CN112830950B - 一种合成On-DNA二氢噻唑/噻唑化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种合成On‑DNA二氢噻唑/噻唑化合物的方法，该方法以On‑DNA氰基化合物为原料，与半胱氨酸及其衍生物反应得到On‑DNA二氢噻唑化合物，On‑DNA二氢噻唑化合物可进一步通过氧化可以得到On‑DNA噻唑化合物。该方法无需催化剂，不引入金属类试剂，操作简单，环境友好，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

Description

一种合成On-DNA二氢噻唑/噻唑化合物的方法

技术领域

本发明属于编码化合物库技术领域，具体涉及一种由On-DNA氰基化合物与半胱氨酸及其衍生物反应得到On-DNA二氢噻唑化合物，以及再进一步氧化得到On-DNA噻唑化合物的方法。

背景技术

在药物研发，尤其是新药研发中，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库技术(WO2005058479、WO2018166532、CN103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，并能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(Accounts of ChemicalResearch,2014,47,1247-1255)。

DNA编码化合物库通过组合化学快速产生巨型化合物库，并且能高通量地筛选出先导化合物，使得先导化合物的筛选变得前所未有的快捷和高效。构建DNA编码化合物库的挑战之一就是需要在DNA上高收率地合成具有化学多样性的小分子。由于DNA需要在一定的条件下(溶剂、pH、温度、离子浓度)才能维持稳定，同时应用于DNA编码化合物库构建的On-DNA反应还需要有较高的产率。因此DNA上进行的化学反应(简称On-DNA反应)的试剂种类、反应种类、反应条件直接影响到DNA编码化合物库的丰富度和可选择性。从而开发能够与DNA兼容的化学反应也成为目前DNA编码化合物库技术的长期探索和研究方向，也直接影响了DNA编码化合物库的应用及商业价值。

二氢噻唑/噻唑类化合物是一类重要的药物骨架化合物，将二氢噻唑/噻唑骨架引入到DNA编码化合物库中能进一步扩展化合物库的多样性，有利于提高筛选到有效化合物的概率。目前已有报道的在DNA编码化合物库中构建噻唑骨架的方法是以On-DNA硫脲化合物为原料进行，适用的底物范围限制较大，且仅能合成胺基取代的On-DNA噻唑化合物。因此需要开发一种新的能广泛应用的On-DNA二氢噻唑/噻唑化合物合成方法，并适用于构建DNA编码化合物库的大批量多孔板操作。

发明内容

为了解决上述问题，我们开发了一种原料稳定存储、反应条件温和，底物普适性好，对DNA损伤小，适合于使用多孔板进行批量操作的DNA编码化合物库的合成方法，可以快速将On-DNA氰基化合物库通过一步反应转化为On-DNA二氢噻唑化合物，在氧化剂存在下，进一步将On-DNA二氢噻唑化合物转化得到On-DNA噻唑化合物。

本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种合成On-DNA二氢噻唑/噻唑化合物的方法，所述On-DNA二氢噻唑化合物是以On-DNA氰基化合物为原料，与半胱氨酸及其衍生物反应后得到；所述On-DNA噻唑化合物是以On-DNA二氢噻唑化合物为原料，在氧化剂存在下反应得到；所述On-DNA氰基化合物的结构式为DNA-R-CN；所述半胱氨酸及其衍生物的结构式为

其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与化合物中剩余部分相连；所述单链或双链的核苷酸链的长度为5～200bp。

其中，结构式中的DNA与R通过一个化学键或多个化学键或基团连接；一个化学键时，是指结构式中的DNA与R直接相连；多个化学键或基团时，指结构式中的DNA与R之间间隔多个化学键相连，比如，DNA与R之间通过一个亚甲基(-CH₂-)相连，即通过两个化学键连接；或DNA与R之间通过一个羰基(-CO-)连接DNA的氨基，也是通过两个化学键连接；或DNA与R通过一个亚甲基羰基(-CH₂CO-)连接DNA的氨基，即通过三个连续的化学键连接。

所述R选自烷基、取代烷基、杂环基、取代杂环基、芳基、取代芳基、芳杂环基或取代芳杂环基；其中，所述烷基为C₁～C₂₀烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基中的一种或多种；

所述芳基选自苯基或萘基；取代芳基的取代基的数量为一个或多个，取代芳基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、烷氧基、C₁～C₂₀烷基中的一种或多种；

所述杂环基是携带至少一个选自O、S、N的3至8个原子的饱和或不饱和的单环或多环烃基，所述取代杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代杂环基的取代基是相互独立的的选自卤素、氰基、硝基、烷氧基、C₁～C₂₀烷基、芳杂环基中的一种或多种；

所述的芳杂环基选自吡啶基、喹啉基、噻唑基或噻吩基；所述取代芳杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、C₁～C₂₀烷基、烷氧基、苯基、卤代苯基、烷基苯基中的一种或多种。

