CN110079867B - DNA编码化合物库中On-DNA维蒂希反应方法及制得的On-DNA烯烃化合物 - Google Patents
DNA编码化合物库中On-DNA维蒂希反应方法及制得的On-DNA烯烃化合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种DNA编码化合物库构建中On‑DNA维蒂希反应的方法以及通过该方法制得的On‑DNA烯烃化合物,该方法按照On‑DNA底物不同分为两类,一类是以On‑DNA醛基或酮化合物为底物,在碱存在的情况下,与膦盐反应得到On‑DNA烯烃化合物;另一类是以On‑DNA烷基卤代物为底物,与碱、膦试剂和小分子醛或酮试剂反应一锅法得到On‑DNA烯烃化合物。本发明所提供的On‑DNA烯烃化合物的制备方法,原料易得,反应条件温和,产率高,底物普适性好,适合于使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成,可以快速将DNA醛基或酮化合物库或DNA氨基化合物库通过一步反应转化为DNA烯烃化合物库,可以显著增加DNA编码化合物库的多样性。
Description
技术领域
本发明属于有机合成技术领域,具体涉及一种DNA编码化合物库中On-DNA维蒂希反应的方法及制得的On-DNA烯烃化合物。
背景技术
美国Scripps研究院的Sydney Brenner和Richard Lerner教授于1992年提出了DNA编码化合物库(DNA Encoded Library,简称DEL)的概念(参考文献:Proc.Natl.Acad.Sci.,1992,89,5381,专利:US5573905),该方法通过将一个有机小分子试剂与一段独特序列的DNA在分子水平进行连接(即对小分子试剂进行DNA标记),利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物库,该化合物库中每一个化合物都由不同有机小分子试剂残基组成,并由相应的唯一碱基序列的DNA标识,将极少量的DNA编码化合物库与靶标进行亲和筛选,与靶标没有吸附的化合物库分子先被洗掉,留下的与靶标有吸附的化合物库分子再洗脱下来,这时得到的化合物库分子浓度很低,常规手段难以分析和识别,但是通过DNA独有的聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction,简称PCR)可以把得到的与靶标有吸附的化合物库分子中的DNA部分进行复制扩增直至得到的DNA量可以被DNA测序仪识别,测序后的数据再通过构建DNA编码化合物库时创建的有机小分子试剂与每个具体DNA碱基序列之间的关系表来解码,进而找到可以识别具有潜在活性分子相对应的具体化合物对应的有机小分子试剂,我们再通过传统的有机合成方法把这些有机小分子试剂组合在一起得到筛选的目标分子,再检测并确认其对靶标的生理活性。
DNA编码化合物库的构建方法主要有三种,第一种是以美国Ensemble公司为主利用DNA模板技术得到的DNA导向分子库(DNA-Templated Chemical Library Synthesis,简称DTCL),第二种是以美国GSK公司,X-Chem公司和国内的成都先导公司为主利用DNA标记技术得到的DNA记录分子库(DNA-Recorded Chemical Library,简称DRCL),第三种是以瑞士Philogen公司为主基于片段的药物设计(Fragment-based drug discovery,简称FBDD)技术得到的编码自组装分子库(Encoded Self-Assembling Chemical Libraries,简称ESAC),目前工业上被大量运用的构建DNA编码化合物库的方法主要是第二种,该方法操作简单,成本更低,能更快速地利用组合化学方法得到含有海量的化合物的DNA编码化合物库。
除了DNA起始片段(详见本公司发明专利申请号:CN201711263372.3,CN201711318894.9)外,需要有大量的DNA标签和可以按照一定顺序进行反应的有机小分子试剂。DNA标签的编码可以通过一定的计算机程序来获得(详见本公司发明专利申请号:CN201711247220.4),再通过DNA合成仪得到具体的DNA碱基序列的引物。有机小分子试剂的获得,可以使用一定的计算机程序来对获得的试剂清单进行筛选得到(详见本公司发明专利申请号:CN201810378969.0)。
DEL库领域目前最主要的工作之一是DNA上化学反应的开发,简称on-DNA化学反应。因为DNA必须在一定比例的水相中,pH范围,温度范围,金属离子浓度和无机盐浓度下才能保持稳定,因此,对DNA破坏小、具有较好的DNA回收率和底物适应性广的on-DNA化学反应,才是大规模应用于DNA编码化合物库的合成所需要的。On-DNA化学反应的种类越多,条件越丰富,在DNA编码化合物库的设计时的选择性才越多,最终DNA编码化合物库的合成成功率才越高,得到的DNA编码化合物库的多样性才越丰富。
目前公开报道的On-DNA化学反应种类大概有50多种,每种的反应条件少则一种,多则十几种,可以说,在其他情况一样的情况下,掌握On-DNA化学反应种类和条件越多的公司,在DNA编码化合物库的设计和合成中的优势就越大。
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件(续)
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件(续)
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件(续)
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件(续)
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件(续)
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件(续)
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件(续)
