CN108070009A - 一种制备dna编码化合物文库的方法及起始头片段化合物和制得的dna编码化合物 - Google Patents

一种制备dna编码化合物文库的方法及起始头片段化合物和制得的dna编码化合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种制备含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库的方法，该方法使用的新型起始头片段带有两个或多个可化学修饰的连接基团，起始头片段包括一条核苷酸链，核苷酸链的5’和3’分别具有可以进行化学反应的基团R1和R2，核苷酸链上具有n个连接头，连接头是由该核苷酸链上的核苷酸单体经修饰后延伸出的长链，每个长链上均具有一个可进行化学反应的位点G。该起始头片段的位点G分别与片段化合物反应生成使该位点G与片段化合物连接在一起的片段化合物残基B，形成DNA编码化合物，最终可以得到含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库。通过本发明的方法及起始头片段可以高效、简单、迅速地得到含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库。

Description

一种制备DNA编码化合物文库的方法及起始头片段化合物和 制得的DNA编码化合物
技术领域
本发明涉及组合化学领域，特别是涉及一种制备含有两个或多个药效团的DNA编码化 合物文库的方法其制得的DNA编码化合物和起始头片段化合物。该方法采用一种新型的用 于DNA编码化合物文库构建的起始头片段，该起始头片段带有两个或多个可化学修饰的连 接基团，通过文库的构建，最终可以得到含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库。
背景技术
药物靶标是指与某种疾病的发生有因果关系或者参与疾病的发展过程,并通过某类药物 对其活性进行调节而实现治疗该种疾病目的的生物分子，自引入离体筛选(invitro)的概念 以来,随着分子生物学、蛋白质组学、基因组学和高通量筛选技术(Highthroughput screening， 简称HTS)的进步，使药物发现从依赖体内筛选(in vivo)逐渐转变到“一病一靶”，现代药 物发现的基础就是寻找分子靶点并证明其与疾病的相关性。但是随着研究的进一步深入,人 们发现单一靶点药物也存在着明显的不足：一是多数疾病并不是由单一基因或靶点导致，单 一基因或靶点异常导致的疾病仅占少数；二是药物靶标并不是某种疾病所独有的，多数具有 多重生物功能，过分抑制或激活体内某一生物分子，在干预其本身生物功能的同时，有可能 影响与其相关的生物分子的功能，从而导致副作用；三是很难找到仅作用于单一靶点的分子。
多靶点(Multi-target)药物可以同时作用于疾病相关的多个靶点，对各靶点的作用可以 产生协同效应，使总效应大于各单效应之和，获得所需的多样性的生物调节功能，减少副作 用，达到最佳的治疗效果，目前在肿瘤治疗过程中使用较多。将两个选择性的潜在药物分子 的药效团组合是获得多靶点药物的重要手段。药效团的组合可以通过用可断裂的或不可断裂 的间隔基来连接具有不同作用的药效团片段，也可以通过不同药效团中相同部分的叠加，或 者对其中一个药效团进行化学修饰，整合得到一个新的药效团分子。基于片段药物设计 (Fragment-Based Drug Discovery，简称FBDD)是多靶点配体设计中的一个比较方便可行的 方法，通过筛选片段化合物数据库，能够得到对两个或多个靶标具有较弱亲和力的片段化合 物，通过药物化学的手段增加其他功能性片段，实现增加对两个靶标的亲和力或者达到所希 望的平衡。该方法仅需要少量的片段化合物进行合成和筛选，在获得先导化合物方面表现出 较高的成功率，目前已经有2个上市药物——Vemurafenib(维罗非尼，黑色素瘤治疗药， Plexxikon公司研制，于2011年上市)和Venetoclax(淋巴细胞白血病治疗药，AbbVie公司 研制，于2016年上市)，还有至少30个候选药物正在临床实验中。
目前在药物研究和筛选领域的另一研究热点是美国Scripps研究院的SydneyBrenner和 Richard Lerner教授于1992年提出了DNA编码化合物文库(DNAEncodedLibrary，简称DEL) 的概念(参考文献：Proc.Natl.Acad.Sci.,1992,89,5381，专利：US5573905)。该方法通过将 一个片段化合物与一段独特序列的DNA在分子水平进行连接(即对小分子化合物进行DNA标 记)，利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物 库，该化合物库中每一个化合物都由不同片段化合物组成，并由相应的唯一碱基序列的DNA 标识，将极少量的DNA编码化合物库与靶标进行亲和筛选，与靶标没有吸附的化合物库 分子先被洗掉，留下的与靶标有吸附的化合物库分子再洗脱下来，这时得到的化合物库 分子浓度很低，常规手段难以分析和识别，但是通过DNA独有的聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，简称PCR)可以把得到的与靶标有吸附的化合物库分子中 的DNA部分进行复制扩增直至得到的DNA量可以被DNA测序仪识别，测序后的数据再 通过构建DNA编码化合物文库时创建的片段化合物与每个具体DNA碱基序列之间的关系 表来解码，进而找到可以识别具有潜在活性分子相对应的具体化合物对应的片段化合 物，我们再通过传统的有机合成方法把这些片段化合物组合在一起得到筛选的目标分 子，再检测并确认其对靶标的生理活性。
DNA编码化合物文库的构建方法主要有三种，第一种是以美国Ensemble公司为主利用 DNA模板技术得到的DNA导向分子库(DNA-Templated Chemical Library Synthesis，简称 DTCL)，第二种是以美国GSK公司、X-Chem公司和国内的成都先导公司为主利用DNA标记 技术得到的DNA记录分子库(DNA-Recorded Chemical Library，简称DRCL)，第三种是以瑞 士Philogen公司为主基于片段的药物设计(FBDD)技术得到的编码自组装分子库(Encoded Self-Assembling Chemical Libraries，简称ESAC)。目前工业上被大量运用的构建DNA编码化 合物文库的方法主要还是第二种方法，该方法操作简单，成本更低，能更快速地利用组合化 学方法得到含有海量的小分子化合物的DNA编码化合物文库。该方法根据使用DNA链的不 同，又分为以GSK公司为主的核苷酸双链链接(参考专利：CN101864412A)和以X-Chem公 司为主的核苷酸单链链接(参考专利：CN103998658A)两种方式。GSK公司的专利 (CN101864412A)中详细阐述了他们用于DNA编码化合物文库构建的一种“Y”构型的起始头片段以及使用生物酶催化进行DNA双链链接的方法；X-Chem公司的专利(CN102317513A)中也描述了他们用于DNA编码化合物文库构建的一种“dT”构型的起始头片段以及使用生物酶催化进行DNA双链链接的方法，他们后续的专利(CN103998658A)则详细阐述了他们使 用单链来构建DNA编码化合物文库，以及使用各种保护策略通过生物酶催化或是化学反应来达到寡聚核苷单酸的链接目的。X-Chem公司虽然介绍了很多单链的化学链接方法，但是通过 其发表的文献(参考文献：Sci.Rep.2015,5,10916)不难看出该方法的合成效率很低，一个3 循环的DNA编码化合物文库合成完毕后的回收率只有4.7％，远远低于一般文献报道的3个循 环DNA编码化合物文库20％的回收率，实际应用受到较大的限制。