或者R不存在，所述的On-DNA氰基化合物的结构式为DNA-CN；

所述的R₁、R₂分别独立的选自氢、卤素、氰基、羟基、羧基、氨基、硝基、烷基、取代烷基、烷基氨基、烷氧基；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基中的一种或多种；所述的烷基为C₁-C₁₂的直链或支链烷基；所述的烷氧基为C₁-C₁₂的直链或支链烷氧基。

优选地，所述的R₁、R₂分别独立的选自氢或烷基，所述烷基为C₁-C₆的直链或支链烷基，所述的C₁～C₆烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基。

更进一步的，所述的所述半胱氨酸的衍生物的结构式为

所述的On-DNA氰基化合物选自：

所述的On-DNA二氢噻唑化合物选自：

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本发明提供的合成On-DNA二氢噻唑/噻唑化合物的方法，所述反应的步骤为：(1)向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mM的On-DNA氰基化合物溶液中，加入10～1000倍摩尔当量的半胱氨酸及其衍生物，在20℃～100℃下反应0.5-24小时至反应结束，得到On-DNA二氢噻唑化合物；

(2)向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mM的On-DNA二氢噻唑化合物溶液中加入10～1000倍摩尔当量的氧化剂，在20℃～100℃下反应0.5-24小时至反应结束，得到On-DNA噻唑化合物。

进一步地，所述氧化剂为单质碘、氧气、高碘酸钠、间氯过氧苯甲酸、过氧叔丁醇、叔丁基过氧化物、过硫酸氢钾复合盐、过硫酸钾；优选地，所述氧化剂为单质碘。

进一步地，所述On-DNA氰基化合物的摩尔当量为1，所述半胱氨酸及其衍生物的摩尔当量为10～1000；优选地，所述半胱氨酸及其衍生物的摩尔当量为100、200、300、400、500、600、700或800。

进一步地，所述On-DNA二氢噻唑化合物的摩尔当量为1，所述氧化剂的摩尔当量为10～1000；优选地，所述氧化剂的摩尔当量为100、200、300、400、500、600、700或800。

进一步地，所述得到On-DNA二氢噻唑化合物的反应是在溶剂中进行的，所述溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂；优选地，所述反应溶剂为硼酸钠缓冲液。

所述得到On-DNA噻唑化合物的反应是在溶剂中进行的，所述溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂；优选地，所述反应溶剂含有硼酸钠缓冲液、乙腈。

进一步地，所述得到On-DNA二氢噻唑化合物的反应的反应温度为20℃～100℃；优选地，反应温度为30℃、60℃、70℃、80℃或90℃；所述得到On-DNA噻唑化合物的反应的反应温度为20℃～100℃；优选地，反应温度为30℃、50℃、60℃、70℃或80℃。

进一步地，所述步骤(1)和(2)反应的反应时间为0.5～24小时；优选地，反应时间为0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时或16小时。

进一步地，所述得到On-DNA二氢噻唑化合物的反应的加料顺序为先加入On-DNA氰基化合物，再加入半胱氨酸；所述得到On-DNA噻唑化合物的反应的加料顺序为先加入On-DNA二氢噻唑化合物，再加入氧化剂。

进一步地，上述方法用于批量的多孔板操作。

进一步地，上述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。

本发明方法可以实现将On-DNA氰基化合物转化为On-DNA二氢噻唑/噻唑化合物。该方法无需催化剂，不引入金属类试剂，环境友好，操作简单，产物单一，能够适用的底物范围广，且适合大规模多孔板操作。

关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。

碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(Ca～C_b)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，C₁～C₂₀烷基是指包含1～20个碳原子的直链或支链的烷基。

烷基是指烷烃分子中少掉一个氢原子而成的直链或支链的烃基，例如甲基-CH₃，乙基-CH₂CH₃；烷基基团也可以是其他基团的一部分，所述其他基团为例如C1～C6烷氧基。

所述卤素为氟、氯、溴或碘。

烷氧基：是指烷基与氧原子连接形成取代基，例如甲氧基为-OCH₃。

卤代苯基：表示卤素取代的苯基。

烷基苯基：表示烷基取代的苯基。

杂环基：是携带至少一个选自O、S、N的3至8个原子的饱和或不饱和的单环或多环烃基。

芳基：是指不含杂原子，由C原子构成的芳香性单一环状或多个环状基团。

芳杂环基指包含一个到多个杂原子的具有共轭的π电子体系的单环或稠合多环，含有至少一个选自N、O或S的环杂原子，其余环原子是C，另外具有完全共轭的π电子系统。例如呋喃、吡咯、喹啉、噻吩、吡啶、吡唑、N-烷基吡咯、嘧啶、吡嗪、咪唑、四唑、噻吩并吡啶基等。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明实施例2中得到的10种On-DNA氮杂环化合物相应的转化率。