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件(续)
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件(续)
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件(续)
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件(续)
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件(续)
在On-DNA化学反应中,缓冲液的选择十分重要,我们确定了几种常用的缓冲液的配制和质检方法(详见本公司发明专利:CN201811181396.9),并提供了在该缓冲液条件下的几种具体的On-DNA化学反应(详见本公司发明专利:CN201811181396.9,CN201811546746.7)。
目前已经公开报道的应用于DRCL构建的On-DNA反应主要集中在碳氮键的形成,如酰胺化,还原氨化,N-亲核取代,Buchwald偶联,(硫)脲的形成等,而公开报道的碳碳键的形成反应在DRCL构建中的应用还比较少,目前主要集中在Suzuki偶联反应,而具体到碳碳双键的形成反应,专利EP3360962A1介绍了胶束催化用于DNA编码化合物库的合成,提到了负载在胶束上的Pd催化剂可以用于On-DNA的Heck反应,直到最近才出现详细实验细节的Heck偶联反应(参考文献:Org.Lett.,2019,21,719–723)的报道,非金属催化的碳碳双键的形成反应目前只有在DNA模板技术中有过维蒂希反应的报道。
为了解决DNA编码化合物库构建中形成碳碳双键的反应稀少这一问题,我们希望开发一种反应条件温和,产率高,反应的底物普适性好,适合于使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成过程,并可以显著增加DNA编码化合物库的多样性的反应。
发明内容
一、本发明的目的在于提供一种用于DNA编码化合物库构建的On-DNA维蒂希反应的方法,按照On-DNA的底物不同分为两类:
其中,结构式中的DNA是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链,R1基团是氢原子时,是醛化合物;R1基团与羰基直接相连的原子是碳原子时,是酮化合物,此时,R1基团是分子量在1000以内,含有碳原子直接与羰基直接相连的有机基团。R2基团是可以与苯基膦类试剂形成膦盐的分子量在1000以下的小分子烷基卤代物的一部分。
另一类具体地是以On-DNA烷基卤代物为底物,与碱、膦试剂和小分子醛或酮试剂反应一锅法得到On-DNA烯烃化合物,其中,On-DNA烷基卤代物的结构式为所制备得到的On-DNA烯烃化合物的结构式如所示:
其中,结构式中的DNA是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链,X是氯、溴、碘原子中一种,R3和R4基团是氢原子或其他有机含碳的且碳原子直接与羰基相连的功能团。这里所说的小分子试剂是指分子量在1000以下的有机试剂。
二、本发明的另一个目的在于提供一种由On-DNA醛基或酮化合物制备On-DNA烯烃化合物的方法。
具体是以On-DNA醛基或酮化合物为底物,以小分子烷基卤代物试剂和膦试剂原位生成的膦盐为原料,以乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、乙醇、甲醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、1,4-二氧六环、水、无机盐缓冲液(硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐)、有机酸缓冲液(醋酸、HEPES、TAPS、MES)、有机碱缓冲液(三乙胺、三羟甲基氨基甲烷)中的任意一项或几项为溶剂,在无机碱或有机碱作用下,温度为4~100℃的条件下反应0.5~24小时得到On-DNA烯烃化合物,具体反应方程式如下:
所述的烷基卤代物,包括苄基类卤代物,卤代物可以是氯代物、溴代物、碘代物;优选地,烷基卤代物为α-溴代酮类试剂。
所述的苯基膦类试剂为三苯基膦(PPh3,CAS:603-35-0)、4-二苯基膦苯甲酸(CAS:2129-31-9)、2-二苯基膦苯甲酸(CAS:17261-28-8)、二苯基(邻甲氧基苯基)膦(CAS:53111-20-9)、4-(二甲氨基)三苯基膦(CAS:739-58-2)、4-二苯基膦基苯磺酸钠(CAS:5952-62-5)、3-二苯基膦氟苯(CAS:21388-29-4)、2-二苯基膦基苯腈(CAS:34825-99-5)、双(4-甲氧基苯基)苯基膦(CAS:14180-51-9)、二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦二钾盐(CAS:151888-20-9)、双(3-磺酸苯基)(3,5-二-三氟甲基苯基)膦酸二钠单水合物(DanPhos,CAS:1289463-82-6)、双(4-三氟甲基苯基)(3-磺酸苯基)膦(Dan2Phos,CAS:1289463-87-1)、3-二苯基膦苯磺酸钠二水合物(CAS:1233014-04-4)、三[3,4-双(三氟甲基)苯基]膦(CAS:175136-62-6)、三(4-氟苯基)膦(CAS:18437-78-0)、三(3-溴苯基)膦(CAS:464928-06-1)、三(2-甲氧基苯基)膦(CAS:4731-65-1)、三(4-甲氧基-3,5-二甲苯基)膦(CAS:121898-64-4)、三(4-二甲氨基苯基)膦(CAS:1104-21-8)、三(4-氯苯基)膦(CAS:1159-54-2)、三(3-氯苯基)膦(CAS:29949-85-7)、三苯基膦-3,3,3-三磺酸三钠盐(TPPTS,CAS:63995-70-0)、三(2,5-二甲苯基)膦(CAS:115034-38