CN114230626A - 一种可在寡聚核酸上一锅法合成四元环内酰胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在寡聚核酸上合成重要的四元环内酰胺类化合物的方法。该方法有应用于基因编码化合物库构建的潜在价值。通过寡聚核酸‑末端炔烃化合物与硝酮反应的方法，可以构建四元环内酰胺的基因编码化合物库，丰富了基因编码化合物库的多样性。本发明提供的寡聚核酸‑末端炔烃化合物与硝酮的反应收率较高、普适性好、条件温和、操作方便，适用于多孔板进行的基因编码化合物库的合成。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种将寡聚核酸-末端炔烃化合物转化为寡聚核酸-四元环内酰胺的方法及其在基因编码化合物库中的应用。
背景技术
四元环内酰胺是一种四元环的β-内酰胺类化合物。β-内酰胺类抗生素是分子结构中含有β-内酰胺环的抗生素。这包括青霉素衍生物(penams)、头孢菌素和头霉素(cephems)、单内酰胺类、碳青霉烯类和碳头孢烯类化合物[1]。
β-内酰胺类抗生素是最常用的处方药之一。自从十九世纪二十年代亚历山大·弗莱明在寻找一种抗葡萄球菌噬菌体开始，β-内酰胺类抗生素的出现彻底改变了人类与细菌传染病作斗争的局面。β-内酰胺类抗生素是三大类抗生素之一。β-内酰胺是过去60年间治疗由多种细菌引起的细菌感染最成功的药物物种。据计算，目前这些抗生素的年支出约为150亿美元，占抗生素市场总量的65％[2]。
从药物的构效关系来看，这些药物有一个共同的特点，就是具有高反应活性的3-碳1-氮环(β-内酰胺环)化学结构特征。这些药包括：
青霉素(Penicillin)。这些抗生素(大多数以-cillin为后缀结尾)含有一个核6-氨基青霉烷酸(内酰胺加噻唑烷)环和其他环侧链。该组包括天然青霉素、β-内酰胺酶抗性药物、氨基青霉素、羧基青霉素和脲基青霉素[3-4]。
头孢菌素(Cephalosporins)。它们含有7-氨基头孢烷酸核和含有3,6-二氢-2H-1,3-噻氮烷环的侧链。头孢菌素类传统上分为五类或五代，尽管对这一术语的并没有被普遍接受[5]。
碳青霉烯类(Carbapenems)[6]。它们的结构特征是与β-内酰胺环偶联的碳青霉烯类化合物，可提供针对大多数β-内酰胺酶的保护作用。尽管这些化合物的耐药性是一个重要问题，并且主要发生在革兰氏阴性病原体中(例如，肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和不动杆菌)产生不同种类的β-内酰胺酶，称为碳青霉烯酶。
单杆菌(Monobacteria)。β-内酰胺环独立存在，不与另一个环并和。
β-内酰胺酶抑制剂。它们主要通过灭活丝氨酸β-内酰胺酶起作用，丝氨酸β-内酰胺酶是水解和灭活β-内酰胺环的酶(特别是在革兰氏阴性菌中存在)。这些药物包括第一代β-内酰胺酶抑制剂(克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦)和较新的阿维巴坦(Avibactam)和瓦博巴坦(Vaborbactam)，它们对碳青霉烯酶如肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)具有生物活性[7]。
然而，β-内酰胺类抗生素一直受到不断增加的临床耐药性问题的困扰。它们的使用形成了一个全球性的健康问题[8]。基于它们的耐药性机制，基本上有两种选择来继续使用β-内酰胺抗生素：1)设计新的不受细菌耐药机制的影响的β-内酰胺抗生素，2)结合现有的β-内酰胺类抗生素与另一种能够压制耐药机制的药物的联合疗法。过去三十多年来科学家一直努力地基于现有的β-内酰胺骨架去发现了新的β-内酰胺类和新的β-内酰胺衍生物并成功地发现了几种新的抗生素。同时，药物学家积极测试将能够抑制耐药性的药物与常用的β-内酰胺类抗生素联合治疗的方法。为了解决抗菌素耐药性的问题[9]，我们认为大量合成有应用价值的β-内酰胺环类化合物的衍生物以便在生物筛选中找到更完善的化学结构是十分有效的抗菌素新药的研发方向。本发明提出一种可以在寡聚核酸上进行的β-内酰胺环类化合物的合成方法及其应用于基因编码化合物库构建。
相较于经过几十年的发展与完善过的高通量生物活性筛选，Brenner和Lerner于1992年创造性地提出可以使用基因编码化合物库技术(DELT)来进行生物活性筛选的方法[10]。DELT不仅突破了前者的高成本瓶颈，实现了筛选的化合物化学结构空间及数量上的飞跃，并且使用了全新的类似于表型筛选(phenotypic screening)的生物筛选模式[11-12]。与传统高通量筛选相比，基因编码化合物库极大地增加了化合物的数量和多样性[13-14]。在很小的体积例如几十微升的反应管中，通过一系列反应，可以合成上千万甚至上亿种不同的化合物。DELT的原理是用不同特定序列的基因片段来标记反应过程中的每一个小分子化合物，用组合化学的策略，通过使用拆分、合并(split and pool)的方法，利用有限的成本和时间，大量合成百万级至百亿级连接有特定基因序列的化合物文库[15]。然后将所得化合物的混合物与蛋白质靶标一起孵育，通过洗去不能够与蛋白质靶标结合的化合物而达到物理分离并找到与标靶蛋白具有高亲和力的化合物[16]。孵育靶标蛋白质所需的基因编码化合物库只需极其小的剂量规模(微克)而且可以在很短时间内(比如1天内)进行。可以轻松地在不同条件下(例如，溶液的酸碱度、样品蛋白混合方式、蛋白质浓度、存在或不存在竞争化合物、存在不同的缓冲液或辅助因子)进行多项筛选实验。由于基因序列与化合物结构一一对应，通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)扩增和下一代测序(Next Generation Sequencing，简称NGS)读取后，就可以通过基因序列解码得到活性化合物的化学结构式。然后对与标靶蛋白具有高结合亲和力的化合物进行“脱离基因”的单独合成，并测定没有附着基因的化合物与目标蛋白质的结合力以确认其生物活性。
近年来，越来越多的制药公司使用DELT这一新药研发的强大工具[17]。它不仅能为传统的生物学靶标蛋白寻找新的配体，而且能为困扰药物学家的新颖靶标蛋白以及用传统方法无法找到结合物的疾病蛋白筛选到配体。因此，DELT将有助于找到新药研发中关键的起始活性化合物。尽管如此，DELT面对的挑战仍然是如何拓展文库小分子的化学空间以及优化其物理化学性质和卓越的生物筛选方法。
最近几年在这一领域里出现的在活细胞上进行的生物筛选方法，是一个引人注目的成就[18-19]。在活细胞上的筛选将不再需要纯化过的靶标蛋白，也无需对蛋白进行标记物修饰，更好地保持了蛋白的原生态结构，而且可以直接找到有细胞活性的先导化合物。这样，药物学家能够在此平台上找到更好的先导化合物。
构建化学结构上的多样性是DELT能够成功地筛选到有生物活性的化合物的重要原因。因此能够在基因编码化合物库上实现的化学反应的种类越多，条件越丰富，在进行基因编码化合物库的设计和和合成时选择才越多，得到的化合物库的多样性也会越丰富。开发更多能适用于基因编码化合物库的合成方法也是DELT领域的重要工作之一。到目前为止能够在DELT上适用的反应类型仍然十分有限。有一些化学反应可以实现在寡聚核酸方法学上的开发，但是在DEL的实际合成上却仍然难以实现。这是因为，DEL库的合成中所面对的反应底物适应性比寡聚核酸化学反应方法学更加复杂。因此，拓展在DELT上能够适用的新化学反应是目前DELT平台急需解决的重要问题。另外，在DELT合成中，对于一个3个循环的DEL，通过需要3到9步化学反应转化来实现。其中，脱保护基团的反应需要2步或者更多步。DELT上的每一步化学反应都不同程度地对寡聚核酸底物造成损伤。能够通过一步化学反应来合成3个循环的DEL反应屈指可数。这种高效方法不仅能够得到高品质的DEL，而且可以缩短DEL的合成时间，降低生产成本。因此，这方面的工作有突出的科学理论与实践应用价值。
目前在基因编码化合物库中直接用末端炔烃构建四元环内酰胺的方法还未有过相关报道，因此我们希望开发一种反应条件温和、底物普适性好、适用于基因编码化合物库中构建四元环内酰胺的合成方法,从而进一步增加基因编码化合物库的多样性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：本发明是首次报道一种在寡聚核酸上制备寡聚核酸-四元环内酰胺的方法。这些新颖结构的寡聚核酸-四元环内酰胺化合物具有如下化学结构特征:
其中，R1可以是氢、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C1-C12烷基、C2-C6烯烃基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C1-C6烷基氧、芳基、杂环芳基、卤素(氟、氯、溴、碘)、羧基、酯基、酰胺基中的任意一种至多种或它们的任意组合；结构式中Ar1、Ar2为五元、六元或更大的芳香环或芳香杂环。
其特征在于，所述反应只需要通过一锅法的化学方法将寡聚核酸-末端炔烃化合物转化为寡聚核酸-四元环内酰胺。
其特征在于以寡聚核酸-末端炔烃化合物和硝酮为原料，在铜催化剂的作用下通过衣笠反应(Kinugasa reaction)得到含有不同取代基的寡聚核酸-四元环内酰胺[20]。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
本申请提供寡聚核酸-四元环内酰胺的合成方法，浓度为0.1～2毫摩尔/升的寡聚核酸-末端炔烃化合物、1～500当量的硝酮、1～500当量的碱、0.1～100当量的铜催化剂及反应溶剂混合，在氮气保护下0～90℃反应1～24小时，直至反应结束，具体反应方程式如下：
其中，结构式中的寡聚核酸是经人工修饰的或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，其中链的长度没有限制。
其中结构式中的寡聚核酸与末端炔基通过一个化学键或多个化学键连接。
具体的炔烃可选自如下结构:
其中，R1可以是氢、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C1-C12烷基、C2-C6烯烃基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C1-C6烷基氧、芳基、杂环芳基、卤素(氟、氯、溴、碘)、羧基、酯基、酰胺基中的任意一种至多种或它们的任意组合；R2为连接寡聚核酸部分的功能团，具体是一个可以与寡聚核酸上的功能团进行链接反应的功能团，可以是羧基、氨基、芳香卤、醛基、烯烃、醛基、羟基、巯基、硼烷中的任意一种。
其中，硝酮可以是纯的化合物也可以是原位生成的反应粗产品；
其中，结构式中Ar1为五元、六元或更大的芳香环或芳香杂环；
其中，结构式中Ar2为五元、六元或更大的芳香环或芳香杂环。
在一个实施方案中，所述寡聚核酸-末端炔烃化合物的浓度是0.1～2毫摩尔/升；在一个优选的实施方案中，寡聚核酸-末端炔烃化合物的浓度为0.5～1.5毫摩尔/升；在一个更优选的实施方案中，寡聚核酸-末端炔烃化合物的浓度为1.0毫摩尔/升。
在一个实施方案中，所述硝酮的用量为1～500当量；在一个优选的实施方案中，硝酮的用量为1～100当量；在一个更优选的实施方案中，硝酮的用量为50当量。
在一个实施方案中，所述反应的碱是三乙胺、正丁胺、异丁胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、1,1,3,3-四甲基胍、N,N-二环己基甲胺、二环己胺、无机盐缓冲液(碳酸盐、磷酸盐、硼酸盐)、有机碱缓冲液(三乙基乙酸铵、三羟甲基氨基甲烷)中的任意一种或任意几种的混合。在一个优选的实施方案中，所述反应的碱是四甲基胍、N,N-二环己基甲胺、二环己胺中的一种；在一个更优选的实施方案中，所述反应的碱是N,N-二环己基甲胺。
在一个实施方案中，以1当量的寡聚核酸为参照，所述反应的碱N,N-二环己基甲胺的用量为1～500当量；在一个优选的实施方案中，N,N-二环己基甲胺的用量为10～200当量；在一个更优选的实施方案中，N,N-二环己基甲胺的用量为100当量。
在一个实施方案中,所述反应的铜催化剂是三氟甲磺酸铜(Cu(CF3SO3)2)、醋酸铜(Cu(OAc)2)、醋酸亚铜(CuOAc)、溴化铜(CuBr2)、无水氯化铜(CuCl2)、硫酸铜(CuSO4)、六氟磷酸四乙腈铜(Cu(MeCN)4PF6)、氟化铜(CuF2)、溴化亚铜(CuBr)、氯化亚铜(CuCl)、氯化亚铜-双(氯化锂)络合物(CuCl(LiCl)2)、溴化亚铜二甲硫醚络合物(CuB·SMe2)、碘化亚铜(CuI)及相应的水合物中的任意一种或任意几种的混合。在一个优选的实施方案中，反应的催化剂是碘化亚铜(CuI)、氯化亚铜-双(氯化锂)络合物(CuCl(LiCl)2)、六氟磷酸四乙腈铜(Cu(MeCN)4PF6)中的一种；在一个更优选的实施方案中，反应的催化剂是碘化亚铜(CuI)。
在一个实施方案中，以1当量的寡聚核酸为参照，所述碘化亚铜的用量为0.1～100当量；在一个优选的实施方案中，碘化亚铜的用量为0.1～50当量；在一个更优选的实施方案中，碘化亚铜的用量为10当量。
在一个实施方案中，所述反应的溶剂是水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环己醇、2-氟乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、1,4-二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚，乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种的混合，在一个优选的实施方案中，所述反应的溶剂是水和乙腈的混合；在一个更优选的实施方案中，所述反应的溶剂是水和乙腈的混合且乙腈的总含量不低于50％。
在一个实施方案中，所述的反应温度为0～90℃；在一个优选的实施方案中，反应温度为0～40℃；在一个更优选的实施方案中，反应温度为25℃。
在一个实施方案中，所述反应的时间为1～24小时；在一个优选的实施方案中，所述反应的时间为5～24小时；在一个更优选的实施方案中，所述反应的时间为12小时。
在一个实施方案中，所述反应的氛围是空气、氮气或氩气中的一种，在一个优选的实施方案中，所述反应的氛围是氮气或氩气中的一种，在一个更优选的方案中，所述反应的氛围是氮气。
本发明提供了一种构建寡聚核酸-四元环内酰胺的方法。本发明是首次在寡聚核酸上合成有重要应用价值的四元环内酰胺。本发明的特征是将寡聚核酸-末端炔烃化合物与硝酮以一锅法的简洁方法高效率地得到寡聚核酸-四元环内酰胺。本发明方法反应收率较高、底物普适性好、条件温和、操作方便，适用于多孔板进行的基因编码化合物库的合成。
附图说明
图1为本发明的原料制备方法1：寡聚核酸-NH2与含羧基和末端炔基的二元化合物使用2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯为缩合剂，反应得到相应的寡聚核酸-末端炔烃化合物，其化学反应式见图1。
图2为本发明的原料寡聚核酸-末端炔烃化合物制备时所使用的含羧基和末端炔基的二元化合物的代表结构式。
图3为本发明的原料制备方法2：寡聚核酸-COOH与含氨基和末端炔基的二元化合物使用2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯为缩合剂，反应得到相应的寡聚核酸-末端炔烃化合物，其化学反应式见图3。
图4为本发明的原料寡聚核酸-末端炔烃化合物制备时所使用的含氨基和末端炔基的二元化合物的代表结构式。
图5为本发明的原料硝酮的制备方法：芳香硝基化合物与芳香醛基化合物使用锌粉为还原剂，原位反应得到相应硝酮，其化学反应式见图5。
图6为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物与硝酮反应生成寡聚核酸-四元环内酰胺的化学反应式。
图7为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1与原位生成的硝酮2-1反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A1的液相色谱质谱检测结果。
图8为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1与原位生成的硝酮2-3反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A2的液相色谱质谱检测结果。
图9为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1与原位生成的硝酮2-4反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A3的液相色谱质谱检测结果。
图10为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1与原位生成的硝酮2-5反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A4的液相色谱质谱检测结果。
图11为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1与原位生成的硝酮2-6反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A5的液相色谱质谱检测结果。
图12为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1与原位生成的硝酮2-7反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A6的液相色谱质谱检测结果。
图13为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1与原位生成的硝酮2-8反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A7的液相色谱质谱检测结果。
图14为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1与原位生成的硝酮2-12反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A8的液相色谱质谱检测结果。
图15为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1与原位生成的硝酮2-16反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A9的液相色谱质谱检测结果。
图16为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1与原位生成的硝酮2-24反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A10的液相色谱质谱检测结果。
图17为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1与原位生成的硝酮2-25反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A11的液相色谱质谱检测结果。
图18为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1与原位生成的硝酮2-27反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A12的液相色谱质谱检测结果。
图19为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-2与原位生成的硝酮2-1反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A13的液相色谱质谱检测结果。
图20为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-3与原位生成的硝酮2-1反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A14的液相色谱质谱检测结果。
图21为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-4与原位生成的硝酮2-1反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A15的液相色谱质谱检测结果。
图22为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-5与原位生成的硝酮2-1反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A16的液相色谱质谱检测结果。
图23为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-6与原位生成的硝酮2-1反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A17的液相色谱质谱检测结果。
图24为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-12与原位生成的硝酮2-1反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A18的液相色谱质谱检测结果。
图25为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-17与原位生成的硝酮2-1反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A19的液相色谱质谱检测结果。
图26为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-18与原位生成的硝酮2-1反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A20的液相色谱质谱检测结果。
图27为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-19与原位生成的硝酮2-1反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A21的液相色谱质谱检测结果。
图28为本发明的寡聚核酸-末端炔烃化合物1-54与原位生成的硝酮2-1反应得到的寡聚核酸-四元环内酰胺A22的液相色谱质谱检测结果。图29为本发明的原料硝酮的代表结构。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明实施例中的所有寡聚核酸原料均为寡聚核酸双链或者单链的底物。
实施例1，寡聚核酸-末端炔烃化合物原料的合成
1)合成方法1
寡聚核酸-NH2溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的水溶液，与含羧基和末端炔基的二元化合物使用2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯作为缩合剂，反应得到相应的寡聚核酸-末端炔烃化合物，该反应完成后经高效液相色谱纯化，得到的寡聚核酸-末端炔烃化合物用于下一步反应。
2)合成方法2
寡聚核酸-COOH溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的水溶液，与含氨基和末端炔基的二元化合物使用2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯作为缩合剂，反应得到相应的寡聚核酸-末端炔烃化合物。该反应完成后经高效液相色谱纯化，得到的寡聚核酸-末端炔烃化合物用于下一步反应。
实施例2，硝酮的合成
0.08毫摩尔芳香硝基化合物溶于700微升乙腈，加入0.16毫摩尔芳香醛基化合物、0.096毫摩尔氯化铵、0.08毫摩尔锌粉以及100微升水，在氮气保护于40℃下搅拌反应12小时。反应结束后在4000rpm的转速下离心十分钟，含有硝酮的上清液直接用于下一步的环化反应。
实施例3，寡聚核酸-四元环内酰胺A1的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-1的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A1的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物(1当量)1-1溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-1的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)。在氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟。再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A1的溶液，分子量为16512。通过液相色谱质谱进行检测，检测到相应产物分子量，说明寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1可与硝酮2-1环化得到相应的寡聚核酸-四元环内酰胺。通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为69％，结果见图7。
实施例4，寡聚核酸-四元环内酰胺A2的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-3的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A2的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-3的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A2的溶液，分子量为16544。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为66％,结果见图8。
实施例5，寡聚核酸-四元环内酰胺A3的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-4的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A3的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-4的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A3的溶液，分子量为16581。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为57％,结果见图9。
实施例6，寡聚核酸-四元环内酰胺A4的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-5的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A4的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-5的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A4的溶液，分子量为16593。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为66％,结果见图10。
实施例7，寡聚核酸-四元环内酰胺A5的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-6的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A5的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-6的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A5的溶液，分子量为16592。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为66％,结果见图11。
实施例8，寡聚核酸-四元环内酰胺A6的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-7的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A6的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-7的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A6的溶液，分子量为16503。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为64％，结果见图12。
实施例9，寡聚核酸-四元环内酰胺A7的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-8的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A7的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1溶于去离子水，配置成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-8的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A7的溶液，分子量为16602。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为69％，结果见图13。
实施例10，寡聚核酸-四元环内酰胺A8的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-12的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A8的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-12的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A8的溶液，分子量为16529。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为53％，结果见图14。
实施例11，寡聚核酸-四元环内酰胺A9的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-16的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A9的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-16的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A9的溶液，分子量为16521。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为84％，结果见图15。
实施例12，寡聚核酸-四元环内酰胺A10的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-24的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A10的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-24的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A10的溶液，分子量为16594。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为49％，结果见图16。
实施例13，寡聚核酸-四元环内酰胺A11的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-25的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A11的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-25的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A11的溶液，分子量为16599。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为51％，结果见图17。
实施例14，寡聚核酸-四元环内酰胺A12的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-27的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A12的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-1溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-27的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A12的溶液，分子量为16624。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为59％，结果见图18。
实施例15，寡聚核酸-四元环内酰胺A13的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-2的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-1的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A13的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-2溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-1的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A13的溶液，分子量为16520。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为73％，结果见图19。
实施例16，寡聚核酸-四元环内酰胺A14的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-3的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-1的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A14的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-3溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-1的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A14的溶液，分子量为16536。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为65％，结果见图20。