把基于片段药物设计(FBDD)与DNA编码化合物文库(DEL)结合起来用于先导化合物的筛选是由瑞士苏黎世联邦理工学院的Dario Neri教授首创(参考文献：Nat.Biotech.,2004, 22,568；Nat.Chem.,2015,7,241-249；US 2004/0014090A1)，他们基于FBDD技术设计了编码 自组装分子库(Encoded Self-Assembling Chemical Libraries，简称ESAC)。该方法可以将不同 的片段化合物与核苷酸单链连接，通过两条单链部分恒定碱基的互补配对形成双链，将不同 的片段化合物组合在一个分子文库中，对应靶点蛋白进行体外筛选。该方法充分利用了FBDD 和DEL的各自优势，合成的化合物文库含有2个或3个片段化合物，可用于多靶点药物的筛选， 在片段化合物的选择上没有任何限制，大大丰富了DNA编码化合物文库的化学丰富性，扩大 了DNA编码化合物文库的应用范围。但是该方法也有很大的局限性，一是循环少，得到的化 合物分子的个数有限，一般很难达到百万级别，与DNA记录分子库(DRCL)动辄几个亿， 甚至几十亿个化合物分子的文库完全不在一个水平上；二是需要分别合成两个或三个子库， 工作量大，合成周期长；三是这些子库之间的核苷酸单链都必须有一段较长的固定碱基序列 用于碱基配对形成双链，可用于编码的碱基数占比较少；四是不同子库的核苷酸编码区需要 通过Klenow fill-in补齐来整合到一个子库的核苷酸单链上，编码转化繁琐；五是主要用于双 靶标药物筛选，由于核苷酸单链本身的限制，很难用于更多靶标的筛选。
发明内容
为了解决上述问题，本发明详细介绍了一种新型的用于DNA编码化合物文库构建的起 始头片段，该起始头片段带有两个或多个可化学修饰的连接基团，通过文库的构建，最终可 以高效、简单、迅速地得到含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库。
名词解释：
多靶点(Multi-target)药物：同时作用于疾病相关的多个靶点、调节疾病网络的多个环 节，对各靶点的作用可以产生协同效应，使总效应大于各单效应之和，获得所需的多样性的 生物调节功能，减少副作用，达到最佳的治疗效果。
基于片段药物设计(Fragment-Based Drug Discovery，简称FBDD)：整个分子与靶点的结 合能可以看作是其片段与靶点间结合能的贡献的函数，通过对靶标结合的片段分子的筛选和 优化可以得到新颖的活性更好的药物实体。
DNA链接(DNA ligation)：利用生物酶或化学反应的方法将起始DNA片段和后续的DNA片段连接在一起，成为一个完整的重组分子的过程。
本发明详细介绍了一种新型的用于DNA编码化合物文库构建的起始头片段，该起始 头片段带有两个或多个可化学修饰的连接基团，通过文库的构建，最终可以得到含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库，没有特别说明，本发明提及的碱基序列都是指 5’到3’方向顺序排列的。
本发明主要包含以下内容：
(1)本发明提供一种用于制备含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库的起始头片段，其具有多个反应位点：所述起始头片段包括一条核苷酸链，该核苷酸链的5’ 和3’分别具有可以进行化学反应的基团R1和R2，该核苷酸链上具有n个连接头，所述连 接头是由该核苷酸链上的一个或多个核苷酸单体经修饰后延伸出的长链，每个长链上均 具有一个或多个可进行化学反应的位点Gn，其中n＝1、2、3、……、20。该起始头片段 的化学结构为图16所示式1化合物；
其中，横排的黑色长方形为一条核苷酸链，竖线为核苷酸链上的核苷酸单体修饰后 延伸出来的长链，G1、G2和Gn为可以进行化学反应的位点，n是指这些长链和功能团的 个数，n＝1、2、3、……、20，R1和R2是可以进行化学反应的基团。
其中，核苷酸链可以是正常核苷酸单体聚合得到的，也可以是人工修饰后的核苷酸 单体聚合后得到的，包括肽核酸，该核苷酸链可以是单链，也可以是双链，是单链的情况下，没有碱基修饰的核苷酸单链的部分碱基可以互补配对，形成一个大的发卡结构， 发卡末端留有m个碱基作为配对区，m是2到20之间的整数，互补区域的碱基序列中有p 个酶切位点或q个可以通过化学反应进行切断的功能团，如化学切断、光切基团，p、q＝ 0、1、2、3、4、5；延伸出来的长链可以是来自一个修饰过的核苷酸单体，修饰的位置 可以是碱基，可以是五碳糖，可以是磷酸基团，也可以是其他人工修饰过的核苷酸单体 的任意位置；延伸出来的长链也可以来自不同的修饰过的核苷酸单体，该核苷酸单体可 以是A、T、C和G中任意一个，修饰的位置可以是碱基，可以是五碳糖，可以是磷酸基 团，也可以是其他人工修饰过的核苷酸单体的任意位置，带有长链的修饰过的核苷酸单 体可以连续出现，可以单独出现，可以在一条核苷酸单链上，也可以同时出现在核苷酸 双链的两条单链上，任意相邻的两个带有长链的修饰过的核苷酸单体间可以间隔o个碱 基，o＝0、1、2、3、……、20；该延伸出来的长链可以是长烷基链，也可以是聚乙二 醇链。G1、G2和Gn是相互之间不会发生直接化学反应的功能团，它们可以是相同的化 学功能团，可以是不同的化学功能团，也可以是部分相同、另一部分不同的化学功能团， R1和R2是可以进行化学反应的基团，它们可以是磷酸基和羟基、炔基和叠氮基、重氮基 和炔基、碘基和硫代磷酸酯基、仲胺基与醛或酮基、氨基与羧酸基、氨基与烷基卤或芳 基卤、氨基与烯基或炔基、磷叶立德基团和醛或酮基、环加成反应的双烯和亲双烯体基 等。
(2)本发明提供一种含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库的合成方法：
a、使用组合化学方法中的“拆分-组合”策略，把含有起始头片段的溶液分成n等分，通过两个核苷酸链的配对区的反应基团的反应，让起始头片段与n个不同的核苷酸 双链链接，处理纯化后，再让起始头片段上G1反应基团与n个不同的片段化合物反应， 之后把所有化合物混合到一起，处理纯化，n是1或大于1的整数。
b、将步骤a得到混合物的溶液分成m等分，通过两个核苷酸链的配对区的反应基团的反应，让步骤a得到的核苷酸链与m个不同的核苷酸双链反应，处理纯化后，再让G2反应基团与m个不同的片段化合物反应，之后把所有化合物混合到一起，处理纯化，m 是1或大于1的整数。
c、将步骤b得到混合物的溶液分成l等分，通过两个核苷酸链的配对区的反应基团的反应，让步骤b得到的核苷酸链与l个不同的核苷酸双链反应，处理纯化后，再让G3反应基团与l个不同的片段化合物反应，之后把所有化合物混合到一起，处理纯化，l是1 或大于1的整数。
按照上述步骤通过简单的三个循环，我们就得到了一个含有3个药效团的共计有m*n*l个化合物的DNA编码化合物文库。经过更多个循环即可得到含有更多个药效团的 DNA编码化合物文库。
(3)本发明提供一种含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库的合成方法，得到的具体的含有两个或多个药效团的化合物具有一条核苷酸链，该核苷酸链的5’和3’分别具有可以进行化学反应的基团R1和R2，该核苷酸链上具有n个连接头，连接头是由 该核苷酸链上的一个或多个核苷酸单体经修饰后延伸出的长链，每个长链上均具有一个 或多个可进行化学反应的位点G，位点G包括G1、G2、……Gn，其中n＝1、2、3、……、 20；位点G分别与片段化合物反应生成使该位点G与片段化合物连接在一起的片段化合 物残基B，片段化合物残基B包括分别与G1、G2、……Gn相对应的B1、B2、……Bn。该 含有两个或多个药效团的化合物具有图17所示式2化合物的结构；
其中，横排的黑色长方形是一条核苷酸链，竖线是核苷酸链上的核苷酸单体修饰后 延伸出来的长链，G1、G2和Gn是可以进行化学反应的功能团的残基，B1、B2和Bn是片 段化合物分别与G1、G2和Gn进行化学反应后留下的片段化合物的残基，n是指这些长链 和功能团的个数，n＝1、2、3、……、20。