-3)、三对甲苯基膦(CAS:1038-95-5)、1,1-双(二苯基膦)甲烷(DPPM,CAS:2071-20-7)、1,2-双(二甲基膦)乙烷(DMPE,CAS:23936-60-9)、1,2-双(二苯基膦)乙烷(DPPE,CAS:1663-45-2)、1,3-双(二苯基膦)丙烷(DPPP,CAS:6737-42-4)、1,4-双(二苯基膦)丁烷(DPPB,CAS:7688-25-7)、2,3-双(二苯基膦)丁烷(ChiraPhos,CAS:74839-84-2)、二苯基环己基膦(CAS:6372-42-5)、苯基二环己基膦(CAS:6476-37-5)、二苯基乙氧基膦(CAS:719-80-2)、三(2-羧乙基)膦(TECP,CAS:51805-45-9)、甲基二苯基膦(CAS:1486-28-8)、乙基二苯膦(CAS:607-01-2)、羧基甲基二苯基膦(CAS:3064-56-0)、二甲基苯基膦(CAS:672-66-2)、2-(二叔丁基膦)联苯(CAS:224311-51-7)、二叔丁基苯基膦(CAS:32673-25-9)、三(3-羟基丙基)膦(CAS:4706-17-6)、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(BINAP,CAS:76189-55-4)、2-二环己基膦-2,4,6-三异丙基联苯(XPhos,CAS:564483-18-7)、2-二环己基膦-2'-甲基联苯(MePhos,CAS:251320-86-2)、2-二环己基膦-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯(RuPhos,CAS:787618-22-8)、2-二环己基膦基-o-2',6'-二甲氧基联苯(SPhos,CAS:657408-07-6)、2-二-叔丁基膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(tBuXPhos,CAS:564483-19-8)、2-二-叔丁基膦基-2'-甲基联苯(tBuMePhos,CAS:255837-19-5)、2-二-叔丁基膦基-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯(tBuDavePhos,CAS:224311-49-3)、2-二环己基膦基-o-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯(DavePhos,CAS:213697-53-1)、2-(二-叔丁基膦基)联苯(JohnPhos,CAS:224311-51-7)、2-二苯基膦基-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯(PhDavePhos,CAS:240417-00-9)、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(XantPhos,CAS:161265-03-8)。优选地,是三苯基膦类试剂,更优选地,是三苯基膦-3,3,3-三磺酸三钠盐为膦试剂。
所述的碱为氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化镁、氢氧化锌、氢氧化铜、氢氧化铁、氢氧化铅、氢氧化钴、氢氧化铬、氢氧化锆、氢氧化镍、氢氧化铵、碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸铵、碳酸钙、碳酸镁、碳酸铜、碳酸锌、碳酸氢锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵、碳酸氢钙、碳酸氢镁、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、磷酸铵、磷酸铁、磷酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钙、磷酸氢二钙、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、硼酸锂、硼酸钠、硼酸钾、硼酸铵、硼酸钙、硼酸镁、偏硼酸钠、偏硼酸钾、偏硼酸铵、偏硼酸钙、偏硼酸镁、氟化锂、氟化钠、氟化钾、氟化铯、氟化铵、氟化钙、氟化镁、氯化锂、氯化钠、氯化钾、氯化铯、氯化铵、氯化钙、氯化镁、溴化锂、溴化钠、溴化钾、溴化铯、溴化铵、溴化钙、溴化镁、碘化锂、碘化钠、碘化钾、碘化铯、碘化铵、碘化钙、碘化镁、三乙胺、二异丙基乙胺、三乙烯二胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、4-二甲氨基吡啶、吡啶、N-甲基吗啉、四甲基乙二胺、乌洛托品、喹啉、咪唑、吲哚、乙二胺、哌啶;优选地,是碳酸盐;更优选地,是碳酸钠。
三、本发明的另一个目的在于提供一种由On-DNA烷基卤代物制备On-DNA烯烃化合物的方法。
具体地是以On-DNA烷基卤代物为底物,以小分子醛或酮试剂和膦试剂为原料,以乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、乙醇、甲醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、1,4-二氧六环、水、无机盐缓冲液(硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐)、有机酸缓冲液(醋酸、HEPES、TAPS、MES)、有机碱缓冲液(三乙胺、三羟甲基氨基甲烷)中的任意一项或几项为溶剂,在无机碱或有机碱作用下,温度为4~100℃的条件下反应0.5~24小时一锅法得到On-DNA烯烃化合物,具体反应方程式如下:
所述的On-DNA烷基卤代物,包括On-DNA苄基类卤代物,卤代物可以是氯代物、溴代物、碘代物;优选地,是On-DNA烷基氯代物。
