CN114920790B - 一种寡聚核酸-二酰亚胺化合物的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了在DNA上合成寡聚核酸‑二酰亚胺先导化合物的方法，它是以式III所示的寡聚核酸‑氨基化合物和式II所示的双羧基化合物为原料，在碱、缩合剂、羧基活化剂作用下于溶剂中反应，得到式I所示的寡聚核酸‑二酰亚胺化合物。本发明方法对DNA损伤小，普适性好，操作简单，条件温和，能高转化率地制得寡聚核酸‑二酰亚胺化合物，可构建含二酰亚胺化合物结构的基因编码化合物库、为将来应用于生物筛选提供基础，同时还可以丰富为数不多的在DNA上合成编码化合物库的有机分子骨架结构，为扩大和丰富DELT化合物库提供重要基础。
Description
技术领域
本发明属于基因编码化合物库构建领域，具体涉及一种寡聚核酸-二酰亚胺化合物的合成方法。
背景技术
在药物研发中，针对生物靶标的高通量筛选可以帮助我们快速获得先导化合物，但基于单个分子的传统高通量筛选存在化合物库数量有限、时间较长、成本高等缺点。这就限制了先导化合物发现的时效性。而Brenner和Lerner于1992年创造性地提出可以使用基因编码化合物库技术(DELT)来进行生物活性筛选的方法，它结合了分子生物学技术，在分子水平上给每个化合物加上一个DNA标签，从而可以通过组合化学的合成方法在较短的时间内产生多达亿级的化合物库，这种DNA逐个标记的化合物库可以直接进行生物活性筛选。DELT不仅突破了传统高通量生物筛选的高成本与化合物化学空间上的瓶颈，实现了化合物化学结构空间及数量上的飞跃，而且使用了全新的类似于表型筛选(phenotypicscreening)的模式，可以同时在多种生物筛选条件下简洁、高效地进行先导化合物的发现。
为了能够成功地筛选到与生物标靶蛋白有亲和力的小分子化合物，构建化学结构上的多样性是DELT能够成功筛选的重要保障。在基因编码化合物库上能够成功应用的化学反应的种类越多，条件越丰富，在进行基因编码化合物库的设计和合成时选择才越多，化合物库的多样性也会越丰富。但由于DNA化学结构的特殊性，它只能在一定的条件下(温度、pH、离子浓度、溶剂等)才能稳定，同时运用于基因编码化合物库构建的化学反应还需要较高的转化率，因此能够在基因编码化合物库上运用的化学反应的种类十分有限。因此开发出更多能适用于基因编码化合物库的合成方法也是DELT领域的重要工作之一。
二酰亚胺化合物是一类重要的药物分子片段。例如：阿普斯特(ApreMilast)是FDA批准的首个用于斑块型银屑病治疗的PDE4抑制剂。又如泊马度胺(Pomalidomide)是新上市的第三代免疫调节剂，可增强T细胞和自然杀伤细胞介导的免疫反应、抑制单核细胞促炎性细胞因子的生成、诱导肿瘤细胞凋亡，在各类恶性肿瘤、免疫性疾病的治疗中受到广泛关注。又如索非布韦(Sofosbuvir)是丙型肝炎病毒的核苷酸抑制剂，对HCVNS5B聚合酶具有选择性的抑制作用。再如来那度胺(又称雷利度胺，Lenalidomide)已被成功地用于治疗炎症性疾病和癌症。可见，多种具有二酰亚胺结构化合物具有药理学活性，意味着对具有二酰亚胺结构的化合物进行生物活性筛选具有重要的意义。
然而，DNA化学与普通化学反应存在重要差别，许多普通的小分子化学反应由于条件苛刻，容易引起DNA变性，使得它们不能应用于基因编码化合物库构建。目前，还没有在DNA上合成琥珀酰亚胺化合物等二酰亚胺结构的相关反应的报道，因此开发一种对DNA损伤小、转化率高的寡聚核酸-二酰亚胺化合物合成方法，对于填补DELT中寡聚核酸-二酰亚胺化合物的空缺，丰富DELT具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种寡聚核酸-二酰亚胺化合物的合成方法。
本发明提供了一种寡聚核酸-二酰亚胺化合物的合成方法，包括如下步骤：
(1)以式III所示的寡聚核酸-氨基化合物和式II所示的双羧基化合物为原料，在碱、缩合剂、羧基活化剂作用下于溶剂中反应；
(2)补加碱、缩合剂、羧基活化剂继续反应；得到式I所示的寡聚核酸-二酰亚胺化合物；反应式如下：
其中，L为连接单元；
R1、R2分别独立选自H、C1～10烷基，或R1、R2连接形成取代或未取代的芳环或芳杂环；所述取代的取代基是卤素或C1～10烷基；
R3、R4分别独立选自H、C1～10烷基，或R3、R4连接形成3～8元环烃基；
m为0～4的任意整数。
进一步地，步骤(1)所述式III所示的寡聚核酸-氨基化合物、式II所示的双羧基化合物、碱、缩合剂和羧基活化剂的摩尔比例为(0.1～2):(1～1000):(1～3000):(1～3000):(1～500)；优选为(0.5～1.5):(1～500):(750～2500):(750～2500):(125～425)；所述反应时间为1～36小时，优选为3～24小时；所述反应温度为20～90℃，优选为20～40℃；