其中，核苷酸链可以是正常核苷酸单体聚合得到的，也可以是人工修饰后的核苷酸 单体聚合后得到的，包括肽核酸，核苷酸链可以是单链，也可以是双链，是单链的情况下，没有碱基修饰的核苷酸单链部分有m个碱基可以互补配对，形成一个大的发卡结构， m是10到250以内的整数，碱基互补区域的碱基序列中有p个酶切位点或q个可以通过化 学反应进行切断的功能团，如化学切断、光切基团，p、q＝0、1、2、3、4、5；延伸出 来的长链可以是来自一个修饰过的核苷酸单体，修饰的位置可以是碱基，可以是五碳糖， 可以是磷酸基团，也可以是其他人工修饰过的核苷酸单体的任意位置；延伸出来的长链 也可以来自不同的修饰过的核苷酸单体，该核苷酸单体可以是A、T、C和G中任意一个， 修饰的位置可以是碱基，可以是五碳糖，可以是磷酸基团，也可以是其他人工修饰过的 核苷酸单体的任意位置，带有长链的修饰过的核苷酸单体可以连续出现，可以单独出现， 可以出现在同一个单链上，也可以出现在核苷酸双链的不同单链上，任意相邻的两个带 有长链的修饰过的核苷酸单体间可以间隔o个碱基，o＝0、1、2、3、……、20；该延 伸出来的长链可以是长烷基链，也可以是聚乙二醇链。G1、G2和Gn是相互之间不会发 生直接化学反应的功能团，它们可以是相同的化学功能团，可以是不同的化学功能团， 也可以是部分相同、另一部分不同的化学功能团，B1、B2和Bn是片段化合物分别与G1、 G2和Gn进行化学反应后留下的片段化合物的残基，B1、B2和Bn可以是一个循环引入的单 一的片段化合物残基，也可以是两个或多个循环引入的多个单一片段化合物残基的组合 体，B1、B2和Bn之间可以互不相连，也可以通过化学修饰让它们之间任意两个或多个片 段化合物的残基通过共价键相连，如B1和B2通过共价键相连得到含有n-1个药效团的化 合物，但是该化合物包含一个大环类药效团。
(4)本发明提供了具有多个反应位点的起始头片段与核苷酸双链的链接方式：
a、核苷酸双链的设计是通过计算机编码设计和排列组合，得到的具有一定规则的核苷酸双链，再通过计算机语言进行筛选得到可用于DNA编码化合物文库构建的一整套 核苷酸双链，这些核苷酸双链主要是由配对区、编码区和反应基团组成。根据设计需要， 这些核苷酸双链的配对区、编码区和反应基团可以根据所设置的一些规则来进行筛选。
比如，对于核苷酸双链编码区，其计算机编码的筛选规则可以包括：(a)计算机 编码得到m碱基对的碱基完全互补配对的核苷酸双链：设定编码区碱基对长度m，完成 计算机编码，得到所有碱基排列组合的上下链完全碱基互补配对的核苷酸双链，m＝3、 4、5、……、50。(b)按照设置的规则对得到的用于编码区的核苷酸双链进行筛选， 具体的筛选规则如下：1)核苷酸双链中上链或下链自身不能通过碱基互补配对形成反 向互补的双链。2)核苷酸双链中上链或下链的5’端和3’端不能有n个碱基能通过碱基 互补配对形成一小段双链，从而让该条核苷酸单链形成发卡形式，n为≥3的整数，具体 的，n＝3、4、……、(m/2)-1，m是该条单链的碱基长度，m/2取整数部分的值；优 选的，m是5到15之内的整数。3)核苷酸双链中的上链和下链在错位o个碱基后不能形 成反向互补的双链，o＝1、2、……、(m/2)+1，m是该条单链的碱基长度，m/2取整 数部分的值；优选的，m是5到15之内的整数。4)核苷酸双链中的GC含量必须是在合适 的范围内(如40-60％)，具体就是核苷酸双链中每条单链的GC含量在40-60％范围内， 也可以说成是核苷酸双链中(A+T)/(G+C)比率在0.67-1.5。5)核苷酸双链之间的最大分 子量差异与核苷酸双链的平均分子量之比不能超过0.1％；优选的，不能超过0.02％。分 子量差异太大，会在建库过程中给通过LCMS判断片段化合物与DNA的反应成功与否的 判断带来很大的挑战。6)核苷酸双链的上链或下链中不能连续出现3个或3个以上的相 同碱基。连续出现多个相同碱基，如GGG或CCC，会使PCR时的错配机率增加。7)核 苷酸双链的上链也可以作为另一个核苷酸双链的下链使用(即直接把上链碱基序列的方 向从5’到3’调整为3’到5’并作为另一个核苷酸双链的上链)，反之下链也可以作为 另一个核苷酸双链的上链使用，但是不可有重复的核苷酸双链。8)核苷酸双链集合中 各个碱基序列之间的汉明距离需要大于等于2，更优选大于等于3，或更高。汉明距离越 大，在后续的PCR过程中发生的碱基错配和突变就越容易被发现，这样PCR得到的碱基 序列的数据的准确性就越接近真实值。
对于核苷酸双链配对区，其计算机编码的筛选规则可以包括：(a)计算机编码得到a碱基对的碱基完全互补配对的核苷酸双链：设定配对区碱基对长度a，完成计算机编码，得到所有碱基排列组合的上下链完全碱基互补配对的核苷酸双链，a＝2、3、4、……、20。(b)按照设置的规则对得到的用于配对区的核苷酸双链进行筛选，具体的筛选规 则如下：1)核苷酸双链中上链或下链自身不能是回文序列，且每个单链中碱基序列的5’ 端和3’端能形成发卡结构的碱基数量之和不超过整条单链的碱基总数的50％。2)核苷 酸双链中上链或下链自身不能连续含有3个或以上的相同碱基。3)核苷酸双链中上链或 下链GC含量在20-80％之间。这样可以保证配对区和编码区的核苷酸双链组合在一起后 形成的最终用于DNA编码化合物文库的核苷酸双链的GC含量符合要求，也即在40-60％ 范围内或相差不大。但在只有2个碱基作为配对区碱基序列时，可以不用考虑GC含量这 一限制。
对于核苷酸双链编码区和配对区组合得到5’或3’端有突出的核苷酸双链的方法，可以包括：(a)DNA编码化合物文库的具有部分双链结构的起始头片段一般是有一条 单链有突出的碱基序列，突出的碱基数量是2、3、4、……、20个，该突出的碱基序列 包含在我们计算得到的核苷酸双链配对区内。(b)第一个循环可与该起始头片段链接 的核苷酸双链集合的构建方法如下：首先是配对区核苷酸双链与起始头片段的突出碱基 序列的互补链的5’端与编码区核苷酸双链中一条单链的3’端组合，或者是配对区核苷 酸双链与起始头片段的突出碱基序列的互补链的3’端与编码区核苷酸双链中一条单链 的5’端组合；二是编码区核苷酸双链中另一条互补的单链的3’端与另一套配对区核苷 酸双链中的一条单链的5’端组合，或者编码区核苷酸双链中另一条互补的单链的5’端 与另一套配对区核苷酸双链中的一条单链的3’端组合；这样就得到了一对上下链部分 碱基能完全互补、上链或下链在5’端和/或3’端有突出碱基序列、可以与起始头片段 的突出碱基序列互补结合的第一个循环的核苷酸双链的集合。(c)第n个循环的核苷酸 双链的构建方法如下：首先是把起始头片段与第一个循环的核苷酸双链的组合体看作一 个新的起始片段，该起始片段也有一条单链有一个新的突出碱基序列，按照步骤b的构 建方法得到第n个循环的核苷酸双链集合，n＝2、3、4、……、20。
对于组合后的核苷酸双链集合的筛选方法，可以包括：再次按照核苷酸双链编码区 设定的八个规则对组合后得到的核苷酸双链集合进行筛选，组合后的核苷酸双链集合对 规则一、四、五、七和八仍然遵守，主要是再次进行规则二、三和六的筛选。
对于核苷酸双链反应基团，其计算机编码的筛选规则可以包括：(a)上一个循环核苷酸双链集合的上链的3’端与下一个循环核苷酸双链集合的上链5’端需要含有反应 基团和其互补反应基团，基团上可以带有保护基团；上一个循环核苷酸双链集合的下链 的5’端与下一个循环核苷酸双链集合的下链3’端需要含有反应基团和其互补反应基团， 基团上可以带有保护基团。所述互补是指该反应基团和其互补反应基团在一定条件下可 以发生化学反应使两个基团形成共价键连接。(b)这些反应基团和其互补反应基团包 括磷酸基和羟基，炔基和叠氮基，重氮基和炔基，碘基和硫代磷酸酯基，仲胺基与醛或 酮基，氨基与羧酸基，氨基与烷基卤或芳基卤，氨基与烯基或炔基，磷叶立德基团和醛 或酮基，环加成反应的双烯和亲双烯体基等，这些反应基团和其互补反应基团都可以带 有保护基团或是带有可以通过一步化学反应转化为可以互相反应的反应基团和其互补 反应基团的基团。
b、起始头片段中位于两端的反应基团与核苷酸双链位于一侧的反应基团正好是一 对反应基团和其互补反应基团，所述互补是指该反应基团和其互补反应基团在一定条件 下可以发生化学反应使两个基团形成共价键连接。首先把起始头片段与核苷酸双链按照 一定比率混匀，90℃退火5分钟，因为配对区碱基序列碱基完全互补配对，退火后这两个核苷酸双链会迅速杂交成为一个双链复合物，拉近了配对区末端的碱基上的两个化学基团的空间距离，使得它们的有效浓度升高，从而使得原本是分子间的化学反应转化为 分子内的化学反应，反应速率大大提高。
c、这些反应基团和其互补反应基团可以是磷酸基和羟基、炔基和叠氮基、重氮基和炔基、碘基和硫代磷酸酯基、仲胺基与醛或酮基、氨基与羧酸基、氨基与烷基卤或芳 基卤、氨基与烯基或炔基、磷叶立德基团和醛或酮基、环加成反应的双烯和亲双烯体基。