所述的苯基膦类试剂为三苯基膦(PPh3,CAS:603-35-0)、4-二苯基膦苯甲酸(CAS:2129-31-9)、2-二苯基膦苯甲酸(CAS:17261-28-8)、二苯基(邻甲氧基苯基)膦(CAS:53111-20-9)、4-(二甲氨基)三苯基膦(CAS:739-58-2)、4-二苯基膦基苯磺酸钠(CAS:5952-62-5)、3-二苯基膦氟苯(CAS:21388-29-4)、2-二苯基膦基苯腈(CAS:34825-99-5)、双(4-甲氧基苯基)苯基膦(CAS:14180-51-9)、二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦二钾盐(CAS:151888-20-9)、双(3-磺酸苯基)(3,5-二-三氟甲基苯基)膦酸二钠单水合物(DanPhos,CAS:1289463-82-6)、双(4-三氟甲基苯基)(3-磺酸苯基)膦(Dan2Phos,CAS:1289463-87-1)、3-二苯基膦苯磺酸钠二水合物(CAS:1233014-04-4)、三[3,4-双(三氟甲基)苯基]膦(CAS:175136-62-6)、三(4-氟苯基)膦(CAS:18437-78-0)、三(3-溴苯基)膦(CAS:464928-06-1)、三(2-甲氧基苯基)膦(CAS:4731-65-1)、三(4-甲氧基-3,5-二甲苯基)膦(CAS:121898-64-4)、三(4-二甲氨基苯基)膦(CAS:1104-21-8)、三(4-氯苯基)膦(CAS:1159-54-2)、三(3-氯苯基)膦(CAS:29949-85-7)、三苯基膦-3,3,3-三磺酸三钠盐(TPPTS,CAS:63995-70-0)、三(2,5-二甲苯基)膦(CAS:115034-38-3)、三对甲苯基膦(CAS:1038-95-5)、1,1-双(二苯基膦)甲烷(DPPM,CAS:2071-20-7)、1,2-双(二甲基膦)乙烷(DMPE,CAS:23936-60-9)、1,2-双(二苯基膦)乙烷(DPPE,CAS:1663-45-2)、1,3-双(二苯基膦)丙烷(DPPP,CAS:6737-42-4)、1,4-双(二苯基膦)丁烷(DPPB,CAS:7688-25-7)、2,3-双(二苯基膦)丁烷(ChiraPhos,CAS:74839-84-2)、二苯基环己基膦(CAS:6372-42-5)、苯基二环己基膦(CAS:6476-37-5)、二苯基乙氧基膦(CAS:719-80-2)、三(2-羧乙基)膦(TECP,CAS:51805-45-9)、甲基二苯基膦(CAS:1486-28-8)、乙基二苯膦(CAS:607-01-2)、羧基甲基二苯基膦(CAS:3064-56-0)、二甲基苯基膦(CAS:672-66-2)、2-(二叔丁基膦)联苯(CAS:224311-51-7)、二叔丁基苯基膦(CAS:32673-25-9)、三(3-羟基丙基)膦(CAS:4706-17-6)、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(BINAP,CAS:76189-55-4)、2-二环己基膦-2,4,6-三异丙基联苯(XPhos,CAS:564483-18-7)、2-二环己基膦-2'-甲基联苯(MePhos,CAS:251320-86-2)、2-二环己基膦-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯(RuPhos,CAS:787618-22-8)、2-二环己基膦基-o-2',6'-二甲氧基联苯(SPhos,CAS:657408-07-6)、2-二-叔丁基膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(tBuXPhos,CAS:564483-19-8)、2-二-叔丁基膦基-2'-甲基联苯(tBuMePhos,CAS:255837-19-5)、2-二-叔丁基膦基-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯(tBuDavePhos,CAS:224311-49-3)、2-二环己基膦基-o-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯(DavePhos,CAS:213697-53-1)、2-(二-叔丁基膦基)联苯(JohnPhos,CAS:224311-51-7)、2-二苯基膦基-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯(PhDavePhos,CAS:240417-00-9)、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(XantPhos,CAS:161265-03-8);优选地,是二苯基膦类试剂;更优选地,是甲基二苯基膦。
所述的碱为氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化镁、氢氧化锌、氢氧化铜、氢氧化铁、氢氧化铅、氢氧化钴、氢氧化铬、氢氧化锆、氢氧化镍、氢氧化铵、碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸铵、碳酸钙、碳酸镁、碳酸铜、碳酸锌、碳酸氢锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵、碳酸氢钙、碳酸氢镁、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、磷酸铵、磷酸铁、磷酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钙、磷酸氢二钙、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、硼酸锂、硼酸钠、硼酸钾、硼酸铵、硼酸钙、硼酸镁、偏硼酸钠、偏硼酸钾、偏硼酸铵、偏硼酸钙、偏硼酸镁、氟化锂、氟化钠、氟化钾、氟化铯、氟化铵、氟化钙、氟化镁、氯化锂、氯化钠、氯化钾、氯化铯、氯化铵、氯化钙、氯化镁、溴化锂、溴化钠、溴化钾、溴化铯、溴化铵、溴化钙、溴化镁、碘化锂、碘化钠、碘化钾、碘化铯、碘化铵、碘化钙、碘化镁、三乙胺、二异丙基乙胺、三乙烯二胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、4-二甲氨基吡啶、吡啶、N-甲基吗啉、四甲基乙二胺、乌洛托品、喹啉、咪唑、吲哚、乙二胺、哌啶;优选地,是磷酸盐;更优选地,是磷酸二氢钠。