和/或，步骤(2)所述补加的碱、缩合剂和羧基活化剂与所述式III所示的寡聚核酸-氨基化合物的摩尔比为：(1～3000):(1～3000):(1～500):(0.1～2)，优选为(750～2500):(750～2500):(125～425):(0.5～1.5)；所述反应时间为1～36小时，优选为3～24小时；所述反应温度为20～90℃，优选为20～40℃；
和/或步骤(1)和步骤(2)所述碱为N-甲基吗啉、三乙胺、正丁胺、异丁胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、1,1,3,3-四甲基胍、N,N-二环己基甲胺、二环己胺、四氢吡咯、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或任意几种的混合；优选为N,N-二异丙基乙胺、硼酸盐缓冲液中的一种；
和/或步骤(1)和步骤(2)所述缩合剂为EDCI、TBTU、EEDQ、COMU或其水合物中的任意一种或任意几种的混合；
所述羧基活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、N-羟基苯并三氮唑或其水合物中的任意一种或任意几种的混合；优选为1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑或N-羟基苯并三氮唑；
和/或所述溶剂为水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环己醇、2-氟乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、1,4-二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚，乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种的混合，优选为水和二甲亚砜的混合。
更进一步地，步骤(1)所述式III所示的寡聚核酸-氨基化合物、式II所示的双羧基化合物、碱、缩合剂和羧基活化剂的摩尔比例为1:200:2400:2400:400；所述反应时间为16小时，所述反应温度为20～30℃；
和/或步骤(2)所述补加的碱、缩合剂和羧基活化剂与所述式III所示的寡聚核酸-氨基化合物的摩尔比为：2400:2400:400:1；所述反应时间为16小时，所述反应温度为20～30℃；
和/或步骤(1)和步骤(2)所述碱为N,N-二异丙基乙胺；
和/或步骤(1)和步骤(2)所述缩合剂为EDCI，所述羧基活化剂是1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；
和/或所述溶剂为水和二甲亚砜的混合且二甲基亚砜的总含量不低于50％。
进一步地，R1、R2分别独立选自H、C1～3烷基，或R1、R2连接形成取代或未取代的芳环或氮杂芳环；所述取代的取代基是卤素；
R3、R4分别独立选自H、C1～3烷基，或R3、R4连接形成3～6元环烷基；
m为0～3的任意整数；
优选地，R1、R2为H，或R1、R2连接形成F取代或未取代的苯环或吡啶环；
R3、R4为H，或R3、R4连接形成3元环烷基；
m为0或1。
进一步地，L为-NHCO-L1-；
L1为Ra、Rb取代或未取代的-(CH2)n-；Ra、Rb分别独立选自H、C1～4烷基、取代或未取代的苯基或苄基；所述取代的取代基是C1～4烷基；或，Ra、Rb连接形成3～8元环烷基；n为1～8的任意整数；
优选地，L1为Ra、Rb取代或未取代的-(CH2)n-；Ra、Rb分别独立选自H、C1～3烷基、苯基或甲基取代的苄基；或，Ra、Rb连接形成6元环烷基；n为1～6的任意整数。
进一步地，上述式I化合物为下列化合物之一：
本发明还提供了式I所示寡聚核酸-二酰亚胺化合物：
其中，L为连接单元；
R1、R2分别独立选自H、C1～10烷基，或R1、R2连接形成取代或未取代的芳环或芳杂环；所述取代的取代基是卤素或C1～10烷基；
R3、R4分别独立选自H、C1～10烷基，或R3、R4连接形成3～8元环烃基；
m为0～4的任意整数。
进一步地，R1、R2分别独立选自H、C1～3烷基，或R1、R2连接形成取代或未取代的芳环或氮杂芳环；所述取代的取代基是卤素；
R3、R4分别独立选自H、C1～3烷基，或R3、R4连接形成3～6元环烷基；
m为0～3的任意整数；
优选地，R1、R2为H，或R1、R2连接形成F取代或未取代的苯环或吡啶环；
R3、R4为H，或R3、R4连接形成3元环烷基；
m为0或1。
进一步地，L为-NHCO-L1-；
L1为Ra、Rb取代或未取代的-(CH2)n-；Ra、Rb分别独立选自H、C1～4烷基、取代或未取代的苯基或苄基；所述取代的取代基是C1～4烷基；或，Ra、Rb连接形成3～8元环烷基；n为1～8的任意整数；
