代苯基；所述取代苯基的取代基选自卤素、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基；所述C1～C6烷氧基具体选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊烷氧基、己烷氧基；
所述的R2选自C1～C6烷基、5～10元芳基、取代5～10元芳基，所述C1～C6烷基具体选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述取代5～10元芳基的取代基选自C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、卤素；所述C1～C6烷氧基具体选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基；
所述的R2＇选自C1～C6烷基、5～10元芳基、取代5～10元芳基，所述C1～C6烷基具体选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述取代5～10元芳基的取代基选自C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、卤素；所述C1～C6烷氧基具体选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基；
所述的R3选自C1～C6烷基、C1～C6烷氧基，所述C1～C6烷基具体选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述C1～C6烷氧基具体选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基；
所述的R3＇选自C1～C6烷基、C1～C6烷氧基，所述C1～C6烷基具体选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述C1～C6烷氧基具体选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应的反应步骤为：向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mM的On-DNA醛基化合物溶液中，加入10-1000倍摩尔当量的胺基化合物和0-100倍摩尔当量的催化剂，反应0.5-2小时，再加入10-1000倍摩尔当量的活泼氢化合物，在5℃～100℃下反应1-24小时。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的催化剂为L-脯氨酸、D-脯氨酸或对甲基苯磺酸。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述反应在溶剂中进行，溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、N,N-二甲基乙酰胺，二甲亚砜、NMP、THF、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：On-DNA醛基化合物的摩尔当量为1，所述胺基化合物的摩尔当量为20当量、50当量、100当量、200当量、300当量、400当量、500当量、600当量、800当量；所述催化剂的摩尔当量为0当量、1当量、2当量、5当量、10当量、20当量、50当量；所述活泼氢化合物的摩尔当量为20当量、50当量、100当量、200当量、300当量、400当量、500当量、600当量、800当量。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述1-24小时的反应时间为2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、18小时或20小时。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于：所述方法可以用于单管操作或者批量的多孔板操作。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于：所述方法用于DNA编码化合物或化合物库的合成。
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