CN113089104B - 一种On-DNA二胺化合物关环反应的合成方法 - Google Patents

一种On-DNA二胺化合物关环反应的合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种On‑DNA二胺化合物关环反应的合成方法，该方法以On‑DNA二胺化合物为底物，与溴化氰进行关环反应，得到On‑DNA氮杂环化合物的方法，该方法底物适用范围广，能够在有机溶剂/水相的混合水相中进行，操作简单，条件温和，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

Description

一种On-DNA二胺化合物关环反应的合成方法
技术领域
本发明属于编码化合物库技术领域，具体涉及一种On-DNA二胺化合物与溴化氰进行关环反应得到On-DNA氮杂环化合物的方法。
背景技术
在药物研发，尤其是新药研发中，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库技术(WO2005058479、WO2018166532、CN103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，并能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(Accounts of ChemicalResearch,2014,47,1247-1255)。
DNA编码化合物库通过组合化学快速产生巨型化合物库，并且能高通量地筛选出先导化合物，使得先导化合物的筛选变得前所未有的快捷和高效。构建DNA编码化合物库的挑战之一就是需要在DNA上高收率地合成具有化学多样性的小分子。由于DNA需要在一定的条件下(溶剂、pH、温度、离子浓度)才能维持稳定，同时应用于DNA编码化合物库构建的On-DNA反应还需要有较高的产率。因此DNA上进行的化学反应(简称On-DNA反应)的试剂种类、反应种类、反应条件直接影响到DNA编码化合物库的丰富度和可选择性。从而开发能够与DNA兼容的化学反应也成为目前DNA编码化合物库技术的长期探索和研究方向，也直接影响了DNA编码化合物库的应用及商业价值。
氮杂环化合物是一类重要的药物化合物骨架结构，将多种氮杂环骨架引入到DNA编码化合物库能进一步扩展化合物库的多样性，有利于提高筛选有效化合物的概率。目前没有报道通过On-DNA二胺化合物与溴化氰通过关环反应构建On-DNA氮杂环骨架化合物的方法。因此需要开发一种新的适用于不同On-DNA二胺化合物的关环反应方法，大规模构建多种氮杂环骨架，显著增加DNA编码化合物库的多样性，进一步提升DNA编码化合物库技术的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种On-DNA二胺化合物关环反应的方法，该方法反应条件温和、选择性高、产率高、后处理简单的优点，适合DNA编码化合物库的生产，能显著提高化合物库分子的多样性。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种On-DNA二胺化合物关环反应的合成方法，所述方法是以On-DNA二胺化合物和溴化氰为原料，经过反应得到On-DNA产物；其中On-DNA二胺化合物的结构式为
Figure BDA0002493281820000021
所述On-DNA产物的结构式为/>
Figure BDA0002493281820000022
Figure BDA0002493281820000023
其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与结构式中其它部分相连；
其中，结构式中的DNA与Ar通过一个化学键或多个化学键或基团连接；一个化学键时，是指结构式中的DNA与Ar直接相连；多个化学键或基团时，指结构式中的DNA与Ar之间间隔多个化学键相连，比如，DNA与Ar之间通过一个亚甲基(-CH2-)相连，即通过两个化学键连接；或DNA与Ar之间通过一个羰基(-CO-)连接DNA的氨基，也是通过两个化学键连接；或DNA与Ar通过一个亚甲基羰基(-CH2CO-)连接DNA的氨基，也是通过三个连续的化学键连接。
其中，Ar是选自取代的单环或双环的芳香环；R1选自氢或分子量1000以下与氨基氮原子直接相连的基团，n的取值是0或1。
R1选自烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；其中，所述烷基为C1～C20烷基或C3～C8环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基中的一种或多种；所述芳香基选自吡啶基、喹啉基、噻唑基、噻吩基或苯基；取代芳香基的取代基的数量为一个或多个，取代芳香基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、烷氧基、C1～C20烷基中的一种或多种。
优选地；所述的R1选自直链或支链C1～C12烷基，更进一步地；所述的R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基。
优选地；R1选自取代烷基；所述烷基为C1～C6烷基，具体选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述取代烷基的取代基选自苯基或C1～C6烷基苯基；所述的C1～C6烷基苯基选自甲基苯基、乙基苯基、正丙基苯基、异丙基苯基、正丁基苯基、异丁基苯基、叔丁基苯基、戊烷基苯基、己烷基苯基。
优选地；R1选自取代芳香基，所述的芳香基为苯基，所述取代芳香基的取代基选自C1～C6烷基；所述C1～C6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基。
优选地；所述的Ar选自以下基团：
Figure BDA0002493281820000031
R2为氢、卤素、氰基、羟基、羧基、氨基、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基中的任意一种或多种的随机组合，Ar上可以有一个或多个R2基团，X为O、S、NH或烷基取代的亚氨基中的任意一种；
所述烷基为C1-C12的直链或支链烷基；所述烷氧基为C1-C12的直链或支链烷氧基；
取代烷基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、羧基、苯基、烷氧基苯基中的一种或多种；
取代烷氧基的取代基的数量为一个或多个，取代烷氧基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、羧基、苯基中的一种或多种。
优选地；所述R2为取代C1-C6烷基，所述C1～C6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述取代C1-C6烷基的取代基为羧基。
优选地；所述R2为取代C1～C6烷氧基，所述C1～C6烷氧基选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊烷氧基、己烷氧基；所述取代C1～C6烷氧基的取代基选自羧基。
进一步地；所述Ar选自
Figure BDA0002493281820000032
优选地，所述的
Figure BDA0002493281820000033
选自/>
Figure BDA0002493281820000034
Figure BDA0002493281820000041
所述R1为芳香基，具体选自吡啶基、喹啉基、噻唑基、噻吩基或苯基；
或R1选自取代烷基；所述烷基为C1～C6烷基，具体选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述取代烷基的取代基选自苯基或C1～C6烷基苯基；所述的C1～C6烷基苯基选自甲基苯基、乙基苯基、正丙基苯基、异丙基苯基、正丁基苯基、异丁基苯基、叔丁基苯基、戊烷基苯基、己烷基苯基；
或R1选自取代芳香基，所述的芳香基为苯基，所述取代芳香基的取代基选自C1～C6烷基；所述C1～C6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基。
所述的On-DNA二胺化合物的结构式具体选自
Figure BDA0002493281820000042
/>
Figure BDA0002493281820000043
Figure BDA0002493281820000051
所述的
Figure BDA0002493281820000052
选自/>
Figure BDA0002493281820000053
Figure BDA0002493281820000054
所述R2选自氢、卤素、氰基、羟基、羧基中的任意一种；
或所述R2为取代烷基，所述烷基为C1-C6的直链或支链烷基，取代烷基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、羧基中的一种或多种；
或所述R2为取代C1～C6烷氧基，所述C1～C6烷氧基选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊烷氧基、己烷氧基；所述取代C1～C6烷氧基的取代基选自羧基。
所述的On-DNA二胺化合物的结构式具体选自
Figure BDA0002493281820000055
/>
Figure BDA0002493281820000056
一种On-DNA二胺化合物关环反应的方法，包括以下步骤：(1)向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mM On-DNA二胺化合物溶液中，加入20～150倍摩尔当量的溴化氰，在20℃～100℃下反应8-24小时至反应结束，反应完毕后进行乙醇沉淀得到固体；
(2)将步骤(1)制备得到的固体溶解，配制成摩尔浓度为0.5-5mM溶液，在20℃～100℃下反应1-3小时至反应结束。
优选地，On-DNA二胺化合物溶液的摩尔浓度为0.5mM、1mM或2mM。
优选地，步骤(1)反应在溶剂中进行，溶剂为水、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的一种或几种含水的混合溶剂；进一步地，步骤(1)所述溶剂含有磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的pH为6～9；优选地，pH为7.1。
优选地，步骤(2)反应在溶剂中进行，溶剂为水、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的一种或几种含水的混合溶剂；优选地，所述溶剂含有硼酸盐缓冲液，所述硼酸盐缓冲液的pH为9～10；优选地，pH为9.4。
优选地，所述步骤(1)反应温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃或90℃。
优选地，所述步骤(2)反应温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃或90℃。
进一步地，所述方法中On-DNA二胺化合物的摩尔当量为1，溴化氰的摩尔当量为20～150；优选地，溴化氰的摩尔当量为40当量、60当量、80当量、100当量或120当量。
进一步地，所述方法的加料顺序为先加入On-DNA二胺化合物溶液，再加入溴化氰。
进一步地，上述方法用于批量的多孔板操作。
进一步地，上述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。
本发明方法可以实现On-DNA二胺化合物与溴化氰进行关环反应以构建On-DNA氮杂环化合物，可广泛适用于各种On-DNA二胺化合物底物，该方法收率高，产物单一，操作简单，环境友好，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成，可以为DNA编码化合物库提供新的化合物骨架。
在本发明的优选实施方案中，通过控制反应的溶剂和温度，可抑制副产物的产生，提升本发明方法应用于DNA编码化合物库建库的准确度。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(Ca～Cb)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，C1～C20烷基是指包含1～20个碳原子的直链或支链的烷基。
烷基是指烷烃分子中少掉一个氢原子而成的直链或支链的烃基，例如甲基-CH3，乙基-CH2CH3；烷基基团也可以是其他基团的一部分，所述其他基团为例如C1～C6烷氧基。
环烷基：是指具有多个碳原子且没有环杂原子且具有单个环或多个环(包括稠合、桥连和螺环体系)的饱和或部分饱和的环状基团。
卤素为氟、氯、溴或碘。
芳香基：是指芳香环上的部分H被取代得到的基团，例如吡啶基、喹啉基、噻唑基或苯基。
烷氧基：是指烷基与氧原子连接形成取代基，例如甲氧基为-OCH3。
卤代苯基：是指苯基上的H被卤素取代而形成的基团。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：本发明实施例3中得到的29种On-DNA氮杂环化合物相应的转化率。
图2：本发明实施例3中得到的29种On-DNA氮杂环化合物相应的转化率分布图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
本发明中，“室温”指20～25℃。
HOAT：N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑；DIC：N,N'-二异丙基碳二亚胺。
DMA：二甲基乙酰胺(Dimethylacetamide)；DMF：二甲基甲酰胺。
HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。
DIPEA：N,N-二异丙基乙胺；CAS：7087-68-5。
DMSO：二甲基亚砜；THF：四氢呋喃。
BBS buffer：硼酸盐缓冲溶液；PBS buffer：磷酸盐缓冲溶液。
DMT-MM：4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉氯化物。
本发明中DNA-NH2是单链或双链DNA与接头基团形成的带有-NH2接头的DNA结构，例如WO2005058479中“compound1”的DNA-NH2结构。
实施例1、On-DNA苯并氮杂环化合物的合成
Figure BDA0002493281820000081
On-DNA二胺化合物1按照上述反应方程式和反应条件制备得到。
Figure BDA0002493281820000082
将On-DNA二胺化合物1溶解在磷酸盐缓冲液(0.2M,pH＝7.1)中，配制成1mM浓度溶液(20μL，20nmol)，向该溶液中加入溴化氰(100摩尔当量，0.1M的H2O溶液),30℃下反应16小时；
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，低温冻干得到固体；
将所得固体溶解在硼酸盐缓冲液(0.5M,pH＝9.4)中，配制成1mM浓度溶液(20μL，20nmol)，80℃下反应1小时；
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，送LCMS确认转化率为89％。
实施例2、On-DNA苯并氮杂环化合物的合成
Figure BDA0002493281820000091
步骤1：将On-DNA二胺化合物1溶解在溶剂中，配制成1mM浓度溶液(20μL，20nmol)，向该溶液中加入溴化氰(X摩尔当量,100mM的H2O溶液),30℃下反应16小时；
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，低温冻干得到固体；
步骤2：将所得固体溶解在溶剂中，配制成1mM浓度溶液(20μL，20nmol)，T℃下反应1小时；
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，送LCMS确认转化率，具体反应条件和产率见下表。
表1：步骤1的反应条件参数和产率：
Figure BDA0002493281820000092
表2：步骤2的反应条件参数和产率：
Figure BDA0002493281820000093
表1和表2中：TM：目标产物；SM：起始物料；BP：中间产物。
表1和表2中的TM代表同一化合物，表1中的TM的转化率为第一步反应的转化率，表2中的TM的转化率为两步(步骤1+步骤2)反应的转化率。通过表1中的实验得出优选反应条件(表1，条件3)，控制该条件不变，在此基础上进行步骤2的实验，以得出步骤2的优选反应条件(表2，条件5)。
实施例3、On-DNA苯并氮杂环化合物的合成