优选地，L1为Ra、Rb取代或未取代的-(CH2)n-；Ra、Rb分别独立选自H、C1～3烷基、苯基或甲基取代的苄基；或，Ra、Rb连接形成6元环烷基；n为1～6的任意整数。
更进一步地，上述式I化合物是下列化合物之一：
本发明还提供了上述的合成方法在构建基因编码化合物库中的用途。
本发明的有益效果：本发明提供了一种在DNA上合成寡聚核酸-二酰亚胺先导化合物的方法，在特定的原料和反应条件下反应，成功制得寡聚核酸-二酰亚胺先导化合物。该方法对DNA损伤小，普适性好，操作简单，条件温和，能高转化率地制得寡聚核酸-二酰亚胺化合物，可构建含二酰亚胺化合物结构的基因编码化合物库、为将来应用于生物筛选提供基础，同时还可以丰富DNA编码化合物库的有机分子骨架结构，为扩大和丰富DELT化合物库提供重要基础。
本发明的术语解释：
本发明结构式中的“DNA”为单链或双链的寡聚核苷酸链。
缩写解释如下：4-(4,6-二甲氧基均三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)、(2-肟基-氰基乙酸乙酯)-N,N-二甲基-吗啉基脲六氟磷酸酯(COMU)。
本发明碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀Ca～b烷基表示任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。例如，C1～6烷基是指包含1～6个碳原子的直链或支链的烷基。
“环烃基”指饱和或不饱和的纯碳环(构成环骨架的原子均为C)，环烃基前的数值表示构成环骨架的原子数量，例如3～8元环烷基即构成环骨架的C原子个数为3～8的任意整数个；“杂环烃基”指环烃基的纯碳环中的部分碳原子被杂原子如O、N、S替代进而形成的稳定环结构，例如一个环上的一个亚甲基-CH2-上的C被O替代，即形成稳定结构的-O-，或被N替代形成稳定结构的-NH-；或被S替代形成稳定结构的-S-等，杂环烃基前的数值含义同环烃基前数值的含义。“环烷基”指饱和的环烃基。
“芳基/芳环”指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团/环状结构，例如苯基/苯环。所述芳基不含有杂原子，如N、O或S，同时连接母体的点必须在具有共轭的π电子体系的环上的碳原子上。
“杂芳基/杂芳环”指包含一个到多个杂原子的杂芳族基团/环状结构。这里所指的杂原子包括O、S和N。例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡唑基等。“氮杂芳环”即是杂原子为氮的杂芳环。
“卤素”指氟、氯、溴或碘。
“有机溶剂”包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环己醇、2-氟乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、1,4-二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚，乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯。
“Fmoc基团”是芴甲氧羰酰基。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明反应物式II化合物的结构。
图2为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物的结构。
图3为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P1的液相色谱质谱检测图谱。
图4为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P2的液相色谱质谱检测图谱。
图5为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P3的液相色谱质谱检测图谱。
图6为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P4的液相色谱质谱检测图谱。
图7为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P5的液相色谱质谱检测图谱。
图8为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P6的液相色谱质谱检测图谱。
图9为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P7的液相色谱质谱检测图谱。
图10为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P8的液相色谱质谱检测图谱。