本发明介绍了一种带有两个或多个可化学修饰的连接基团的核苷酸链的起始头片 段，参与到DNA编码化合物文库的构建，最终可以得到含有两个或多个药效团的DNA 编码化合物文库，该文库中的化学分子都含有两个或多个药效团且通过长链与一段核苷 酸链相连，没有特别说明，本发明提及的核苷酸链的碱基序列都是指5’到3’方向顺序 排列的，本发明所述的核苷酸链都是人工合成的。
其中，内容(1)的核苷酸链可以是正常核苷酸单体聚合得到的，也可以是人工修饰后的核苷酸单体聚合后得到的，包括肽核酸(Peptide nucleic acid，简称PNA)，核苷 酸链可以是单链，也可以双链。
其中，内容(1)的核苷酸链是单链时，没有碱基修饰的核苷酸单链部分有m个碱 基可以互补配对，形成一个大的发卡结构，m是10到250以内的整数，碱基互补区域的 碱基序列中有p个酶切位点或q个可以通过化学反应进行切断的功能团，如化学切断、光 切基团，p、q＝0、1、2、3、4、5，p和q不可以同时为0；可以使用的限制性内切酶有 AflIII、AscI、AvaI、BamHI、BglII、BssHII、BstEII、BstXI、ClaI、EcoRI、HaeIII、 HindIII、KpnI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、NsiI、PacI、PmeI、PstI、PvuI、SacI、 SacII、SalI、ScaI、SmaI、SpeI、SphI、StuI、XbaI、XhoI和XmaI等，可通过化学反应 进行切断的功能团有：二硫键、羟胺键、重氮键、偶氮键、硅氧键、2-硝基苯基丙二醇 类醚键、邻二醇键、砜乙基氧羰基键、三芳基膦亚甲基羰基键、巯乙基硫酸酯键，没有 碱基修饰的核苷酸链有一端有一个突出碱基序列作为配对区，核苷酸链的两端都带有一 个化学反应基团，用于与后面标记片段化合物的核苷酸双链配对并发生化学反应而链 接，这些反应基团可以是磷酸基和羟基、炔基和叠氮基、重氮基和炔基、碘基和硫代磷 酸酯基、仲胺基与醛或酮基、氨基与羧酸基、氨基与烷基卤或芳基卤、氨基与烯基或炔 基、磷叶立德基团和醛或酮基、环加成反应的双烯和亲双烯体基。
其中，内容(1)的核苷酸链是双链时，没有碱基修饰的核苷酸链两端都有一个突出碱基序列作为配对区，核苷酸双链任意一条单链两端都带有一个化学反应基团，用于 与后面标记片段化合物的核苷酸双链配对并发生化学反应而链接，这些反应基团可以是 磷酸基和羟基、炔基和叠氮基、重氮基和炔基、碘基和硫代磷酸酯基、仲胺基与醛或酮 基、氨基与羧酸基、氨基与烷基卤或芳基卤、氨基与烯基或炔基、磷叶立德基团和醛或 酮基、环加成反应的双烯和亲双烯体基。
其中，内容(1)的延伸出来的长链可以来自同一个修饰过的核苷酸单体，修饰的位置可以是常规核苷酸单体的任意位置，如碱基、五碳糖或磷酸基团等，也可以是其他 人工修饰过的核苷酸单体的任意位置；该长链也可以来自不同的修饰过的核苷酸单体， 该核苷酸单体可以是A、T、C和G中任意一个，修饰的位置可以是常规核苷酸单体的任 意位置，如碱基、五碳糖或磷酸基团等，也可以是其他人工修饰过的核苷酸单体的任意 位置，带有长链的修饰过的核苷酸单体可以连续出现，可以单独出现，可以在一条核苷 酸单链上，也可以同时出现在核苷酸双链的两条单链上，一条核苷酸单链上任意相邻的 两个带有长链的修饰过的核苷酸单体间可以间隔o个碱基，o＝0、1、2、3、……、20。
其中，内容(1)的长链可以是长烷基链，也可以是聚乙二醇链，也可以是他们相 互交叉形成的长链，不同的长链的原子个数可以是一样的，也可以是不一样的。
其中，内容(1)的G1、G2和Gn是相互之间不会发生直接化学反应的功能团，它们 可以是相同的化学功能团，可以是不同的化学功能团，也可以是部分相同、另一部分不 同的化学功能团，他们具体可以是氨基(NH2)、仲胺基(NH)、叔丁氧羰基胺基(Boc-N)、 芴甲氧羰基胺基(Fmoc-N)、6-硝基藜芦氧基胺基(Nvoc-N)、烯丙氧基羰基胺基 (Alloc-N)、邻硝基苯磺酰基胺基(Ns-N)、甲砜基乙氧羰基胺基(Msec-N)、三氟 乙酰基胺基(CF3CO-N)、硝基(NO2)、羧基(CO2H)、甲氧羰基(MeO2C)、乙 氧羰基(EtO2C)、叔丁氧羰基(tBuO2C)、杂环芳氯(ArCl)、芳基氟(ArF)、芳 基碘(ArI)、芳基溴(ArBr)、醛基(CHO)、二甲氧基缩醛(CH(OMe)2)、二乙氧 基缩醛(CH(OEt)2)、乙二醇缩醛(CH(OCH2)2)、酮基(C＝O)、二甲氧基缩酮(C(OMe)2)、 二乙氧基缩酮(C(OEt)2)、乙二醇缩酮(C(OCH2)2)、叠氮(N3)、炔基(C≡C)、 胺氧基(NH-O)、二环[6.1.0]壬炔(bicyclo[6.1.0]nonyne，简称BCN)、烷基溴(CH2Br)、 烷基氯(CH2Cl)、二苯并环辛炔(Dibenzocyclooctyne，简称DBCO)、2,4-二硝基苯 (2,4-Dinitrophenol，简称DNP)、马来酰亚胺(Maleimide)、磷酸(PO3 2-)、磷酸乙 酯(PO(OEt)2)、磺酸(SO3 -)、羟基(OH)和巯基(SH)。
其中，内容(1)的G1、G2和Gn可以通过化学合成的方法连在在一起，再从连接链 上引出一条带有可引入片段化合物的化学位点的长链，这样又得到一个可用于制备含有 单一药效团的DNA编码化合物文库的起始头片段。
其中，内容(1)的R1和R2是可以进行化学反应的基团，它们可以是磷酸基和羟基、炔基和叠氮基、重氮基和炔基、碘基和硫代磷酸酯基、仲胺基与醛或酮基、氨基与羧酸 基、氨基与烷基卤或芳基卤、氨基与烯基或炔基、磷叶立德基团和醛或酮基、环加成反 应的双烯和亲双烯体基等。
其中，G1、G2和Gn是相同的反应基团时，内容(2)的一个循环可以在所有相同的 反应基团上进行同样的化学反应，得到两个或多个具有相同药效团的带有DNA编码的化 合物分子。
其中，G1、G2和Gn是不相同的反应基团时，内容(2)的步骤a可以在任意一个反应 基团G1上进行化学反应，步骤b可以在任意另一个反应基团上进行化学反应，也可以在 原来的反应基团G1反应后得到的新的分子上继续反应，步骤c可以在任意非步骤a和b的 反应基团上进行化学反应，也可以在步骤a或b的反应基团反应后得到的新的分子上继续 反应。
其中，内容(2)的步骤不仅限于3步反应，可以有2步反应，也可以是4步反应、5 步反应、6步反应、7步反应、8步反应、9步反应、10步反应、11步反应、12步反应、13 步反应、14步反应、15步反应、16步反应、17步反应、18步反应。
其中，内容(2)中每个循环中前一个核苷酸链与标记片段化合物的核苷酸双链的链接方式可以是生物酶催化的链接，可以使用的生物酶有:Blunt/TA Ligase Master Mix、Instant Sticky-end Master Mix、T4DNA Ligase、QuickLigationTMKit、 T3DNA Ligase、T7DNA Ligase、HiFi Taq DNA Ligase、Taq DNA Ligase、9°NTMDNA Ligase、E.coli DNA Ligase等。
其中，内容(2)中每个循环中前一个核苷酸链与标记片段化合物的核苷酸双链的链接方式也可以是常规化学反应得到的共价链接，此时，需要前一个核苷酸链的5’端和 标记核苷酸双链的3’端的化学基团是一对反应基团和其互补反应基团，且前一个核苷酸 链的3’端和标记核苷酸双链的5’端的化学基团是同一对反应基团和其互补反应基团；不 同循环之间的化学链接需要的反应基团和其互补反应基团可以相同，也可以不相同。
其中，内容(2)中配对区的反应基团是一对反应基团和其互补反应基团，它们可以是磷酸基和羟基、炔基和叠氮基、重氮基和炔基、碘基和硫代磷酸酯基、仲胺基与醛 或酮基、氨基与羧酸基、氨基与烷基卤或芳基卤、氨基与烯基或炔基、磷叶立德基团和 醛或酮基、环加成反应的双烯和亲双烯体基等。
其中，内容(3)的核苷酸链可以是正常核苷酸单体聚合得到的，也可以是人工修饰后的核苷酸单体聚合后得到的，包括肽核酸(Peptide nucleic acid，简称PNA)，核苷 酸链可以是单链，也可以双链。