Figure BDA0002493281820000101
29种On-DNA二胺化合物按照上述反应方程式和条件制备得到。
将29种On-DNA二胺化合物分别溶解在磷酸盐缓冲溶液(0.2M,pH＝7.1)中，配制成1mM浓度溶液(20μL，20nmol)，向该溶液中加入溴化氰(100摩尔当量,0.1M的H2O溶液),30℃下反应16小时；
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，低温冻干得到固体；
将所得29种固体分别溶解在硼酸盐缓冲液(0.5M,pH＝9.4)中，配制成1mM浓度溶液(20μL，20nmol)，80℃下反应1小时；
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，送LCMS确认为转化率。
综上所述，本发明通过控制反应时的溶剂、温度、pH等条件，由On-DNA二胺合物和溴化氰反应可以得到On-DNA氮杂环化合物。该方法底物适用范围广，能够短时间内高收率得到高多样性的DNA编码化合物库。该方法能够在水相中进行，操作简单，条件温和，环境友好，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

Claims (7)

1.一种On-DNA二胺化合物关环反应的合成方法，其特征在于：所述方法是以On-DNA二胺化合物和溴化氰为原料，经过反应得到On-DNA产物；其中On-DNA二胺化合物的结构式为
Figure FDA0003924574480000011
所述On-DNA产物的结构式为/>
Figure FDA0003924574480000012
其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与结构式中其它部分相连；
其中，Ar是选自取代的单环或双环的芳香环，R1选自氢或分子量1000以下与氨基氮原子直接相连的基团，n的取值是0或1；
所述反应的步骤为：(1)向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mM的On-DNA二胺化合物溶液中，加入20～150倍摩尔当量的溴化氰，在20℃～100℃下反应8-24小时至反应结束，反应完毕后进行沉淀得到固体；
(2)将步骤(1)制备得到的固体溶解，配制成0.5-5mM摩尔浓度溶液，在20℃～100℃下反应1-3小时至反应结束；
步骤(1)所述溶液含有磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的pH为6～9；
步骤(2)所述溶液含有硼酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液的pH为9～10。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：R1选自烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；其中，所述烷基为C1～C20烷基或C3～C8环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基中的一种或多种；所述芳香基选自吡啶基、喹啉基、噻唑基、噻吩基或苯基；取代芳香基的取代基的数量为一个或多个，取代芳香基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、烷氧基、C1～C20烷基中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的Ar选自以下基团：
Figure FDA0003924574480000013
Figure FDA0003924574480000021
R2为氢、卤素、氰基、羟基、羧基、氨基、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基中的任意一种或多种的随机组合，Ar上有一个或多个R2基团，X为O、S、NH或烷基取代的亚氨基中的任意一种；
所述烷基为C1-C12的直链或支链烷基；所述烷氧基为C1-C12的直链或支链烷氧基；
取代烷基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、羧基、苯基、烷氧基苯基中的一种或多种；
取代烷氧基的取代基的数量为一个或多个，取代烷氧基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、羧基、苯基中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应步骤(1)的反应温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃或90℃；所述反应步骤(2)的反应温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃或90℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述溴化氰的摩尔当量为40当量、60当量、80当量、100当量或120当量。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述方法用于批量的多孔板操作。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。
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