本发明为On-DNA烯烃化合物的的合成提供了新的方法,本发明的On-DNA原料易得,反应条件温和,反应的小分子试剂底物普适性好,适合于多孔板进行的DNA编码化合物库的合成过程,可以显著增加DNA编码化合物库的多样性。
附图说明
图1为本发明的On-DNA维蒂希反应的原料制备方法,DNA-NH2与对羧基苯甲醛在EDCI为缩合剂、s-NHS为缩合活化剂下反应得到On-DNA苯甲醛的化学反应式以及相应的LCMS-LTQ谱图。
图2为本发明的由On-DNA苯甲醛与α-溴代酮和TPPTS原位生成的膦盐在碱作用下制得On-DNA烯烃化合物的产率情况分布(产率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准),其中,纵坐标是试剂个数,横坐标是转化率区间,如0-20%表示0%<转化率≤20%。
图3为本发明的由On-DNA醛或酮化合物与α-溴代酮和TPPTS原位生成的膦盐在碱作用下制得On-DNA烯烃化合物的α-溴代酮原料的代表结构式及制得产物的产率(产率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)。
图4为本发明的On-DNA维蒂希反应的原料制备方法,DNA-NH2与氯乙酰氯在碱性buffer存在下,反应得到相应的On-DNA氯甲基化合物的化学反应式以及相应的LCMS-LTQ谱图。
图5为本发明的由On-DNA烷基卤代物与甲基二苯基膦和醛试剂在碱作用下制得On-DNA烯烃化合物的产率情况分布(产率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准),其中,纵坐标是试剂个数,横坐标是转化率区间,如0-20%表示0%<转化率≤20%。
图6为本发明的由On-DNA烷基卤代物与甲基二苯基膦和醛试剂在碱作用下制得On-DNA烯烃化合物的醛原料的代表结构式及制得产物的产率(产率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)。
图7为本发明的由On-DNA烷基卤代物与甲基二苯基膦和醛试剂在碱作用下制得On-DNA烯烃化合物为原料,与11bp的DNA标签进行酶链反应后的琼脂糖电泳的胶图(TBEbuffer,4%agarose,120V,15min)。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1,On-DNA醛或酮化合物与α-溴代酮和TPPTS原位生成的膦盐在碱作用下制得On-DNA烯烃化合物
1)On-DNA醛或酮化合物的合成
DNA-NH2(例如专利CN108070009A提及的起始头片段)溶于250mM,pH=9.4的硼酸缓冲液,配制成1mM浓度溶液,与对羧基苯甲醛使用EDCI作为缩合剂、s-NHS缩合活化剂反应得到相应的On-DNA醛化合物(参考文献:Nat.Chem.,2015,7,3,241,见图1),该反应完成后乙醇沉淀处理,浓缩干燥后直接用于下一步的On-DNA维蒂希反应。
乙醇沉淀处理后的On-DNA苯甲醛的纯度为89%。
2)On-DNA烯烃化合物的合成1
用移液器向每个孔中含有不同α-溴代酮(4000mM的DMAc溶液,1.25μL,100eq.)的96孔板中加入三苯基膦-3,3,3-三磺酸三钠盐(TPPTS,200mM的超纯水溶液,2.50μL,100eq.),之后用封口膜将96孔板密封,并在PCR仪中于80℃加热2小时(盖温:105℃)。
On-DNA苯甲醛溶解于250mM,pH=9.4的硼酸缓冲液,配制成1mM浓度溶液,用12道移液器分装到新的96孔板中(1mM,5μL,1eq),再依次将上述制得的膦盐,碳酸钠(400mM水溶液,1.25μL,100eq.)加到96孔板中,封膜离心,让溶液沉底,涡旋混匀,再次离心后,封膜,在25℃下反应3小时。
反应完毕后乙醇沉淀:
向96孔板的每个孔加入总反应液体积10%的5M氯化钠溶液,封膜,振荡混匀后,加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇,于-80℃冰箱冷冻2小时,之后拿出在4℃以4000G的离心力离心30分钟,吸除上清液,沉淀用去离子水溶解后真空冻干,得到产物,通过酶标仪检测OD确认回收率,同时检测LCMS确认每个小分子的转化率。
我们共计验证了131个α-溴代酮和TPPTS原位生成的膦盐在碳酸钠作用下与On-DNA醛或酮化合物的On-DNA维蒂希反应,具体转化率分布见图2,代表试剂结构和产率见图3。
由于市售的膦盐或膦叶立德试剂种类偏少且不稳定,我们通过原料更易得的卤代酮与TPPTS原位生成膦盐试剂,在碱存在下,可以在室温下快速与On-DNA醛化合物反应得到On-DNA烯烃化合物,适合于多孔板进行的DNA编码化合物库的合成过程,可以显著增加DNA编码化合物库的多样性。
实施例2,On-DNA烷基卤代物与甲基二苯基膦和醛试剂在碱作用下制得On-DNA烯烃化合物
1)On-DNA烷基卤代物的合成
DNA-NH2(例如专利CN108070009A提及的起始头片段)溶于300mM,pH=12.4的磷酸缓冲液,配制成1mM浓度溶液(10nmol,10μL,1eq.),继续加入氯乙酰氯(200mM的乙腈溶液,5μL,100eq.),封膜涡旋混匀,离心,在20℃下反应4小时。该反应完成后乙醇沉淀处理,浓缩干燥后直接用于下一步的On-DNA维蒂希反应。
乙醇沉淀处理后的On-DNA甲基氯的纯度为98%。
2)On-DNA烯烃化合物的合成2
On-DNA甲基氯溶解于250mM,pH=9.5的硼酸缓冲液,配制成2mM浓度溶液,用12道移液器分装到新的96孔板中(2mM,5μL,1eq),再依次加入磷酸二氢钾(400mM水溶液,2.5μL,100eq.)、甲基二苯基膦(400mM的DMAc溶液,2.5μL,100eq.)和小分子醛(200mM的DMAc溶液,5.0μL,100eq.),封膜离心,让溶液沉底,涡旋混匀,再次离心后,封膜,并在PCR仪中于80℃加热6小时(盖温:105℃)。