实施例17，寡聚核酸-四元环内酰胺A15的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-4的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-1的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A15的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-4溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-1的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A15的溶液，分子量为16534。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为74％，结果见图21。
实施例18，寡聚核酸-四元环内酰胺A16的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-5的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-1的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A16的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-5溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-1的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A16的溶液，分子量为16540。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为73％，结果见图22。
实施例19，寡聚核酸-四元环内酰胺A17的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-6的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-1的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A17的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-6溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-1的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A17的溶液，分子量为16525。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为47％，结果见图23。
实施例20，寡聚核酸-四元环内酰胺A18的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-12的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法1
2)硝酮2-1的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A18的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-12溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-1的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A18的溶液，分子量为16491。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为44％，结果见图24。
实施例21，寡聚核酸-四元环内酰胺A19的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-17的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法2
2)硝酮2-1的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A19的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-17溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-1的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A19的溶液，分子量为16539。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为61％，结果见图25。
实施例22，寡聚核酸-四元环内酰胺A20的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-18的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法2
2)硝酮2-1的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A20的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-18溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-1的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A20的溶液，分子量为16554。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为72％结果见图26。
实施例23，寡聚核酸-四元环内酰胺A21的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-19的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法2
2)硝酮2-1的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A21的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-19溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-1的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A21的溶液，分子量为16552。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为50％结果见图27。
实施例24，寡聚核酸-四元环内酰胺A22的合成
1)寡聚核酸-末端炔烃化合物1-54的合成
其制备方法同实施例1中的合成方法2
2)硝酮2-1的合成
其制备方法同实施例2
3)寡聚核酸-四元环内酰胺A22的合成