其中，内容(3)的核苷酸链是单链时，没有碱基修饰的核苷酸单链部分有m个碱 基可以互补配对，形成一个大的发卡结构，m是10到250以内的整数，碱基互补区域的 碱基序列中有p个酶切位点或q个可以通过化学反应进行切断的功能团，如化学切断、光 切基团，p、q＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，p和q不可以同时为0；可以使用 的限制性内切酶有AflIII、AscI、AvaI、BamHI、BglII、BssHII、BstEII、BstXI、ClaI、 EcoRI、HaeIII、HindIII、KpnI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、NsiI、PacI、PmeI、 PstI、PvuI、SacI、SacII、SalI、ScaI、SmaI、SpeI、SphI、StuI、XbaI、XhoI和XmaI等， 可通过化学反应进行切断的功能团有：二硫键、羟胺键、重氮键、偶氮键、硅氧键、2- 硝基苯基丙二醇类醚键、邻二醇键、砜乙基氧羰基键、三芳基膦亚甲基羰基键、巯乙基 硫酸酯键。
其中，内容(3)的延伸出来的长链可以来自同一个修饰过的核苷酸单体，修饰的位置可以是常规核苷酸单体的任意位置，如碱基、五碳糖或磷酸基团等，也可以是其他 人工修饰过的核苷酸单体的任意位置；该长链也可以来自不同的修饰过的核苷酸单体， 该核苷酸单体可以是A、T、C和G中任意一个，修饰的位置可以是常规核苷酸单体的任 意位置，如碱基、五碳糖或磷酸基团等，也可以是其他人工修饰过的核苷酸单体的任意 位置，带有长链的修饰过的核苷酸单体可以连续出现，可以单独出现，可以在一条核苷 酸单链上，也可以同时出现在核苷酸双链的两条单链上，一条核苷酸单链上任意相邻的 两个带有长链的修饰过的核苷酸单体间可以间隔o个碱基，o＝0、1、2、3、……、20。
其中，内容(3)的长链可以是长烷基链，也可以是聚乙二醇链，也可以是他们相 互交叉形成的长链，两条链的原子个数可以相同，也可以不相同。
其中，内容(3)的G1、G2和Gn与片段化合物反应完的化学基团残基，它们可以是 相同，可以是不同的，也可以是部分相同、另一部分不同，他们具体可以是氨基残基 (NH)、仲胺基残基(N)、羰基残基(CO)、杂环芳基残基或芳基残基(Ar)、亚 甲基(CH2)等。
其中，内容(3)的B1、B2和Bn是片段化合物分别与G1、G2和Gn进行化学反应后留 下的片段化合物的残基，B1、B2和Bn可以是一个循环引入的单一的片段化合物残基，也 可以是两个或多个循环引入的多个单一片段化合物残基的组合体，B1、B2和Bn之间可以 互不相连，也可以通过化学修饰让它们之间任意两个或多个片段化合物的残基通过共价 键相连，如B1和B2通过共价键相连得到含有n-1个药效团的化合物，但是该化合物包含 一个大环类药效团。
本发明提供了一种高效、迅速、简单的得到百万级别直至几十亿级别的含有两个或 多个药效团的小分子的DNA编码化合物文库的方法，得到的化合物文库能够加速多靶点药物的筛选进程，大大缩短多靶点药物的研发周期。
附图说明
图1本发明介绍的可用于合成含有单一、两个或多个药效团的DNA编码化合物文库的起始头片段的具体结构示意图，共有6种形式，其中，核苷酸链可以是单链，可以是 双链(形式6)，也可以是人工修饰后的核苷酸单体聚合后得到的，如肽核酸，单链的 情况下，没有碱基修饰的核苷酸单链的部分碱基可以互补配对，形成一个大的发卡结构， 发卡末端留有l个碱基作为配对区，l是2到20之间的整数，互补区域的碱基序列中有p个 酶切位点或q个可以通过化学反应进行切断的功能团，如化学切断、光切基团，p、q＝0、 1、2、3、4、5，p和q不同时为0；延伸出来的长链可以是来自一个修饰过的核苷酸单体 (形式1和2)，修饰的位置可以是碱基，可以是五碳糖，可以是磷酸基团，也可以是其 他人工修饰过的核苷酸单体的任意位置；延伸出来的长链也可以来自不同的修饰过的核 苷酸单体(形式3和4)，该核苷酸单体可以是A、T、C和G中任意一个，修饰的位置可 以是碱基，可以是五碳糖，可以是磷酸基团，也可以是其他人工修饰过的核苷酸单体的 任意位置，带有长链的修饰过的核苷酸单体可以连续出现，可以单独出现，可以在一条 核苷酸单链上，也可以同时出现在核苷酸双链的两条单链上；任意相邻的两个带有长链 的修饰过的核苷酸单体间可以间隔o个碱基，o＝0、1、2、3、……、20；该延伸出来的 长链可以是长烷基链，也可以是聚乙二醇链；G1、G2和Gn是相互之间不会发生直接化 学反应的功能团，它们可以是相同的，可以是不同的，也可以是部分相同、另一部分不 同的；R1和R2是可以进行化学反应的基团，它们可以是磷酸基和羟基、炔基和叠氮基、 重氮基和炔基、碘基和硫代磷酸酯基、仲胺基与醛或酮基、氨基与羧酸基、氨基与烷基 卤或芳基卤、氨基与烯基或炔基、磷叶立德基团和醛或酮基、环加成反应的双烯和亲双 烯体基等；G1、G2可以通过化学合成的方法连在在一起，再从连接链上引出一条带有 可引入片段化合物的化学位点的长链，这样又得到一个可用于制备含有单一药效团的 DNA编码化合物文库的起始头片段(形式5)。
图2本发明合成含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库的一个具体循环的示 意图，其中起始头片段上带有n个可以引入化学反应的反应位点、具有与引入核苷酸双链的突出碱基序列互补的突出碱基序列且突出碱基序列末端带有可发生化学反应的基团，首先把起始头片段与要引入的核苷酸双链按照一定比率混匀，90℃退火5分钟，因 为配对区碱基序列碱基完全互补配对，退火后这两个核苷酸双链会迅速杂交成为一个双 链复合物，拉近了配对区末端的碱基上的两个化学基团的空间距离，使得它们的有效浓 度升高，从而使得原本是分子间的化学反应转化为分子内的化学反应，反应速率大大提 高，之后在特定的反应位点进行化学反应引入一个片段化合物，继续引入核苷酸双链后 再引入片段化合物会得到含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库。
图3本发明提供的一种通过Click反应引入含有TIPS保护的炔基的核苷酸双链的方 法。
图4本发明提供的一种通过氰基咪唑催化的化学反应引入常规的5’磷酸化修饰的核 苷酸双链的方法，因为较长的配对区的存在，使得配对区的反应速率远远大于非配对区的，因此，该方法核苷酸双链的3’端羟基不需要保护。
图5本发明提供的一种通过碘和巯基磷酸反应形成硫代磷酸酯键引入核苷酸双链的 方法，P是保护基。
图6本发明提供的一种通过胺基与羧基的酰胺化反应引入核苷酸双链的方法，因为 较长的配对区的存在，使得配对区的反应速率远远大于非配对区的，因此，该方法核苷酸双链的末端氨基不需要保护。
图7本发明提供的一种通过仲胺基与醛基的还原氨化反应引入核苷酸双链的方法，P 是保护基。
图8本发明的含有单一药效团的DNA编码化合物文库的起始头片段得到的具有单一 药效团的DNA编码化合物文库的化合物分子。
图9本发明的含有两个药效团的DNA编码化合物文库的起始头片段得到的具有两个 药效团的DNA编码化合物文库的化合物分子，具体有三种形式，虚线表示两条核苷酸单链之间的部分碱基是互补配对的。
图10本发明的含有三个药效团的DNA编码化合物文库的起始头片段得到的具有三个药效团的DNA编码化合物文库的化合物分子，具体有四种形式，虚线表示两条核苷酸 单链之间的部分碱基是互补配对的。
图11本发明实施例1起始头片段的HPLC谱图和MS谱图。
图12本发明实施例3得到的10x10的DNA编码化合物文库在每个循环下的胶图，使用 的是4％琼脂糖胶。
图13本发明实施例3得到的10x10的DNA编码化合物文库第二个循环后的LCMS谱图和去卷积后的产物MS谱图。
图14本发明实施例4得到的10x10的DNA编码化合物文库酶切前后胶图。
图15本发明实施例4得到的10x10的DNA编码化合物文库酶切前后PCR效率对比图。
图16为式1化合物的化学结构示意图。
图17为式2化合物的化学结构示意图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普 通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发 明保护的范围。
实施例1，起始头片段(SO-1)的制备
合成了具有以下序列的5’磷酸化的核苷酸链作为起始头片段并通过苏州金唯智生 物科技有限公司进行HPLC纯化。