反应完毕后乙醇沉淀:
向96孔板的每个孔加入总反应液体积10%的5M氯化钠溶液,封膜,振荡混匀后,加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇,于-80℃冰箱冷冻2小时,之后拿出在4℃以4000G的离心力离心30分钟,吸除上清液,沉淀用去离子水溶解后于冻干,得到产物,通过酶标仪检测OD确认回收率,同时检测LCMS确认每个小分子的转化率。
我们共计验证了1864个醛与On-DNA甲基氯的On-DNA维蒂希反应,具体转化率分布见图4,代表试剂结构和产率见图5。
为了扩大DNA编码化合物库的多样性,常见的给DNA氨基化合物库盖帽方法有:与小分子酸及其衍生物反应得到酰胺,与小分子醛还原氨化反应得到仲/叔胺,与异氰酸酯反应得到脲,与硫异氰酸酯反应得到硫脲,与磺酰氯反应得到磺酰胺,与醇反应形成氨基甲酸酯,与烷基卤代物反应得到仲/叔胺,与活性芳卤反应得到芳基仲/叔胺,本发明可以增加一种DNA氨基化合物库的盖帽方法,具体是让DNA氨基化合物库与类似氯乙酰氯的化合物反应,在DNA化合物库分子的小分子部分引入一个烷基卤代物,再与醛反应得到On-DNA烯烃化合物,可以显著增加DNA编码化合物库的多样性。
实施例3,On-DNA维蒂希反应适用于DNA编码化合物库合成的实验验证
为了验证该步反应对DNA的损伤和下一步酶链反应之间的相互影响,我们取部分验证得到的On-DNA烯烃化合物继续与11bp的DNA标签进行酶链:
向96孔板每个孔分装验证得到的On-DNA烯烃化合物(1mM,5.0μL,5.0nmol)和11bp短链DNA引物(1mM,7.5μL,7.5nmol,1.5eq.),继续加入10X T4DNA连接酶缓冲液(2.0μL),去离子水(8.1μL)和T4DNA连接酶(0.2μL,30U/μL),在20-25℃下150rpm振荡16h。4%琼脂糖胶显示酶链完毕后。
向96孔板的每个孔加入总反应液体积10%的5M氯化钠溶液,封膜,振荡混匀后,加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇,于-80℃冰箱冷冻2小时,之后拿出在4℃以4000G的离心力离心30分钟,吸除上清液,沉淀用去离子水溶解后于-40℃真空冻干,得到产物,通过酶标仪检测OD确认回收率,同时检测LCMS确认每个小分子的转化率。
4%琼脂糖胶图和LCMS都显示本发明得到的On-DNA烯烃化合物与11bp短链DNA引物酶链反应成功;用修饰后的DNA起始头片段与11bp短链DNA引物酶链后再分别进行本发明所述方法的On-DNA维蒂希反应,分别测试了10个代表结构式,产率没有明显变化,该步反应完全可以用于DNA编码化合物库的合成中。
综上所述,上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (27)
1.一种DNA编码化合物库构建中的On-DNA维蒂希反应的方法,其特征在于,是以On-DNA的醛或酮化合物为底物,在碱存在的情况下,与膦盐反应得到On-DNA烯烃化合物,其中,On-DNA的醛或酮化合物的结构式为所制备得到的On-DNA烯烃化合物的结构式如所示:
其中,结构式中的DNA是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链,R1基团是氢原子时,是醛化合物;R1基团与羰基直接相连的原子是碳原子时,是酮化合物,此时,R1基团是分子量在1000以内,且含有碳原子直接与羰基直接相连的有机基团;R2基团是可以与膦试剂形成膦盐的分子量在1000以下的小分子烷基卤代物的一部分。
所述On-DNA维蒂希反应中,将On-DNA醛或酮化合物溶于反应溶液中至摩尔浓度为0.1~5.0mM,与10~1000摩尔当量烷基卤代物和10~1000摩尔当量膦试剂在4~100℃反应0.5~24小时得到的膦盐,在10~1000摩尔当量的碱作用下,于4~100℃下反应0.5~24小时直至反应结束。
2.一种DNA编码化合物库构建中的On-DNA维蒂希反应的方法,其特征在于,是以On-DNA烷基卤代物为底物,与碱、膦试剂和小分子醛或酮试剂反应一锅法得到On-DNA烯烃化合物,其中,On-DNA烷基卤代物的结构式为所制备得到的On-DNA烯烃化合物的结构式如所示:
其中,结构式中的DNA是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链,X是氯、溴、碘原子中一种,R3或R4基团任意一个是氢原子,是分子量在1000以下的小分子醛试剂,R3或R4基团中直接与羰基相连的是的碳原子,是小分子酮试剂,此时,R3或R4基团是分子量在1000以内,含有碳原子直接与羰基直接相连的有机基团。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述On-DNA醛或酮化合物溶于反应溶液后的摩尔浓度是0.1~5.0mM。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述反应溶液是乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、1,4-二氧六环、水、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种溶液,且最终反应液中的水的含量不低于20%。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的烷基卤代物包括苄基类卤代物,卤代物是氯代物、溴代物、碘代物中的一种。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的烷基卤代物的摩尔当量是10~1000当量。