图11为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P9的液相色谱质谱检测图谱。
图12为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P10的液相色谱质谱检测图谱。
图13为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P11的液相色谱质谱检测图谱。
图14为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P12的液相色谱质谱检测图谱。
图15为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P13的液相色谱质谱检测图谱。
图16为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P14的液相色谱质谱检测图谱。
图17为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P15的液相色谱质谱检测图谱。
图18为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P16的液相色谱质谱检测图谱。
图19为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P17的液相色谱质谱检测图谱。
图20为本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物P9与Tag A链接后的产物P9-1的液相色谱质谱检测图谱。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。本发明说明书中所有的“当量”指摩尔当量。
1.寡聚核苷酸链-氨基化合物原料S1-1～S1-9的合成
1.1合成DNA-NHFmoc
将100nmol HP(HP的结构如图最后所示，为市售产品)溶于去离子水配制成1mmol/L的溶液(100μL，1当量)。将40当量的起始头片段化合物SM2(市售产品)的DMSO溶液(20μL，200mmol/L)、250当量pH＝9.47的四硼酸钠(Na2B4O7)缓冲液(100μL，250mmol/L)、40当量的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)水溶液(20μL，200mmol/L)混合，将该混合物用涡旋振荡器充分混匀。再将上述混合物加入到HP的溶液中，混合均匀后于4℃下反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5mol/L氯化钠溶液。然后，继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应液置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液。余下沉淀用去离子水溶解后得到DNA-NHFmoc的溶液。
1.2合成DNA-NH2
将100nmol DNA-NHFmoc溶于去离子水配制成1mmol/L的DNA-NHFmoc溶液(100μL，1当量)，向其中加入10％的哌啶(piperidine)水溶液(56μL，659当量)，将两者混合均匀后于室温下反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5mol/L氯化钠溶液。然后，继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液。余下沉淀用去离子水溶解后得到寡聚核酸-NH2(简写为DNA-NH2)的溶液。
1.3合成寡聚核苷酸链-氨基化合物原料S1-5
将100nmol DNA-NH2溶于去离子水配制成1mmol/L的溶液(100μL，1当量)，向其中加入250当量pH＝9.47的四硼酸钠(Na2B4O7)缓冲液(100μL，250mmol/L)，50当量Fmoc-甘氨酸的二甲基亚砜溶液(25μL，200mmol/L)，40当量4-(4,6-二甲氧基均三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)水溶液(20μL，200mmol/L)，混合均匀后室温反应1小时。之后加入10％哌啶水溶液(56μL，659当量)，室温反应1小时脱掉氨基保护基。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5mol/L氯化钠溶液。然后，继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解后得到寡聚核苷酸链-氨基化合物S1-5水溶液，该溶液直接用于下一步反应。