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物1-54溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升浓度的溶液，并加入50当量原位生成的硝酮2-1的乙腈/水(7/1)溶液(100毫摩尔/升，50当量)、100当量N,N-二环己基甲胺的乙腈溶液(200毫摩尔/升，100当量)以及10当量碘化亚铜的乙腈溶液(20毫摩尔/升，10当量)，氮气保护下25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟，再向上述反应液中加入0.5微升5摩尔/升的氯化钠水溶液、18微升无水乙醇，震荡混匀，在-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转/分钟，5分钟)，取出上清液，余下沉淀用去离子水溶解即得到寡聚核酸-四元环内酰胺化合物A22的溶液，分子量为16489。液相色谱质谱检测到产物分子量，通过超微量分光光度计进行OD测定后，结合液相色谱质谱检测结果确定反应收率为50％结果见图28。
综上所述，上述各实施例及附图仅为说明本发明的广适性而已，可以适用于不同类型的寡聚核酸-末端炔烃化合物和不同类型的硝酮，其后续反应的反应性及稳定性，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
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Claims (12)
1.一种寡聚核酸-四元环内酰胺类化合物，其结构式为：
其中，R1可以是氢、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C1-C12烷基、C2-C6烯烃基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C1-C6烷基氧、芳基、杂环芳基、卤素(氟、氯、溴、碘)、羧基、酯基、酰胺基中的任意一种至多种或它们的任意组合；结构式中Ar1、Ar2为五元、六元或更大的芳香环或芳香杂环。
2.一种基因编码化合物库中利用寡聚核酸-末端炔烃化合物制备寡聚核酸-四元环内酰胺的方法，其反应方程式如下：
其中，结构式中的寡聚核酸是经人工修饰的或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，其中链长度没有限制；
其中结构式中的寡聚核酸与末端炔基通过一个化学键或多个化学键连接；
具体的炔烃可选自如下基团:
其中，R1可以是氢、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C1-C12烷基、C2-C6烯烃基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C1-C6烷基氧、芳基、杂环芳基、卤素(氟、氯、溴、碘)、羧基、酯基、酰胺基中的任意一种至多种或它们的任意组合；R2为连接寡聚核酸部分的功能团，具体是一个可以与寡聚核酸上的功能团互补反应的功能团，可以是羧基、氨基、芳香卤、醛基、烯烃、醛基、羟基、巯基、硼烷中的任意一种；
其中，硝酮可以是纯的化合物也可以是原位生成的反应粗产品；
其中，结构式中Ar1为五元、六元或更大的芳香环或芳香杂环；
其中，结构式中Ar2为五元、六元或更大的芳香环或芳香杂环。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述寡聚核酸-末端炔烃化合物的浓度是0.1～2毫摩尔/升；优选地，所述寡聚核酸-末端炔烃化合物的浓度为0.5～1.5毫摩尔/升；更优选地，所述寡聚核酸-末端炔烃化合物的浓度为1.0毫摩尔/升。
4.根据权利要求2的方法，其特征在于,所述硝酮的用量为1～500当量；优选地，所述硝酮的用量为1～100当量；更优选地，所述硝酮的用量为50当量。
5.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述反应的碱是三乙胺、正丁胺、异丁胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、1,1,3,3-四甲基胍、N,N-二环己基甲胺、二环己胺、无机盐缓冲液(碳酸盐、磷酸盐、硼酸盐)、有机碱缓冲液(三乙基乙酸铵、三羟甲基氨基甲烷)中的任意一种或任意几种的混合；优选地，所述反应的碱是四甲基胍、N,N-二环己基甲胺、二环己胺中的一种；更优选地，所述反应的碱是N,N-二环己基甲胺。
6.根据权利要求5的方法,其特征在于，所述N,N-二环己基甲胺的用量为1～500当量；优选地，所述N,N-二环己基甲胺的用量为10～200当量；更优选地，所述N,N-二环己基甲胺的用量为100当量。
7.根据权利要求2的方法,其特征在于，所述反应的铜催化剂是三氟甲磺酸铜(Cu(CF3SO3)2)、醋酸铜(Cu(OAc)2)、醋酸亚铜(CuOAc)、溴化铜(CuBr2)、无水氯化铜(CuCl2)、硫酸铜(CuSO4)、六氟磷酸四乙腈铜(Cu(MeCN)4PF6)、氟化铜(CuF2)、溴化亚铜(CuBr)、氯化亚铜(CuCl)、氯化亚铜-双(氯化锂)络合物(CuCl(LiCl)2)、溴化亚铜二甲硫醚络合物(CuBr·SMe2)、碘化亚铜(CuI)及相应的水合物中的任意一种或任意几种的混合；优选地，所述反应的铜催化剂是碘化亚铜(CuI)、氯化亚铜-双(氯化锂)络合物(CuCl(LiCl)2)、六氟磷酸四乙腈铜(Cu(MeCN)4PF6)中的一种；更优选地，所述反应的铜催化剂是碘化亚铜(CuI)。
8.根据权利要求7的方法,其特征在于，所述碘化亚铜的用量为0.1～100当量；优选地，所述碘化亚铜的用量为0.1～50当量；更优选地，所述碘化亚铜的用量为10当量。
9.根据权利要求2的方法,其特征在于，所述反应的溶剂是水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环己醇、2-氟乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、1,4-二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚，乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种的混合；优选地，所述反应的溶剂是水和乙腈的混合；更优选地，所述反应的溶剂是水和乙腈的混合且乙腈的总含量不低于50％。
10.根据权利要求2的方法,其特征在于，所述反应的温度为0～90℃；优选地，所述反应的温度为0～40℃；更优选地，所述反应的温度为25℃。
11.根据权利要求2的方法,其特征在于，所述反应的时间为1～24小时；优选地，所述反应的时间为5～24小时；更优选地，所述反应的时间为12小时。
12.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述反应的氛围是空气、氮气或氩气中的一种，优选地，所述反应的氛围是氮气或氩气中的一种,更优选地，所述反应的氛围是氮气。
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