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的膦试剂是三苯基膦、4-二苯基膦苯甲酸、2-二苯基膦苯甲酸、二苯基(邻甲氧基苯基)膦、4-(二甲氨基)三苯基膦、4-二苯基膦基苯磺酸钠、3-二苯基膦氟苯、2-二苯基膦基苯腈、双(4-甲氧基苯基)苯基膦、二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦二钾盐、双(3-磺酸苯基)(3,5-二-三氟甲基苯基)膦酸二钠单水合物、双(4-三氟甲基苯基)(3-磺酸苯基)膦、3-二苯基磷苯磺酸钠二水合物、三[3,4-双(三氟甲基)苯基]膦、三(4-氟苯基)膦、三(3-溴苯基)膦、三(2-甲氧基苯基)膦、三(4-甲氧基-3,5-二甲苯基)膦、三(4-二甲氨基苯基)膦、三(4-氯苯基)膦、三(3-氯苯基)膦、三苯基膦-3,3,3-三磺酸三钠盐、三(2,5-二甲苯基)膦、三对甲苯基膦、1,1-双(二苯基膦)甲烷、1,2-双(二甲基膦)乙烷、1,2-双(二苯基膦)乙烷、1,3-双(二苯基膦)丙烷、1,4-双(二苯基膦)丁烷、2,3-双(二苯基膦)丁烷、二苯基环己基膦、苯基二环己基膦、二苯基乙氧基膦、三(2-羧乙基)膦、甲基二苯基膦、乙基二苯膦、羧基甲基二苯基膦、二甲基苯基膦、2-(二叔丁基膦)联苯、二叔丁基苯基膦、三(3-羟基丙基)膦、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦、2-二环己基膦-2,4,6-三异丙基联苯、2-二环己基膦-2'-甲基联苯、2-二环己基膦-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯、2-二环己基膦基-o-2',6'-二甲氧基联苯、2-二-叔丁基膦基-2',4',6'-三异丙基联苯、2-二-叔丁基膦基-2'-甲基联苯、2-二-叔丁基膦基-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯、2-二环己基膦基-o-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯、2-(二-叔丁基膦基)联苯、2-二苯基膦基-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯、或4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述膦试剂的摩尔当量是10~1000当量。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述烷基卤代物和膦试剂原位生成膦盐的反应温度是4~100℃。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述烷基卤代物和膦试剂原位生成膦盐的反应时间是0.5~24小时。
11.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述碱是氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化镁、氢氧化锌、氢氧化铜、氢氧化铁、氢氧化铅、氢氧化钴、氢氧化铬、氢氧化锆、氢氧化镍、氢氧化铵、碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸铵、碳酸钙、碳酸镁、碳酸铜、碳酸锌、碳酸氢锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵、碳酸氢钙、碳酸氢镁、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、磷酸铵、磷酸铁、磷酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钙、磷酸氢二钙、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、硼酸锂、硼酸钠、硼酸钾、硼酸铵、硼酸钙、硼酸镁、偏硼酸钠、偏硼酸钾、偏硼酸铵、偏硼酸钙、偏硼酸镁、氟化锂、氟化钠、氟化钾、氟化铯、氟化铵、氟化钙、氟化镁、氯化锂、氯化钠、氯化钾、氯化铯、氯化铵、氯化钙、氯化镁、溴化锂、溴化钠、溴化钾、溴化铯、溴化铵、溴化钙、溴化镁、碘化锂、碘化钠、碘化钾、碘化铯、碘化铵、碘化钙、碘化镁、三乙胺、二异丙基乙胺、三乙烯二胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、4-二甲氨基吡啶、吡啶、N-甲基吗啉、四甲基乙二胺、乌洛托品、喹啉、咪唑、吲哚、乙二胺、或哌啶。
12.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述碱的摩尔当量是10~1000当量。
13.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的On-DNA维蒂希反应的反应温度是4~100℃。
14.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的On-DNA维蒂希反应的反应时间是0.5~24小时。
15.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述On-DNA维蒂希反应中,将On-DNA烷基卤代物溶于反应溶液中至摩尔浓度为0.1~5.0mM,与10~1000当量小分子醛或酮试剂和10~1000当量膦试剂,在10~1000当量碱作用下,于4~100℃下反应0.5~24小时直至反应结束。
16.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述On-DNA烷基卤代物溶于反应溶液后的摩尔浓度是0.1~5.0mM。
17.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述反应溶液是乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、1,4-二氧六环、水、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种溶液,且最终反应液中的水的含量不低于20%。