利用上述方法，换用不同的Fmoc-氨基酸反应物，共合成如下9个寡聚核苷酸链-氨基化合物S1-1～S1-9：
在基因编码化合物库的合成中，数量庞大的氨基酸试剂为合成大量的目标产物提供了可能。另一方面，可以在基因编码化合物库的合成中第一个循环时将氨基酸试剂接到寡聚核苷酸链上，因此该方法可以很好的应用到基因编码化合物库的合成中，也体现了该方法的应用范围广，普适性高。
HP-NH2的代表结构为：
但需要特别说明的是，本发明方法不仅限于本发明上述特定结构的DNA链，可以是其它经人工修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸单体聚合得到的单链或双链的脱氧核糖核苷酸链，链的长度没有限制。
实施例1、寡聚核苷酸-二酰亚胺化合物的合成
1、寡聚核苷酸-二酰亚胺化合物P1的合成
将10nmol寡聚核苷酸链-NH2(S1-1)溶于去离子水配制成1mmol/L的溶液(10μL，1当量)，向其中加入200当量邻苯二甲酸的二甲基亚砜溶液(S2-1，10μL，200mmol/L)，2400当量N,N-二异丙基乙胺的乙腈溶液(24μL，1mol/L)，2400当量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的二甲基亚砜溶液(40μL，600mmol/L)，400当量1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)的二甲基亚砜溶液(20μL，200mmol/L)，混合均匀后室温反应16小时。之后补加2400当量N,N-二异丙基乙胺的乙腈溶液(24μL，1mol/L)，2400当量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的二甲基亚砜溶液(40μL，600mmol/L)，400当量1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)的二甲基亚砜溶液(20μL，200mmol/L)，混合均匀后室温反应16小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5mol/L氯化钠溶液。然后，继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解后得到寡聚核苷酸链-二酰亚胺化合物P1水溶液,分子量为5414。通过液相色谱质谱进行检测，检测到相应产物分子量，说明寡聚核苷酸链-氨基化合物S1-1可与邻苯二甲酸S2-1偶联得到寡聚核苷酸链-二酰亚胺化合物P1。通过液相色谱质谱检测得反应转化率为71％。
2、寡聚核酸-二酰亚胺化合物P2～P17的合成
将原料S1-1替换为S1-2～S1-9，以及DNA-NH2，原料S2-1替换为图1所示S2-2～S2-5化合物；按照P1的合成方法，合成图2所示的P2～P17寡聚核酸-二酰亚胺化合物化合物。
化合物P1～P17的液相色谱质谱检测图谱如图3～19所示，括号中百分数为液质转化率,“M.W.”代表分子量。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例2、本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物中寡聚核苷酸的完整性验证
寡聚核酸-二酰亚胺化合物与Tag A(短链的寡聚核苷酸，两条链的分子量分别为4064，5884)链接实验，以P9为例。
步骤：将1nmol P9溶于去离子水配制成1mmol/L的溶液(1μL，1当量)，向其中加入1.2当量的Tag A水溶液(1.2μL，1mmol/L)、1μL 10×T4DNA链接缓冲溶液以及0.5μL T4 DNA链接酶。然后将上述溶液混合均匀，室温反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5mol/L氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液。余下沉淀用去离子水溶解后通过液相色谱质谱检测确认产物分子量。
产物P9-1的液相色谱质谱联用仪检测结果见图20，寡聚核酸-二酰亚胺化合物P9与Tag A能够成功偶联。这说明按照本发明中描述的合成方法得到的寡聚核酸-二酰亚胺化合物的DNA链完整性好。再通过LCMS质谱能够精确地显示其分子量，进一步证实其核苷酸没有受到损伤。因此，本发明中的反应方法不会对DNA基本结构和活性造成损坏。
实验例3、本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物合成条件筛选
1、缩合剂筛选：