图2为本发明实施例3中得到的11种On-DNA氮杂环化合物相应的转化率。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例中DNA是单链或双链DNA与接头基团形成的带有-NH₂接头的DNA结构，例如WO2005058479中“compound1”的DNA-NH₂结构。也例如下述的DNA结构：

其中，A为腺嘌呤，T为胸腺嘧啶，C为胞嘧啶，G为鸟嘌呤。

上述DNA-NH₂结构进一步通过一个或多个化学键或基团与氰基或-R₁-CN相连以得到实施例中的原料DNA-CN或DNA-R₁-CN。

实施例1、On-DNA二氢噻唑/噻唑化合物的合成

将On-DNA氰基化合物溶解到硼酸钠的缓冲液中(250mM，pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(100μL，100nmol)，向溶液中加入半胱氨酸(20000nmol,200当量，100mM硼酸钠溶液(0.25M,pH＝9.4))，混合均匀，80℃反应16小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA二氢噻唑化合物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS确认氰基转化为二氢噻唑的反应转化率为92％。

将On-DNA二氢噻唑化合物溶解到硼酸钠的缓冲液中(250mM，pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(50μL，50nmol)，向溶液中加入碘(10000nmol,200当量，400mM乙腈溶液)，混合均匀，60℃反应16小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA噻唑化合物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS确认反应转化率为86％。

实施例2、On-DNA二氢噻唑化合物的合成

将10种On-DNA氰基化合物溶解到硼酸钠的缓冲液中(250mM，pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(100μL，100nmol)，分别向溶液中加入L-半胱氨酸(20000nmol,200当量，100mM的硼酸钠溶液(0.25M,pH＝9.4))，混合均匀，80℃反应16小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA二氢噻唑化合物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS确认转化为二氢噻唑的反应转化率。

实施例3、On-DNA二氢噻唑化合物的合成

将11种On-DNA氰基化合物溶解到硼酸钠的缓冲液中(250mM，pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(100μL，100nmol)，分别向溶液中加入D-青霉胺(50000nmol,500当量，100mM的硼酸钠溶液(0.25M,pH＝9.4)，混合均匀，80℃反应16小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA二氢噻唑化合物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS确认转化为二氢噻唑的反应转化率。

综上，本发明通过控制反应时的溶剂、温度、pH等条件，由On-DNA氰基化合物和半胱氨酸反应得到On-DNA二氢噻唑化合物，再进一步氧化可得到On-DNA噻唑化合物。该方法能够引入二氢噻唑和噻唑作为化合物骨架结构，反应无需催化剂，不引入金属类试剂，操作简单，环境友好，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

Claims (8)

1.一种合成On-DNA二氢噻唑/噻唑化合物的方法，其特征在于：所述On-DNA二氢噻唑化合物是以On-DNA氰基化合物为原料，与半胱氨酸及其衍生物反应后得到；所述On-DNA噻唑化合物是以On-DNA二氢噻唑化合物为原料，在单质碘存在下反应得到；所述On-DNA氰基化合物的结构式为DNA-R-CN；所述半胱氨酸及其衍生物的结构式为

其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过亚甲基、羰基、亚氨基中任意一种或多种与化合物中R相连；

所述反应的步骤为：(1)将On-DNA氰基化合物溶解于浓度为250mM且pH＝9.4的硼酸钠缓冲液中，配制成1mM浓度溶液，将半胱氨酸及其衍生物溶解于250mM且pH＝9.4的硼酸钠缓冲液中，配制100mM浓度溶液，向摩尔当量为1，摩尔浓度为1mM的On-DNA氰基化合物溶液中，加入10～1000倍摩尔当量的半胱氨酸及其衍生物的硼酸钠缓冲液，在20℃～100℃下反应0.5-24小时至反应结束，得到On-DNA二氢噻唑化合物；

(2)向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mM的On-DNA二氢噻唑化合物溶液中加入10～1000倍摩尔当量的单质碘，在20℃～100℃下反应0.5-24小时至反应结束，得到On-DNA噻唑化合物；

所述R选自苯基、卤代苯基、吡啶基、噻吩基、吡嗪基取代的哌嗪基或者不存在；

所述的R₁、R₂分别独立的选自氢或甲基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述On-DNA氰基化合物的摩尔当量为1，所述半胱氨酸及其衍生物的摩尔当量为100、200、300、400、500、600、700或800。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述On-DNA二氢噻唑化合物的摩尔当量为1，所述单质碘的摩尔当量为100、200、300、400、500、600、700或800。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述得到On-DNA二氢噻唑化合物的反应是在溶剂中进行的，所述溶剂为水、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂；所述得到On-DNA噻唑化合物的反应是在溶剂中进行的，所述溶剂为水、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述得到On-DNA二氢噻唑化合物的的反应温度为30℃、60℃、70℃、80℃或90℃；所述得到On-DNA噻唑化合物的反应温度为30℃、50℃、60℃、70℃或80℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)的反应时间为0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时或16小时。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述方法用于批量的多孔板操作。

8.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。

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