18.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述On-DNA烷基卤代物包括On-DNA苄基类卤代物,卤代物是氯代物、溴代物、碘代物中的一种。
19.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述小分子醛或酮试剂的摩尔当量是10~1000当量。
20.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述膦试剂是三苯基膦、4-二苯基膦苯甲酸、2-二苯基膦苯甲酸、二苯基(邻甲氧基苯基)膦、4-(二甲氨基)三苯基膦、4-二苯基膦基苯磺酸钠、3-二苯基膦氟苯、2-二苯基膦基苯腈、双(4-甲氧基苯基)苯基膦、二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦二钾盐、双(3-磺酸苯基)(3,5-二-三氟甲基苯基)膦酸二钠单水合物、双(4-三氟甲基苯基)(3-磺酸苯基)膦、3-二苯基膦苯磺酸钠二水合物、三[3,4-双(三氟甲基)苯基]膦、三(4-氟苯基)膦、三(3-溴苯基)膦、三(2-甲氧基苯基)膦、三(4-甲氧基-3,5-二甲苯基)膦、三(4-二甲氨基苯基)膦、三(4-氯苯基)膦、三(3-氯苯基)膦、三苯基膦-3,3,3-三磺酸三钠盐、三(2,5-二甲苯基)膦、三对甲苯基膦、1,1-双(二苯基膦)甲烷、1,2-双(二甲基膦)乙烷、1,2-双(二苯基膦)乙烷、1,3-双(二苯基膦)丙烷、1,4-双(二苯基膦)丁烷、2,3-双(二苯基膦)丁烷、二苯基环己基膦、苯基二环己基膦、二苯基乙氧基膦、三(2-羧乙基)膦、甲基二苯基膦、乙基二苯膦、羧基甲基二苯基膦、二甲基苯基膦、2-(二叔丁基膦)联苯、二叔丁基苯基膦、三(3-羟基丙基)膦、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦、2-二环己基膦-2,4,6-三异丙基联苯、2-二环己基膦-2'-甲基联苯、2-二环己基膦-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯、2-二环己基膦基-o-2',6'-二甲氧基联苯、2-二-叔丁基膦基-2',4',6'-三异丙基联苯、2-二-叔丁基膦基-2'-甲基联苯、2-二-叔丁基膦基-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯、2-二环己基膦基-o-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯、2-(二-叔丁基膦基)联苯、2-二苯基膦基-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯、或4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽。
21.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述膦试剂的摩尔当量是10~1000当量。
22.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述的碱是氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化镁、氢氧化锌、氢氧化铜、氢氧化铁、氢氧化铅、氢氧化钴、氢氧化铬、氢氧化锆、氢氧化镍、氢氧化铵、碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸铵、碳酸钙、碳酸镁、碳酸铜、碳酸锌、碳酸氢锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵、碳酸氢钙、碳酸氢镁、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、磷酸铵、磷酸铁、磷酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钙、磷酸氢二钙、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、硼酸锂、硼酸钠、硼酸钾、硼酸铵、硼酸钙、硼酸镁、偏硼酸钠、偏硼酸钾、偏硼酸铵、偏硼酸钙、偏硼酸镁、氟化锂、氟化钠、氟化钾、氟化铯、氟化铵、氟化钙、氟化镁、氯化锂、氯化钠、氯化钾、氯化铯、氯化铵、氯化钙、氯化镁、溴化锂、溴化钠、溴化钾、溴化铯、溴化铵、溴化钙、溴化镁、碘化锂、碘化钠、碘化钾、碘化铯、碘化铵、碘化钙、碘化镁、三乙胺、二异丙基乙胺、三乙烯二胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、4-二甲氨基吡啶、吡啶、N-甲基吗啉、四甲基乙二胺、乌洛托品、喹啉、咪唑、吲哚、乙二胺、或哌啶。
23.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述碱的摩尔当量是10~1000当量。
24.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述的On-DNA维蒂希反应的反应温度是4~100℃。
25.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述的On-DNA维蒂希反应的反应时间是0.5~24小时。
26.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法适用于批量的多孔板操作。
27.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述方法适用于批量的多孔板操作。
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GR01 | Patent grant | ||
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