(1)换用碱+DMT-MM条件制备P1或P2：将10nmol寡聚核苷酸链-NH2(S1-1)溶于去离子水配制成1mmol/L的溶液(10μL，1当量)，向其中加入250当量pH＝9.47的四硼酸钠(Na2B4O7)缓冲液(10μL，250mmol/L)，50当量双羧基化合物S2-1或S2-2的二甲基亚砜溶液(2.5μL，200mmol/L)，80当量4-(4,6-二甲氧基均三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)水溶液(2μL，400mmol/L)，混合均匀后室温反应1小时。之后补加50当量双羧基化合物S2-1或S2-2的二甲基亚砜溶液(2.5μL，200mmol/L)，80当量4-(4,6-二甲氧基均三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)水溶液(2μL，400mmol/L)，室温反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5mol/L氯化钠溶液。然后，继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解后得到产物P1或P2，转化率均低于10％。说明换用其他缩合条件难以合成得到本发明寡聚核酸-二酰亚胺化合物。
(2)换用HATU条件制备P1：将10nmol寡聚核苷酸链-NH2(S1-1)溶于去离子水配制成1mmol/L的溶液(10μL，1当量)，向其中加入200当量N,N-二异丙基乙胺的二甲基亚砜溶液(10μL，200mmol/L)，200当量邻苯二甲酸的二甲基亚砜溶液(S2-1，10μL，200mmol/L)，200当量O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)的二甲基亚砜溶液(10μL，200mmol/L)，混合均匀后室温反应16小时。产品转化率仅为2％，显著低于本发明实施例1的71％。
2、缩合体系加入方式的筛选：合成P1时，如果一次性加足所需体系碱、EDCI、HOAt，得到的产品峰较杂，且产品转化率仅为50％，低于本发明实施例1分批次加料的转化率71％。
上述结果说明，只有在本发明特定的缩合剂体系和加入方式下，才能够制得本发明高转化率的寡聚核酸-二酰亚胺化合物。
综上，本发明提供了一种在DNA上合成寡聚核酸-二酰亚胺先导化合物的方法，在特定的原料和反应条件下反应，成功制得寡聚核酸-二酰亚胺先导化合物。该方法对DNA损伤小，普适性好，操作简单，条件温和，能制得高转化率地寡聚核酸-二酰亚胺化合物，可构建含二酰亚胺化合物结构的基因编码化合物库、为将来应用于生物筛选提供基础，同时还可以丰富DNA编码化合物库的有机分子骨架结构，为扩大和丰富DELT化合物库提供重要基础。
Claims (3)
1.一种寡聚核酸-二酰亚胺化合物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以式III所示的寡聚核酸-氨基化合物和式II所示的双羧基化合物为原料，在碱、缩合剂、羧基活化剂作用下于溶剂中反应；
(2)补加碱、缩合剂、羧基活化剂继续反应；得到式I所示的寡聚核酸-二酰亚胺化合物；反应式如下：
其中，m为0或1；m为0时，R1、R2连接形成F取代或未取代的苯环或吡啶环；m为1时，R3、R4连接形成3元环烷基；
L不存在或L为-NHCO-L1-；
L1为Ra、Rb取代或未取代的-(CH2)n-；Ra、Rb分别独立选自H、C1～3烷基、苯基或甲基取代的苄基；或，Ra、Rb连接形成6元环烷基；n为1～6的任意整数；
DNA为经人工修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸单体聚合得到的单链或双链的脱氧核糖核苷酸链；
步骤(1)所述式III所示的寡聚核酸-氨基化合物、式II所示的双羧基化合物、碱、缩合剂和羧基活化剂的摩尔比例为1:200:2400:2400:400；所述反应时间为16小时，所述反应温度为20～30℃；
步骤(2)所述补加的碱、缩合剂和羧基活化剂与所述式III所示的寡聚核酸-氨基化合物的摩尔比为：2400:2400:400:1；所述反应时间为16小时，所述反应温度为20～30℃；
步骤(1)和步骤(2)所述碱为N,N-二异丙基乙胺；
步骤(1)和步骤(2)所述缩合剂为EDCI，所述羧基活化剂是1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；
所述溶剂为水和二甲亚砜的混合且二甲基亚砜的总含量不低于50％。
2.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述式I化合物为下列化合物之一：
3.权利要求1～2任一项所述的合成方法在构建基因编码化合物库中的用途。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |