BRPI9809433B1

BRPI9809433B1 - moléculas de dna enzimáticas

Info

Publication number: BRPI9809433B1
Application number: BRPI9809433A
Authority: BR
Inventors: Gerald F Joyce; Ronald R Breaker
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 1997-04-29
Filing date: 1998-04-29
Publication date: 2015-09-08
Also published as: AU735522B2; JP2009000117A; JP5066016B2; EP2275546A2; EP2275546A3; CA2287520C; CA2287520A1; EP0981646A1; JP4203126B2; BR9809433A; JP2002514080A; EP0981646A4; WO1998049346A1; AU735522C; CN1261920A; EP0981646B1; AU7267598A

Abstract

patente de invenção:<b>"moléculas de dna enzimáticas"<d>. a presente invenção refere-se a enzimas de ácido desoxirribonucléico - moléculas de dna catalíticas ou enzimáticas - capazes de clivar seqüências ou moléculas de ácidos nucléicos, particularmente rna, de maneira específica para sítio, bem como composições que incluem as mesmas. também estão descritos métodos para fazer e usar as enzimas e composições descritas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE DNA ENZIMÁTICAS, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO AS MESMAS, MÉTODO DE CLIVAR UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ALVO E MÉTODO DE CONSTRUÇÃO DAS REFERIDAS MOLÉCULAS DE DNA ENZIMÁTICAS".

Campo Técnico A presente invenção refere-se a enzimas de ácido nucléico ou moléculas de DNA catalíticas (enzimáticas) que são capazes de clivar outras moléculas de ácido nucléico, particularmente RNA. A presente invenção também refere-se a composições contendo as moléculas de DNA enzimáticas descritas e a métodos de produzir e usar estas enzimas e composições.

Fundamentos A necessidade de catalisadores que operam fora de seu contexto nativo ou que catalisam reações que não são representadas na natureza resultou no desenvolvimento da tecnologia de "engenharia de enzimas". O caminho usual tomado na engenharia de enzimas foi um método de "desenho racional", tendo por base o entendimento de enzimas naturais para ajudar na construção de enzimas. Infelizmente, a estado de proficiência nas áreas de estrutura e química de proteínas é insuficiente para tornar rotineira a geração de catalisadores biológicos.

Recentemente, vem sendo aplicado um novo método para desenvolver catalisadores. Este método envolve a construção de um grupo heterogêneo de macromoléculas e a aplicação de um procedimento de seleção in vitro para isolar moléculas do grupo que catalisam a reação desejada. A seleção de catalisadores de um grupo de macromoléculas não depende de uma compreensão completa de suas propriedades estruturais e químicas. Por conseguinte, este processo foi chamado de "desenho irracional" (Brenneret al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89:5381-5383, 1992). A maioria dos esforços até o presente envolvendo o desenho racional de moléculas de RNA enzimáticas ou ribozimas não levaram a moléculas com função catalítica fundamentalmente nova ou melhorada.

No entanto, a aplicação de métodos de desenho irracional via um processo que descrevemos como "evolução molecular dirigida" ou "evolução in vitro", que é copiado da evolução darwiniana de organismos na natureza, tem o potencial de levar à produção de moléculas de DNA que têm características funcionais desejáveis.

Esta técnica foi aplicada com graus variáveis de sucesso a moléculas de RNA em solução (veja, por exemplo, Mills et al., Proc. Natl. Acad· Sei. USA. 58:217, 1967; Green et al., Nature. 347:406,1990; Chowrira et al., Nature. 354:320, 1991; Joyce, Gene, 82:83, 1989; Beaudry et al., Science, 257:635-641, 1992; Robertson et al., Nature. 344:467, 1990), assim como a RNAs ligados a um ligando que está preso a um suporte sólido (Tuerk et al., Science. 249:505, 1990; Ellington et al., Nature. 346:818,1990). Ela também foi aplicada a peptídios presos diretamente a um suporte sólido (Lam et al., Nature. 354:82, 1991); e epítopos de peptídio expressos em uma proteína de revestimento viral (Scott et al., Science. 249:386, 1990; Devlin et al., Science. 249:249, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87:6378, 1990). Já se passou mais de uma década desde a descoberta de RNA catalítico (Kruger et al., Çelj, 31:147-157, 1982; Guerrier-Takada et al., Çeji, 35:849-857, 1983). A lista de ribozimas naturais conhecidas continua a crescer (veja Cech. in The RNA World. Gesteland & Atkins (eds.), pp. 239-269, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1993); Pyle, Science. 261:709-714, 1993; Symons, Curr. Qpin. Struct. Biol., 4:322-330, 1994) e, nos últimos anos, foi aumentada por ribozimas sintéticas obtidas através de evolução in vitro. (Veja Joyce, Curr. Qpin. Struct. Biol., 4:331-336, 1994; Breaker et al., Trends Biotech.. 12:268-275, 1994; Chapman et al.. Curr. Qpin. Struct. Biol.. 4:618-622. 1994).

Parece razoável supor que o DNA pode ter atividade catalítica, bem como considerar que ele contém a maioria dos mesmos grupos funcionais que o RNA. No entanto, com exceção de alguns genomas virais e intermediários de replicação, quase todo o DNA nos organismos biológicos ocorrem como um dúplex completo, impedindo-o de adotar umaLestrutura secundária e terciária complexa. Assim sendo, não é surpreendente que as enzimas de DNA não tenham sido encontradas na natureza.

Até o advento da presente invenção, o desenho, a síntese e o uso de moléculas de DNA catalíticas com capacidades de clivar nucleotí-deos ainda não foram descritos nem demonstrados. Portanto, as descobertas e invenções aqui descritas são particularmente significativas, no sentido de que ressaltam o potencial de evolução in vitro como um meio de criar moléculas catalíticas cada vez mais eficientes, incluindo moléculas de DNA enzimáticas que clivam outros ácidos nucléicos, particularmente RNA.

Breve Sumário da Invenção A presente invenção descreve uma molécula de DNA catalítica sintética ou construída (isto é, de ocorrência não-natural) ou (molécula de DNA enzimtática) capaz de clivar uma seqüência de ácidos nucléicos (NA) de substrato em um sítio de divagem definido. A invenção também contempla uma molécula de DNA enzimática tendo uma atividade de endonuclease.

Uma molécula de DNA catalítica preferida tem uma atividade de endonuclease específica para sítio específico para uma seqüência de nu-cleotídeos definindo um sítio de divagem em uma seqüência de ácidos nucléicos de substrato pré-selecionada. A molécula de DNA tem primeira e segunda regiões de ligação a substrato flanqueando uma região de núcleo, onde a primeira região de ligação a substrato tem uma seqüência complementar a uma primeira porção da seqüência de ácidos nucléicos de substrato pré-selecionada, e a segunda região de ligação a substrato tem uma seqüência complementar a uma segunda porção da seqüência de ácidos nucléicos de substrato pré-selecionada. A região de núcleo tem uma seqüência de acordo com a fórmula: (I.) T(tronco)’AGC(tronco)"Z, onde cada um de (tronco)' e (tronco)" são três nucleotídeos consecutivos que quando hibridizades como um par (tronco)':(tronco)" compreendem três pares de base incluindo pelo menos dois pares G:C e onde Z = WCGR ou WCGAA, e W = A ou T e R = A ou G. Em uma modalidade preferida, a fórmula I define a SEQ ID N° 120 (8-17).

Também é contemplada uma região de núcleo tendo uma se-qüência de acordo com a fórmula: (II.) RGGCTAGCXACAACGA (SEQ ID N°), onde X = T, C ou A, e R = A ou G. Em uma modalidade preferida, a fórmula I define a SEQ ID N° 121 (10-23).

Em uma outra modalidade, a atividade de endonuclease é específica para uma seqüência de nucleotídeos definindo um sítio de divagem compreendendo um ácido nucléico de cordão simples em uma seqüência de ácidos nucléicos de substrato. Em uma outra modalidade preferida, o sítio de divagem é um ácido nucléico de cordão duplo. De maneira similar, se-qüências de ácidos nucléicos de substrato podem ser de cordão simples, de cordão duplo, de cordão parcialmente simples ou duplo, em laço, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em uma outra modalidade contemplada, a seqüência de ácidos nucléicos de substrato inclui um ou mais análogos de nucleotídeo. Em uma variação, a seqüência de ácidos nucléicos de substrato é uma porção de uma molécula maior ou está presa à mesma.

Em várias modalidades, a molécula maior é selecionada do grupo que consiste em RNA, RNA modificado, DNA, DNA modificado, análogos de nucleotídeo, ou compósitos dos mesmos. Em um outro exemplo, a molécula maior compreende um compósito de uma seqüência de ácidos nucléicos e uma seqüência de ácidos não-nucléicos.

Em uma outra modalidade, a invenção contempla que uma seqüência de ácidos nucléicos de substrato inclui um ou mais análogos de nucleotídeo. Uma outra variação contempla que o ácido nucléico de cordão simples compreende RNA, DNA, RNA modificado, DNA modificado, um ou mais análogos de nucleotídeo, ou quaisquer compósitos dos mesmos. Em uma modalidade da invenção descrita, a atividade de endonuclease compreende divagem hidrolítica de uma ligação fosfoéster no sítio de divagem.

Em várias modalidades preferidas, as moléculas de DNA catalíticas da presente invenção são de cordão simples no todo ou em parte. Estas moléculas de DNA catalíticas podem de preferência assumir uma varie- dade de formatos consistentes com sua atividade catalítica. Assim, em uma variação, uma molécula de DNA catalítica da presente invenção inclui uma ou mais estruturas em forma de grampo de cabelo. Em ainda uma outra variação, uma molécula de DNA catalítica pode assumir um formato semelhante àquele de ribozimas em forma de "cabeça de martelo". Em ainda outras modalidades, uma molécula de DNA catalítica pode assumir uma conformação semelhante àquela de ribozimas de Tetrahymena thermophila, por exemplo, aquelas derivadas de introns do grupo I.

De maneira similar, as moléculas de DNA catalíticas preferidas da presente invenção são capazes de demonstrar atividade de endonuclea-se para sítio específico independente da orientação original da molécula de substrato. Assim, em uma modalidade preferida, uma molécula de DNA en-zimática da presente invenção é capaz de clivar uma seqüência de ácidos nucléicos de substrato que é separada da molécula de DNA enzimática, isto é, não está ligada à DNAzima. Em uma outra modalidade preferida, uma molécula de DNA enzimática é capaz de clivar uma seqüência de ácidos nucléicos de substrato ligada, isto é, é capaz de realizar uma reação semelhante à autoclivagem. A invenção também contempla moléculas de DNA enzimático (moléculas de DNA catalíticas, desoxirribosimas ou DNAzimas) tendo atividade de endonuclease, pelo que a atividade de endonuclease requer a presença de um cátion divalente. Em várias modalidades alternativas preferidas, o cátion divalente é selecionado do grupo que consiste em Pb2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ e Ca2+. Uma outra variação contempla que a atividade de endonuclease requer a presença de um cátion monovalente. Nessas modalidades alternativas, o cátion monovalente é de preferência selecionado do grupo que consiste em Na+ e K+.

Em várias modalidades preferidas da invenção, uma molécula de DNA enzimática compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 14; SEQ ID N° 15; SEQ ID N° 16; SEQ ID N° 17; SEQ ID N° 18; SEQ ID N° 19; SEQ ID N° 20; SEQ ID N° 21; e SEQ ID N° 22. Em outras modalidades preferidas, uma molécula de DNA catalítica da presente invenção compreende uma seqüên-cia de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 23; SEQ ID N° 24; SEQ ID N° 25; SEQ ID N° 26; SEQ ID N° 27; SEQ ID N° 28; SEQ ID N° 29; SEQ ID N° 30; SEQ ID N° 31; SEQ ID N° 32; SEQ ID N° 33; SEQ ID N° 34; SEQ ID N° 35; SEQ ID N° 36; SEQ ID N° 37; SEQ ID N° 38; e SEQ ID N° 39.

Uma outra modalidade preferida contempla que uma molécula de DNA catalítica da presente invenção compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 50 e SEQ ID N ° 51. Em ainda uma outra modalidade preferida, uma molécula de DNA catalítica da presente invenção compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N- 52 a 101. Como aqui descrito, moléculas de DNA catalíticas tendo seqüências substancialmente similares àquelas aqui descritas também são contempladas. Assim, uma ampla variedade de substituições, deleções, inserções, duplicações e outras mutações podem ser feitas nas moléculas aqui descritas para gerar uma variedade de outras moléculas de DNA enzimático úteis; desde que as referidas moléculas apresentem atividade de divagem para sítio específico como aqui descrito, elas estão dentro dos limites desta descrição.

Em uma outra variação da presente invenção, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção de preferência tem uma afinidade de ligação a substrato de cerca de 1 μΜ ou menos. Em uma outra modalidade, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção liga-se a um substrato com um KD inferior a cerca de 0,1 μΜ. A presente invenção também descreve moléculas de DNA enzimático tendo taxas de "turnover" úteis. Em uma modalidade, a taxa de "tur-nover" é inferior a 5 hr"1; em uma modalidade preferida, a taxa é inferior a cerca de 2 hr"1; em uma modalidade mais preferida, a taxa é inferior a cerca de 1 hr"1; em uma modalidade ainda mais preferida, a taxa de "turnover" é de cerca de 0,6 hr"1 ou menos.

Em ainda uma outra modalidade, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção apresenta uma taxa de "turnover" útil onde "kobs" é menor que 1 min.'1, de preferência menor que 0,1 min.'1; mais preferivelmente menor que 0,01 min.'1; e ainda mais preferivelmente menor que 0,005 min.'1. Em uma variação, a valor de "kobs" é aproximadamente 0,002 min.'1 ou menos. A presente invenção também contempla modalidades nas quais a taxa catalítica das enzimas de DNA descritas é totalmente otimizada. Assim, em várias modalidades preferidas, a Km para reações melhoradas pela presença de Mg2+ é aproximadamente 0,5 - 20 mM, de preferência cerca de 1-10 mM, e mais preferivelmente cerca de 2 - 5 mM. A presente invenção também contempla uma modalidade na qual a seqüência de nucleotídeos definindo o sítio de divagem compreende pelo menos um nucleotídeo. Em várias outras modalidades preferidas, uma molécula de DNA catalítica da presente invenção é capaz de reconhecer e clivar uma seqüência de nucleotídeos definindo um sítio de divagem de dois ou mais nucleotídeos.

Em várias modalidades preferidas, uma molécula de DNA enzi-mática da presente invenção compreende um núcleo conservado flanquea-do por uma ou mais regiões de ligação a substrato. Em uma modalidade, uma molécula de DNA enzimática inclui primeira e segunda regiões de ligação a substrato. Em uma outra modalidade, uma molécula de DNA enzimática inclui duas ou mais regiões de ligação a substrato.

Como anteriormente_observado, as moléculas de DNA catalíticas preferidas da presente invenção também podem incluir um núcleo conservado. Em uma modalidade preferida, o núcleo conservado compreende uma ou mais regiões conservadas. Em outras variações preferidas, a uma ou mais regiões conservadas incluem uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em CG; CGA; AGCG; AGCCG; CAGCGAT; CTTGTTT e CTTATTT (veja, por exemplo, a figura 3).

Em uma modalidade da invenção, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção compreende ainda um ou mais nucleotídeos variáveis ou espaçadores entre as regiões conservadas no núcleo conservado. Em uma outra modalidade, uma molécula de DNA enzimática da pre- sente invenção compreende ainda um ou mais nucleotídeos variáveis ou espaçadores entre o núcleo conservado e a região de ligação a substrato.

Em uma variação, a primeira região de ligação a substrato de preferência inclui uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em CATCTCT; GCTCT; TTGCTTTTT; TGTCTTCTC; TTGCTGCT; GCCATGCTTT (SEQ ID N° 40); CTCTATTTCT (SEQ ID N° 41); GTCGGCA; CATCTCTTC; e ACTTCT. Em uma outra variação preferida, a segunda região de ligação a substrato inclui uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em TATGTGACGCTA (SEQ ID N° 42); TATA-GTCGTA (SEQ ID N° 43); ATAGCGTATTA (SEQ ID N° 44); ATAGTTA-CGTCAT (SEQ ID N° 45); AATAGTGAAGTGTT (SEQ ID N° 46); TATA-GTGTA; ATAGTCGGT; ATAGGCCCGGT (SEQ ID N° 47); AATAGTGAG GCTTG (SEQ ID N° 48); e ATGNTG.

Em várias modalidades da presente invenção, as regiões de ligação a substrato variam de comprimento. Assim, por exemplo, uma região de ligação a substrato pode compreender de um único nucleotídeo a dezenas de nucleotídeos. No entanto, fica entendido que regiões de ligação a substrato com cerca de 3 - 25 nucleotídeos de comprimento, de preferência cerca de 3 - 15 nucleotídeos de comprimento, e mais preferivelmente cerca de 3 - 10 nucleotídeos de comprimento são particularmente preferidas. Em várias modalidades, os nucleotídeos individuais nas regiões de ligação a substrato são capazes de formar pares de base complementares com os nucleotídeos das moléculas de substrato; em outras modalidades, são formados pares de base não-complementares. Uma mistura de pares de base complementares e não-complementares também é contemplada uma vez que está dentro do escopo das modalidades apresentadas da invenção.

Em uma modalidade preferida, uma molécula de DNA catalítica da presente invenção pode compreender ainda uma terceira região de ligação a substrato. Em algumas modalidades preferidas, a terceira região inclui uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em TGTT; TGTTA; e TGTTAG. Uma outra modalidade preferida da presente invenção descreve uma molécula em DNA enzimática compreendendo ain- da uma ou mais regiões variáveis ou "espaçadoras" entre as regiões de ligação a substrato.

Em uma outra modalidade descrita, a presente invenção contempla uma molécula de DNA enzimática sintética purificada separada de outras moléculas de DNA e oligonucleotídeos, a molécula de DNA enzimática tendo uma atividade de endonuclease, onde a atividade de endonuclease é específica para uma seqüência de nucleotídeos definindo um sítio de divagem compreendendo ácido nucléico de cordão simples ou duplo em uma seqüência de ácidos nucléicos de substrato. Em uma variação, é descrita uma molécula de DNA enzimática sintética (ou construída) tendo uma atividade de endonuclease, onde a atividade de endonuclease é específica para uma seqüência de nucleotídeos definindo um sítio de divagem consistindo essencialmente de uma região de cordão simples ou duplo de uma seqüência de ácidos nucléicos de substrato.

Em ainda uma outra modalidade, a invenção contempla uma molécula de DNA enzimática compreendendo um polímero de desoxirribo-nucleotídeo tendo uma atividade catalítica para hidrolisar um substrato contendo ácidos nucléicos para produzir produtos de divagem de substrato. Em uma variação, a hidrólise ocorre de maneira específica para sítio. Como observado anteriormente, o polímero pode ser de cordão simples, de cordão duplo ou alguma combinação dos mesmos. A invenção contempla ainda que o substrato compreende uma seqüência de ácidos nucléicos. Em várias modalidades, o substrato com seqüência de ácidos nucléicos compreende RNA, RNA modificado, DNA, DNA modificado, um ou mais análogos de nucleotídeo, ou compósitos de quaisquer dos precedentes. Uma modalidade contempla que o substrato inclui um segmento de cordão simples; ainda uma outra modalidade contempla que o substrato é de cordão duplo. A presente invenção também contempla uma molécula de DNA enzimática compreendendo um polímero de desoxirribonucleotídeo tendo uma atividade catalítica para hidrolisar um substrato contendo ácidos nucléicos para produzir um produto de divagem. Em uma variação, a molécula de DNA enzimática tem uma afinidade de ligação eficaz para o substrato e não tem uma afinidade de ligação eficaz para o produto de divagem.

Em uma modalidade preferida, a invenção descreve uma molécula de DNA enzimática de ocorrência não-natural compreendendo uma se-qüência de nucleotídeos definindo um núcleo conservado flanqueado por domínios de reconhecimento, regiões variáveis e regiões espaçadoras. Assim, em uma modalidade preferida, a seqüência de nucleotídeos define uma primeira região variável contígua ou adjacente ao terminal 5' da molécula, um primeiro domínio de reconhecimento localizado no terminal 3' para a primeira região variável, uma primeira região espaçadora localizada no terminal 3' para o primeiro domínio de reconhecimento, uma primeira região conservada localizada no terminal 3' para a primeira região espaçadora, uma segunda região espaçadora localizada no terminal 3' para a primeira região conservada, uma segunda região conservada localizada no terminal 3' para a segunda região espaçadora, um segundo domínio de reconhecimento localizado no terminal 3' para a segunda região conservada, e uma segunda região variável localizada no terminal 3' para o segundo domínio de reconhecimento.

Em uma outra modalidade, a seqüência de nucleotídeos de preferência define uma primeira região variável contígua ou adjacente ao terminal 5' da molécula, um primeiro domínio de reconhecimento localizado no terminal 3' para a primeira região variável, uma primeira região espaçadora localizada no terminal 3' para o primeiro domínio de reconhecimento, uma primeira região conservada localizada no terminal 3' para a primeira região espaçadora, uma segunda região espaçadora localizada no terminal 3' para a primeira região conservada, uma segunda região conservada localizada no terminal 3' para a segunda região espaçadora, um segundo domínio de reconhecimento localizado no terminal 3' para a segunda região conservada, uma segunda região variável localizada no terminal 3' para o segundo domínio de reconhecimento e um terceiro domínio de reconhecimento localizado no terminal 3' para a segunda região variável.

Em uma variação do precedente, a molécula inclui uma região de núcleo conservada flanqueada por dois domínios de ligação a substrato; em uma outra, a região de núcleo conservada compreende um ou mais domínios conservados. Em outras modalidades preferidas, a região de núcleo conservada compreende ainda um ou mais nucleotídeos variáveis ou espa-çadores. Em ainda uma outra modalidade, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção compreende ainda uma ou mais regiões espaçadoras. A presente invenção contempla ainda uma ampla variedade de composições. Por exemplo, composições incluindo uma molécula de DNA enzimática como acima descrita estão descritas e contempladas nesta invenção. Em uma modalidade alternativa, uma composição de acordo com a presente invenção compreende duas ou mais populações de moléculas de DNA enzimático como descrito acima, onde cada população de moléculas de DNA enzimático é capaz de clivar uma seqüência diferente em um substrato. Em uma outra variação, uma composição compreende duas ou mais populações de moléculas de DNA enzimático como descrito acima, onde cada população de moléculas de DNA enzimático é capaz de reconhecer um substrato diferente. Em várias modalidades, também é preferido que as composições incluam um cátion monovalente ou divalente. A presente invenção contempla ainda métodos para gerar, selecionar e isolar moléculas de DNA enzimático da presente invenção. Em uma variação, um método para selecionar moléculas de DNA enzimático que cli-vam uma seqüência de ácidos nucléicos (por exemplo, RNA) em um sítio específico compreende as seguintes etapas: (a) obter uma população de moléculas de DNA enzimático putativas - sejam as sequências naturais ou sintéticas - e, de preferência, elas são moléculas de DNA de cordão simples; (b) misturar seqüências de substrato contendo nucleotídeos com a população acima mencionada de moléculas de DNA para formar uma mistura; (c) manter a mistura por um período de tempo suficiente e em condições reaci-onais predeterminadas para permitir que as moléculas de DNA enzimático putativas na população causem a divagem das seqüências de substrato, dessa forma produzindo produtos de divagem de substrato; (d) separar a população de moléculas de DNA das seqüências de substrato e dos produ- tos de divagem de substrato; e (e) isolar as moléculas de DNA que clivam seqüências de ácidos nucléicos de substrato (por exemplo RNA) em um sítio específico da população.

Em uma outra variação do método precedente, as moléculas de DNA que clivam seqüências de ácidos nucléicos de substrato em um sítio específico são etiquetados com um agente imobilizador. Em um exemplo, o agente compreende biotina.

Em ainda uma outra variação do método acima mencionado, começa-se por selecionar uma seqüência - por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos "alvo" predeterminada - que se deseja clivar usando uma molécula de DNA enzimática construída com esta finalidade. Assim, em uma modalidade, a seqüência "alvo" pré-selecionada (ou predeterminada) é usada para gerar uma população de moléculas de DNA capazes de clivar seqüências de ácidos nucléicos de substrato em um sítio específico via ligação ou "etiquetagem" da mesma a uma seqüência de ácidos desoxirribonucléi-cos contendo uma ou mais seqüências ou segmentos randomizados. Em uma variação, a seqüência randomizada tem cerca de 40 nucleotídeos de comprimento; em uma outra variação, a seqüência randomizada tem cerca de 50 nucleotídeos de comprimento. Seqüências randomizadas que têm 1 -40, 40 - 50 e 50 - 100 nucleotídeos de comprimento também são contempladas pela presente invenção.

Em uma modalidade da presente invenção, a seqüência de nucleotídeos usada para gerar uma população de moléculas de DNA enzimáti-co é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 4, 23, 50 e 51. Em uma outra modalidade, a seqüência de nucleotídeos de "substrato" ou "alvo" compreende uma seqüência de um ou mais ribonucleotídeos - veja, por exemplo, as porções relevantes de SEQ ID N— 4 e 23, e SEQ ID N° 49. Também é contemplado pela presente invenção que uma seqüência de nucleotídeos de "substrato" ou "alvo" pode compreende DNA, RNA ou um compósito dos mesmos.

A invenção também contempla métodos como descrito acima, onde a etapa de isolamento compreende ainda expor as moléculas de DNA etiquetadas a uma superfície sólida tendo avidina ligada à mesma, pelo que as moléculas de DNA etiquetadas ficam presas à superfície sólida. Como anteriormente, o substrato pode ser RNA, DNA ou um compósito de ambos, ou uma molécula incluindo seqüências de nucleotídeos. A presente invenção também contempla um método para clivar especificamente uma seqüência de ácidos nucléicos de substrato em um sítio de divagem particular, compreendendo as etapas de (a) proporcionar uma molécula de DNA enzimática capaz de clivar uma seqüência de ácidos nucléicos de substrato em um sítio de divagem específico; e (b) contatar a molécula de DNA enzimática com a seqüência de ácidos nucléicos de substrato para causar a divagem específica da seqüência de ácidos nucléicos no sítio de divagem. Em uma variação, a molécula de DNA enzimática é uma molécula de DNA não-natural (ou sintética). Em uma outra variação, a molécula de DNA enzimática é de cordão simples.

Em ainda uma outra variação do método precedente, o substrato compreende um ácido nucléico. Em várias modalidades, o ácido nu-cléico de substrato compreende RNA, RNA modificado, DNA, DNA modificado, ou um ou mais análogos de nucleotídeo, ou compósitos de quaisquer dos precedentes. Em ainda uma outra modalidade, a divagem específica é provocada pela atividade de endonuclease da molécula de DNA enzimática. Alteração de condições reacionais - por exemplo o ajuste do pH, a temperatura, a percentagem de cátions, a percentagem de enzimas, a percentagem de substrato e a percentagem de produto - também é contemplada nesta invenção.

A presente invenção também contempla um método de clivar uma ligação de fosfoéster, que compreende (a) misturar uma molécula de DNA catalítica capaz de clivar uma seqüência de ácidos nucléicos de substrato em um sítio de divagem definido com um substrato contendo ligação de fosfoéster, para formar uma mistura reacional; e (b) manter a mistura em condições reacionais predeterminadas para permitir que molécula de DNA enzimática clive a ligação de fosfoéster, dessa forma produzindo uma população de produtos de substrato. Em uma modalidade, a molécula de DNA enzimática é capaz de clivar a ligação de fosfoéster de forma específica para sítio. Em uma outra modalidade, o método compreende ainda as etapas de (c) gerar os produtos da molécula de DNA catalítica; e (d) adicionar substrato extra à molécula de DNA enzimática para formar uma nova mistura reacional. A presente invenção também contempla métodos de construção de moléculas de DNA enzimático que clivam ligações de fosfoéster. Um método exemplificativo compreende as seguintes etapas: (a) obter uma população de moléculas de DNA de cordão simples; (b) introduzir variação genética na população para produzir uma população variante; (c) selecionar indivíduos da população variante que satisfaçam critérios de seleção predeterminados; (d) separar os indivíduos selecionados do restante da população variante; e (e) ampliar os indivíduos selecionados.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 ilustra um esquema de ampliação seletiva para isolamento dos DNAs que clivam um fosfoéster de RNA alvo. Como mostrado, o DNA de cordão duplo que contém uma extensão de 50 nucleotídeos randô-micos (a molécula com "Ν^," (SEQ ID N° 145) indicada acima do mesmo) é ampliado por PCR, empregando um primer de DNA 5'-biotinilado que é terminado na extremidade 3' por um adenosina ribonucleotídeo (rA). (O rótulo de biotina é indicado via a letra circundada ”B".) Este primer é estendido por Taq polimerase para dar um produto de DNA que contém um único ribonucleotídeo encaixado. O DNA de cordão duplo resultante é imobilizado em uma matriz de estreptavidina e o cordão de DNA não-biotinilado é removido por lavagem com NaOH a 0,2 N. Depois de reequilibrar a coluna com uma solução tamponada, a coluna é lavada com a mesma solução com PbOAc 1 mM adicionado. Os DNAs que sofrem autoclivagem dependente de Pb2+ são liberados da coluna, colhidos no eluente e ampliados por PCR. Os produtos de PCR são então usados para iniciar a próxima rodada de ampliação seletiva. A figura 2 ilustra a atividade de autoclivagem do grupo de partida de DNA (GO) e das populações obtidas depois das primeira a quinta ro- dadas de seleção (G1 - G5), na presença de cátion de chumbo (Pb2+). O símbolo Pre representa DNA precursor de 108 nucleotídeos (SEQ ID N° 40); Clv, produto de divagem em 5' de 28 nucleotídeos (SEQ ID N° 5); e M, pri-mer 3a (SEQ ID N° 6), que corresponde em comprimento ao produto de divagem em 5'. A figura 3 ilustra o alinhamento de seqüências de variantes individuais isoladas da população depois de cinco rodadas de seleção. O domínio de substrato fixo está mostrado na parte superior, com o riboadenilato alvo identificado por um triângulo invertido (SEQ ID N° 13). Nucleotídeos de substrato que estão comumente envolvidos nas interações de pares de base presumidas estão indicados por barras verticais. As seqüências correspondendo aos 50 nucleotídeos inicialmente randomizados são alinhadas antipa-ralelas ao domínio de substrato. Todas as variantes são 3'-terminadas pela seqüência fixa 5'-CGGTAAGCTTGGCAC-3' (não-mostrada; SEQ ID N° 1). Os nucleotídeos no interior da região inicialmente randomizada, que se acredita formarem pares de base com o domínio de substrato, estão indicados à direita e à esquerda da figura; as regiões formadoras de pares de base putativas das moléculas de DNA enzimático estão individualmente envolvidas por um retângulo em cada seqüência mostrada. As regiões conservadas estão ilustradas pelos dois retângulos grandes centralmente localizados.

As figuras 4A e 4B ilustram a divagem catalisada por DNA de um fosfoéster de RNA em uma reação intermolecular que prossegue com "turnover" catalítico. A figura 4A é uma representação diagramática do complexo formado entre o substrato 19mer (5[3]'-TCACTATrAGGAAGAGATGG-5[3]', SEQ ID N° 2) e a enzima de DNA 38mer (5-ACACATCTCTGAAGTA GCGC CGCCGTATAGTGACGCTA-3', SEQ ID N° 3). O substrato contém um único adenosina ribonucleotídeo ("rA", adjacente à seta), flanqueado por desoxirribonucleotídeos. A enzima de DNA sintética é uma porção de 38 nucleotídeos da variante de ocorrência mais freqüente mostrada na figura 3. Nucleotídeos altamente conservados localizados no domínio catalítico puta-tivo estão "empacotados". Como ilustrado, uma seqüência conservada é "AGCG", ao passo que uma outra é "CG" (leitura na direção 5'-3'). A figura 4B mostra um gráfico de Eadie-Hofstee usado para determinar Km (inclinação negativa) e Vmax (intercepção em y) para divagem catalisada com DNA de substrato rotulado com [5'-32P] em condições idênticas àquelas empregadas durante a seleção in vitro. As taxas iniciais de divagem foram determinadas para reações envolvendo 5 nM de enzima de DNA e 0,125, 0,5,1, 2 ou 4 μΜ de substrato. A figura 5 é uma representação fotográfica mostrando um polia-crilamida gel demonstrando atividade de endorribonuclease específica de quatro famílias de DNAs catalíticos selecionados. A seleção de uma família dependente de Pb2+ foi repetida de forma lado a lado como controle (primeiro grupo). No segundo grupo, Zn2+é usado como o cátion; no terceiro grupo, o cátion é Mn2+; e no quarto grupo, o cátion é Mg2+. Um quinto sítio no gel consiste no produto de divagem apenas, como marcador.

Como observado, existem três faixas em cada um dos quatro grupos acima mencionados. Em cada grupo de três faixas, a primeira faixa mostra a falta de atividade da população selecionada na ausência do cátion de metal, a segunda faixa mostra a atividade observada na presença do cátion de metal, e a terceira faixa mostra a falta de atividade do grupo de partida (GO).

As figuras 6A e 6B oferecem ilustrações bidimensionais de uma molécula de DNA catalítica "progenitora" e uma de várias moléculas de DNA catalíticas obtidas pelos métodos de ampliação seletiva aqui descritos, respectivamente. A figura 6A ilustra uma molécula exemplificativa do grupo de partida, mostra a configuração global das moléculas representadas pela SEQ ID N° 133. Como ilustrado, vários nucleotídeos complementares flan-queiam a região randômica (N^) (SEQ ID N° 143). A figura 6B é uma representação diagramática de uma das moléculas de DNA catalíticas dependentes de Mg2+ (ou "DNAzimas") (SEQ ID N° 123) geradas pelos procedimentos aqui descritos. A localização do ribonucleotídeo no ácido nucléico de substrato está indicada pela seta em ambas as figs. 6A e 6B. A figura 7 ilustra alguns dos resultados de dez rodadas de ampliação seletiva in vitro realizadas essencialmente como descrito no exemplo 5 abaixo. Como mostrado, surgiram dois sítios e duas famílias de catalisadores apresentando a divagem mais eficiente da seqüência alvo. As condições de divagem foram essencialmente como indicado na figura 7, a saber, 10 mM Mg2+, pH 7,5 e 37°C; os dados colhidos depois de reação por 2 horas estão mostrados. A divagem (%) está representada contra o número de gerações (aqui, 0 a 10). O número/predomínio de moléculas de DNA catalíticas capazes de clivar a seqüência alvo nos sítios indicados no substrato está ilustrado pelas barras verticais, com divagem em G^UAACUAGAGAU mostrada pelas barras hachuradas, e com divagem em GUAACUAÍGAGAU ilustrada pelas barras vazias (levemente sombreadas). A figura 8 ilustra as seqüências de nucleotídeos, sítios de divagem e taxas de "turnover" de duas moléculas de DNA catalíticas da presente invenção, clones 8-17 (SEQ ID N° 134) e 10-23 (SEQ ID N° 136). As condições reacionais foram como mostrado, isto é, 10 mM Mg2+, pH 7,5 e 37°C. A DNAzima identificada como clone 8-17 está ilustrada à esquerda, com o sítio de divagem do substrato de RNA indicado pela seta. A seqüência de substrato (5’-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3' (SEQ ID N° 135) ) - que é separada da DNAzima (isto é, divagem intermolecular está mostrada) - é rotulada como tal. De maneira similar, a DNAzima aqui identificada como 10-23 está mostrada à direita, com o sítio de divagem do substrato de DNA indicado pela seta. Mais uma vez, a seqüência de substrato está indicada (SEQ ID N° 135). Para a enzima 8-17, a taxa de "turnover" foi aproximadamente 0,6 hr1; para a enzima 10-23, a taxa de "turnover" foi aproximadamente 1 hr'1. Pares não complementares estão indicados com um círculo cheio (·), ao passo que pares complementares estão indicados com uma linha vertical (|). A figura 9 ilustra ainda as seqüências de nucleotídeos, sítios de divagem e taxas de "turnover" de duas moléculas de DNA catalíticas da presente invenção, os clones 8-17 (SEQ ID N° 134) e 10-23 (SEQ ID N° 136) . As condições reacionais foram conforme mostradas, isto é, 10 mM Mg2+, pH 7,5 e 37°C. Como na figura 8, a DNAzima identificada como clone 8-17 está ilustrada à esquerda, com o sítio de divagem do substrato de RNA indicado pela seta. A seqüência de substrato (5'-GGAAAAAGUAACUAGA GAUGGAAG-3 (SEQ ID N° 135)) - que é separada da DNAzima (isto é, divagem intermolecular está mostrada) - é rotulada como tal. De maneira similar, a DNAzima aqui identificada como 10-23 está mostrada à direita, com o sítio de divagem do substrato de RNA indicado pela seta. Mais uma vez, a seqüência de substrato está indicada (SEQ ID N° 135). Para a enzima 8-17, "kobs" foi aproximadamente 0,002 min/1; para a enzima 10-23, o valor de "kobs" foi aproximadamente 0,01 min/1. Pares não-complementares estão indicados com um círculo cheio (·), ao passo que pares complementares estão indicados com uma linha vertical (|). A figura 10 ilustra um esquema mostrando a composição dos motivos catalíticos 8-17 (SEQ ID N° 120) e 10-23 (SEQ ID N° 121). A enzima de DNA (cordão inferior) liga-se ao substrato de RNA (cordão superior) através de pares de Watson-Crick complementares (linhas verticais) entre nucleotídeos complementares não-especificados (linhas horizontais). A divagem ocorre na posição indicada pela seta, onde R = A ou G e Y = U ou C. A figura 11 ilustra a atividade catalítica da enzima de DNA 10-23 em condições de múltiplos "turnovers" como descrito no exemplo 6. As velocidades iniciais foram medidas nos primeiros 10% da reação, empregando uma concentração fixa de enzima (0,004 nM) e concentrações variáveis de substrato (0,02 - 4 nM). O substrato de RNA 17mer, correspondente à região de códon inicial de HIV-1 gag/pol mRNA, foi preparada por transcrição in vitro. Condições reacionais: MgCI2 2 mM, NaCI 150 mM, pH 7,5, 37°C. Os dados de duas experiências independentes estão mostrados e foram adequados à equação de Michaelis-Menten: v = kcat [E]/(Km + [S]).

As figuras 12A e 12B contêm dois painéis que ilustram o efeito de variação para o comprimento das regiões de ligação a substrato de uma enzima de DNA da invenção, como descrito no exemplo 6. O comprimento da região de ligação a substrato complementar teve o comprimento (n) variado de 4 a 13 nucleotídeos para cada uma das primeira e segunda região de ligação a substrato (braço), como observado, e a atividade catalítica foi medida e expressam como k^ (min/1) e Km (nanomolar [nM]). A figura 13 ilustra o efeito de modificações para os resíduos de nucleotídeo de uma enzima de DNA, como descrito no exemplo 6. enzimas de DNA foram incubadas em soro bovino fetal inativado por calor a 10% no meio RPMI-1640 a 37°C, comparadas com DNA não-modificado (círculos vazios), timidilato invertido (círculos cheios), cinco resíduos 2-O-Me em cada (quadrados vazios), todos os resíduos 2-O-Me em cada braço (quadrados cheios), cinco resíduos P=S em núcleo (triângulos vazios) e três resíduos P=S em cada braço (triângulos cheios).

Descrição Detalhada A. Definições Como aqui usado, o termo "desoxirribozima" é usado para descrever um ácido nucléico contendo DNA que é capaz de funcionar como uma enzima. No presente relatório descritivo, o termo "desoxirribozima" inclui endorribonucleases e endodesoxirribonucleases, embora desoxirribozi-mas com atividade de endorribonuclease sejam particularmente preferidas. Outros termos aqui usados intercambiavelmente com desoxirribozima são "molécula de DNA enzimática", "DNAzima" ou "molécula de DNA catalítica", termos esses que devem ser entendidos como incluindo porções enzimati-camente ativas da mesma, sejam elas produzidas sinteticamente ou derivadas de organismos ou outras fontes. O termo "moléculas de DNA enzimático" também inclui moléculas de DNA que têm complementaridade em uma região de ligação a substrato para um alvo ou substrato de oligonucleotídeo específico; essas moléculas também têm uma atividade enzimática que é ativa para clivar especificamente o substrato de oligonucleotídeo. Em outras palavras, a molécula de DNA enzimática é capaz de clivar o substrato de oligonucleotídeo intermole-cularmente. Esta complementaridade funciona para permitir hibridização suficiente da molécula de DNA enzimática para que o oligonucleotídeo de substrato permita a ocorrência da divagem intermolecular do substrato. Embora seja preferido uma complementaridade de cem porcento (100%), complementaridade na faixa de 75 - 100% também é útil e contemplada pela presente invenção.

As moléculas de DNA enzimático da presente invenção podem ser alternativamente descritas como tendo atividade de nuclease ou ribonu-clease. Estes termos podem ser usados intercambiavelmente nesta invenção. O termo "ácido nucléico enzimático" conforme aqui usado abrange moléculas de RNA ou DNA enzimático, polímeros de RNA-DNA enzimáticos e porções enzimaticamente ativas ou derivados dos mesmos, embora as moléculas de DNA enzimático sejam uma classe particularmente preferida de moléculas enzimaticamente ativas de acordo com a presente invenção. O termo "endodesoxirribonuclease", conforme aqui usado, é uma enzima capaz de clivar um substrato constituído predominantemente de DNA. O termo "endorribonuclease", conforme aqui usado, é uma enzima capaz de clivar um substrato constituído predominantemente de RNA.

Conforme aqui usado, o termo "par de base" (bp) é geralmente usado para descrever uma parceria de adenina (A) com timina (T) ou uracil (U), ou de citosina (C) com guanina (G), embora deva ser apreciado que análogos menos comuns das bases A, T, C e G (bem como U) possam ocasionalmente participar na formação de pares de base. Nucleotídeos que normalmente formam pares quando DNA ou RNA adota uma configuração de cordão duplo também podem ser chamados nesta invenção de "bases complementares". "Seqüência de nucleotídeos complementar" geralmente refere-se a uma seqüência de nucleotídeos em uma molécula de cordão simples ou segmento de DNA ou RNA que é suficientemente complementar àquele em um outro cordão de oligonucleotídeo simples para especificamente hibri-dizar no mesmo com conseqüente ligação de hidrogênio. "Nucleotídeo" geralmente refere-se a uma unidade monomérica de DNA ou RNA consistindo em uma porção açúcar (pentose), um grupo fosfato e uma base heterocíclica nitrogenosa. A base é ligada à porção açúcar via o carbono glicosídico (carbono 1' da pentose) e essa combinação de base e açúcar é um "nucleosídeo". Quando o nucleosídeo contém um grupo fosfato ligado à posição 3' ou 5' da pentose, ele é chamado de nucleotídeo.

Uma seqüência de nucleotídeos operacionalmente ligados é tipicamente denominada, nesta invenção, uma "seqüência de bases" ou "seqüência de nucleotídeos", e seus equivalentes gramaticais, e está representado nesta invenção por uma fórmula cuja orientação da esquerda para a direita está na direção convencional do terminal 5' para o terminal 3', a menos que de outra forma especificado. "Análogo de nucleotídeo" geralmente refere-se a um nucleotídeo purina ou pirimidina que difere estruturalmente de A, T, G, C ou U, mas que é suficientemente similar para substituir o nucleotídeo normal em uma molécula de ácido nucléico. Como aqui usado, o termo "análogo de nucleotídeo" abrange bases alteradas, açúcares diferentes ou incomuns (isto é, açúcares que não a pentose "usual") ou uma combinação dos dois. Uma lista de análogos exemplificativos onde a base fora alterada é fornecida na seção C abaixo. "Oligonucleotídeo ou polinucleotídeo" geralmente refere-se a um polímero de nucleotídeos de cordão simples ou duplo. Conforme aqui usado, "oligonucleotídeo" e seus equivalentes gramaticais vão incluir toda a gama de ácidos nucléicos. Um oligonucleotídeo vai tipicamente se referir a uma molécula de ácido nucléico constituída de um cordão linear de ribonu-cleotídeos. O tamanho exato vai depender de muitos fatores que, por sua vez, depende das condições finais de uso, como bastante conhecido na técnica.

Conforme aqui usado, o termo "condições fisiológicas" pretende sugerir condições reacionais tentando igualar aquelas encontradas em organismos mamíferos, particularmente humanos. Embora variáveis tais como temperatura, disponibilidade de cátions e faixas de pH possam variar como descrito mais detalhadamente abaixo, "condições fisiológicas" geralmente compreendem uma temperatura de cerca de 35 - 40°C, com 37°C sendo particularmente preferida, bem como um pH de cerca de 7,0 - 8,0, com 7,5 sendo particularmente preferido, e ainda compreendem a disponibilidade de cátions, de preferência cátions divalentes e/ou monovalentes, com uma concentração de cerca de 2 -15 mM Mg2+ e 0 -1,0 M Na+ sendo particular- mente preferida. "Condições fisiológicas", conforme aqui usado, podem opcionalmente incluir a presença de co-fator de nucleotídeo livre. Como observado anteriormente, condições preferidas estão descritas mais detalhadamente abaixo. B. Moléculas de DNA enzimático Em várias modalidades, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção pode combinar uma ou mais modificações ou mutações que incluem adições, deleções e substituições. Em modalidades alternativas, essas mutações ou modificações podem ser geradas usando-se métodos que produzem mutações ou modificações randômicas ou específicas. Essas mutações podem, por exemplo, alterar o comprimento, ou alterar a seqüência de nucleotídeos, de um laço, uma região espaçadora ou a se-qüência (ou domínio) de reconhecimento. Uma ou mais mutações em uma molécula de DNA enzimática cataliticamente ativa podem ser combinadas com a(s) mutação(ões) em uma segunda molécula de DNA enzimática cataliticamente ativa para produzir uma molécula de DNA enzimática nova contendo as mutações de ambas as moléculas.

Em outras modalidades preferidas, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção pode ter mutações randômicas introduzidas na mesma usando-se uma variedade de métodos bastante conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, os métodos descritos por Cadwell et al., PCR Methods and Applications. 2:28-33, 1992, são particularmente preferidos para uso como aqui descrito, com algumas modificações, como descrito nos exemplos a seguir. (Veja também Cadwell et al., PCR Methods and Applications. 3 (Suppl.):S136-S140, 1994.) De acordo com este método de PCR modificado, mutações pontuais randômicas podem ser introduzidas em genes clonados.

Os métodos acima mencionados vêm sendo usados, por exemplo, para mutageneizar genes codificando ribozimas com uma taxa de mutação de 0,66% ± 0,13% (intervalo de confiança 95%) por posição, como determinado por análise de seqüências, sem fortes preferências observadas com relação ao tipo de substituição de base. Isso permite a introdução de mutações randômicas em qualquer posição nas moléculas de DNA enzimá-tico da presente invenção.

Um outro método útil para introduzir mutações definidas ou randômicas está descrito por Joyce et al., Nucleic Acids Res.. 17:711-722, 1989. Este último método envolve excisão de um cordão (codificador) de gabarito de um DNA de cordão duplo, reconstrução do cordão de gabarito com inclusão de oligonucleotídeos mutagênicos, e subseqüente transcrição do gabarito parcialmente imperfeito. Isto permite a introdução de mutações definidas ou randômicas em qualquer posição na molécula por inclusão poli-nucleotídeos contendo seqüências de nucleotídeos conhecidas ou randômicas em posições selecionados.

As moléculas de DNA enzimático da presente invenção podem ser de comprimentos e padrões de dobra variáveis, conforme apropriado, dependendo do tipo e função da molécula. Por exemplo, moléculas de DNA enzimático podem ter cerca de 15 a cerca de 400 ou mais nucleotídeos de comprimento, embora um comprimento não excedendo cerca de 250 nucleotídeos seja preferido, para evitar limitar a utilidade terapêutica de moléculas tornando-as excessivamente grandes ou pesadas. Em várias modalidades preferidas, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção tem pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento e, embora moléculas úteis possam exceder 100 nucleotídeos de comprimento, as moléculas preferidas geralmente não têm mais de cerca de 100 nucleotídeos de comprimento.

Em várias aplicações terapêuticas, as moléculas de DNA enzimático da presente invenção compreendem as porções enzimaticamente ativas de desoxirribozimas. Em várias modalidades, as moléculas de DNA enzimático da presente invenção de preferência compreendem não mais de cerca de 200 nucleotídeos. Em outras modalidades, uma desoxirribozima da presente invenção compreende não mais de cerca de 100 nucleotídeos. Em ainda outras modalidades preferidas, desoxirribozimas da presente invenção têm cerca de 20 - 75 nucleotídeos de comprimento, mais preferivelmente cerca de 20 - 65 nucleotídeos de comprimento. Outras moléculas de DNA enzimático preferidas têm cerca de 10 - 50 nucleotídeos de comprimento.

Em outras aplicações, moléculas de DNA enzimático podem assumir configurações semelhantes àquelas de ribozimas de "cabeça de martelo". Estas moléculas de DNA enzimático de preferência têm não mais que cerca de 75-100 nucleotídeos de comprimento, com um comprimento de 20 - 50 nucleotídeos sendo particularmente preferido.

Em geral, caso se pretenda sintetizar moléculas para uso como aqui descrito, quanto maior for a molécula de ácido nucléico enzimático, mais difícil será sintetizá-la. Os versados na técnica certamente vão apreciar estas limitações de desenho. Não obstante, estas moléculas maiores estão dentro do escopo da presente invenção.

Também deve ser entendido que uma molécula de DNA enzi-mática da presente invenção pode compreender porções enzimaticamente ativas de uma desoxirribozima ou pode compreender uma desoxirribozima com uma ou mais mutações, por exemplo, com uma ou mais seqüências formadoras de pares de base ou espaçadores ausentes ou modificados, desde que essas deleções, adições ou modificações não afetem adversamente a capacidade da molécula para funcionar como uma enzima. O domínio de reconhecimento de uma molécula de DNA enzi-mática da presente invenção tipicamente compreende duas seqüências de nucleotídeos flanqueando um domínio catalítico, e tipicamente contém uma seqüência de pelo menos cerca de 3 a cerca de 30 bases, de preferência de cerca de 6 a cerca de 15 bases, que são capazes de hibridizar em uma seqüência de bases complementar no ácido nucléico de substrato dando para a molécula de DNA enzimática sua alta especificidade para seqüência. Modificação ou mutação do sítio de reconhecimento por métodos bastante conhecidos permite que se altere a especificidade para seqüência de uma molécula de ácido nucléico enzimático. (Veja Joyce et al., Nucleic Acids Res.. 17:711-712, 1989).

As moléculas de ácido nucléico enzimático da presente invenção também incluem aquelas com sítios ou domínios de reconhecimento alterados. Em várias modalidades, esses domínios de reconhecimento alterados conferem especificidades para seqüência únicas à molécula de ácido nucléico enzimático incluindo esses domínios de reconhecimento. As bases exatas presentes no domínio de reconhecimento determinam a seqüência de bases na qual ocorrerá a divagem. A divagem do ácido nucléico de substrato ocorre no interior do domínio de reconhecimento. Esta divagem deixa um grupo fosfato 2', 3' ou 2',3'-cíclico na seqüência de divagem de substrato e uma 5' hidroxila no nucleotídeo que era originalmente imediatamente 3' da seqüência de divagem de substrato no substrato original. A divagem pode ser redirecionada para um sítio de escolha mudando-se as bases presentes na seqüência de reconhecimento (seqüência de guia interna). Veja Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 86:9218-9222, 1989.

Além disso, pode ser útil adicionar uma poliamina para facilitar o reconhecimento e a ligação entre a molécula de DNA enzimática e seu substrato. Exemplos de poliaminas úteis incluem espermidina, putrescina ou espermina. Uma concentração de espermidina de cerca de 1 mM pode ser eficaz em modalidades particulares, enquanto que concentrações variando de cerca de 0,1 mM a cerca de 10 mM também podem ser úteis.

Em várias modalidades alternativas, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção tem uma capacidade melhorada ou otimizada para clivar substratos de ácido nucléico, de preferência substratos de RNA. Como será apreciado pelos versados na técnica, a taxa de reação catalisada com enzima varia dependendo das concentrações de substrato e de enzima e, em geral, se estabiliza a altas concentrações de substrato ou de enzima. Levando em conta esses efeitos, a cinética de uma reação catalisada com enzima pode ser descrita nos termos a seguir, que definem a reação. A capacidade melhorada ou otimizada de uma molécula de DNA enzimática da presente invenção para clivar um substrato de RNA pode ser determinada em uma reação de divagem com quantidades variáveis de substrato de RNA rotulado na presença de molécula de DNA enzimática. A capacidade para clivar o substrato é geralmente definida pela taxa catalítica (k^,) dividida pela constante de Michaelis (KM). O símbolo k^ representa a velocidade máxima de uma reação enzimática quando o substrato se aproxima de um valor de saturação. KM representa a concentração de substrato à qual a velocidade reacional é metade da máxima.

Por exemplo, os valores para KM e kcat podem ser determinados nesta invenção por experiências nas quais a concentração de substrato [S] é superior à concentração de molécula de DNA enzimática [E]. As velocidades de reação iniciais (v0) em uma gama de concentrações de substrato são estimadas a partir da fase linear inicial, geralmente os primeiros 5% ou menos da reação. Os dados são ajustados por um método de mínimos quadrá-ticos a uma linha teórica dada pela equação: v = -KM (Vq/[S]) + Vmax. Assim, k^t e KM são determinados pela velocidade de reação inicial, v0, e pela concentração de substrato [S].

Em várias modalidades alternativas, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção tem uma capacidade melhorada ou otimizada para clivar substratos de ácido nucléico, de preferência substratos de RNA. Em modalidades preferidas, a capacidade melhorada ou otimizada de uma molécula de DNA enzimática para clivar substratos de RNA mostra uma melhora de cerca de 10 a 109 vezes em relação à taxa não-catalisada. Em modalidades mais preferidas, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção é capaz de clivar substratos de RNA a uma velocidade que é cerca de 103 a 107 vezes melhor que a da espécie "progenitora". Em modalidades ainda mais preferidas, a capacidade melhorada ou otimizada para clivar substratos de RNA é expressa como uma melhora de 104 a 106 vezes em relação à espécie progenitora. Um versado na técnica vai apreciar que a capacidade melhorada ou otimizada de uma molécula de DNA enzimática para clivar substratos de ácido nucléico pode variar dependendo das limitações de seleção aplicadas durante o procedimento de evolução in vitro da invenção. Vários métodos preferidos para modificar desoxirribozimas e outras moléculas de DNA enzimático e nucleases da presente invenção estão ainda descritos nos exemplos 1-3 abaixo. C. Análogos de nucleotídeo Como observado acima, o termo "análogo de nucleotídeo" conforme aqui usado geralmente refere-se a um nucleotídeo purina ou pirimidi- na que difere estruturalmente de A, T, G, C ou U, mas é essencialmente semelhante para substituir os nucleotídeos "normais" em uma molécula de ácido nucléico. Conforme aqui usado, o termo "análogo de nucleotídeo" abrange bases alteradas, açúcares diferentes (ou incomuns), esqueletos de fosfato alterados ou qualquer combinação dessas alterações. Exemplos de análogos de nucleotídeo úteis de acordo com a presente invenção incluem aqueles listados na Tabela a seguir, a maioria deles sendo encontrada na listagem aprovada de bases modificadas em 37 CFR §1.822 (que está aqui incorporada a título de referência).

Tabela 1 Análogos de Nucleotídeo Abreviação____________________Descrição______________________________________ ac4c 4-acetilcitidina chmõu 5-(carboxihidroxilmetil)uridina cm 2'-0-metilcitidina cmnm5s2u 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina d dihidrouridina fm 2'-0-metilpseudouridina galq p,D-galactosilqueosina' gm 2-O-metilguanosina I inosina i6a N6-isopenteniladenosina m1a 1-metiladenosina m1f 1-metilpseudouridina m1g 1-metilguanosina ml1 1-metilinosina m22g 2,2-dimetilguanosina m2a 2-metiladenosina m2g 2-metilguanosina m3c 3-metilcitidina m5c 5-metilcitidina m6a N6-metiladenosina Tabela 1 - Continuação Análogos de Nucleotídeo Abreviação____________________Descrição _______________________________________ m7g 7-metilguanosina mamõu 5-metilaminometiluridina mam5s2u 5-metoxiaminometil-2-tiouridina manq p,D-manosilmetiluridina mcm5s2u 5-metoxicarbonilmetiluridina mo5u 5-metoxiuridina ms2i6a 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina ms2t6a N-((9-p-D-ribofuranosil-2-metiltiopurina-6-il) carbamoil) treonina mt6a N“((9-p-D-ribofuranosilpurina-6-il)N-metil- carbamoil) treonina mv éster metílico do ácido uridina-5-oxiacético o5u ácido uridina-5-oxiacético (v) osyw vibutoxosina p pseudouridina q queosina s2c 2-tiocitidina s2t 5-metil-2-tiouridina s2u 2-tiouridina s4u 4-tiouridina t 5-metiluridina t6a N-((9-p-D-ribofuranosilpurina-6-il)carbamoil) treonina tm 2'-0-metil-5-metiluridina um 2'-0-metiluridina yw vibutosina x 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina, (acp3)u araU p,D-arabinosil araT p,D-arabinosil Outros análogos úteis incluem aqueles descritos no pedido internacional publicado n° WO 92/20823 (cujo relatório está aqui incorporado a título de referência), ou análogos feitos de acordo com os métodos apresentados no mesmo. Análogos descritos em DeMesmaeker et al., Anoew. Chem. Int. Ed. Enql.. 33:226-229, 1994; DeMesmaeker et al., Svnlett 733-736 (outubro 1993); Nielsen et al., Science. 254:1497-1500, 1991; e Idziak et al., Tetrahedron Letters. 34:5417-5420, 1993, também são úteis de acordo com a invenção descrita e os referidos relatórios estão aqui incorporados a título de referência. D. Métodos de Engenharia de Moléculas de DNA enzimático A presente invenção também contempla métodos para produzir moléculas de ácido nucléico tendo uma atividade predeterminada. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico é uma molécula de DNA enzimática. Em uma outra variação, a atividade desejada é uma atividade catalítica.

Em uma modalidade, a presente invenção contempla métodos para sintetizar moléculas de DNA enzimático que podem ser então "construídas" para catalisar uma reação específica ou predeterminada. Métodos para preparação de moléculas de DNA enzimático estão aqui descritos; veja, por exemplo, exemplos 1-3 abaixo. Em outras modalidades, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção pode ser construída para se ligar a moléculas pequenas ou ligandos, tal como adenosina trifosfato (ATP). (Veja Sassanfar et al., Nature. 364:550-553, 1993).

Em uma outra modalidade, a presente invenção contempla que uma população de moléculas de DNA enzimático pode ser submetida a condições de mutagênese para produzir uma população diferente de moléculas de DNA enzimático mutantes (que podem ser alternativa mente chamadas de "desoxirribozimas" ou "DNAzimas"). Em seguida, as moléculas de DNA enzimático tendo as características desejadas são selecionadas e/ou separadas da população e são subseqüentemente ampliadas.

Alternativamente, mutações podem ser introduzidas na molécula de DNA enzimática alterando-se o comprimento dos domínios de reconhe- cimento da molécula de DNA enzimática. Os domínios de reconhecimento da molécula de DNA enzimática se associam com uma seqüência de bases complementar em uma seqüência de ácidos nucléicos de substrato. Métodos para alterar o comprimento dos domínios de reconhecimento são conhecidos na técnica e incluem PCR, por exemplo; técnicas úteis estão descritas ainda nos exemplos abaixo.

Alteração do comprimento dos domínios de reconhecimento de uma molécula de DNA enzimática pode ter um efeito desejável sobre a especificidade para ligação da molécula de DNA enzimática. Por exemplo, um aumento no comprimento dos domínios de reconhecimento pode aumentar a especificidade para ligação entre a molécula de DNA enzimática e as se-qüências de bases complementares de um oligonucleotídeo em um substrato, ou pode melhorar o reconhecimento de uma seqüência particular em um substrato híbrido. Além disso, um aumento no comprimento dos domínios de reconhecimento também aumenta a afinidade com a qual ela se liga ao substrato. Em várias modalidades, esses domínios de reconhecimento alterados na molécula de DNA enzimática conferem especificidade para ligação e afinidade aumentadas entre a molécula de DNA enzimática e seu substrato.

Foi recentemente observado que determinados oligonucleotí-deos são capazes de reconhecer e se ligar a moléculas que não oligonucle-otídeos com seqüências complementares. Esses oligonucleotídeos fre-qüentemente recebem o nome de "aptâmeros". Por exemplo, Ellington et al. descrevem moléculas de RNA que são capazes de se ligar a uma variedade de corantes orgânicos (Nature, 346:818-822, 1990), ao passo que Bock et al. descrevem moléculas de ssDNA que se ligam à trombina humana (Natu-re, 355:564-566, 1992). De maneira similar, Jellinek et al. descrevem ligan-dos de RNA para fator de crescimento de fibroblastos básico (Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90:11227-11231, 1993). Assim, é ainda contemplado por esta invenção que enzimas de DNA cataliticamente ativas da presente invenção podem ser construídas de acordo com os métodos aqui descritos para apresentar uma variedade de capacidades tipicamente associadas com aptâmeros.

Um versado na técnica deve portanto apreciar que as moléculas de DNA enzimático desta invenção podem ser alteradas em qualquer se-qüência de nucleotídeos, tais como os domínios de reconhecimento, por vários métodos aqui descritos, incluindo PCR e 3SR (replicação de seqüên-cia auto-sustentada - veja exemplo 1 abaixo). Por exemplo, nucleotídeos adicionais podem ser adicionados à extremidade 5' da molécula de DNA enzimática incluindo-se nucleotídeos adicionais nos primeres.

As moléculas de DNA enzimático da presente invenção também podem ser preparadas ou construídas de forma não-randômica pelo uso de métodos tal como mutagênese direcionada para o sítio. Por exemplo, a mutagênese direcionada para o sítio pode ser realizada essencialmente como descrito por Morinaga et al., Biotechnoloav. 2:636, 1984, modificada como aqui descrito, para aplicação a desoxirribozimas. Métodos úteis para a construção de moléculas de DNA enzimático estão descritos ainda nos exemplos abaixo.

Em uma modalidade descrita, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção compreende um núcleo conservado flanqueado por dois domínios ou seqüências de ligação (ou reconhecimento) a substrato que interagem com o substrato através de interações formadoras de pares de base. Em várias, modalidades, o núcleo conservado compreende um ou mais domínios ou seqüências conservados. Em uma outra variação, uma molécula de DNA enzimática compreende ainda uma região (ou seqüência) "espaçadora" entre as regiões (ou seqüências) envolvidas na formação de pares de base. Em ainda uma outra variação, o núcleo conservado é "interrompido" em vários intervalos por um ou mais nucleotídeos variáveis ou "es-paçadores" menos conservados.

Em várias modalidades, a população de moléculas de DNA enzimático é constituída de pelo menos 2 tipo diferentes de moléculas de de-soxirribozima. Por exemplo, em uma variação, as moléculas têm seqüências diferentes. Em uma outra variação, as desoxirribozimas são moléculas de ácido nucléico tendo uma seqüência de ácidos nucléicos definindo uma do- mínio de reconhecimento que é contíguo ou adjacente ao terminal 5' da se-qüência de nucleotídeos. Em várias modalidades alternativas, as moléculas de DNA enzimático da presente invenção podem compreender ainda uma ou mais regiões espaçadoras localizadas no terminal 3' para os domínios de reconhecimento, um ou mais laços localizados no terminal 3' para os domínios de reconhecimento e/ou regiões espaçadoras. Em outras variações, uma desoxirribozima da presente invenção pode compreender uma ou mais regiões que são capazes de hibridizar em outras regiões da mesma molécula. Outras características das moléculas de DNA enzimático produzidas de acordo com os métodos ora apresentados estão descritas em alguma parte deste relatório.

Em outras modalidades, condições de mutagênese incluem condições que introduzem substituições de nucleotídeos definidas ou ran-dômicas em uma molécula de DNA enzimática. Exemplos de condições de mutagênese típicas incluem as condições descritas em outras partes deste relatório descritivo e os métodos descritos por Joyce et al., Nucl. Acids Res.. 17:711-722 1989; Joyce, Gene. 82:83-87, 1989; e Beaudry et al., Science. 257:635-41,1992.

Em ainda outras modalidades, uma população distinta de moléculas de ácido nucléico enzimático mutantes da presente invenção é aquela que contém pelo menos 2 moléculas de ácido nucléico que não têm exatamente a mesma seqüência de nucleotídeos. Em outras variações, de uma tal população distinta, uma molécula de DNA enzimática ou outro ácido nucléico enzimático tendo uma atividade predeterminada é então selecionado com base em sua capacidade de realizar a atividade predeterminada. Em várias modalidades, a atividade predeterminada compreende, sem limitação, atividade catalítica melhorada, KM reduzido, capacidade de ligação a substrato melhorada, especificidade para substrato alterada, e outras.

Outros parâmetros que podem ser considerados aspectos do desempenho da enzima incluem atividade ou capacidade catalítica, capacidade de ligação a substrato, taxa de "turnover" da enzima, sensibilidade da enzima a mecanismos de retro-alimentação e outros. Em determinados as- pectos, a especificidade para substrato pode ser considerada um aspecto do desempenho da enzima, particularmente em situações nas quais uma enzima é capaz de reconhecer e se ligar a dois ou mais substratos competidores, cada um deles afetando o desempenho da enzima em relação ao(s) outro(s) substrato(s).

Especificidade para substrato, conforme aqui usado, pode se referir à especificidade uma molécula de ácido nucléico enzimático como aqui descrito para um substrato particular, tal como aquele compreendendo ribonucleotídeos apenas, desoxirribunocleotídeos apenas, ou um compósito de ambos. Moléculas de substrato também podem conter análogos de nu-cleotídeo. Em várias modalidades, uma molécula de ácido nucléico enzimático da presente invenção pode de preferência se ligar a uma região particular de um substrato híbrido ou não-híbrido. O termo ou parâmetro aqui identificado como "especificidade para substrato" também pode incluir especificidade para seqüência, isto é, uma molécula de ácido nucléico enzimático da presente invenção pode "reconhecer" e se ligar a um substrato de ácido nucléico tendo uma seqüência de ácidos nucléicos particulares. Por exemplo, se os domínios de reconhecimento de substrato de uma molécula de ácido nucléico enzimático da presente invenção se ligar apenas a moléculas de substrato tendo uma série de um ou dois ribonucleotídeos (por exemplo, rA) em uma fileira, então a molécula de ácido nucléico^enzimático tenderá a não reconhecer ou se ligar a moléculas de substrato de ácido nucléico sem esta seqüência.

Com relação ao processo de seleção, em várias modalidades, seleção inclui qualquer meio para separar fisicamente os ácidos nucléicos enzimáticos mutantes tendo uma atividade predeterminada da população distinta de ácidos nucléicos enzimáticos mutantes. Normalmente, a seleção compreende separação por tamanho, pela presença de uma atividade catalítica, ou por hibridização do ácido nucléico mutante em um outro ácido nucléico, em um peptídio ou alguma outra molécula que esteja em solução ou presa a uma matriz sólida.

Em várias modalidades, a atividade predeterminada é tal que o ácido nucléico enzimático mutante tendo a atividade predeterminada fica rotulado de alguma maneira em virtude da atividade. Por exemplo, a atividade predeterminada pode ser uma atividade de molécula de DNA enzimática pelo que a atividade do ácido nucléico enzimático mutante sobre seu substrato faz com que o ácido nucléico enzimático mutante fique covalentemente ligado ao mesmo. O ácido nucléico enzimático mutante é então selecionado em virtude da ligação covalente.

Em outras modalidades, a seleção de um ácido nucléico enzimático mutante tendo uma atividade predeterminada inclui ampliação do ácido nucléico enzimático mutante (veja Joyce, Gene. 82:83-87, 1989; Be-audry et al., Science. 257:635-41, 1992). Outros métodos de seleção de uma molécula de ácido nucléico enzimático tendo uma característica ou atividade predeterminada estão descritos na seção de exemplos. E. Composições A invenção também contempla composições contendo um ou mais tipos ou populações de moléculas de DNA enzimático da presente invenção; por exemplo, tipos ou populações diferentes podem reconhecer e clivar seqüências de nucleotídeos diferentes. As composições podem incluir ainda um substrato contendo ácido ribonucléico. As composições de acordo com a presente invenção podem compreender ainda íon de chumbo, íon de magnésio ou outros cátions divalentes ou monovalentes, como aqui discutido.

De preferência, a molécula de DNA enzimática está presente em uma concentração de cerca de 0,05 μΜ a cerca de 2 μΜ. Tipicamente, a molécula de DNA enzimática está presente em uma razão de concentração de molécula de DNA enzimática para substrato de cerca de 1:5 a cerca de 1:50. Mais preferivelmente, a molécula de DNA enzimática está presente em uma concentração de cerca de 0,1 μΜ a cerca de 1 μΜ. Ainda mais preferivelmente, as composições contêm a molécula de DNA enzimática em uma concentração de cerca de 0,1 μΜ a cerca de 0,5 μΜ. De preferência, o substrato está presente na composição em uma concentração de cerca de 0,5 μΜ a cerca de 1000 μΜ.

Um versado na técnica vai entender que existem muitas fontes de substratos contendo ácido nucléico que incluem fontes naturais e sintéticas. Fontes de substratos adequados incluem, sem limitação, uma variedade de agentes virais e retrovirais, que incluem HIV-1, HIV-2, HTLV-I e HTLV-II.

Outros substratos adequados incluem, sem limitação, agentes virais e retrovirais que incluem aqueles compreendendo piconavírus, he-padnarididae (por exemplo HBV, HCV), papilomavírus (por exemplo HPV), vírus do gamaherpes (por exemplo EBV), linfocriptovírus, vírus da leucemia (por exemplo HTLV-I e -II), flavivírus, togavírus, vírus do herpes (incluindo vírus do alfaherpes e vírus do betaherpes), citomegalovírus (CMV), vírus da influenza, e vírus e retrovírus que contribuem para doenças e síndromes de imunodeficiência (por exemplo HIV-1 e -2) ou produzidos pelos mesmos. Além disso, substratos adequados incluem agentes virais e retrovirais que infectam primatas não-humanos e outros animais que incluem, sem limitação, os vírus da imunodeficiência símia e felina e vírus da leucemia bovina. íon de magnésio, íon de chumbo ou um outro cátion monova-lente ou divalente adequado, como descrito anteriormente, também pode estar presente na composição, a uma concentração variando de cerca de 1 -100 mM. Mais preferivelmente, o íon pré-selecionado está presente na composição a uma concentração de cerca de 2 mM a cerca de 50 mM, com uma concentração de cerca de 5 mM sendo particularmente preferida. Um versado na técnica vai entender que a concentração de íon é apenas limitada pelos limites de solubilidade de sua fonte (por exemplo magnésio) em solução aquosa e o desejo de ter a molécula de DNA enzimática presente na mesma composição em uma conformação ativa. A invenção também contempla composições contendo uma molécula de DNA enzimática da presente invenção, moléculas de desoxirri-bonucleotídeo-ribonucleotídeo híbridas, e íon de magnésio ou chumbo em concentrações como acima descrito. Como observado anteriormente, outros íons monovalentes ou divalentes (por exemplo Ca2+) podem ser usados no lugar do magnésio.

Também contempladas pela presente invenção são composições contendo uma molécula de DNA enzimática da presente invenção, um substrato contendo ácido nucléico (por exemplo RNA) e um íon pré-selecionado a uma concentração de mais de cerca de 1 milimolar, onde o referido substrato tem o comprimento maior que o dos domínios de reconhecimento presentes na molécula de DNA enzimática.

Em uma variação, uma composição compreende um complexo de molécula de DNA enzimática-substrato, onde a formação de pares de base entre uma molécula de DNA enzimática e seu substrato é contígua. Em uma outra modalidade, a formação de pares de base entre uma molécula de DNA enzimática e seu substrato é interrompida por um ou mais pares não-complementares. Em uma variedade de modalidades alternativas, uma composição da presente invenção pode compreender ainda um cátion monovalente, um cátion divalente ou ambos.

Em uma outra variação, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção é capaz de funcionar eficientemente na presença ou ausência de um cátion divalente. Em uma variação, um cátion divalente esta presente e compreende Pb2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ ou Ca2+. Alternativamente, uma molécula de DNA enzimática da presente invenção é capaz de funcionar eficientemente na presença ou ausência de cátions monovalentes. Es-pera-se que concentrações de cátion monovalente ou divalente similares àquelas aqui descritas para Pb2+ ou Mg2+ sejam úteis como aqui descrito.

Opcionalmente, cátions monovalentes também podem estar presentes além dos cátions divalentes ou como "alternativa" para os mesmos. Por exemplo, cátions monovalentes tais como sódio (Na+) ou potássio (K+) podem estar presentes, seja como íons dissociados ou na forma de compostos dissociáveis tais como NaCI ou KCI.

Em uma modalidade, a concentração de cátion monovalente presente na composição varia de 0 -1,0 M. Em uma outra modalidade, um cátion monovalente está presente em uma concentração que varia de cerca de 0 - 200 mM. Em outras modalidades, cátions monovalentes estão presentes em uma concentração que varia de cerca de 1 - 100 mM. Alternati- vamente, a concentração de cátions monovalentes varia de cerca de 2 mM -50 mM. Em ainda outras modalidades, a concentração varia de cerca de 2 mM - 25 mM. F. Métodos de uso de moléculas de DNA enzimático Métodos para usar moléculas de DNA enzimático como aqui descritas cobrem muitas utilidades diferentes como bastante na técnica de oligonucleotídeos enzimáticos e/ou anti-sentido da técnica anterior. Como discutido anteriormente, moléculas capazes de clivar as ligações que ligam ácidos nucléicos vizinhos (por exemplo ligações de fosfoéster) possuem numerosas utilidades abrangendo uma ampla variedade de aplicações. Por exemplo, moléculas de DNA enzimático tendo as capacidades, estruturas e/ou funções aqui descritas são úteis em produtos farmacêuticos e médicos (por exemplo, para debridamento de ferida, dissolução de coágulo etc.) bem como em itens domésticos (por exemplo, detergentes, produtos para higiene dental, agentes para tornar tenra a carne). Para inativar seqüências de ácidos nucléicos alvos, tal como mRNA in vitro e in vivo. A utilidade industrial dos compostos, composições e métodos aqui descritos também é contemplada e está dentro do escopo da presente invenção. A presente invenção também descreve métodos úteis para clivar qualquer ácido nucléico de cordão simples, em laço, de cordão parcialmente ou totalmente duplo; a maioria desses métodos emprega as novas moléculas de ácido nucléico enzimaticamente ativas da presente invenção. Em várias modalidades, o segmento ou porção de ácido nucléico de cordão simples do substrato (ou o substrato inteiro) compreende DNA, DNA modificado, RNA, RNA modificado ou compósitos dos mesmos. De preferência, o substrato de ácido nucléico precisa apenas ser de cordão simples na se-qüência de divagem do substrato ou perto da mesma para que uma molécula de ácido nucléico enzimático da presente invenção possa hibridizar na seqüência de divagem do substrato em virtude da seqüência de reconhecimento da enzima.

Um substrato de ácido nucléico que pode ser clivado por um método desta invenção pode ser quimicamente sintetizado ou enzimatica- mente produzido, ou pode ser isolado de várias fontes tais como fagos, vírus, células procarióticas ou células eucarióticas, incluindo células animais, células vegetais, células de levedura e células bacterianas. Ácidos nucléicos de cordão simples e de cordão duplo quimicamente sintetizados encontram-se comercialmente disponíveis em muitas fontes que incluem, sem limitação, Research Genetics (Huntsville, AL).

Substratos de RNA também podem ser sintetizados usando um sintetizador de oligonucleotídeos da Applied Biosystems (Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Fagos de cordão simples também são uma fonte de substratos de ácido nucléico. (Veja Messing et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 74:3642-3646, 1977, e Yanisch-Perron et al., Gene, 33:103-119, 1985). Células bacterianas contendo fago de cordão simples também são uma fonte disponível de substratos de ácido nucléico de cordão simples adequados. RNA de cordão simples clivável por um método da presente invenção poderíam ser fornecidos por qualquer dos vírus de RNA tais como os picornavírus, togavírus, ortomixovírus, paramixovírus, rabdovírus, coronaví-rus, arenavírus ou retrovírus. Como observado anteriormente, uma ampla variedade de células procarióticas e eucarióticas também podem ser excelentes fontes de substrato de ácido nucléico adequados.

Os métodos desta invenção podem ser usados em ácidos nu-cléicos de cordão simples ou porções de cordão simples de ácidos nucléicos em laço ou de cordão duplo que estão presentes no interior de uma célula, que inclui células eucarióticas, procarióticas, vegetais, animais, de levedura ou bacterianas. Nestas condições uma molécula de ácido nucléico enzimáti-co (por exemplo, uma molécula de DNA enzimática ou desoxirribozima) da presente invenção poderiam atuar como um agente antiviral ou um regulador de expressão genética. Exemplos desses usos de moléculas de DNA enzimático da presente invenção estão descritos mais adiante.

Na maioria dos métodos da presente invenção, a divagem de ácidos nucléicos de cordão simples ocorre no terminal 3' de uma seqüência de bases predeterminada. Esta seqüência de bases predeterminada ou se- qüência de divagem do substrato tipicamente contém de 1 a cerca de 10 nucleotídeos. Em outras modalidades preferidas, uma molécula de DNA en-zimática da presente invenção é capaz de reconhecer nucleotídeos a montante, ou a montante e a jusante do sítio de divagem. Em várias modalidades, uma molécula de DNA enzimática é capaz de reconhecer cerca de 2 -10 nucleotídeos a montante do sítio de divagem; em outras modalidades, uma molécula de DNA enzimática é capaz de reconhecer cerca de 2 - 10 nucleotídeos a montante e cerca de 2 -10 nucleotídeos a jusante do sítio de divagem. Outras modalidades preferidas contemplam uma molécula de DNA enzimática que é capaz de reconhecer uma sequência de nucleotídeos de até cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, com um comprimento até cerca de 20 nucleotídeos sendo ainda mais preferido.

Os métodos aqui descritos permitem a divagem em qualquer seqüência de nucleotídeos alterando a seqüência de nucleotídeos dos domínios de reconhecimento da molécula de DNA enzimática. Isso permite a divagem de ácido nucléico de cordão simples na ausência de um sítio de endonuclease de restrição na posição selecionada.

Uma molécula de DNA enzimática da presente invenção pode ser separada de qualquer porção do substrato de ácido nucléico de cordão simples que permanece ligado à molécula de DNA enzimática por hidrólise específica para sítio no sítio de divagem apropriado. A separação da molécula de DNA enzimática do substrato (ou "produto de divagem") permite que a molécula de DNA enzimática realize uma outra reação de divagem.

Geralmente, o substrato de ácido nucléico é tratado em condições apropriadas de divagem de ácido nucléico -- de preferência, condições fisiológicas -- com uma quantidade eficaz de uma molécula de DNA enzimática da presente invenção. Caso o substrato de ácido nucléico compreenda DNA, as condições de divagem podem incluir a presença de um cátion di-valente em uma concentração de cerca de 2 -10 mM.

Uma quantidade eficaz de uma molécula de DNA enzimática é a quantidade necessária para clivar uma seqüência de bases predeterminada presente no ácido nucléico de cordão simples. De preferência, a molécula de DNA enzimática èstá presente a uma razão molar de molécula de DNA para sítios de divagem do substrato de 1 a 20. Esta razão pode variar dependendo do período de tratamento e da eficiência da molécula de DNA enzimática particular nas condições particulares empregadas de divagem de ácido nucléico.

Assim, em uma modalidade preferida, o tratamento tipicamente envolve misturação, em solução aquosa, do substrato contendo RNA e da enzima para formar uma mistura de divagem, e em seguida manutenção da mistura assim formada em condições de divagem de RNA por um período de tempo suficiente para a molécula de DNA enzimática clivar o substrato de RNA em qualquer das seqüências de nucleotídeos predeterminadas presentes no RNA. Em várias modalidades, também é prevista uma fonte de íons -- isto é, cátions monovalentes ou divalentes, ou os dois.

Em uma modalidade da presente invenção, a quantidade de tempo necessária para a molécula de DNA enzimática clivar o ácido nucléico de cordão simples foi predeterminada. A quantidade de tempo varia de cerca de 1 minuto a cerca de 24 horas e vai variar dependendo da concentração dos reagentes e da temperatura da reação. Usualmente, este período de tempo varia de cerca de 10 minutos a cerca de 2 horas para que a molécula de DNA enzimática clive o ácido nucléico de cordão simples em qualquer das seqüências de nucleotídeos predeterminadas. ---------- A invenção contempla ainda que as condições de divagem de ácido nucléico incluem a presença de uma fonte de cátions divalentes (por exemplo, PbOAc) a uma concentração de cerca de 2 - 100 mM. Tipicamente, as condições de divagem de ácido nucléico incluem cátion divalente a uma concentração de cerca de 2 mM a cerca de 10 mM, com uma comn-centração de cerca de 5 mM sendo particularmente preferida. A concentração catiônica ótima a ser incluída nas condições de divagem de ácido nucléico pode ser facilmente determinada determinando-se a quantidade de ácido nucléico de cordão simples clivado a uma dada concentração de cátions. Um versado na técnica vai entender que a concentração ótima pode variar dependendo da molécula de DNA enzimática parti- cular empregada. A presente invenção contempla ainda que as condições de divagem de ácido nucléico incluem um pH de cerca de pH 6,0 a cerca de pH 9,0. Em uma modalidade preferida, o pH varia de cerca de pH 6,5 a pH 8,0. Em uma outra modalidade preferida, o pH tenta igualar condições fisiológicas, isto é, o pH é de cerca de 7,0 - 7,8, com um pH de cerca de 7,5 sendo particularmente preferido.

Um versado na técnica vai apreciar que os métodos da presente invenção vão funcionar em uma ampla faixa de pH desde que o pH usado para a divagem de ácido nucléico seja tal que a molécula de DNA enzimá-tica é capaz de permanecer em uma conformação ativa. Uma molécula de DNA enzimática em uma conformação ativa é facilmente detectada por sua capacidade de clivar ácido nucléico de cordão simples a uma seqüência de nucleotídeos predeterminada.

Em várias modalidades, as condições de divagem de ácido nucléico também incluem uma variedade de faixas de temperatura. Como observado anteriormente, as faixas de temperatura consistentes com condições fisiológicas são especialmente preferidas, embora faixas de temperatura consistentes com aplicações industriais também sejam contempladas nesta invenção. Em uma modalidade, a temperatura varia de cerca de 15°C a cerca de 60°C. Em uma outra variação, as condições de divagem de ácido nucléico incluem uma temperatura variando de cerca de 30°C a cerca de 56°C. Em ainda uma outra variação, as condições de divagem de ácido nucléico incluem uma temperatura de cerca de 35°C a cerca de 50°C. Em uma modalidade preferida, as condições de divagem de ácido nucléico compreendem uma faixa de temperatura de cerca de 37°C a cerca de 42°C. As faixas de temperatura consistentes com condições de divagem de ácido nucléico são limitadas apenas pela taxa de divagem desejada e pela estabilidade da molécula de DNA enzimática particular àquela temperatura particular.

Em vários métodos, a presente invenção contempla condições de divagem de ácido nucléico que incluem a presença de uma poliamina. Poliaminas úteis para praticar a presente invenção incluem espermidina, putrescina, espermina e outras. Em uma variação, a poliamina está presente a uma concentração de cerca de 0,01 mM a cerca de 10 mM. Em uma outra variação, a poliamina está presente a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM. As condições de divagem de ácido nucléico também podem incluir a presença de poliamina a uma concentração de cerca de 2 mM a cerca de 5 mM. Em várias modalidades preferidas, a poliamina é espermi-dina. G. Vetores A presente invenção também refere-se a vetores de expressão que incluem um segmento de ácido nucléico codificando uma molécula de DNA enzimática da presente invenção situada no vetor, de preferência de uma maneira que permita a expressão daquela molécula de DNA enzimática no interior de uma célula alvo (por exemplo, uma célula vegetal ou animal).

Assim, em geral, um vetor de acordo com a presente invenção de preferência inclui um vetor de plasmídio, cosmídio, fagemídio, vírus ou fago. De preferência, vetores adequados compreendem DNA de cordão simples (ssDNA) -- por exemplo, ssDNA de fagemídio circular. Também deve ser apreciado que vetores úteis de acordo com a presente invenção não precisam ser circulares.

Em uma variação, seqüências de nucleotídeos flanqueando cada uma das seqüências codificadoras de molécula de DNA enzimática adicionais são de preferência previstas, seqüências estas que podem ser reconhecidas pela primeira molécula de DNA enzimática. As seqüências intermediárias ou flanqueadoras de preferência compreendem pelo menos 1 nucleotídeo; mais preferivelmente, as seqüências intermediárias ou flanqueadoras têm cerca de 2 - 20 nucleotídeos de comprimento, com seqüências de cerca de 5 - 10 nucleotídeos de comprimento sendo particularmente preferidas. A adição de caudas de polinucleotídeo também pode ser útil para proteger a extremidade 3' de uma molécula de DNA enzimática de acordo com a presente invenção. Estas podem ser previstas unindo-se uma seqüência polimérica empregando a enzima terminal transferase.

Um vetor de acordo com a presente invenção inclui duas ou mais moléculas de DNA enzimático. Em uma modalidade, uma primeira molécula de DNA enzimática tem atividade de divagem intermolecular e é capaz de reconhecer e clivar seqüências de nucleotídeos para liberar outras sequências de DNA enzimático, isto é, ela é capaz de funcionar para "liberar" outras moléculas de DNA enzimático do vetor. Por exemplo, um vetor é de preferência construído de maneira que, quando a primeira molécula de DNA enzimática for expressa, essa primeira molécula será capaz de clivar seqüências de nucleotídeos flanqueando seqüências de nucleotídeos adicionais codificando uma segunda molécula de DNA enzimática, um terceira molécula de DNA enzimática, e assim por diante. Supondo-se que a primeira molécula de DNA enzimática (isto é, a molécula "liberadora") é capaz de clivar seqüências de oligonucleotídeos intramolecularmente, as moléculas de DNA enzimático adicionais (por exemplo, segunda, terceira e assim por diante) não precisam possuir características idênticas às da molécula "liberadora". Por exemplo, em uma modalidade, as moléculas de DNA enzimático "liberadas" (isto é, a segunda, terceira etc.) são capazes de clivar seqüências de RNA específicas, ao passo que a primeira molécula de DNA enzimática ("liberadora") tem atividade de nuclease que a permite liberar as moléculas "liberadas". Em uma outra modalidade, a molécula de DNA enzimática "liberada" tem atividade de divagem de ligação amida, ao passo que a primeira molécula de DNA enzimática ("liberadora") tem atividade de nuclease.

Alternativamente, a primeira molécula de DNA enzimática pode ser codificada em um vetor separado da segunda (e terceira, quarta etc.) molécula(s) de DNA enzimático e pode ter atividade de divagem intermolecular. Como observado neste relatório, a primeira molécula de DNA enzimática pode ser uma molécula de DNA enzimática autoclivável (por exemplo, uma desoxirribozima), e a segunda molécula de DNA enzimática pode ser qualquer tipo de molécula de DNA enzimática. Quando se faz com que um vetor expresse DNA dessas seqüências de ácidos nucléicos, esse DNA tem a capacidade, em condições apropriadas, de clivar cada uma das regiões flanqueadoras, dessa forma liberando uma ou mais cópias da segunda molécula de DNA enzimática. Se desejado, várias segundas moléculas de DNA enzimático diferentes podem ser colocadas na mesma célula ou carreador para produzir desoxirribozimas diferentes. Também é contemplado que qualquer um ou mais vetores podem compreender uma ou mais ribozimas ou desoxirribozimas em qualquer combinação de moléculas de ácido nucléi-co enzimático "liberadoras" e "liberadas", desde que tal combinação atinja o resultado desejado: a liberação de moléculas de ácido nucléico enzimático que são capazes de clivar seqüências de ácidos nucléicos predeterminadas. Métodos para isolar e purificar as moléculas de DNA enzimático da presente invenção também são contemplados. Além dos métodos aqui descritos, vários métodos de purificação (por exemplo, aqueles usando HPLC) e técnicas cromatográficas de isolamento encontram-se disponíveis na literatura. Veja, por exemplo, os métodos descritos no pedido internacional publicado n° WO 93/23569, cujo relatório está aqui incorporado a título de referência.

Também deve ficar entendido que várias combinações das modalidades aqui descritas estão incluídas dentro do escopo da presente invenção. Outros aspectos e vantagens da presente invenção tomar-se-ão aparentes das descrições acima, dos exemplos a seguir, e das reivindicações.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir ilustram, mas não limitam, a presente invenção. 1 .Evolução in vitro de moléculas de DNA enzimático: uma visão geral Técnicas de seleção in vitro e evolução in vitro permitem que novos catalisadores sejam isolados sem conhecimento prévio de sua composição ou estrutura. Esses métodos vêm sendo usados para obter RNA enzimas com novas propriedades catalíticas. Por exemplo, ribozimas que sofrem divagem autolítica com cátion de chumbo foram derivadas de um grupo randomizado de moléculas de tRNAphe (Pan et al., Biochemistrv. 31:3887-3895, 1992). Foram isoladas variantes de ribozima do grupo I que podem clivar DNA (Beaudry et ai., Science, 257:635-641, 1992) ou que tive- ram alterada a dependência de metal (Lehman et al., Nature. 361:182-185, 1993). Começando com um grupo de seqüências de RNA randômicas, foram obtidas moléculas que catalisam uma reação semelhante à polimerase (Bartel et al., Science, 261:1411-1418, 1993). No presente exemplo, é descrito o refinamento de propriedades catalíticas específicas de uma enzima evoluída por alteração das limitações de seleção durante um procedimento de evolução in vitro. A evolução darwiniana requer a operação repetida de três processos: (a) introdução de variação genética; (b) seleção de indivíduos com base no mesmo critério de adequação; e (c) ampliação dos indivíduos selecionados. Cada um desses processos pode ser realizado in vitro (Joyce, Gene, 82:83, 1989). Um gene pode ser mutageneizado por modificação química, incorporação de oligodesoxinucleotídeos mutagênicos randomiza-dos ou cópia inexata por uma polimerase. (Veja Cadwell et al., PCR Methods and Applications, 2:28-33, 1992); Cadwell et al., PCR Methods and Applications. 3 (Suppl.): S136-S140, 1994; Chu et al., Virology, 98:168, 1979; Shortle et al., Meth, Enzvmol., 100:457, 1983; Myers et al., Science, 229:242, 1985; Matteucci et al., Nucleic Acids Res.. 11:3113, 1983; Wells et al., Gene, 34:315, 1985; McNeil et al., Mol. Cell. Biol.. 5:3545, 1985; Hutchi-son et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83:710,1986; Derbyshire et al., Gene, 46:145, 1986; Zakour et al., Nature. 295:708, 1982; Lehtovaara et al., Pro-tein Enq., 2:63, 1988; Leung etal., Technique. 1:11, 1989; Zhou et al., Nucl. Acids Res.. 19:6052,1991). O produto genético pode ser selecionado, por exemplo, por sua capacidade de se ligar a um ligando ou de realizar uma reação química. (Veja, por exemplo, Joyce, Id., 1989; Robertson et al., Nature, 344:467, 1990; Tuerk et al., Science. 249:505, 1990). O gene que corresponde ao produto genético selecionado pode ser ampliado por um método de primer recíproco, tal como reação de cadeia de polimerase (PCR). (Veja Saiki et al., Science, 230:1350-54, 1985; Saiki et al., Science. 239:487-491, 1988).

Alternativamente, a ampliação de ácido nucléico pode ser realizada usando replicação de seqüência auto-sustentada (3SR). (Veja Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:1874, 1990, cujo relatório está aqui incorporado a título de referência). De acordo com o método de 3SR, se-qüências de ácidos nucléicos alvos podem ser ampliadas (replicadas) expo-nencialmente in vitro em condições isotérmicas usando três atividades en-zimáticas essenciais para replicação retroviral: (1) transcriptase invertida, (2) RNase H, e (3) uma RNA polimerase dependente de DNA. Imitando a estratégia retroviral de replicação de RNA por meio de intermediários de cDNA, esta reação acumula cópias de cDNA e RNA do alvo original.

Em resumo, caso seja contemplada a evolução de uma população de moléculas de DNA enzimático, uma série contínua de reações de transcrição invertida e transcrição replica uma seqüência alvo de RNA por meio de intermediários de cDNA. Os elementos cruciais deste desenho são (a) ambos os primeres de oligonucleotídeo especificam o alvo e contêm extensões 5' codificando o sítio de ligação à T7 RNA polimerase, de modo que os cDNAs resultantes são gabaritos de transcrição competentes; (b) a síntese de cDNA pode continuar para completar ambos os cordões devido à degradação de RNA gabarito no híbrido intermediário RNA-DNA por RNase H; e (c) os produtos reacionals (cDNA e RNA) podem funcionar como gabaritos para as etapas subseqüentes, permitindo replicação exponencial.

Caso se esteja evoluindo moléculas de DNA enzimático, vários elementos críticos deste desenho são bastante diferentes, como descrito nesses exemplos. Por exemplo, (1) os primeres de oligonucleotídeo especificam o alvo e são de preferência "marcados" ou rotulados de alguma maneira - por exemplo, por biotinilação -- para que os cordões de gabarito competentes resultantes sejam facilmente identificados; e (2) o procedimento de seleção in vitro usado de preferência depende da identificação do mecanismo de liberação mais favorável.

Um obstáculo importante para realizar a evolução darwiniana in vitro é a necessidade de integrar mutação e ampliação, as duas sendo ge-nótipo-relacionadas, com seleção, que é fenótipo-relacionada. No caso de enzimas de ácido nucléico, para as quais genótipo e fenótipo estão incluídos na mesma molécula, a tarefa é simplificada. A. Desenho de moléculas de DNA enzimático Sabe-se que DNA de cordão simples pode assumir estruturas terciárias interessantes. A estrutura de um "tDNA", por exemplo, muito se parece com aquela do tRNA correspondente. (Veja Paquette et al., Eur. J. Biochem.. 189:259-265, 1990). Além disso, tem sido possível substituir tanto quanto 31 de 35 ribonucleotídeos em uma ribozima do tipo cabeça de martelo, ao mesmo tempo em que se retém pelo menos um pouco de atividade catalítica. (Veja Perreault et al., Nature. 344:565-567, 1990; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89:918-921, 1992; Yang et al., Biochemistrv. 31:5005-5009, 1992). Técnicas de seleção in vitro foram aplicadas a grandes populações de DNAs de seqüência randômica, levando à recuperação de "aptâme-ros" de DNA específicos que se ligam a um ligante alvo com alta afinidade (Bock et al., Nature. 355:564-566, 1992; Ellington et al., Nature. 355:850-852, 1992; Wyatt et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 91:1356-1360, 1994). Recentemente, dois grupos realizaram a primeira determinação estrutural por NMR de um aptâmero, um DNA 15mer que forma uma estrutura de quarteto de G e liga-se à proteína trombina com alta afinidade (Wang et al., Biochemistry, 32:1899-1904, 1993; Macaya et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90:3745-3749, 1993). Estas descobertas foram corroboradas por uma análise cristalográfica por raios X (Padmanabhan et al., J. Biol. Chem.. 268:17651-17654,1993). A capacidade de ligar-se a uma molécula de substrato com alta afinidade e especificidade é um pré-requisito de uma boa enzima. Além disso, uma enzima deve fazer uso de grupos funcionais bem posicionados, ou nela mesma ou em um co-fator, para promover uma transformação química particular. Além do mais, a enzima deve permanecer inalterada durante o curso da reação e ser capaz de operar com "turnover” catalítico. Algumas pessoas acrescentariam a exigência de que ela fosse uma macromolécula informacional, compreendida de subunidades cuja disposição específica é responsável pela atividade catalítica. Apesar destes critérios estarem abertos a debates nas bases tanto semântica quanto química, eles servem para distinguir fenômenos de aumento da qualidade química que variam desde efeitos simples do solvente a enzimas biológicas operando no limite de difusão do substrato (Albery et ai., Biochemistrv. 15:5631-5640, 1976).

Como descrito mais detalhadamente abaixo, procurou-se desenvolver um método geral para obter rapidamente catalisadores de DNA e enzimas de DNA, a partir de seqüências randômicas. Como alvo inicial, es- * colheu-se uma reação que acreditou-se estar bem de acordo com a capacidade do DNA: a divagem hidrolítica de um RNA fosfodiéster, assistida por um co-fator de metal divalente. Esta é a mesma reação realizada por várias enzimas de RNA naturais, incluindo os motivos do tipo cabeça de martelo e grampo de cabelo. (Veja, por exemplo, Foster et al., Cell, 49:211-220, 1987; Uhlenbeck, Nature. 328:596-600, 1987; Hampel et al., Biochemistrv. 28:4929-4933,1989).

Foi recentemente mostrado que, partindo de uma biblioteca ran-domizada de moléculas de tRNA, pode-se obter ribozimas que têm atividade de RNA fosfoesterase específica para sítio, Pb2+-dependente, a um pH neutro (Pan et al., Biochemistrv. 31:3887-3895, 1992; Pan et al., Nature, 358:560-563, 1992). Isto é análogo à reação de autoclivagem casual de tRNAPhe de levedura (Dirheimer et al., Biochimie. 54:127-144, 1972), que depende de coordenação específica de um íon Pb2+ em um sítio definido no tRNA. (Veja Rubin et al., J, Biomol. Struct. Dvn.. 1:639-646, 1983; Brown et al., ■Biochemistrv. 24:4785-4801, 1985).

Como descrito neste relatório, nossos objetivos incluíam o desenvolvimento de DNAs que pudessem realizar divagem Pb2+-dependente de um RNA fosfoéster particular, inicialmente apresentado em um seqüência líder curta presa à extremidade 5' do DNA, e finalmente localizado em uma molécula separada que pudesse ser clivada de maneira intermolecular com "turnover" catalítico rápido. Estes objetivos foram alcançados com êxito, como descrito mais adiante.

Nenhuma suposição foi feita quanto a como o DNA poderia interagir com o fosfoéster alvo e nucleotídeos circundantes. Partindo de um grupo de aproximadamente 1014 seqüências 50mer randômicas, deixou-se je a seleção in vitro seguisse seu curso. Depois que foram realizadas cin-> rodadas de seleção durante quatro dias, a população como um todo atin-u a capacidade de clivar o fosfoéster alvo na presença de 1 mM de Pb2+ a na taxa de cerca de 0,2 min.'1. Isto significa um aumento de aproximada-ente 105 vezes comparado com a taxa de divagem espontânea nas mesas condições reacionais.

Indivíduos foram isolados da população, seqüenciados e anali-idos quanto à atividade catalítica. Com base nestas informações, a reação i convertida para um formato intermolecular e em seguida simplificada »ra permitir divagem específica para sítio de um substrato 19mer por uma ízima de DNA 38mer, em uma reação que prossegue com uma taxa de jrnover" de 1 min.'1 a 23°C e pH 7,0 na presença de 1 mM de PbOAc. Esquema de seleção in vitro Foi gerado um grupo de partida de aproximadamente 1014 molé-ilas de DNA de cordão simples, todas elas contendo uma porção de 5' bio-la, seguida sucessiva mente por um domínio fixo que inclui um ribonucleo-leo simples, um domínio catalítico potencial compreendido de 50 desoxir-•onucleotídeos randômicos, e um segundo domínio fixo que fica no termi-il 3’(figura 1). O grupo foi construído por uma técnica de PCR (reação de ca-iia de polimerase) aninhada, partindo de DNA sintético que continha 50 icleotídeos randômicos flanqueados por sítios de ligação a primer. O pri-3r de PCR embebido foi um oligodesoxinucleotídeo sintético 5'-biotinilado m um adenosina ribonucleotídeo 3'-terminal. Os oligonucleotídeos termi-dos em ribonucleotídeo provêem eficientemente elongação direcionada ira gabarito no contexto da PCR, neste caso dando origem a um produto extensão que contém um único ribonucleotídeo encaixado. A figura 1 ilustra um esquema de ampliação seletiva para isola-snto de DNAs que clivam um RNA fosfoéster alvo. DNA de cordão duplo ntendo uma extensão de 50 nucleotídeos randômicos é ampliado por )R, empregando um primer de DNA 5'-biotinilado (por exemplo, primer 3 --ou 3b) terminado na extremidade 3' por um adenosina ribonucleotídeo (representado pelo símbolo "N" ou "rA", onde tanto N quanto rA representam um adenosina ribonucleotídeo). Este primeré estendido porTaq polimerase para dar um produto de DNA que contém um único ribonucleotídeo encaixado. O DNA de cordão duplo resultante é imobilizado sobre uma matriz de estreptavidina e o cordão de DNA não-biotinilado é removido por lavagem com NaOH 0,2 N. Depois de reequilibrar a coluna com uma solução tampo-nante, a coluna é lavada com a mesma solução com 1 mM de PbOAc adicionado. Os DNAs que sofrem autoclivagem Pb2+-dependente são liberados da coluna, colhidos no eluente e ampliados por PCR. Os produtos de PCR são então usados para iniciar a rodada seguinte de ampliação seletiva.

Os produtos de PCR foram passados sobre uma matriz de afinidade para estreptavidina, resultando em ligação não-covalente do cordão 5'-biotinilado do DNA dúplex. O cordão não-biotinilado foi removido por uma ligeira lavagem com NaOH 0,2 N, e o cordão ligado foi equilibrado em um tampão contendo NaCI 0,5 M, KOI 0,5 M, MgCI2 50 mM e HEPES 50 mM (pH 7,0) a 23°C. Em seguida, 1 mM de PbOAc foi proporcionado no mesmo tampão, permitindo que a divagem Pb2+-dependente ocorresse no fosfoéster alvo, dessa forma liberando um subgrupo de DNAs da matriz de estreptavidina. Em princípio, um DNA individual deveria facilitar sua própria liberação por vários meios, tal como rompimento da interação entre biotina e estreptavidina ou divagem de uma das ligações de desoxirribonucleotídeo. Foi considerado que a divagem da ligação 3'-0-P de ribonucleosídeo seria o mecanismo mais provável para liberação, com base na labilidade relativa desta ligação, e que divagem hidrolítica Pb2+-dependente permitiría que a liberação ocorresse mais rapidamente. Em princípio, no entanto, o procedimento de seleção in vitro identificaria o mecanismo de liberação mais favorável bem como os indivíduos mais capazes de realizar esse mecanismo.

As moléculas de DNA liberadas da matriz mediante adição de Pb2+ foram colhidas no eluente, concentradas por precipitação com etanol, e submetidas à ampliação por PCR embebido. Como na construção do grupo de moléculas de partida, a primeira ampliação por PCR utilizou primeres que flanqueiam a região randômica (primeres 1 e 2) e a segunda utilizou um pri- mer 5'-biotinilado (primer 3b) que tem um riboadenilato 3'-terminal, dessa forma reintroduzindo o fosfoéster de RNA alvo. Todo o procedimento de ampliação seletiva requer 3 - 4 horas para ser executado.

As moléculas são purificadas de três maneiras durante cada i rodada deste procedimento: primeira, depois de ampliação por PCR, por extração duas vezes com fenol e uma vez com clorofórmio/álcool isoamílico, em seguida precipitação com etanol; segunda, depois de ligação do DNA à estreptavidina, por remoção por lavagem de todas as moléculas não-biotiniladas em condições fortemente desnaturantes; e terceira, depois de i eluição com Pb2+, por precipitação com etanol. Não há nenhuma etapa de purificação por eletroforese em gel, e assim nenhuma pressão de seleção limitando as moléculas a um comprimento particular. C. Seleção de DNA catalítica Cinco rodadas sucessivas de seleção in vitro foram realizadas, i progressivamente diminuindo o tempo de reação depois de adição de Pb2+ para progressivamente aumentar a severidade de seleção. Durante as rodadas 1 a 3, o tempo de reação foi de 1 hora; durante a rodada 4, o tempo de reação foi de 20 minutos; e durante a rodada 5, ele foi de 1 minuto. O grupo de partida de DNAs de cordão simples, junto com a população de i moléculas obtidas depois de cada rodada de seleção, foi analisado quanto à atividade de autoclivagem em condições idênticas àquelas empregadas durante a seleção in vitro (veja figura 2).

Para este ensaio, as moléculas foram preparadas com uma porção 5'-32P ao invés de uma porção 5-biotina, permitindo a detecção tanto do material de partida como do produto de divagem em 5'. Depois de uma incubação de 5 minutos, não havia atividade detectável no grupo de partida (GO) nem na população obtida depois das primeira e segunda rodadas de seleção. Os DNAs obtidos depois da terceira rodada (G3) apresentaram um nível modesto de atividade; esta atividade aumentou regularmente, atingindo aproximadamente 50% de autoclivagem para os DNAs obtidos depois da quinta rodada de seleção (G5). A divagem foi detectada apenas no fosfoéster alvo, mesmo depois de longos períodos de incubação. Esta atividade era perdida se Pb2+ fosse omitido da mistura reacional. A figura 2 ilustra a atividade de autoclivagem do grupo de partida de DNA (GO) e das populações obtidas depois das primeira a quinta rodadas de seleção (G1 - G5). As misturas reacionais continham MgCI2 50 mM, NaCI 0,5 M, KCI 0,5 M, HEPES 50 mM (pH 7,0 a 23°C) e 3 nM DNA rotulado com [5'-32P], foram incubadas a 23°C por 5 min., seja na presença ou na ausência de PbOAc 1 mM. O símbolo Pre representa DNA precursor de 108 nucleotídeos (SEQ ID N° 4); Clv, produto de divagem em 5' de 28 nucleotídeos (SEQ ID N° 5); e M, primer 3a (SEQ ID N° 6), correspondendo em comprimento ao produto de divagem em 5'. O produto de divagem em 5' de 28 nucleotídeos (Clv) ilustrado tem de preferência a seqüência 5'-GGGACGAATTCTAATACGACTCACT ATN-3', onde "N" representa adenosina ribonucleotídeo com fosfato 2',3'-cíclico adicionado na extremidade 3'(SEQ ID N° 5). Em modalidades alternativas, "N" representa adenosina ribonucleotídeo com um 2' ou 3' fosfato adicional na extremidade 3' da molécula.

Na figura 2, a banda "Pre" da faixa "G0" compreende uma amostra de DNAs precursores de 108 nucleotídeos que incluem, cada um, 50 nucleotídeos randômicos. Portanto, qualquer amostra "Pre" dada conterá uma ampla variedade de DNAs precursores, e cada amostra provavelmente diferirá das amostras anterior e subseqüente. As faixas "G1" a "G5" contêm bandas "Pre" que são crescentemente enriquecidas quanto a moléculas de DNA catalítico, mas ainda contêm um grande número de seqüências de DNA diferentes (isto é, diferindo no domínio randomizado de nucleotídeo 50). Uma amostra destas seqüências diferentes de "G5 Pre" DNA está mostrada na figura 3. Técnicas de "shotgun cloning" foram empregadas para isolar indivíduos da população G5; as seqüências de nucleotídeos completas de 20 destes subclones foram então determinadas (veja figura 3). (Veja também Cadwell et al., PCR Methods and Applications. 2:28-33, 1992; e Ca-dwell etc., PCR Methods and Applications. 3(Suppl.): S136-S140, 1994). Das 20 seqüências, cinco eram únicas, duas ocorreram duas vezes, uma ocorreu três vezes e uma ocorreu oito vezes. Todas as variantes individuais compartilham elementos de seqüência comuns na região de 50 nucleotídeos que fora randomizada no grupo de partida de DNA. Todas elas contêm duas regiões de gabarito supostas, uma com complementaridade para uma extensão de nucleotídeos que se situa imediatamente a montante do sítio de divagem e a outra com complementaridade para nucleotídeos que se situam pelo menos quatro nucleotídeos a jusante. Entre essas duas supostas regiões de gabarito fica um domínio variável de 1 -11 nucleotídeos, seguido da seqüência fixa 5'-AGCG-3', e em seguida um segundo domínio variável de 3 - 8 nucleotídeos, e por fim a seqüência fixa 5'-CG-3' ou 5'-CGA-3'. Os nucleotídeos que ficam fora das duas supostas regiões de gabarito são altamente variáveis tanto na seqüência como no comprimento. Em todos os subclones seqüenciados, a região correspondendo aos 50 nucleotídeos inicialmente randomizados continua com um total de 50 nucleotídeos de comprimento. A figura 3 ilustra o alinhamento de seqüência de variantes individuais isoladas da população depois de cinco rodadas de seleção. O domínio de substrato fixo (5'-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATrAGGAA GAGATGGCGAC-3' (SEQ ID N° 13) ou 5-GGGACGAATTGTAATACGACT CACTATNGGA AGAGATGGCGAC-3', onde N representa adenosina ribo-nucleotídeo) (SEQ ID N° 13) está mostrado na parte superior, com o riboa-denilato alvo identificado por um triângulo invertido. Nucleotídeos de substrato que estão comumente envolvidos em supostas interações de formação de pares de base estão indicados por uma barra vertical. As seqüências correspondentes aos 50 nucleotídeos inicialmente randomizados são alinhados antiparalelos ao domínio de substrato. Todas as variantes são 3'-terminadas pela seqüência fixa 5,-CGGTAAGCTTGGCAC-3, (SEQ ID N° 1) ("sítio de primer", não-mostrado). Os nucleotídeos dentro da região inicialmente randomizada que se supõe formar pares de base com o domínio de substrato estão indicados à direita e à esquerda da figura; as regiões formadoras de pares de base putativas (ou de ligação a substrato) das moléculas de DNA enzimático estão individualmente envolvidas em um retângulo em cada seqüência mostrada. Os nucleotídeos altamente conservados dentro do domí- nio catalítico putativo estão ilustrados nas duas colunas envolvidas por um retângulo. Embora se antecipe que dados adicionais serão úteis na construção de um modelo estrutural secundário significativo do domínio catalítico, observou-se que, assim como as ribozimas do tipo cabeça de martelo e grampo de cabelo, o domínio catalítico de nossas moléculas de DNA enzi-mático parece conter um núcleo conservado flanqueado por duas regiões de ligação a substrato (ou domínios de reconhecimento) que interagem com o substrato através de interações formadoras de pares de base. De maneira similar às ribozimas do tipo cabeça de martelo e grampo de cabelo, os DNAs catalíticos também parecem requerer uma extensão curta de nucleo-tídeos de substrato não-pareados -- neste caso 5-GGA-3' -- entre as duas regiões que estão envolvidas na formação de pares de base.

Também foi interessante observar que cada uma das nove variantes diferentes apresentaram um padrão diferente de suposta complementaridade com o domínio de substrato. Em alguns casos, a formação de pares de base era contígua, ao passo que em outros ela era interrompida por um ou mais pares não-complementares. A tendência geral parece ser formar interação mais estreita com os nucleotídeos que ficam a montante do sítio de divagem comparados com aqueles que ficam a jusante. Estudos de ligação e análise de mutagênese direcionada para o sítio devem nos possibilitar outras suposições e também substanciar esta conjectura.

Para outras suposições sobre as exigências de seqüência quanto à função catalítica, a atividade de autoclivagem de seis das nove variantes foi testada e avaliada nas condições de seleção aqui descritas (veja figura 3). Não surpreendentemente, a seqüência que ocorreu em oito dos 20 subclones provou ser a mais reativa, com uma constante de taxa de primeira ordem de 1,4 min.'1. Todas as variantes estudadas foram ativas no ensaio de autoclivagem e todas deram origem a um produto 5'-rotulado simples correspondendo à divagem no fosfoéster de RNA alvo. O subclone dominante foi ainda analisado em várias condições reacionais. Sua atividade de autoclivagem era dependente de Pb2+ porém inalterada se Mg2+ fosse omitido da mistura reacional. Também houve uma exigência de cátion monovalente, que pôde ser satisfeita ou por Na+ ou K+. A taxa reacional aumentou linearmente com concentração crescente de cátion monovalente na faixa de 0 - 1,0 M (r = 0,998). Outras variáveis que podem afetar a reação, tal como pH, temperatura e a presença de outros metais divalentes, estão em vias de serem avaliadas. 2. Materiais e Métodos A. Oliqonucleotídeos e análogos de oligonucleotídeo DNAs sintéticos e análogos de DNA foram adquiridos da Operon Technologies. O substrato de 19 nucleotídeos, 5'-pTCACTATrAGGAAGAG ATGG-3' (SEQ ID N° 7) (ou 5'-pTCACTATNGGAAGAGATGG-3', onde "N" representa adenosina ribonucleotídeo) (SEQ ID N° 7), foi preparado por extensão catalisada por transcriptase invertida de 5’-pTCACTATrA-3' (SEQ ID N° 8) (ou 5'-pTCAGTATN-3', onde "N" representa adenosina ribonucleotídeo) (SEQ ID N° 8), como previamente descrito (Breaker et al., Biochemis-try, 33:11980-11986, 1994), usando o gabarito 5'-CCATCTCTTCCTATAGT GAGTCCGGCTGCA-3' (SEQ ID N° 9). O primer 3, 5-GGG ACG AATTCTA ATACGACTCACTATrA-3' (SEQ ID N° 6) (ou 5-GGGACGAATTCTAATAC GACTCACTATN-3', onde "N" representa adenosina ribonucleotídeo) (SEQ ID N° 6), foi 5-rotulado com [γ-32Ρ]ΑΤΡ e T4 polinucleotídeo cinase (primer 3a) ou 5'-tiofosforilado com [y-S]ATP e T4 polinucleotídeo cinase e subse-qüentemente biotinilado com N-iodoacetil-N-biotinilhexilenodiamina (primer 3b).

B. Preparação do grupo de DNA O grupo de partida de DNA foi preparado por PCR usando o oligômero sintético õ^GTGCCAAGCTTACCG-Nso-GTCGCCATCTCTTCC-S' (SEQ ID N° 4), onde N é uma mistura equimolar de G, A, T e C. Uma PCR de 2 ml, contendo 500 pmoles do oligômero randomizado, 1.000 pmoles de primer 1 (5'-GTGCCAAGCTTACCG-3', SEQ ID N° 10), 500 pmoles de primer 2 (5'-CTGCAGAATTCTAATACGACTCACTATAGGAAGAGATGGCG AC-3', SEQ ID N° 11), 500 pmoles de primer 3b, 10 pCi [a-32P]dATP, e 0,2 U μΓ1 Taq DNA polimerase, foi incubada na presença de 50 mM KCI, 1,5 mM MgCI2, 10 mM Tris-HCI (pH 8,3 a 23°C), 0,01% de gelatina e 0,2 mM de cada dNTP por 1 min., a 92°C, 1 min., a 50°C e 2 min., a 72°C, em seguida 5 ciclos de 1 min., a 92°C, 1 min. a 50°C e 1 min., a 72°C. A mistura resultante foi extraída duas vezes com fenol e uma vez com clorofórmio/álcool isoamílico, e o DNA foi isolado por precipitação com etanol. C. Seleção in vitro O grupo de partida de DNA foi novamente suspendido em 500 μΙ de tampão A (NaC11 M e HEPES 50 mM (pH 7,0 a 23°C)) foi passado repetidamente em uma coluna de estreptavidina (AffiniTip Strep 20, Genosys, The Woodlands, TX). A coluna foi lavada com cinco volumes de 100 μΙ de tampão A, seguidos de cinco volumes de 100 μΙ de NaOH 0,2 N, e em seguida equilibrada com cinco volumes de 100 μΙ de tampão B (NaCI 0,5 M, KCI 0,5 M, MgCI2 50 mM e HEPES 50 mM (pH 7,0 a 23°C)). O DNA de cordão simples imobilizado foi eluído no decorrer de 1 hora com três volumes de 20 μΙ de tampão B com 1 mM de PbOAc adicionado. Todo o processo de imobilização e eluição foi conduzido a 23°C. O eluente foi colhido em um volume igual de tampão C (HEPES 50 mM (pH 7,0 a 23°C) e EDTA 80 mM) e o DNA foi precipitado com etanol. O DNA resultante foi ampliado em uma PCR de 100 μΙ contendo 20 pmoles de primer 1, 20 pmoles de primer 2, 0,05 U μΓ1 de Taq polimera-se, 50 mM de KCI, 1,5 mM de MgCI2, 10 mM de Tris-HCI (pH 8,3 a 23°C), 0,01% de gelatina e 0,2 mM de cada dNTP por 30 ciclos de 10 seg. a 92°C, 30 seg. a 50°C e 30 seg. a 72°C. Os produtos reacionais foram extraídos duas vezes com fenol e uma vez com clorofórmio/álcool isoamílico, e o DNA foi recuperado por precipitação com etanol. Aproximadamente 4 pmoles do DNA ampliado foram adicionados a uma segunda PCR embebido contendo 100 pmoles de primer 1, 100 pmoles de primer 3b, 20 pCi de [a-32P]dATP e 0,1 U μΓ1 de Taq polimerase, em um volume total de 200 μΙ que foi ampliado por 10 ciclos de 1 min. a 92°C, 1 min., a 50°C e 1 min., a 72°C. Os produtos de PCR foram mais vez extraídos e precipitados, e o DNA resultante foi novamente suspendido em 50 μΙ de tampão A, e em seguida usado para começar a rodada seguinte de seleção.

As segunda e terceira rodadas foram realizadas como acima, com a diferença de que a PCR embebido ao final da terceira rodada foi rea- lizada em um volume de 100 μΙ. Durante a quarta rodada, o tempo de elui-ção depois da adição de Pb2+ foi reduzido para 20 min., (dois volumes de eluição de 20 μΙ) e apenas metade do DNA recuperado foi usado na primeira PCR, que envolvia apenas 15 ciclos de temperatura. Durante a quinta rodada, o tempo de eluição foi reduzido para 1 min., (dois volumes de eluição de 20 μΙ) e apenas um quarto do DNA recuperado foi usado na primeira PCR, que envolvia apenas 15 ciclos de temperatura. O DNA obtido depois da quinta rodada de seleção foi subclonado e seqüenciado, como descrito previamente (Tsang et al., Biochemistrv. 33:5966-5973, 1994). D. Análise cinética de DNAs catalíticos Populações de DNA e vários indivíduos subclonados foram preparados com um rótulo de 5'-32P por PCR assimétrica em uma mistura reaci-onal de 25 μΙ contendo 10 pmoles de primer 3a, 0,5 pmoles de DNA de entrada e 0,1 U μΓ1 de Taq polimerase, nas condições descritas acima, por 10 ciclos de 1 min. a 92°C, 1 min., a 50°C e 1 min., a 72°C. Os produtos de ampliação rotulados com [5'-32P] resultantes foram purificados por eletroforese em 10% poliacrilamida/8 M gel.

Ensaios de autoclivagem foram realizados depois de pré-incu-bação do DNA em tampão B por 10 min.. As reações foram iniciadas por a-dição de PbOAc até uma concentração final de 1 mM e foram terminadas por adição de um volume igual de tampão C. Os produtos reacionais foram separados por eletroforese em 10% poliacrilamida/8 M gel. Análises cinéti-cas em condições de múltiplos "turnovers" foram realizadas em tampão B que incluía 50 μρ ml'1 de BSA para impedir a aderência de material às paredes do vaso. As moléculas de substrato e enzima foram pré-incubadas separadamente por 5 min., em tampão reacional sem Pb2+, em seguida combinadas, e a reação foi iniciada por adição de PbOAc até uma concentração final de 1 mM. 3. Evolução de desoxirribozimas que clivam intermolecularmente A. Conversão para um formato intermolecular Com base no padrão variável de supostas interações de formação de pares de base entre os domínios catalíticos e de substrato das vari- antes estudadas, foi considerado razoavelmente correto converter a reação catalisada com DNA em um formato intermolecular. Agindo assim, desejamos simplificar as duas regiões de ligação a substrato do catalisador para que cada uma formasse uma extensão ininterrupta de 7 - 8 pares de base com o substrato. Além disso, desejamos fornecer um substrato mínimo, limitado às duas regiões formadoras de pares de base e à seqüência intermediária 5'-GGA-3' (figura 4A).

As figuras 4A e 4B ilustram a divagem catalisada com DNA de um fosfoéster de RNA em uma reação intermolecular que prossegue com "tumover" catalítico. A figura 4A é uma representação diagramática do complexo formado entre o substrato 19mer e enzima de DNA 38mer. O substrato contém um único adenosina ribonucleotídeo ("rA" ou "N", adjacente à seta), flanqueado por desoxirribonucleotídeos. A enzima de DNA sintética é uma porção de 38 nucleotídeos da variante de ocorrência mais freqüente mostrada na figura 3. Nucleotídeos altamente conservados localizados dentro do domínio catalítico putativo estão "empacotados". Como ilustrado, uma seqüência conservada é "AGCG", ao passo que uma outra é "CG" (lendo na direção 5'-3'). A figura 4B mostra um gráfico de Eadie-Hofstee usado para determinar Km (inclinação negativa) e Vmax (intercepção em y) para divagem catalisada com DNA de substrato rotulado com [5'-32P] em condições idênticas àquelas empregadas durante seleção in vitro. As taxas de divagem iniciais foram determinadas para reações envolvendo 5 nM de enzima de DNA e ou 0,125, 0,5, 1, 2 ou 4 μΜ de substrato.

Na criação do domínio catalítico, contamos fortemente com a composição da variante mais reativa, truncando por dois nucleotídeos na extremidade 5' e 11 nucleotídeos na extremidade 3’. Os 15 nucleotídeos que ficam entre as duas regiões de gabarito foram deixados inalterados e um único nucleotídeo foi inserido na região de gabarito 3' para formar uma extensão contínua de nucleotídeos capazes de formar pares de base com o substrato. O substrato foi simplificado para a seqüência 5'-TCACTATrA · GGAAGAGATGG-3’ (SEQ ID N° 12) (ou 5'-TCACTATN · GGAAGAGATGG- 3', onde "N" representa adenosina ribonucleotídeo) (SEQ ID N° 12), onde os nucleotídeos sublinhados correspondem às duas regiões envolvidas na formação de pares de base à molécula de DNA catalítica. O sistema de reação simplificado, empregando uma molécula de DNA catalítica 38mer (catalisador) compreendida inteiramente de desoxirri-bonucleotídeos e um substrato 19mer contendo um único ribonucleotídeo encaixado em uma outra seqüência de "alI-DNA", permite a eficiente divagem de fosfoéster catalisada com DNA com rápido "turnover". Com uma incubação de 90 minutos na presença de 0,01 μΜ de catalisador e 1 μΜ de substrato, são clivados 46% do substrato, correspondendo a 46 "turnovers" do catalisador. Uma análise cinética preliminar desta reação foi realizada, avaliada em condições de múltiplos "turnovers". O catalisador DNA apresenta cinética de Michaelis-Menten, com valores para e Km de 1 min."1 e 2 μΜ, respectivamente (veja figura 4B). O valor para Km é consideravelmente maior que a constante de dissociação esperada entre o catalisador e o substrato com base nas interações de Watson-Crick. O substrato foi incubado em condições reacionais idênticas (porém, na ausência do catalisador); foi obtido um valor para Kuncat de 4 x 10"6 min.'1. Isto é consistente com o valor relatado de 5 x 10'3 min.'1 para hidrólise do 1-nitrofenil-1,2-propanodiol mais lábil na presença de 0,5 mM de Pb2+ a pH 7,0 e 37°C (Breslow et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 88:4080-4083,1991).

Supõe-se agora que a reação de divagem do fosfoéster prossegue por meio de um mecanismo hidrolítico envolvendo ataque pelo ribonu-cleosídeo 2'-hidroxila no fosfato vicinal, gerando um produto 5' com um fosfato 2'(3')-cíclico terminal e um produto 3' com um 5'-hidroxila terminal. Como suporte deste mecanismo, o produto da divagem em 3' é eficientemente fosforilado com T4 polinucleotídeo cinase e [γ-32Ρ]ΑΤΡ, consistente com a disponibilidade de um 5'-hidroxila livre. B. Discussão Depois de cinco rodadas de seleção in vitro, foi obtida uma população de moléculas de DNA de cordão simples que catalisam a divagem Pb2+-dependente eficiente de um fosfoéster de RNA alvo. Com base nos aspectos comuns de indivíduos representativos isolados desta população, foi construída uma versão simplificada dos domínios tanto catalíticos como do substrato, levando a uma demonstração de "turnover” catalítico rápido em um contexto intermolecular. Assim, o domínio catalítico 38mer oferece um exemplo de uma enzima de DNA, ou daquilo que pode ser chamado de "desoxirribozima". A referência a esta molécula como uma enzima, com base no fato de que ela é uma macromolécula informacional capaz de acelerar uma transformação química em uma reação que prossegue com "turnover" rápido e obedece à cinética de Michaelis-Menten, pode não satisfazer a noção daquilo que constitui uma enzima. Pode-se insistir que uma enzima, por definição, deve ser um polipeptídio. Se, no entanto, for aceita a noção de uma enzima de RNA, então parece razoável adotar uma visão similar no que se refere a enzimas de DNA. Considerando o quão rápido foi-se capazes de gerar esta molécula a partir de um grupo de DNAs de seqüência randômica, esperou-se que muitos outros exemplos de enzimas de DNA sintéticas surjam no futuro próximo. A divagem Pb2+-dependente de um fosfoéster de RNA foi escolhida como um alvo inicial para a catálise de DNA porque ela é uma reação constante que requer simplesmente o posicionamento apropriado de um Pb2+-hidroxila coordenado para facilitar a desprotonação da Pb2+-hidroxila que se situa adjacente ao sítio de divagem. (Veja Pan et al., in The RNA World. Gesteland & Atkins (eds.), pp. 271-302, Cold Spring Harbor Labo-ratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1993)). Sabe-se que Pb2+ coordena para a posição N7 de purinas, a posição 06 de guanina, a posição 04 de uracila, e a posição N3 de citosina (Brown et al., Nature. 303:543-546, 1993). Assim, parecia improvável que as diferenças na composição de açúcar e conformação de DNA comparadas com RNA impedissem que o DNA formasse uma bolsa de ligação a Pb2+ bem definida.

Um substrato que contém um único ribonucleotídeo dentro de uma seqüência de "alI-DNA" foi escolhido porque forneceu um sítio unicamente favorecido para divagem e assegurou que qualquer atividade catalíti- ca resultante fosse atribuível apenas ao DNA. O reconhecimento de substrato parece depender de duas regiões de interações de formação de pares de base entre o catalisador e o substrato. No entanto, os nucleotídeos do substrato não pareados, 5’-GGA-3', que se situam entre estas duas regiões, podem desempenhar um papel importante no reconhecimento de substrato, coordenação de metais ou outros aspectos da função catalítica.

Antecipa-se ainda que uma molécula de "alI-RNA", outros com-pósitos de RNA-DNA, e moléculas contendo um ou mais análogos de nu-cleotídeo podem ser substratos aceitáveis. Como aqui descrito, os procedimentos de evolução in vitro aqui descritos podem ser usados com êxito para gerar moléculas de DNA enzimáticas tendo as especificidades desejadas; outras análises por estas linhas estão atualmente em andamento.

Além disso, estudos para determinar se as interações de formação de pares de base pressupostas entre enzima e substrato são generali-záveis, no que diz respeito à seqüência, estão em andamento, usando os métodos ora descritos. As desoxirribozimas Pb2+-dependentes aqui descritas também podem ser consideradas compostos modelo para explorar as propriedades estruturais e enzimáticas de DNA.

Os métodos empregados no presente relatório para o rápido desenvolvimento de catalisadores de DNA terão generalidade considerável, permitindo-se utilizar outros co-fatores para dar início à divagem de uma ligação alvo unida a um domínio catalítico potencial. Neste contexto, o desenvolvimento de enzimas de DNA Mg2+-dependentes que especificamente clivam RNAs alvos em condições fisiológicas é de interesse, assim como também o é o desenvolvimento de enzimas de DNA que funcionam na presença de outros cátions (veja exemplo 4). Estas moléculas vão oferecer uma alternativa para os tradicionais métodos anti-sentido e de ribozima para a inativação específica de mRNAs alvos. DNA une-se assim ao RNA e à proteína na lista de macromolé-culas biológicas que são capazes de apresentar atividade enzimática. Toda a gama de capacidades catalíticas do DNA ainda está por ser explorada, rrias estas explorações devem prosseguir rapidamente com base em méto- dos de seleção in vitro tais como aqueles empregados neste estudo.

Enzimas de DNA oferecem várias vantagens importantes comparadas com outros catalisadores macromoleculares. Em primeiro lugar, elas são fáceis de preparar, em uma era em que a maioria dos laboratórios têm acesso a um sintetizador de DNA automatizado e o custo de DNA fosfo-ramiditas ficou bastante modesto. Em segundo lugar, elas são compostos muito estáveis, especialmente quando comparadas com RNA, dessa forma facilitando seu uso em estudos biofísicos. Terceiro, esperou-se que elas pudessem ser adaptadas a aplicações terapêuticas que no presente fazem uso de DNAs anti-sentido sem atividade de divagem de RNA. A seleção in vitro poderia ser realizada com análogos de DNA, incluindo compostos que são resistentes à nuclease tal como DNA contendo fosforotioato, uma vez que estes análogos possam ser preparados na forma de um desoxinucleosídeo 5'-trifosfato e são aceitos como um substrato para um DNA polimerase de DNA-dependente. Por fim, as enzimas de DNA oferecem uma nova janela em nossa compreensão da base macromolecular da função catalítica. Será interessante, por exemplo, realizar análises comparativas de enzimas à base de proteína, RNA e DNA que catalisam a mesma transformação química. 4. Outras famílias de DNAs catalíticos Um grupo de DNA de partida foi preparado por PCR essencialmente como descrito no exemplo 2.B° acima, exceto que o grupo de DNA inicial compreendia moléculas contendo 40 nucleotídeos randômicos. Assim, o grupo de DNA de partida aqui descrito foi preparado por PCR usando o oligômero sintético 5' GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGA TGG CGA CAT CTC N40GT GAC GGT AAG CTT GGC AC 3’ (SEQ ID N° 23), onde N é uma mistura equimolar de G, A, T e C, e onde as moléculas de DNA foram selecionadas quanto à capacidade de clivar o fos-foéster seguinte ao rA alvo. (Veja também a figura 6A). * A ampliação seletiva foi realizada na presença de ou Pb2+, Zn2+, Mn2+ ou Mg2+, dessa forma, gerando pelo menos quatro "famílias" de moléculas de DNA catalíticas. Como ilustrado na figura 5, moléculas de DNA catalíticas, demonstrando atividade específica, foram geradas na presença de uma variedade de cátions. A figura 5 é uma representação fotográfica mostrando um polia-crilamida gel demonstrando atividade de endorribonuclease específica de quatro famílias de DNAs catalíticos selecionados. A seleção de uma família Pb2+-dependente de moléculas foi repetida de uma maneira lado a lado como controle. Em cada grupo de três faixas, a primeira faixa mostra a falta de atividade da população selecionada na ausência do cátion de metal, a segunda faixa mostra a atividade observada na presença de um cátion de metal, e a terceira faixa mostra a falta de atividade no grupo de partida (GO). No momento, a ordem de reatividade é observada como sendo Pb2+ > Zn2+ > Mn2+ > Mg2+, espelhando o píC, do hidróxido de metal correspondente.

Depois de ou cinco (G5) ou seis (G6) rodadas de ampliação seletiva na presença do cátion divalente pré-selecionado, foi obtida a atividade de endonuclease desejada. A descrição a seguir de ampliação seletiva na presença de Mg2+ destina-se a ser exemplificativa.

Seis rodadas de ampliação seletiva in vitro foram realizadas, seguindo-se o método descrito no exemplo 2 acima, exceto que o metal divalente usado foi 1 mM de Mg2+ ao invés de 1 mM de Pb2+. (Veja também Breaker et al., Chem. & BioL. 1:223-229, 1994), aqui incorporado a título de referência, que descreve essencialmente o mesmo procedimento).

Clones individuais foram isolados depois da sexta rodada, e a seqüência de nucleotídeos de 24 destes clones foi determinada. Todas as seqüências começavam com: 5' GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGA TGG CGA CA (SEQ ID N° 139) e terminavam com: CGG TAA GCT TGG CAC 3' (SEQ ID N° 1). O segmento do meio, correspondente ao TCTC N40 GTGA (SEQ ID N° 140) no grupo de partida variava da seguinte maneira: (13) CCG CCC ACC TCT ITT ACG AGC CTG TAC GAA ATA GTG CTC TTT TTA GTA T (SEQ. ID N° 24) (5) TCT CTT CAG CGA TGC ACG CTT GTT TTA ATG TTG CAC CCA TGT TAG TGA (SEQ. ID N° 25) (2) TCT CAT CAG CGA TTG AAC CAC TTG GTG GAC AGA CCC ATG TTA GTG A (SEQ. ID N° 26) (1) CCG CCC ACC TCT TTT ACG AGC CTG TAC GAA ATA GTG TTC TTG TTA GTA T (SEQ ID N° 27) (1) CCG CCC ACC TCT TTT ACG AGC CTG TAC GAA ATA GTG CTC TCG TTA GTA T (SEQ ID N° 28) (1) TCT CAG ACT TAG TCC ATC ACA CTC TGT GCA TAT GCC TGC TTG ATG TGA (SEQ ID N°29) (1) -CT CTC ATC TGC TAG CAC GCT CGA ATA GTG TC A GTC GAT GTG A (SEQ ID N° 30). O número inicial entre parênteses indica o número de clones tendo aquela seqüência particular. Observe que algumas mutações (destacadas em negrito) ocorreram em posições de nucleotídeo diferentes daquelas que foram randomizadas inicialmente. A segunda seqüência listada acima (isto é, SEQ ID N° 25), que ocorreu em 5 dos 24 clones, foi escolhida como um composto líder (isto é, principal) para estudos posteriores. Sua atividade de divagem foi medida na presença de uma concentração de 1 mM de vários metais divalentes e 1 M de NaCI em pH 7,0 e 23°C: metal (min.'1) nenhum n.d.

Mg2+ 2,3x10'3 Mn2+ 6,8x10"3 Zn2+ 4,2x10'2 Pb2+ 1,1 x10'2 Assim, o composto líder é ativo na presença dos quatro metais divalentes, embora tenha sido selecionado quanto à atividade na presença de Mg2+. Ao contrário, as moléculas de DNA que foram selecionadas quanto à atividade na presença de Mn2+, Zn2+ ou Pb2+ não mostraram qualquer atividade na presença de Mg2+.

Além disso, a população de DNAs obtida depois de seis rodadas de seleção in vitro na presença de Mg2+, quando preparada como análogos de DNA contendo fosforotioato mostrou atividade de divagem Mg2+-depen- dente a uma taxa observada de ~10'3 min.'1. Os análogos contendo fosforo-tioato foram preparados enzimaticamente para ter uma configuração Rp em cada estereocentro. Estes compostos são relativamente resistentes à degradação por nucleases celulares comparados com DNA não-modificado. O composto líder foi novamente randomizado em 40 posições de nucleotídeo (sublinhadas), introduzindo mutações a uma freqüência de 15% (5% de probabilidade de cada uma das três substituição de base possíveis). A população novamente randomizada foi submetida a mais sete rodadas de seleção in vitro. Durante as quatro últimas rodadas, as moléculas que eram reativas na presença de 1 mM de Pb2+ foram removidas da população antes que o restante fosse tratado para reagir na presença de 1 mM de Mg2+. Clones individuais foram isolados depois da sétima rodada e a se-qüência de nucleotídeos de 14 desses clones foi determinada. Todas as seqüências começavam com: 5' GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGA TGG CGA CAT CTC (SEQ ID N° 141), e terminavam com: GTG ACG GTA AGC TTG GCA C 3' (SEQ ID N° 142). O segmento do meio, correspondente às 40 posições parcialmente randomizadas (N^, SEQ ID N° 143) variava da seguinte maneira: (4) TAC AGC GAT TCA CCC TTG TTT AAG GGT TAC ACC CAT GTT A (SEQ ID N° 31) (2) ATC AGC GAT TAA CGC TTG TTT CAA TGT TAC ACC CAT GTT A (SEQ ID N° 32) (2) TTC AGC GAT TAA CGC TTA TTT TAG CGT TAC ACC CAT GTT A (SEQ ID N° 33) (1) ATC AGC GAT TCA CCC TTG TTT TAA GGT TGC ACC CAT GTT A (SEQ ID N° 34) (1) ATC AGC GAT TCA CCC TTG TTT AAG CGT TAC ACC CAT GGT G (SEQ ID N° 35) (1) ATC AGC GAT TCA CCC TTG TTT TAA GGT TAC ACC CAT GTT A (SEQ ID N° 36) (1) ATC AGC GAT TAA CGC TTA TTT TAG CGT TAC ACC CAT GTT A (SEQ ID N° 37) (1) ATC AGC GAT TAA CGC TTG TTT TAG TGT TGC ACC CAT GTT A (SEQ ID N° 38) (1) ATC AGC GAT TAA CGC TTA TTT TAG CAT TAC ACC CAT GTT A (SEQ ID N° 39). O número eM parênteses indica o número de clones tendo aquela seqüência particular. Os nucleotídeos mostrados em negrito são aqueles que diferem em comparação com a seqüência líder.

Análise formal da atividade de divagem desses clones está em andamento. A população como um todo mostra atividade de divagem Mg2+-dependente a uma taxa observada de ~10'2 min.'1, com um nível de atividade comparável na presença de Pb2+.

As figuras 6A e 6B oferecem ilustrações bidimensionais de uma molécula de DNA catalítica "progenitora" e uma de várias moléculas de DNA catalíticas obtida pelos métodos de ampliação seletiva aqui descritos, respectivamente. A figura 6A ilustra uma molécula exemplificativa do grupo de partida, mostrando a configuração global das moléculas representadas pela SEQ ID N° 23. Como ilustrado, vários nucleotídeos complementares flan-queiam a região randômica (N40) (SEQ ID N° 143). A figura 6B é uma representação diagramática de uma das moléculas de DNA catalítico Mg2+-dependentes (ou "DNAzimas") geradas pelos procedimentos aqui descritos. A localização do ribonucleotídeo no ácido nu-cléico de substrato está indicada pela seta. (A molécula ilustrada inclui a seqüência aqui identificada como SEQ ID N° 25, bem como as seqüências "inicial” e "terminal" de SEQ ID N° 23.) A atividade de endonuclease continua a ser melhorada em cada uma das "famílias" acima mencionadas por evolução in vitro, como aqui descrito, de modo que se antecipa que moléculas de DNA enzimático de especificidades crescentemente desejáveis podem ser geradas com êxito usando as orientações aqui descritas. 5. Clivaaem de seqüências de RNA maiores Como uma extensão do precedente, desenvolveu-se enzimas de DNA que clivam um substrato de "ail-RNA", ao invés de um único ribonu- cleotídeo encaixado em um substrato de "alI-DNA" como demonstrado acima. (Veja também Breaker et al., Chem. & Biol.. 1:223-229, 1994; Breaker et al., Chem. & Biol.. 2:655-660, 1995). Como seqüência alvo, escolhemos uma extensão de 12 nucleotídeos altamente conservados dentro de uma região U5 LTR de HIV-1 RNA, tendo a seqüência 5' GUAACUAGAGAU 3' (SEQ ID N° 49).

Seguindo-se os métodos descritos nos exemplos anteriores, gerou-se um grupo de 1014 moléculas de DNA que têm a seguinte composição: 5’ - GGAAAA r (GUAACUAGAGAU) GGAAGAGATGGCGAC N50 CGGTAAGCTTGGCAC - 3' (SEQ ID N° 50), onde N é uma mistura equimolar dos desoxirribonucleotídeos G, A, T e C, e onde a seqüência identificada como "r(GUAACUAGAGAU)" é compreendida de ribonucleotídeos. (Opcionalmente, pode-se alterara seqüência de nucleotídeos 5' inicial, por exemplo, adicionando um resíduo dA adicional à seqüência que precede a porção de ribonucleotídeo na extremidade 5', dessa maneira fazendo com que a seqüência inicial passe a ser "GGAAAAA" e fazendo com que a SEQ ID N° 50 tenha 99 resíduos de comprimento. Nitidamente, este é apenas um exemplo das modificações que podem ser feitas para construir moléculas de DNA enzimático específicas, como aqui descrito detalhadamente.) A biblioteca inicial foi gerada por extensão direcionada para gabarito de 50 pmoles de 5'-biotina-d(GGAAAAA)r(GUAACUAGAGAU)d(GGA AGAGATGGCGAC)-3' (SEQ ID N° 144) em 100 pmoles de 5-GTGCCAAG CTTACCG-N50-GTCGCCATCTCTTCC-3' (SEQ ID N° 4) (N = G, A, T ou C), em uma mistura reacional de 50 ul contendo 10 U ul'1 de transcriptase invertida Superscript II (RT; Gibco BRL), 3 mM de MgCI2, 75 mM KCI, 50 mM de Tris*HCI (pH 8,3) e 0,2 mM de cada dTNP. Uma quantidade de traço de pri-mer rotulado com [5-32P] foi incluída na mistura reacional para permitir que a eficiência de extensão seja monitorada. Todos os componentes, com exceção de RT, foram combinados, incubados a 65°C por 5 min., e em seguida resfriados para 45°G por 10 min.. RT foi adicionado e a mistura foi incubada a 45°C por 45 min., e em seguida resfriada bruscamente por adição de Na2 EDTA. NaCI foi adicionado até uma concentração final de 1 M e os produtos de extensão foram imobilizados por passagem repetida através de quatro colunas de afinidade de estreptavidina (Genosys). As colunas foram lavadas com cinco volumes de 100-ul de tampão de lavagem (1 M de NaCI, 50 mM de Tris*HCI (pH 7,5), 0,1 mM de Na2EDTA), seguidos de cinco volumes de 100 ul de NaOH 0,1 N e cinco volumes de 100-ul de tampão de lavagem a 37°C, e em seguida eluídas a 37°C por 1 h com três alíquotas de 20-ul de tampão reacional (10 mM de MgCI2, 1 M de NaCI, 50 mM de Tris*HCI (pH 7,5)). As moléculas eluídas foram recuperadas e ampliadas pela reação de cadeia de polimerase (PCR) usando os primers 5'-biotina-GGAAGAGATGGCGAC-3' (SEQ ID N° 145) e 5'-GTGCCAAGCTTACCG-3' (SEQ ID N° 10). Os produtos de PCR foram imobilizados em colunas de estreptavidina, como acima, que foram lavadas com cinco volumes de 100=ul de tampão de lavagem e eluídas com 40 ul de NaOH 0,1 N para obter o cordão não-biotinilado. Os DNAs isolados foram precipitados em etanol e usados como gabaritos em uma reação de extensão de primer para iniciar a rodada seguinte de seleção. As rodadas 2-10 foram realizadas como acima, exceto que a escala reacional foi reduzida cinco vezes durante a etapa de extensão e duas vezes durante PCR.

As moléculas de DNA enzimático assim produzidas foram selecionadas quanto a sua capacidade de clivar um fosfoéster que se situa dentro da seqüência alvo de RNA encaixada. Dez rodadas de ampliação seletiva in vitro foram realizadas, com base na atividade das moléculas de DNA enzimático na presença de 10 mM de Mg2+ a pH 7,5 e 37°C. Durante o processo de seleção, houve competição para sítios de divagem "preferidos" bem como para o "melhor" catalisador que cliva em cada um de tais sítios preferidos. Surgiram dois sítios e duas famílias de catalisadores como possuidores das capacidades de divagem mais eficientes (veja figura 7). A figura 7 ilustra alguns dos resultados de dez rodadas de ampliação seletiva in vitro realizadas essencialmente como aqui descrito. Como mostrado, surgiram dois sítios e duas famílias de catalisadores apresentando a divagem mais eficiente da seqüência alvo. As condições de divagem foram essencialmente como indicadas na figura 7, a saber, 10 mM Mg2+, pH 7,5 e 37°; os dados colhidos de reação por 2 horas estão mostrados. A divagem (%) está mostrada plotada contra o número de gerações (aqui, 0 a 10). O número/predomínio de moléculas de DNA catalítico capazes de clivar a seqüência alvo nos sítios indicados no substrato está ilustrado pelas barras verticais, com divagem em GÍUAACUAGAGAU mostrada por barras hachuradas, e com divagem em GUAACUA4GAGAU ilustrada pelas barras vazias (levemente sombreadas). Na figura 7, como aqui, a seta (4) indica o sítio entre dois nucleotídeos vizinhos onde ocorre a divagem. Vários indivíduos da população obtida depois das 8a e 10a rodadas de ampliação seletiva foram clonados. As seqüências de nucleotídeos de 29 indivíduos da 8a rodada e 32 indivíduos da 10a rodada foram então determinadas (veja Tabelas 2 e 3, respectivamente).

Sob o título "Seqüência de Nucleotídeos" em cada uma das Tabelas 2 e 3 está mostrada a porção de cada clone identificado que corresponde aos 50 nucleotídeos que foram randomizados no grupo de partida (isto é, NgoíSEQ ID N° 146)); assim, a seqüência de nucleotídeos inteira de um dado clone geralmente inclui a seqüência de nucleotídeos que precede, segue e inclui o segmento "N50" (SEQ ID N° 146), presumindo que a seqüência de substrato está unida e que não ocorrera autoclivagem. Por exemplo, a seqüência inteira de um clone (não-autoclivado) pode geralmente compreender os resíduos n- 1 - 33 da SEQ ID N° 50, seguidos dos resíduos que representam a região N50 (SEQ ID N° 146) randomizada, seguidos os resíduos n- 84 - 98 da SEQ ID N° 50, ou dos resíduos nos 1-34 da SEQ ID N° 51, seguidos dos resíduos que representam a região N50 (SEQ ID N° 146) randomizada, seguidos dos resíduos n- 85 - 99 da SEQ ID N° 51. Acredita-se, no entanto, que a região N50 (SEQ ID N° 146) (ou N^ (SEQ ID N° 143)) -- ou uma porção da mêsma -- de cada clone é particularmente importante para determinação da especificidade e/ou atividade de uma molécula de DNA enzimática particular. Isto é particularmente evidente em reações nas quais o substrato e a DNAzima são moléculas separadas (veja, por exemplo, figs. 8 e 9).

Os números dos clones são designados por 8-x ou 10-x para indivíduos obtidos depois da 8ã ou 10ã rodada, respectivamente. As SEQ ID Nos também estão listadas e correspondem à região "N50" (SEQ ID N° 50) de cada clone.

Tabela 2 Indivíduos Clonados da 8a Rodada de Ampliação Clone N° SEQ ID N° Seqüência de Nucleotídeos "NL," (5'-»3') 8-2 52 CCA ATA GTG CTA CTG TGT ATC TCA ATG

CTG GAA ACA CGG GTT ATC TCC CG 8-4 53 CCA AAA CAG TGG AGC ATT ATA TCT ACT

CCA CAA AGA CCA CTT TTC TCC CG 8-51 54 ATC CGT ACT AGC ATG CAG ACA GTC TGT

CTG CTT TTT CAT TAC TCA CTC CC 8-14 55 CAA TTC ATG ATG ACC AAC TCT GTC AAC

ACG CGA ACT TTT AAC ACT GGC A 8-172 56 CTT CCA CCT TCC GAG CCG GAC GAA GTT

ACT TTT TAT CAC ACT ACG TAT TG 8-3 57 GGC AAG AGA TGG CAT ATA TTC AGG TAA

CTG TGG AGA TAC CCT GTC TGC CA 8-6 58 CTA GAC CAT TCA CGT TTA CCA AGC TAT

GGT AAG AAC TAG AAT CAC GCG TA 8-8 59 CGT ACA CGT GGA AAA GCT ATA AGT CAA

GTT CTC ATC ATG TAC CTG ACC GC 8-10 60 CAG TGA TAC ATG AGT GCA CCG CTA CGA

CTA AGT CTG TAA CTT ATT CTA CC 8-22 61 ACC GAA TTA AAC TAC CGA ATA GTG TGG

TTT CTA TGC TTC TTC TTC CCT GA 8-11 62 CAG GTA GAT ATA ATG CGT CAC CGT GCT

TAC ACT CGT TTT ATT AGT ATG TC 8-21 63 CCC TAC AAC ACC ACT GGG CCC AAT TAG

ATT AAC GCT ATT TTA TAA CTC G 8-12 64 CCA AAC GGT TAT AAG ACT GAA AAC TCA

ATC AAT AGC CCA ATC CTC GCC C

Tabela 2 - Continuação Indivíduos Clonados da 8a Rodada de Ampliação Clone N° SEQ ID N° Seaüência de Nucleotídeos "NL," (5'->3') 8-13 65 CAC ATG TAT ACC TAA GAA ATT GGT CCC

GTA GAC GTC ACA GAC TTA CGC CA 8-23 66 CAC AAC GAA AAC AAT CTT CCT TGG CAT

ACT GGG GAG AAA GTC TGT TGT CC 8-40 67 CAC ACG AAC ATG TCC ATT AAA TGG CAT

TCC GTT TTT CGT TCT ACA TAT GC 8-24 68 CAG AAC GAG GGT CTT GTA AGA CTA CAC

CTC CTC AGT GAC AAT AAT CCT G 8-26 69 CAC TAC AGC CTG ATA TAT ATG AAG AAC

AGG CAA CAA GCT TAT GCA CTG G 8-27 70 GGG TAC ATT TAT GAT TCT CTT ATA AAG

AGA ATA TCG TAC TCT TTT CCC CA 8-28 71 CCA AAG TAC ATT CCA ACC CCT TAT ACG

TGA AAC TTC CAG TAG TTT CCT A 8-29 72 CTT GAA GAT CCT CAT AAG ACG ATT AAA

CAA TCC ACT GGA TAT AAT CCG GA 8-34 73 CGA ATA GTG TCC ATG ATT ACA CCA ATA

ACT GCC TGC CTA TCA TGT TTA TG 8-35 74 CCA AGA GAG TAT CGG ATA CAC TTG GAA

CAT AGC TAA CTC GAA CTG TAC CA 8-36 75 CCA CTG ATA AAT AGG TAA CTG TCT CAT

ATC TGC CAA TCA TAT GCC GTA

8-37 76 CCC AAA TTA TAA ACA ATT TAA CAC AAG

CAA AAG GAG GTT CAT TGC TCC GC 8-39 77 CAA TAA ACT GGT GCT AAA CCT AAT ACC ___________________ TTG TAT CCA AGT TAT CCT CCC CC____________________ 1 idêntica a 10-4,10-40 2 idêntica a 8-20, 8-32, 8-38, 10-1, 10-34; 1 mutação para 10-11; 3 mutações para 10-29.

Tabela 3 Indivíduos Clonados da 10a Rodada de Ampliação Clone N° SEQ ID N° Seqüência de Nucleotídeos "NU" (5'->3') 10-33 78 CCG AAT GAC ATC CGT AGT GGA ACC TTG

CTT TTG ACA CTA AGA AGC TAC AC 10-10 79 CCA TAA CAA ATA CCA TAG TAA AGA TCT

GCA TTA TAT TAT ATC GGT CCA CC 10-12 80 CAG AAC AAA GAT CAG TAG CTA AAC ATA

TGG TAC AAA CAT ACC ATC TCG CA 10-14 81 CCT TTA GTT AGG CTA GCT ACA ACG ATT

TTT CCC TGC TTG GCA ACG ACA C 10-15 82 CTC CCT ACG TTA CAC CAG CGG TAC GAA

TTT TCC ACG AGA GGT AAT CCG CA 10-19 83 CGG CAC CTC TAG TTA GAC ACT CCG GAA

TTTTTCCCC

10-39 84 CGG CAC CTC TAG TTA GAC ACT CCG GAA

TTT TAG CCT ACC ATA GTC CGG T 10-23 85 CCC TTT GGT TAG GCT AGC TAC AAC GAT

TTT TCC CTG CTT GAA TTG TA

10-274 86 CCC TTT GGT TAG GCT AGC TAC AAC GAT

TTT TCC CTG CTT GAC CTG TTA CGA 10-31 87 CCT TTA GTT AGG CTA GCT ACA ACG ATT

TTT CCC TGC TTG GAA CGA CAC

10-18 88 CAT GGC TTA ATC ATC CTC AAT AGA AGA

CTA CAA GTC GAA TAT GTC CCC CC 10-20 89 CAA CAG AGC GAG TAT CAC CCC CTG TC A

ATA GTC GTA TGA AAC ATT GGG CC 10-6 90 TAC CGA CAA GGG GAA TTA AAA GCT AGC

TGG TTA TGC AAC CCT TTT CGC A 10-7 91 CTC GAA ACA GTG ATA TTC TGA ACA AAC

GGG TAC TAC GTG TTC AGC CCC C

Tabela 3 - Continuação Indivíduos Clonados da 10a Rodada de Ampliação Clone N° SEQ ID N° Seqüência de Nucleotídeos "NL·" (5'—>3') 10-8 92 CCA ATA ACG TAA CCC GGT TAG ATA AGC

ACT TAG CTA AGA TGT TTA TCC TG 10-16 93 CAA TAC AAT CGG TAC GAA TCC AGA AAC

ATA ACG TTG TTT CAG AAT GGT CC 10-21 94 GCA ACA ACA AGA ACC AAG TTA CAT ACA

CGT TCA TCT ATA CTG AAC CCC CA 10-24 95 CCT TTG AGT TCC TAA ATG CCG CAC GGT

AAG CTT GGC ACA CTT TGA CTG TA 10-28 96 CAA AGA TCT CAC TTT GGA AAT GCG AAA

TAT GTA TAT TCG CCC TGT CTG C 10-33 97 CCA CGT AGA ATT ATC TGA TTT ATA ACA

TAA CGC AGG ATA ACT CTC GCC CA 10-35 98 CAC AAG AAA GTG TCG TCT CCA GAT ATT

TGA GTA CAA GGA ACT ACG CCC

10-36 99 CAT GAA GAA ATA GGA CAT TCT ACA GGC

TGG ACC GTT ACT ATG CCT GTA GG 10-37 100 CAT AGG ATA ATC ATG GCG ATG CTT ATG

ACG TGT ACA TCT ATA CCT T

10-38 101 CAG ATG ATC TTC CTT TAA AGA CTA CCC

______________________ TTT AAA GAA ACA TAA GGT ACC CC 31 mutação para 10-5 41 mutação para 10-30 A atividade de autoclivagem de vários clones foi subseqüente-mente medida. Foi verificado que os clones 8-5, 8-17 e 10-3 clivam eficientemente no sítio 5' GUAACUÍAGAGAU 3' (SEQ ID N° 49), ao passo que foi verificado que os clones 10-14, 10-19 e 10-27 clivam eficientemente o sítio 5’ GlUAACUAGAGAU 3' (SEQ ID N° 135). Quando a porção de RNA da molécula foi estendida até a seqüência 5' GGAAAAAGUAACUAGAGAUGG AAG 3' (SEQ ID N° 135), os clones 8-17, 10-14 e 10-27 retiveram toda a atividade, ao passo que os clones 8-5, 10-3 e 10-19 mostraram atividade reduzida. Subseqüentemente, verificou-se que o clone 10-23 apresentava um alto nível de atividade na reação de autoclivagem envolvendo o domínio de RNA estendido.

Também deve ser observado, no caso de um versado na técnica não avaliar, que as seqüências de nucleotídeos precedentes e subseqüen-tes aos segmentos "N50" (SEQ ID N° 146) das moléculas de polinucleotídeo construídas de acordo com os ensinamentos da presente invenção, isto é, as regiões de ligação a substrato flanqueando a região "N50" (SEQ ID N° 146), podem ser alteradas de várias maneiras para gerar moléculas de DNA enzimático de especificidades particulares, tais como por comprimento, se-qüência de nucleotídeos, tipo de ácido nucléico e outros. Por exemplo, embora os resíduos n- 1-24 da SEQ ID N° 51 estejam aqui descritos como nucleotídeos de RNA, eles podem alternativamente compreender DNA, RNA ou compósitos dos mesmos. (Assim, por exemplo, a SEQ ID N° 51 poderia ser facilmente alterada para que os resíduos de ácido nucléico nos 1-7 compreendessem DNA, os resíduos noS 8-19 compreendessem RNA, os resíduos nos 20-99 compreendessem DNA e assim por diante.) De maneira similar, os nucleotídeos subseqüentes à região "N50" (SEQ ID N° 146) podem compreender RNA, DNA ou compósitos dos mesmos. O comprimento das regiões precedentes e subseqüentes à(s) região(ões) ''N50" (SEQ ID N° 146) (ou "N^" (SEQ ID N° 143) -- veja exemplo 4) também pode ser variado, como aqui descrito. Além disso, as seqüências precedentes e/ou subseqüentes às regiões N50(SEQ ID N° 146) ou N40(SEQ ID N° 143) podem ser encurtadas, expandidas ou deletadas em sua totalidade.

Além disso, como observado acima, selecionamos uma região específica de HIV-1 RNA como a seqüência alvo nos métodos descritos neste exemplo; tal seqüência não é a única seqüência que pode ser usada como alvo. Nitidamente, um versado na técnica pertinente pode seguir nossos ensinamentos dados nesta invenção para construir e desenhar moléculas de DNA enzimático com especificidade para outras seqüências alvo. Como aqui descrito, tais seqüências alvo podem ser construídas ou inseri- das em seqüências maiores compreendendo DNA, RNA ou compósitos dos mesmos, como ilustrado pelas SEQ ID Nos 50 e 51. A reação de autoclivagem foi facilmente convertida em uma reação de divagem intermolecular dividindo os domínios de enzima e de substrato em moléculas separadas. Os clones 8-17 e 10-23 foram escolhidos como moléculas protótipos. Os dois mostraram agir como enzimas de DNA na divagem de um substrato de RNA separado em uma reação que prossegue com múltiplos "turnovers" (figura 8). Os braços de ligação do substrato foram subseqüentemente reduzidos para 7 pares de base em cada lado do nucleotídeo não-pareado que demarca o sítio de divagem (figura 9). A figura 8 ilustra as seqüências de nucleotídeos, sítios de divagem e taxas de "turnover" de duas moléculas de DNA catalítico da presente invenção, os clones 8-17 e 10-23. As condições reacionais foram como mostradas, isto é, 10 mM de Mg2+, pH 7,5 e 37°C. A DNAzima identificada como clone 8-17 está ilustrada à esquerda, com o sítio de divagem do substrato de RNA indicado pela seta. A seqüência de substrato (5'-GGAAAA AGUAACUAGAGAUGGAAG-3' (SEQ ID N° 135)) - que é separada da DNAzima (isto é, divagem intermolecular está mostrada) - está marcada como tal. De maneira similar, a DNAzima aqui identificada como 10-23 está mostrada à direita, com o sítio de divagem do substrato de RNA indicado pela seta. Mais uma vez, a seqüência de substrato está indicada. Para a enzima 8-17, a taxa de "turnover" foi de aproximadamente 0,6 h'1; para a enzima 10-23, a taxa de "turnover" foi de aproximadamente 1 h'1.

Como ilustrado na figura 8, a seqüência de nucleotídeos da molécula de DNA catalítica do clone 8-17 capaz de clivar uma molécula de substrato separada foi como segue: 5'-CTTCCACCTTCCGAGCCGGACGA AGTTACI I I I 1-3' (SEQ ID N° 134). Nessa mesma figura, a seqüência de nucleotídeos da molécula de DNA catalítica do clone 10-23 capaz de clivar uma molécula de substrato separada foi a seguinte: 5'-CTTTGGTTAGGCT AGCTACAACGATTTTTCC-3' (SEQ ID N° 136). A figura 9 ilustra ainda as seqüências de nucleotídeos, sítios de divagem e taxas de "turnover" de duas moléculas de DNA catalítico da pre- sente invenção, os clones 8-17 e 10-23. As condições reacionais foram como mostradas, isto é, 10 mM de Mg2+, pH 7,5 e 37°C. Como mostrado na figura 8, a DNAzima identificada como clone 8-17 está ilustrada à esquerda, com o sítio de divagem do substrato de RNA indicado pela seta. A seqüên-cia de substrato (5'-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3' (SEQ ID N° 135)) -- que é separada da DNAzima (isto é, divagem intermolecular está mostrada) -- está marcada como tal. De maneira similar, a DNAzima aqui identificada como 10-23 está mostrada à direita, com o sítio de divagem do substrato de RNA indicado pela seta. Mais uma vez, a seqüência de substrato está indicada. Para a enzima 8-17, "kobs" foi de aproximadamente 0,002 min.'1; para a enzima 10-23, o valor de "kobs" foi de aproximadamente 0,01 min.'1.

Como ilustrado na figura 9, a seqüência de nucleotídeos da molécula de DNA catalítica do clone 8-17 capaz de clivar uma molécula de substrato separada foi a seguinte: 5'-CCACCTTCCGAGCCGGACGAAGTTACT-3' (SEQ ID N° 138). Nessa mesma figura, a seqüência de nucleotídeos da molécula de DNA catalítica do clone 10-23 capaz de clivar uma molécula de substrato separada foi a seguinte: 5'-CTAGTTAGGCTAGCTACAACGATTT 11CC-3’ (SEQ ID N° 137) (resíduos nos 5-33 da SEQ ID N° 85, com "CTA" substituído por "TTG" na extremidade 5'). A taxa catalítica das enzimas de DNA que clivam RNA ainda não foi totalmente otimizada. Como discutido acima e como relatado em estudos anteriores, pôde-se melhorar a taxa catalítica randomizando parcialmente a molécula protótipo e realizando rodadas adicionais de ampliação seletiva. Descobriu-se, no entanto, que a Km para Mg2+ é aproximadamente 5 mM e 2 mM para as enzimas de DNA 8-17 e 10-23, respectivamente, medida a pH 7,5 e 37°C; isto é certamente compatível com as condições intracelulares. 6. Preparação de uma Enzima de Substrato Universal O precedente mostrou que uma enzima da presente invenção tem a capacidade de clivar cataliticamente ácidos nucléicos alvos tendo se- qüências pré-selecionadas. Além disso, foi mostrado que uma enzima cliva um ácido nucléico que é "ail-DNA", ou que tem um ribonucleotídeo (isto é, um componente de RNA) encaixado dentro de uma seqüência de desoxirri-bonucleotídeos (isto é, DNA), ou que é inteiramente DNA. Além disso, é visto que o substrato pode ser alterado e é preparada uma enzima que pode clivar o substrato.

Pela presente invenção, é fornecida uma enzima que pode clivar qualquer substrato alvejado, isto é, uma enzima contendo uma seqüência de nucleotídeos pré-selecionada na faixa de comprimento de cerca de 10 - 30 nucleotídeos, de uma maneira cinética que é eficiente e específica em condições fisiológicas. Esta enzima é de produção fácil e econômica, e é útil para inativação de RNA alvo, particularmente RNA mensageiro (mRNA), para sondar a estrutura de RNA e para a manipulação de RNA recombinante, tal como uma endorribonuclease específica para seqüência.

Para inativação de RNAs, a enzima é particularmente útil para inativação de RNAs celulares alvos, tal como um oligodesoxinucleotídeo "anti-sentido" pode ser usado, para bloquear a função de mRNA. No entanto, a presente enzima é superior a um reagente anti-sentido porque a presente enzima oferece reconhecimento e divagem do alvo, e pode funcionar com "turnover" catalítico, ao passo que uma molécula anti-sentido só oferece reconhecimento de maneira equimolar (isto é, não catalítica), e precisa contar com outras enzimas celulares para as reações de inativação de RNA. A seção a seguir descreve a preparação de enzimas melhoradas com base nos motivos "10-23" e "8-17" descritos acima. Estas enzimas melhoradas são enzimas genéricas que podem clivar qualquer seqüência alvo pré-selecionada, e cuja especificidade alvo depende unicamente da seqüência das regiões de ligação a substrato da enzima, como descrito mais adiante.

Como descrito no exemplo 5 acima, dois motivos, designados "10-23" e "8-17", foram identificados durante rodadas consecutivas de ampliação seletiva e novamente remodelados em uma reação de divagem in-termolecular, e mostraram funcionar eficientemente desta maneira.

Foram conduzidos estudos posteriores usando uma reação que produziu divagem catalítica específica para sítio da molécula de substrato separada mostrada na figura 9 (isto é, divagem intermolecular) em condições fisiológicas simuladas de 2 mM MgCI2, 150 mM KCI, pH 7,5, 37°C, para uma taxa de cerca de k^ = 0,01 min.'1. A divagem ocorreu depois de um nucleotídeo de purina não-pareada do substrato que era flanqueado por oligonucleotídeos complementares à enzima. Os produtos de divagem 5' e 3’ continham um 2'(3') fosfato e 5' hidroxila, respectivamente, indicativos de um mecanismo reacio-nal envolvendo ataque por um 2-| hidroxila em um fosfato adjacente. Para ambas as enzimas de motivos 8-17 e 10-23, a seqüência do substrato pode ser alterada sem perda de atividade catalítica, desde que os braços de ligação a substrato da enzima sejam alterados de forma complementar. A enzima 8-17 tinha uma exigência especial para um par "oscilante" rG-dT localizado imediatamente a jusante do sítio de divagem. A substituição de um par Watson-Crick nesta posição eliminou a atividade catalítica. Os braços de ligação a substrato da enzima 10-23 interagiram com o substrato inteira-mente através do par Watson-Crick padrão. O núcleo catalítico das enzimas de motivo 8-17 e 10-23, localizado entre os dois braços de ligação a substrato, continha 13 e 15 desoxinucleotídeos, respectivamente.

Para definir mais precisamente as exigências de seqüência do núcleo catalítico, uma biblioteca de IO14 variantes de cada motivo foi gerada, introduzindo mutações randômicas a uma freqüência de 25% por posição de nucleotídeo em todo o núcleo. Cada biblioteca foi submetida a seis protocolos de seleção in vitro diferentes, envolvendo um total de 52 rodadas de ampliação seletiva. O método e a severidade de seleção foram variados para realizar um exame completo das sequências relacionadas com as duas moléculas protótipos. Indivíduos das populações selecionadas foram clonados, seqüenciados e testados quanto à atividade catalítica. Este procedimento foi realizado da seguinte maneira.

As re-seleções com base nas moléculas de 8-17 e 10-23 envolveram seis linhagens diferentes para cada motivo. Cada linhagem acarretou 5-21 rodadas de seleção in vitro, diferindo quanto ao protocolo de seleção e os tempos de reação. Todas as reações de divagem foram realizadas em 2 mM de MgCI2, 150 mM de NaCI e 50 mM de Tris*HCI (pH 7,5) a 37°C. Os tempos de reação variaram de 60 min. nas primeiras rodadas a 1 min. nas últimas rodadas. Cada grupo de partida de gabaritos foi baseado em uma seqüência complementar ao protótipo, com braços de ligação fixos de sete nucleotídeos cada e um núcleo catalítico randomizado para 25% de degene-ração em cada posição do nucleotídeo. Para os motivos 8-17 e 10-23, os gabaritos tinham a seqüência 5'-gtgccaagcttaccgagtaactTCG-TCCGGCTC GGRagatgggtcgtctgtccttccATCTCTAGTTACTTTTTC-3' (SEQ ID N° 124) e 5'-gttgccaagcttaccg-ggaaaaaTCGTTGTAGCTAGCCtaactaggtcgtctgtccttccAT CTCTAGTTACl l l l IC-3' (SEQ ID N° 125), respectivamente (sítios de primer de PCR em caixa baixa; os braços de ligação a substrato sublinhados; posições randomizadas em itálico). O primer usado nas extensões direcionadas para gabarito tinham a seqüência 5'-biotina-r(GGAAAAA-GUAACUAG AGAUGG)d(AAGAGATGGCGAC)-3' (SEQ ID M° 132). Os primeres de PCR para as seleções com base em 8-17 foram 5-GTGCC AAGCTTACCGAGT AACT-3' (SEQ ID N° 147) e 5'-d(GGAAGGACAGACGACC-CATC)rU (SEQ ID N° 148) e para as seleções com base em 10-23 foram 5'-GTGCCAAGCT TACCGGGAAAAA-3' (SEQ ID N° 127) e 5'-d(GGAAGGACAGACGACCTA GTT)rA (SEQ ID N° 149). Os primeres de PCR incluíam os braços de ligação, dessa forma fixando estas seqüências. Um dos primeres de PCR em cada grupo continha um ribonucleotídeo 3'-terminal, permitindo isolamento do cordão de gabarito dos produtos de PCR de cordão duplo por hidrólise alcalina do cordão de não-gabarito e subseqüente purificação por eletrofore-se em poliacrilamida gel. Um esquema de seleção à base de gel foi empregado em algumas linhagens. Nesses casos, os primeres de PCR foram 5'-biotina-GTGCCAAGCTTACCG-3' (SEQ ID N° 150) e 5-GAAAAAGTAACTA GAGATGGAAGGACAGACGACC-3' (SEQ ID N° 129) e as reações de extensão foram realizadas sobre o suporte sólido usando o primer 5'-r(GGAAA AAGUAACUAGAGAUGGAAG)-3' (SEQ ID N° 135). Uma quantidade de traço de [a-32P]-dATP foi incluída na mistura para marcar os produtos de ex- tensão, que foram eluídos com álcali, purificados por purificação em polia-crilamida gel desnaturante, e recuperados por eletroeluição. As moléculas foram então reagidas e as que sofreram divagem foram isoladas por eletro-forese em gel.

Depois da oitava e décima rodadas da seleção inicial, moléculas individuais foram clonadas e seqüenciadas, como descrito acima. 0 17° clone da rodada 8 (8-17) e o 23° clone da rodada dez (10-23) tinham a seqüên-cia 5'-cacggttcga-atggcGTTATGCATCACACTATTTTTCATTGAAGCAGGC CGAGCCTT CCACCTTCcagcggtag-agaagg-3' e 5'-cacggttcgaatggcAT GTT AAGTTCGTCCCTTTTTAGCAACATCGATCGGATT-GGTTTCCCcagcggtag agaagg-3', respectivamente (sítios de primer em caixa baixa; braços de ligação a substrato sublinhados). Para a reação intermolecular, oligodesoxi-nucleotídeos sintéticos foram preparados com base nas seqüências clonadas porém sem as regiões externas dos braços de ligação a substrato. Estes foram usados para clivar um substrato de "alI-RNA" tendo a mesma se-qüência que o primer usado para construir a biblioteca inicial (veja acima). Subseqüentemente, os braços de ligação a substrato da enzima de DNA foram reduzidos para sete nucleotídeos cada e tornadas perfeitamente complementares ao substrato de RNA.

No caso da enzima 8-17, a variação de seqüência entre os indivíduos clonados sugeriu que o núcleo catalítico consistisse em um tronco-laço (tronco-loop) interno curto seguido de uma região não-pareada de 4 - 5 nucleotídeos (figura 10). O tronco sempre continha três pares de base, dos quais pelo menos dois eram G-C. O laço era variante, tendo a seqüência 5'-AGC-3’. Construções sintéticas nas quais o tronco foi alongado ou a seqüência do laço foi alterada não apresentaram atividade catalítica. A região não-pareada, conectando a metade 3' do tronco ao domínio de ligação a substrato a jusante tinha a seqüência 5'-WCGR-3' ou 5'-WCGAA-3' (W = A ou T; R = A ou G). Variantes tendo a seqüência 5'-TCGAA-3' nesta região apresentaram o nível mais alto de atividade catalítica, porém esta intensificação em relação à enzima 8-17 não foi generalizada para outras seqüências de substrato. A oitava posição de nucleotídeo do núcleo catalítico do motivo de enzima 10-23 permite variação seja como T, C ou A, embora um T nesta posição (como no protótipo) oferecesse o nível mais alto de atividade. Um exame de numerosas combinações diferentes de substrato de RNA e enzima de DNA complementar correspondente na região de ligação a substrato descreveu-se que o motivo 10-23 era generalizável em relação a qualquer seqüência de substrato.

As atividades catalíticas para as variantes de motivo 10-23 e 8-17 foram então medidas usando reações de múltiplos "turnovers", tipicamente apresentando < 20% de variação para experiências idênticas realizadas em dias diferentes. Os valores cinéticos obtidos em experiências de um "turnover" e de múltiplos "turnovers" foram semelhantes; os valores obtidos com substratos de RNA sintético foram ligeiramente menos favoráveis que aqueles obtidos com substratos transcritos in vitro. Os valores de kcat e Km descritos foram determinados a partir da intercepção em y e da curva de negativa, respectivamente, da linha mais adequada para um gráfico de Ea-die-Hofstee de "kobs" vs. "kobs'7[S]. Cada gráfico consistia de dez pontos de dados para uma faixa de [S] que atravessa Km, com [S] em um excesso em 10 vezes em relação a [E]. Os valores de "kobs" foram tipicamente baseados em cinco pontos de dados obtidos nos primeiros 10% da reação. Moléculas de substrato e de enzima foram pré-incubadas separadamente por 10 min. em um tampão reacional, e em seguida combinadas para iniciar a reação. Todas as reações foram realizadas na presença de 0,01% de dodecil sulfato de sódio para impedir a aderência de material às paredes do vaso. O pH foi mantido por adição de 50 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-piperazina-1-propanossulfônico. Os valores cinéticos não dependeram da identidade do tampão. Os produtos reacionais foram separados por eletroforese em um poliacrilamida gel desnaturante a 20% e quantificados usando um imagea-dor de fósforo (phosphorimager). A divagem ocorreu no lado 3' de um único nucleotídeo não pa-reado, de preferência uma purina, que foi seguido de uma pirimidina. Sítios alvos circundados por A e U foram clivados mais eficientemente, com uma taxa catalítica de aproximadamente 0,1 min-1 em condições fisiológicas simuladas.

Uma enzima de DNA que cliva RNA em um sítio A*U pode ser usada para alvejar qualquer códon de partida de mRNA (A*UG). Como um caso de teste, foram preparadas versões transcritas tanto sintéticas como in vitro de um RNA 17mer correspondente à região de início de translação de HIV-1 gag/ pol mRNA (5'-GGAGAGAGA*UGGGUGCG-3'). Ambas as versões do substrato foram clivadas na posição esperada pela enzima de DNA 10-23 correspondente, em uma reação que prosseguiu com um kcat de 0,15 min.-1 e Km de 0,47 nM em condições fisiológicas simuladas (eficiência catalítica, kcat/Km = 3,2 x 108 M-1 min.-1) (figura 11). A taxa catalítica aumentava com uma faixa de concentração de MgCI2 crescente de 1 - 250 mM, com um Km aparente para Mg2+ de 180 mM a um pH 7,5 e 37°C. A taxa catalítica aumentava de forma grosseiramente log-linear com um pH crescente na faixa de 7,0 - 8,5 consistente com um mecanismo reacional envolvendo desprotonação da 2-hidroxila que se situa adjacente ao fos-foéster clivado. Na presença de 50 mM de MgCI2 a um pH 8,0 e 37°C, condições que são úteis na manipulação de laboratório de RNA, kcat foi de 3,4 min.-1 e Km foi de 0,76 nM. A eficiência catalítica da enzima de DNA 10-23, tanto em condições fisiológicas como de laboratório, é superior àquelas enzimas de RNA de divagem de RNA, conhecidas. Comparada com a proteína enzima ribonuclease A, a enzima de DNA tem um kcat ~104 vezes menor porém um Km ~105 vezes mais favorável. A enzima 10-23 pode ser usada para clivar uma variedade de RNAs biologicamente importantes. Preparou-se substratos de RNA sintético correspondentes aos nucleotídeos 15-17 que circundam o sítio de início de translação de HIV-1 gag/pol, env, vpr, tat, nef IGF-R e E100 ligase mRNA. Cada um foi clivado na posição esperada por uma enzima de DNA sintética que continha o núcleo catalítico 10-23 flanqueado por braços de ligação a substrato de 7 a 12 nucleotídeos cada (Tabela 4). Em todos os casos a taxa catalítica foi de cerca de 0,1 min.-1 em condições fisiológicas simuladas. Os valores para Km, no entanto, variavam com a composição do nucleotídeo do substrato. Para o substrato gag/pol rico em guanosina, Km foi < 1 nM quando foram empregados braços de ligação a substrato de 7 ou 8 nucleotídeos. Os substratos env e vpr foram clivados com um Km muito menos favorável quando foram usados os braços de ligação de 7 nucleotídeos, porém Km melhorou substancialmente quando os braços foram aumentados para 8 nucleotídeos cada.

Tabela 4 Clivaqem catalisada com DNA de vários substratos de RNA em condições fisiológicas simuladas Gene SEQ Seaüência Comprimento kcat Km HIV-1 ID N° 'Alvo do Braco (min-1) (nM) gag 102 GGAGAGAGA*UGGGUGCG 8+8 0,1 0,7 gag 103 GAGAGAGA*UGGGUGC 7+7 0,1 0,9 env 104 CAGUGGCAA*UGAGAGUG 8+8 0,04 9 env 105 AGUGGCAA*UGAGAGU 7+7 0,03 900 vpr 106 GAGGAUAGA*UGGAACAA 8+8 0,01 20 vpr 107 AGG AU AG A*U G G AACA 7+7 0,08 500 tat 108 GCAAGAAA*UGGAGCC 7+7 0,04 300 nef 109 CUAUAAGA*UGGGUGA 7+7 0,05 900 FIV gag 110 UACAGCAACA*UGGGGAAUGG 9+10 0,005 8 gag 111 CAUGGGGAA*UGGACAGGG 8+9 0,006 5 IGF-R 112 CAAAUAAAAGGGA*UGAAGUCUGG 12+10 0,02 20 113 AAGGAAUGAAG*UCUGGCUCCG 10+10 0,3 50 114 AUACCGCAAAG*UCUUUGAGAAUU 10+12 0,1 30 115 AAGUCUUUGAGAG*UUUCCUGCAC 12+10 0,05 21 116 AACACCACCA*UGUCCAGCC 9+9 0,06 2 117 GGCCUUUCACA*UUGUACCGC 10+9 0,1 10 118 UUGUACCGCA*UCGAUAUCCAC 9+11 0,06 1 E100 ligase 119 G AACAU U ACAU U A*U AG U G ACCAG 12+10 1,0 80 Os valores cinéticos medidos e mostrados na Tabela 4 foram obtidos em condições de múltiplos "turnovers", com substrato de RNA sintético em um excesso de 10 vezes em relação à enzima de DNA sintética, usando as condições reacionais: 2 mM de MgCI2,150 mM de NaCI, pH 7,5, 37°C, obtidos a 25 mM de MgCI2.

Como uma outra demonstração da variação para a região de ligação a substrato (braços) que uma enzima de DNA da presente invenção pode suportar, o comprimento dos braços foi sistematicamente variado de 4 a 13 resíduos de nucleotídeo usando a seqüência de nucleotídeos alvo do códon inicial do gene HIV-1 gag mostrada na Tabela 4. A reação foi realizada separadamente para cada construção de enzima de DNA preparada como descrito acima, exceto que o comprimento do braço foi variado como mostrado na figura 13. As propriedades cinéticas da enzima de DNA catalítica foi medida como anteriormente nas condições de 2 mM de Mg+2, 150 mM de NaCI, pH 7,5, 37°C e medindo o "turnover" múltiplo da enzima. Tanto a kcat (min.'1) como Km (nM) foram medidas, e estão mostradas na figura 13 usando o motivo 10-23 modificado para ligação complementar ao gene HIV-1 gag.

Os resultados mostram que taxas catalíticas úteis são observadas em toda a faixa de 5 a 13 nucleotídeos por braço por região de ligação a substrato, com uma faixa preferida de 7 a 10 nucleotídeos sendo particularmente eficiente. Os resultados também mostram que a concentração eficaz de enzima para catálise meio máxima (Km) varia na faixa de 1000 a 0,05 na-nomolar (nM) para braços de 5 a 13 nucleotídeos de comprimento, com comprimentos de 7 a 13 particularmente preferidos. Várias modificações foram incorporadas na enzima de DNA 10-23 e testadas quanto à estabilidade em soro bovino fetal a 10% (figura 13). Estas modificações incluíram: 1) um timidilato (3,,3'-ligado) "invertido" na extremidade 3' do DNA; 2) cinco resíduos 2'-0-metila na extremidade distai de ambos os braços de ligação a substrato; 3) resíduos 2-O-metil em todas as posições em ambos os braços de ligação a substrato; 4) resíduos fosforo-tioato nos cinco sítios de pirimidina-pirimidina no interior do núcleo catalítico; 5) três resíduos fosforotioato na extremidade distai de ambos os braços de ligação a substrato. A melhor proteção foi dada pelo timidilato invertido (t1/2 > 60 min.). Todas as outras modificações resultaram em estabilidade de soro melhorada comparada com o DNA não modificado, com exceção das cinco substituições P=S no núcleo. Todas as enzimas de DNA modificadas retiveram a atividade catalítica.

Assim, a invenção descreve uma molécula de DNA catalítica tendo atividade de endonuclease específica para sítio que pode ser criada para clivar qualquer seqüência de ácidos nucléicos de substrato pré-selecionada. A molécula de DNA (enzima) tem primeira e segunda regiões de ligação a substrato (braços) flanqueando uma região de núcleo, e cada braço tem uma seqüência complementar a uma porção da seqüência de ácidos nucléicos de substrato alvo, de modo que, juntos, os primeiro e segundo braços definem a seqüência de ácidos nucléicos de substrato a ser clivada. Por complementar entende-se que as regiões de ligação a substrato se ligam à seqüência alvo usando formação de pares de base de Watson-Crick convencional.

Os braços podem ter qualquer de uma variedade de comprimentos. No entanto, como observa-se que o comprimento afeta a taxa catalítica (kcat) e a concentração eficaz (Km) da enzima (veja figura 12), os comprimentos de braço preferidos variam de 5 a 13 nucleotídeos de complementaridade cada, de preferência cerca de 6 a 11 nucleotídeos, e mais preferivelmente cerca de 7 a 10 nucleotídeos de comprimento. A região de núcleo pode ter uma variedade de seqüências com base na fórmula: (I.) T(tronco)'AGC(tronco)"Z, onde cada um de (tronco)' e (tronco)" são três nucleotídeos seqüenciais que quando hibridizados como um par (tronco)':(tronco)" compreendem três pares de base incluindo pelo menos dois pares G:C e onde Z = WCGR ou WCGAA, eW = AouTeR = AouG. Esta estrutura de tronco ("tronco") está mostrada na figura 10 e ilustra três pares de nucleotídeos complementares. Particularmente preferida é a estrutura de protótipo da região de núcleo do motivo 8-17 "TCCGAGCCGGACGA" (SEQ ID N° 120) mostrada na figura 10.

Em uma outra modalidade, uma região de núcleo pode ter a sequência de acordo com a fórmula: (II.) RGGCTAGCXACAACGA (SEQ ID N° 122), onde X = T, C ou A, e R = A ou G. Particularmente preferida é a estrutura de protótipo da região de núcleo do motivo 10-23, "RGGCTAGCTACAACGA" (SEQ ID N° 121) mostrada na figura 10.

Uma enzima de DNA com o desenho acima pode apresentar uma gama de taxas catalíticas úteis e concentrações catalíticas eficazes dependendo do comprimento do braço, como observado na figura 12. Uma enzima de DNA desta invenção de acordo com o motivo 8-17 ou 10-23 tipicamente tem uma taxa de "turnover" catalítica (kcat) de cerca de 0,005 a 0,1 min.'1, de preferência cerca de 0,01 a 0,1 min.'1, e mais preferivelmente cerca de 0,03 a 0,1 min.1, em condições fisiológicas. Uma enzima particularmente preferida tem uma taxa de cerca de 0,1 min.'1. Uma enzima de DNA desta invenção de acordo com o motivo 8-17 ou 10-23 tipicamente também tem uma concentração eficaz catalítica meio máxima (Km) de cerca de 0,05 a 1000 nanomolar (nM), de preferência cerca de 0,7 a 900 nM, mais preferivelmente menos de cerca de 1,0 micromolar (uM), e ainda mais preferivelmente cerca de 0,1 (uM), em condições fisiológicas. O precedentemente exposto também demonstra que uma enzima de DNA preferida tem modificações no nucleotídeo que estabilizam a enzima de DNA para uso em condições fisiológicas. Qualquer uma de várias modificações pode ser utilizada desde que a enzima retenha sua atividade catalítica como definido e medido nesta invenção, e portanto a invenção não precisa estar assim limitada a uma modificação de estabilização particular. Modificações preferidas levam a uma molécula de DNA objeto menos suscetível à digestão nucleolítica exo ou endo. Em uma modalidade, a modificação compreende a incorporação de um ou mais resíduos de nucleosídeo fosforotioato, tal como descrito por Zhang et al., Biochem. Pharmacol., 50:545-556 (1995) ou por Stein, C. A., Trends Biotechnol.. 14:147-149 (1996). O resíduo fosforotioato pode estar nos braços ou no núcleo, e em uma modalidade pode compreender um resíduo em uma dipirimidina no interior do núcleo. Uma outra modificação compreende a substituição de um grupo O-metila na posição 2' do componente ribose ou desoxirribose do nu-cleotídeo de açúcar, para formar um 2' O-metil ribonucleotídeo, como conhecido e descrito por Zhang et al., acima. Uma modificação adicional é prender um nucleotídeo terminal invertido à extremidade 3' da molécula de DNA, de modo que a extremidade 3' fica bloqueada, aparecendo como uma extremidade 5' livre. Esta estrutura bloqueia 3' endonucleases, e é produzida por formação de um nucleotídeo 3'-3' ligado na extremidade 3' (isto é, um nucleotídeo invertido). A preparação de um nucleotídeo invertido 3' na extremidade 3' é bastante conhecida, e ele é preparado usando um suporte sólido modificado em síntese de oligonucleotídeo tendo um resíduo 3' terminal invertido como material de partida. Um material de suporte sólido preferido para tal é dT-5'-CPG 500, disponível em Glen Research (Sterling, VA) e é uma resina de vidro de poro controlado modificada tendo o resíduo modificado. O relatório descritivo precedente, incluindo as modalidades e exemplos específicos, destina-se a ser ilustrativo da presente invenção e não deve ser tomado como limitativo. Numerosas outras variações e modificações podem ser efetuadas sem que se saia do verdadeiro espírito e escopo da presente invenção.

Claims

1. Molécula de DNA catalítica de fita simples, caracterizada pelo fato de possuir atividade de endonuclease sítio específica, específica para uma seqüência de nucleotídeos definindo um sítio de divagem em uma se-qüência de ácidos nucléicos de substrato pré-selecionada, a referida molécula tendo primeira e segunda regiões de ligação a substrato flanqueando uma região de núcleo, em que a referida primeira região de ligação a substrato tem uma seqüência complementar a uma primeira porção da referida seqüência de ácidos nucléicos de substrato pré-selecionada, a referida segunda região de ligação a substrato tem uma seqüência complementar a uma segunda porção da referida seqüência de ácidos nucléicos de substrato pré-selecionada, e a referida primeira ou segunda região de ligação a substrato tem de 5 a 13 nucleotídeos de comprimento, e a referida região de núcleo tendo uma seqüência de acordo com a fórmula: (I.) T(tronco)'AGC(tronco)"Z, em que a fórmula (I) não inclui a SEQ ID NO:120, e em que cada um dos referidos (tronco)' e (tronco)" são três nucleotídeos se-qüenciais que quando hibridizados como um par (tronco)':(tronco)" compreendem três pares de base incluindo pelo menos dois pares G:C e em que o referido Z = WCGR ou WCGAA, e W = A ou T e R = A ou G; ou (II.) RGGCTAGCHACAACGA (SEQ ID N° 122), em que a fórmula (II) não inclui a SEQ ID NO:121, e em que o referido Η = T, C ou A e R = A ou G.

2. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de DNA catalítica compreende desoxirribonucleotídeos (DNA), DNA modificado, análogos de nu-cleotídeo ou compósitos dos mesmos.

3. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido ácido nucléico de substrato com- preende RNA, DNA, RNA modificado, DNA modificado, análogos de nucleo-tídeo ou compósitos dos mesmos.

4. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido desoxirribonucléico de fita simples tendo terminais 5' e 3', onde os referidos terminais são modificados com nucleotídeos resistentes à exonuclease.

5. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que os referidos nucleotídeos resistentes à exonuclease compreendem nucleosídeo fosforotioato.

6. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida primeira ou segunda região de ligação a substrato compreende pelo menos dois fosforotioato nucleosídeos.

7. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida região de núcleo compreende um resíduo fosforotioato nucleosídeo em uma dipirimidina no interior do referido núcleo.

8. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o referido terminal 3' compreende um nucleo-tídeo (3',3-ligado) invertido.

9. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um 2' O-metil ribonucleotídeo.

10. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as referidas primeira e segunda regiões de ligação a substrato compreendem uma sequência de nucleotídeos complementar a uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NoS 102-119.

11. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que catalisa uma reação com uma Km de cerca de 0,05 -1000 nanomolares.

12. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que liga-se ao referido substrato com uma Km feri-or a cerca de 1,0 micromolar.

13. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que liga-se ao referido substrato com uma Km de cerca de 0,1 nanomolar.

14. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida molécula tem uma taxa de "turno-ver" de reação catalítica (kcat) de cerca de 0,005 - 0,1 min"1.

15. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida atividade de endonuclease é melhorada pela presença de um cátion divalente.

16. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o referido cátion divalente é selecionado do grupo que consiste em Pb2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ e Ca2+.

17. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a referida atividade de endonuclease é melhorada pela presença de Mg2+.

18. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida atividade de endonuclease é melhorada pela presença de um cátion monovalente.

19. Molécula de DNA catalítica de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o referido cátion monovalente é selecionado do grupo que consiste em Na+ e K+.

20. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende duas ou mais populações de moléculas de DNA catalíticas como definidas na reivindicação 1, onde cada população de moléculas de DNA catalíticas é capaz de clivar uma seqüência de nucleotídeos diferente em um substrato.

21. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende duas ou mais populações de moléculas de DNA catalítico como definidas na reivindicação 1, onde cada população de moléculas de DNA catalíticas é capaz de reconhecer um substrato diferente.

22. Método in vitro de clivar uma molécula de ácido nucléico alvo, caracterizado pelo fato de compreender: a) misturar uma molécula de DNA catalítica como definida na reivindicação 1 com uma molécula de ácido nucléico alvo tendo uma sequência de ácidos nucléicos de substrato pré-selecionada complementar às referidas primeira e segunda regiões de ligação a substrato, para formar uma mistura reacional; e b) manter a referida mistura em condições reacionais predeterminadas para permitir que a referida molécula de DNA catalítica clive a referida molécula de ácido nucléico alvo, dessa forma produzindo uma população de produtos de substrato.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o referido substrato compreende RNA.

24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as referidas condições reacionais predeterminadas incluem a presença de um cátion monovalente, um cátion divalente ou ambos.

25. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a referida mistura compreende a introdução da referida molécula de DNA catalítica em uma célula contendo a referida molécula de ácido nucléico alvo.

26. Método de construção de uma molécula de DNA catalítica de fita simples que cliva uma seqüência de ácidos nucléicos de substrato pré-selecionada em uma molécula de ácido nucléico alvo, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) selecionar uma seqüência de ácidos nucléicos de substrato de 10 a 26 nucleotídeos de comprimento em uma molécula de ácido nucléico alvo; e b) sintetizar uma molécula de ácido desoxirribonucléico compreendendo primeira e segunda regiões de ligação a substrato flanqueando uma região de núcleo, onde a referida primeira região de ligação a substrato tem uma seqüência complementar a uma primeira porção da referida seqüência de ácidos nucléicos alvo pré-selecionada, a referida segunda região de ligação a substrato tem uma seqüência complementar a uma segunda porção da referida seqüência de áci- dos nucléicos alvo pré-selecionada, e a referida primeira ou segunda região de ligação a substrato tem de 5 a 13 nucleotídeos de comprimento, e a referida região de núcleo tendo uma seqüência de acordo com a fórmula: (I.) T(tronco)'AGC(tronco)"Z, em que a fórmula I não inclui a SEQ ID N°:120, e em que cada um dos referidos (tronco)' e (tronco)" são três nucleotídeos consecutivos que quando hibridizados como um par (tronco)': (tronco)" compreendem três pares de base incluindo pelo menos dois pares G:C e onde o referido Z = WCGR ou WCGAA, e W = A ou T e R = A ou G; ou (II.) RGGCTAGCHACAACGA (SEQ ID N° 122), em que a fórmula II não inclui a SEQ ID N°:121, e em que o referido Η = T, C ou A e R = A ou G.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de DNA catalítica compreende desoxirri-bonucleotídeos (DNA), DNA modificado, análogos de nucleotídeo ou compó-sitos dos mesmos.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, o caracterizado pelo fato de que a referida molécula de DNA catalítica compreende um ácido desoxirribonucléico de fita simples tendo terminais 5' e 3', onde os referidos terminais são modificados com nucleotídeos resistentes à exonuclease.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que os referidos nucleotídeos resistentes à exonuclease compreendem nucleosídeo fosforotioato.

30. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a referida primeira ou segunda região de ligação a substrato compreende pelo menos dois fosforotioato nucleosídeos.

31. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a referida região de núcleo compreende um resíduo fosforotioato nucleosídeo em uma dipirimidina no interior do referido núcleo.

32. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pe- Io fato de que o referido terminal 3' compreende um nucleotídeo (3',3'-ligado) invertido.

33. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de DNA catalítica compreende um 2' O-metil ribonucleotídeo.

34. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as referidas primeira e segunda regiões de ligação a substrato compreendem uma seqüência de nucleotídeos complementar a uma se-qüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NoS 102-119.

35. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a referida molécula catalisa uma reação com uma Km de cerca de 0,05 - 1000 nanomolares.

36. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a referida molécula tem uma taxa de "turnover" de reação catalítica (kcat) de cerca de 0,005 - 0,1 min-1.

37. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a referida atividade de endonuclease é melhorada pela presença de um cátion divalente.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o referido cátion divalente é selecionado do grupo que consiste em Pb2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ e Ca2+.

39. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a referida atividade de endonuclease é melhorada pela presença de um cátion monovalente.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o referido cátion monovalente é selecionado do grupo que consiste em Na+ e K+.