5’-PO4 2-CTGCATAAGGCCTTAGTCTTdTTTdTTTGACTAAGGCCTTATGCAGCC-3’ (序列编号：01，分子量：14460.2，图示11)
dT是具有如下结构：
该碱基是在DNA合成仪中使用了如下单体：Fmoc Amino-Modifier C6-dT-CEPhosphoramidite(MFCD08061991，CAS：210534-16-0)得到的。
该核苷酸链两端的部分碱基是互补配对的，可以形成具有突出碱基序列CC的大的发卡结构且核苷酸双链中包含两个切割位点(AGGCCT)，该切割位点用于限制性内切 酶StuI的切口变体。在发卡环的中部有两个碱基胸腺嘧啶上的侧链C5处有一个6个碳的 烷基链，烷基链的末端是一个伯胺。
该起始头片段含有两个末端带有氨基的长链，可以用于两个相同药效团的DNA编码 化合物文库的制备，通过与带有不同反应基团的连接基反应，可以得到两个末端的反应基团不一样的长链，修饰后的起始头片段可以用于两个不同药效团的DNA编码化合物文 库的制备。
实施例2，带有连接基的完全头片段(SO-2)的制备
实施例1得到的起始头片段与Fmoc-PEG5-NHS酯和Acid-PEG5-NHS酯反应制备具有以下序列的头片段SO-2。
5’-PO4 2-CTGCATAAGGCCTTAGTCTTdT(X)TTdT(Y)TTGACTAAGGCCTTATGCA GCC-3’(序列编号：02，分子量：15294.2)
X和Y是表示下列结构中的任意一个：
将100纳摩尔的起始头片段(SO-1)溶于100微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.5，250mM)中，将200纳摩尔的Fmoc-PEG5-NHS酯(MFCD28976702，CAS：1402080-11-8，分子 量：628.67，上海药明康德新药开发有限公司定制)溶解于20uL二甲基乙酰胺(DMAc) 中并在室温下加入SO-1的溶液中室温下反应，反应结束后，向反应液加入12微升5N的 氯化钠溶液和360微升的冷乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，得到DNA 沉淀继续溶于100微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.5，250mM)中，将200纳摩尔的 Acid-PEG5-NHS酯(MFCD27952888，CAS：1343476-41-4，分子量：435.42，上海药明 康德新药开发有限公司定制)溶解于20uL二甲基乙酰胺(DMAc)中并在室温下加入上 述溶液中室温下反应，反应结束后，向反应液加入12微升5N的氯化钠溶液和360微升的 冷乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，得到DNA沉淀使用HPLC进行纯 化得到SO-2。
起始头片段与Fmoc-PEG5-NHS酯或Acid-PEG5-NHS酯反应后延长了连接基的长度，让最终的DNA编码化合物文库得到的两个药效团的小分子与标记的DNA部分尽量 的远，避免DNA部分对亲和筛选的靶标产生影响，进而影响到筛选的结果。而且引入的 长链的末端的反应基团一个是酸，一个是Fmoc保护的胺基，可以用于两个不同药效团 的DNA编码化合物文库的制备。
实施例3，10×10库的具有两个药效团的DNA编码化合物文库的制备
步骤1：起始引物与完全头片段SO-2的连接得到带有引物的头片段SO-2-P
在此示例性DNA编码化合物文库中，将一种固定编码的核苷酸双链(简称起始引物， 苏州金唯智生物科技有限公司定制，HPLC纯化)连接于SO-2用于后续筛选完所有DNA编码化合物的PCR的通用引物片段：
起始引物上链：5’-PO4 2--AAATCGATGACACAG-3’(序列编号：03)
起始引物下链：5’-PO4 2--CATCGATTTGG-3’(序列编号：04)
将100纳摩尔的完全头片段SO-2水溶液100微升与110纳摩尔的起始引物上链和110 纳摩尔的起始引物下链的混合水溶液110微升混合均匀，然后再PCR仪中90℃加热5分钟 (顶盖温度105℃)，接着以1℃每秒的速度冷却至室温来进行退火，之后加入10X T4 DNA连接酶缓冲液40微升(Thermo公司)、T4DNA连接酶4微升(30U/微升，Thermo 公司)和双蒸水146微升，反应液在室温下孵育16小时，待反应完全后，加入40微升的 5N的氯化钠溶液和1200微升的冷乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液， 得到DNA沉淀继续溶于200微升双蒸水中，用大小500微升的规格为10K的超滤管 (Amicon Ultra Centrifugal，货号：Millipore-UFC501096)对产物进行脱盐和提纯，得 到带有引物的头片段SO-2-P。
步骤2：DNA编码化合物文库第一个循环的合成
类似于步骤1的链接反应，设置了10种连接反应，将浓度为1mM带有引物的头片 段SO-2-P溶液分装到96孔板的10个连续的孔中，每个孔10微升，继续向每个孔加入浓度 为2mM的第一个循环的标记核苷酸双链的上链和下链(简称第一个循环标记核苷酸双 链，苏州金唯智生物科技有限公司定制，HPLC纯化)各11纳摩尔，按照步骤1退火后加 入N-氰基咪唑、ZnCl2和MgCl2，待反应完全后，如上所述乙醇沉淀，得到DNA沉淀继 续溶于10微升的磷酸钠缓冲溶液(pH＝5.5，250mM)中，加入对应的片段化合物-小 分子胺(均来自上海药明康德新药开发有限公司的览博网，50当量，200mM的DMAc 溶液)、200mM的HCl水溶液(50当量)、200mM的4-(4,6-二甲氧基均三嗪)-4-甲基吗 啉盐酸盐水溶液(简称DMT-MM，TCI，45当量，现配现用)，待反应完全后，所有反 应液混合到一起，如上所述进行乙醇沉淀，得到DNA沉淀继续溶于2％的哌啶水溶液， 待反应完全后，如上所述乙醇沉淀，得到DNA沉淀溶于200微升双蒸水中，用大小500 微升的规格为10K的超滤管(Amicon Ultra Centrifugal，货号：Millipore-UFC501096) 对产物进行脱盐和提纯，得到第一个循环的产物B1-SO-2-P-T1。
第一个循环的小分子和对应的核苷酸双链具体如下：
步骤3：DNA编码化合物文库第二个循环的合成
第二个循环的标记核苷酸双链(苏州金唯智生物科技有限公司定制，HPLC纯化)与第一个循环的产物B1-SO-2-P-T1的链接类似于步骤1的链接反应，纯化后的DNA沉淀 继续溶于10微升的硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.5，250mM)中，加入对应的片段化合物- 小分子酸(均来自上海药明康德新药开发有限公司的览博网，50当量，200mM的DMAc 溶液)和200mM的4-(4,6-二甲氧基均三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(简称DMT-MM，TCI， 45当量，现配现用)，待反应完全后，所有反应液混合到一起，如上所述进行乙醇沉淀， 得到DNA沉淀继续溶于200微升双蒸水中，用大小500微升的规格为10K的超滤管 (Amicon Ultra Centrifugal，货号：Millipore-UFC501096)对产物进行脱盐和提纯，得 到第二个循环的产物(平均分子量：38313，图示12和13)。
第二个循环的小分子和对应的核苷酸双链具体如下：
步骤4：尾端引物与DNA编码化合物文库连接
在此示例性DNA编码化合物文库中，将一种固定编码的核苷酸双链(简称尾端引物， 苏州金唯智生物科技有限公司定制，HPLC纯化)连接于DNA编码化合物文库上，作为PCR的另一端通用引物片段：
尾端引物上链：5’-PO4 2--ATAGACTGCAAGCA-3’(序列编号：43)
尾端引物下链：5’-PO4 2--TGCAGTCTATTGTACG-3’(序列编号：44)
将10纳摩尔的DNA编码化合物文库水溶液10微升与15纳摩尔的尾端引物上链和15纳摩尔的尾端引物下链的混合水溶液15微升混合均匀，然后再PCR仪中90℃加热5分钟 (顶盖温度105℃)，接着以1℃每秒的速度冷却至室温来进行退火，之后加入10X T4 DNA连接酶缓冲液4微升(Thermo公司)、T4DNA连接酶0.4微升(30U/微升，Thermo 公司)和双蒸水10.6微升，反应液在室温下孵育16小时，待反应完全后，加入4微升的 5N的氯化钠溶液和120微升的冷乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，得 到DNA沉淀继续溶于50微升双蒸水中，用大小500微升的规格为10K的超滤管(Amicon Ultra Centrifugal，货号：Millipore-UFC501096)对产物进行脱盐和提纯。
从完全头片段SO-2计算，仅仅通过5步反应就得到了含有100个小分子的具有两个不 同药效团的DNA编码化合物文库，该文库可以用于与多靶点靶标的亲和筛选中。
实施例4，DNA编码化合物文库PCR效率比较
向接上尾端引物的DNA编码化合物文库(10微克)溶液(10微升)加入20微升的10X缓冲液B(Thermo公司)、10微升的Eco1471(StuI，10U/微升，NEB-R0187S)和双蒸 水160微升，在37℃孵育16小时，之后在PCR仪中加热15分钟让StuI酶失活，加入2微升 的5N的氯化钠溶液和60微升的冷乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液， 得到DNA沉淀继续溶于50微升双蒸水中，用大小500微升的规格为10K的超滤管(Amicon UltraCentrifugal，货号：Millipore-UFC501096)对产物进行脱盐和提纯，酶切前后的胶 图见图示14，得到的DNA片段与没有使用限制性内切StuI进行切除的DNA编码化合物文 库的DNA一起进行PCR，并通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，简称 qPCR)，定量试剂是SYBR Green Master Mix(Cat#:Vazyme-Q141-02)。
成分 加入体积(1×反应液)
SYBR Green Master Mix 5微升
primer-F(10uM)：ATGCAGCCAAATCGATGACAC 0.5微升
primer-R(10uM)：TGCTTGCAGTCTATTGTACGAGG 0.5微升
DEPC-Treated water 2微升
DNA 2微升
实验证明用限制性内切酶切除掉起始头片段上的发卡后，剩下来的配对的碱基序列 的PCR效率与没有酶切的大发卡结构比较起来，PCR效率有明显提高，扩增效率的标 准曲线见图示15。
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的 保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含 在本发明的保护范围内。

Claims (44)

1.一种制备含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库的起始头片段化合物，其特征在于，所述起始头片段化合物包括一条核苷酸链，该核苷酸链的5’和3’分别具有可以进行化学反应的基团R1和R2，该核苷酸链上具有n个连接头，所述连接头是由该核苷酸链上的一个或多个核苷酸单体经修饰后延伸出的长链，每个长链上均具有一个或多个可进行化学反应的位点Gn，其中n＝1、2、3、……、20。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述核苷酸链是由正常核苷酸单体聚合得到的，和/或是由人工修饰后的核苷酸单体聚合后得到的，包括肽核酸，所述核苷酸链为单链或双链。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，当所述核苷酸链是单链时，没有碱基修饰的核苷酸单链的部分碱基可以互补配对，形成一个大的发卡结构，发卡末端留有m个碱基作为配对区，m是2到20之间的整数。
4.如权利要求3所述的化合物，其特征在于，所述发卡结构的互补区域的碱基序列中有p个酶切位点或q个可以通过化学反应进行切断的功能团，如化学切断基团、光切基团，p、q＝0、1、2、3、4、5，p和q不同时为0。
5.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，所述酶切位点所使用的限制性内切酶选自：AflIII、AscI、AvaI、BamHI、BglII、BssHII、BstEII、BstXI、ClaI、EcoRI、HaeIII、HindIII、KpnI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、NsiI、PacI、PmeI、PstI、PvuI、SacI、SacII、SalI、ScaI、SmaI、SpeI、SphI、StuI、XbaI、XhoI和XmaI。
6.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，可通过化学反应进行切断的功能团有：二硫键、羟胺键、重氮键、偶氮键、硅氧键、2-硝基苯基丙二醇类醚键、邻二醇键、砜乙基氧羰基键、三芳基膦亚甲基羰基键、巯乙基硫酸酯键。
7.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，延伸出来的长链来自同一个修饰过的核苷酸单体，修饰的位置可以是碱基，可以是五碳糖，可以是磷酸基团，也可以是其他人工修饰过的核苷酸单体的任意位置。
8.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，延伸出来的长链来自不同的修饰过的核苷酸单体，该核苷酸单体可以是A、T、C和G中任意一个，修饰的位置可以是碱基，可以是五碳糖，可以是磷酸基团，也可以是其他人工修饰过的核苷酸单体的任意位置。
9.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，带有长链的修饰过的核苷酸单体可以连续出现，可以单独出现，可以在一条核苷酸单链上，也可以同时出现在核苷酸双链的两条单链上，任意相邻的两个带有长链的修饰过的核苷酸单体间可以间隔o个碱基，o＝0、1、2、3、……、20。
10.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，该延伸出来的长链可以是长烷基链，也可以是聚乙二醇链，或是它们的交叉形式，不同的长链的原子个数可以是相同的，也可以是不相同的。
11.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，不同长链上的位点G是相互之间不会发生直接化学反应的功能团。
12.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，G1、G2和Gn选自氨基、仲胺基、叔丁氧羰基胺基、芴甲氧羰基胺基、6-硝基藜芦氧基胺基、烯丙氧基羰基胺基、邻硝基苯磺酰基胺基、甲砜基乙氧羰基胺基、三氟乙酰基胺基、硝基、羧基、甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基、杂环芳氯、芳基氟、芳基碘、芳基溴、醛基、二甲氧基缩醛、二乙氧基缩醛、乙二醇缩醛、酮基、二甲氧基缩酮、二乙氧基缩酮、乙二醇缩酮、叠氮、炔基、胺氧基、二环[6.1.0]壬炔、烷基溴、烷基氯、二苯并环辛炔、2,4-二硝基苯、马来酰亚胺、磷酸、磷酸乙酯、磺酸、羟基、巯基。
13.如权利要求12所述的化合物，其特征在于，n＝2，G1和G2选自芴甲氧羰基胺基和羧基。
14.如权利要求12所述的化合物，其特征在于，n＝2，G1和G2选自芴甲氧羰基胺基和叠氮。
15.如权利要求12所述的化合物，其特征在于，n＝2，G1和G2选自羧基和叠氮。
16.如权利要求12所述的化合物，其特征在于，n＝2，G1和G2选自氨基和叔丁氧羰基。
17.如权利要求12所述的化合物，其特征在于，n＝2，G1和G2选自羧基和叔丁氧羰基。
18.如权利要求12所述的化合物，其特征在于，n＝3，G1、G2和G3选自羧基、叔丁氧羰基和芴甲氧羰基胺基。
19.如权利要求12所述的化合物，其特征在于，n＝3，G1、G2和G3选自羧基、叔丁氧羰基和叠氮。
20.如权利要求8所述的化合物，其特征在于，n＝2，G1和G2可以通过化学合成的方法连在在一起，再从连接链上引出一条带有可引入片段化合物的化学位点的长链得到一个可用于制备含有单一药效团的DNA编码化合物文库的起始头片段。
21.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，n＝2，G1所在长链和G2所在长链在核苷酸单链的同一个碱基上。
22.如权利要求8所述的化合物，其特征在于，n＝2，G1所在长链和G2所在长链在核苷酸单链的两个碱基上，这两个碱基可以相邻，也可以不相邻。
23.如权利要求9所述的化合物，其特征在于，n＝2，G1所在长链在核苷酸双链的上链的碱基上，G2所在长链在核苷酸双链的下链的碱基上，上下链没有碱基修饰的碱基序列部分互补配对，核苷酸双链的两侧都有一个突出碱基序列。
24.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1和R2是用于与后面标记片段化合物的核苷酸双链配对并发生化学反应而链接，R1和R2选自磷酸基和羟基、炔基和叠氮基、重氮基和炔基、碘基和硫代磷酸酯基、仲胺基与醛或酮基、氨基与羧酸基、氨基与烷基卤或芳基卤、氨基与烯基或炔基、磷叶立德基团和醛或酮基、环加成反应的双烯和亲双烯体基，所有基团都可以带有保护基或是通过一步化学反应转化过来。
25.如权利要求24所述的化合物，其特征在于，R1和R2为磷酸基和羟基。
26.如权利要求24所述的化合物，其特征在于，R1和R2为炔基和叠氮基。
27.一种制备含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库的方法，其特征在于，所述DNA编码化合物文库构建一种起始头片段化合物，所述起始头片段化合物包括一条核苷酸链，该核苷酸链的5’和3’分别具有可以进行化学反应的基团R1和R2，该核苷酸链上具有n个连接头，所述连接头是由该核苷酸链上的核苷酸单体经修饰后延伸出的长链，每个长链上均具有一个可进行化学反应的位点G，位点G包括G1、G2、……Gn，其中n＝1、2、3、……、20。
28.一种含有两个或多个药效团的DNA编码化合物，其特征在于，所述含有两个或多个药效团的DNA编码化合物具有一条核苷酸链，该核苷酸链的5’和3’分别具有可以进行化学反应的基团R1和R2，该核苷酸链上具有n个连接头，所述连接头是由该核苷酸链上的核苷酸单体经修饰后延伸出的长链，每个长链上均具有一个可进行化学反应的位点G，位点G包括G1、G2、……Gn，其中n＝1、2、3、……、20；所述位点G分别与片段化合物反应生成使该位点G与片段化合物连接在一起的片段化合物残基B，所述片段化合物残基包括分别与G1、G2、……Gn相对应的B1、B2、……、Bn。
29.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，所述核苷酸链是由正常核苷酸单体聚合得到的，和/或是由人工修饰后的核苷酸单体聚合后得到的，包括肽核酸；所述核苷酸链为单链或双链。
30.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，当核苷酸链为单链时，没有碱基修饰的核苷酸单链部分有m个碱基可以互补配对，形成一个大的发卡结构，m是10到250以内的整数，碱基互补区域的碱基序列中有p个酶切位点或q个可以通过化学反应进行切断的功能团，如化学切断基团、光切基团，p、q＝0、1、2、3、4、5，p和q不同时为0。
31.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，所述酶切位点所使用的限制性内切酶选自：AflIII、AscI、AvaI、BamHI、BglII、BssHII、BstEII、BstXI、ClaI、EcoRI、HaeIII、HindIII、KpnI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、NsiI、PacI、PmeI、PstI、PvuI、SacI、SacII、SalI、ScaI、SmaI、SpeI、SphI、StuI、XbaI、XhoI和XmaI。
32.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，可通过化学反应进行切断的功能团选自：二硫键、羟胺键、重氮键、偶氮键、硅氧键、2-硝基苯基丙二醇类醚键、邻二醇键、砜乙基氧羰基键、三芳基膦亚甲基羰基键、巯乙基硫酸酯键。
33.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，延伸出来的长链是来自一个修饰过的核苷酸单体，修饰的位置可以是碱基，可以是五碳糖，可以是磷酸基团，也可以是其他人工修饰过的核苷酸单体的任意位置。
34.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，延伸出来的长链来自不同的修饰过的核苷酸单体，该核苷酸单体可以是A、T、C和G中任意一个，修饰的位置可以是碱基，可以是五碳糖，可以是磷酸基团，也可以是其他人工修饰过的核苷酸单体的任意位置。
35.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，带有长链的修饰过的核苷酸单体可以连续出现，可以单独出现，可以出现在同一个单链上，也可以出现在核苷酸双链的不同单链上，任意相邻的两个带有长链的修饰过的核苷酸单体间可以间隔o个碱基，o＝0、1、2、3、……、20。
36.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，该延伸出来的长链可以是长烷基链，也可以是聚乙二醇链，也可以是他们交叉的任意形式，它们的原子个数可以是相同的，也可以是不相同的。
37.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，G1、G2和Gn是相互之间不会发生直接化学反应的功能团的残基，它们可以是相同的，可以是不同的，也可以是部分相同、另一部分不同的；G1、G2和Gn选自氨基残基、仲胺基残基、羰基残基、杂环芳基残基或芳基残基、亚甲基、烯基和三氮唑残基。
38.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，B1、B2和Bn是一个循环引入的单一的片段化合物残基。
39.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，B1、B2和Bn是两个或多个循环引入的多个单一片段化合物残基的组合体。
40.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，B1、B2和Bn之间是互不相连。
41.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，B1、B2和Bn通过化学修饰让它们之间任意两个或多个片段化合物的残基通过共价键相连。
42.如权利要求41所述的化合物，其特征在于，B1和B2通过共价键相连得到含有n-1个药效团的化合物且该化合物包含一个大环类药效团。
43.一种制备含有两个或多个药效团的DNA编码化合物文库的方法，其特征在于，所述含有两个或多个药效团的DNA编码化合物具有一条核苷酸链，该核苷酸链的5’和3’分别具有可以进行化学反应的基团R1和R2，该核苷酸链上具有n个连接头，所述连接头是由该核苷酸链上的核苷酸单体经修饰后延伸出的长链，每个长链上均具有一个可进行化学反应的位点G，位点G包括G1、G2、……、Gn，其中n＝1、2、3、……、20；所述位点G分别与片段化合物反应生成使该位点G与片段化合物连接在一起的片段化合物残基B，所述片段化合物残基包括分别与G1、G2、……、Gn相对应的B1、B2、……、Bn。
44.一种DNA编码化合物文库，其特征在于，是由如权利要求28所述的含有两个或多个药效团的DNA编码化合物所组成或是由如权利要求43所述的方法所制备。
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