KR100564061B1 - 효소적dna분자 - Google Patents

Abstract

본 발명에는 핵산 서열 또는 분자, 특히 RNA를 부위-특이적 방식으로 절단시킬 수 있는 데옥시리보핵산 효소-촉매적 또는 효소적 DNA 분자, 및 이를 포함하는 조성물이 기술되어 있다. 언급된 효소 및 조성물의 제조방법 및 사용방법이 또한 기술되어 있다.

Description

효소적 DNA 분자{Enzymatic DNA molecules}

본 발명은 다른 핵산 분자, 특히 RNA를 절단시킬 수 있는 핵산 효소 또는 촉매적(효소적) DNA 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 언급된 효소적 DNA 분자를 함유하는 조성물, 및 이러한 효소 및 조성물의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.

고유 환경이 아닌 환경에서 작동되거나 천연에서는 나타나지 않는 반응을 촉매하는 촉매에 대한 필요성으로 인해 "효소 공학" 기술이 발전되어 왔다. 효소 공학 분야에서 통상적으로 취한 접근 방법은, 천연의 효소가 새로운 효소의 작제를 도와준다는 견해에 입각한 "합리적인 고안"이었다. 불행하게도, 단백질 구조와 화학 분야에 있어서의 실력이 뛰어나다 할지라도, 신규의 생물학적 촉매를 용이하게 통상의 과정처럼 생성시키키에는 충분치 못하다.

최근에는, 신규의 촉매를 개발하기 위한 상이한 접근방법이 응용되었다. 이러한 방법은 거대 분자의 이종성 풀(heterogeneous pool)을 작제하고 이러한 풀로부터 목적하는 반응을 촉매하는 분자를 분리시키는 시험관내 선별과정을 적용시키는 것과 연관이 있다. 거대 분자의 풀로부터 촉매를 선별하는 것은 그들의 구조적 및 화학적 성질에 관한 광범위한 지식에 근거하지 않는다. 따라서, 이러한 방법은 "비합리적인 고안"으로 칭해져 왔다[참조: Brenner and Lerner, PNAS USA 89: 5381-5383(1992)].

효소적 RNA 분자 또는 리보자임의 합리적인 구상과 연관된 현재까지의 대부분의 노력이, 기본적으로 신규하거나 개선된 촉매적 기능을 갖는 분자를 생성시키지는 못하였다. 그러나, 본 발명자들이 자연계에서의 유기체에 관한 다윈의 진화론을 모방한 "지시된 분자 진화" 또는 "시험관내 진화"로서 언급하여 온 특정의 공정을 통해 비합리적인 고안 방법을 적용시킴으로 인해, 바람직한 작용성 특징을 지닌 DNA 분자의 생성을 유도하는 잠재력이 나타나게 되었다.

이러한 기술은 용액중의 RNA 분자[참조: Mills, et al., PNAS USA 58: 217, 1967; Green, et al., Nature 347: 406, 1990; Chowrira, et al., Nature 354: 320, 1991; Joyce, Gene 82: 83, 1989; Beaudry and Joyce, Science 257: 635-641, 1992; Robertson and Joyce Nature 344: 467, 1990] 뿐만 아니라 고체 지지체에 부착된 리간드에 결합된 RNA[참조: Tuerk, et al., Science 249: 505, 1990; Ellington, et al., Nature 346: 818, 1990]에 대해서 다양한 정도의 성공을 가져왔다. 이러한 기술은 또한 고체 지지체에 직접적으로 부착된 펩티드[참조: Lam, et al., Nature 354: 82, 1991], 및 바이러스성 외막 단백질내에 발현된 펩티드 에피토프[참조: Scott, et al., Science 249: 386, 1990; Devlin, et al., Science 249: 249, 1990; Cwirla, et al., PNAS USA 87: 6378, 1990]에도 적용하였다.

촉매적 RNA의 발견[참조: Kruger, et al., Cell 31: 147-157, 1982; Guerrier-Takada, et al., Cell 35: 849-857, 1983] 이래로 10년 이상이 지났다. 공지된 천연 리보자임의 목록이 지속적으로 늘어나고 있으며[참조: Cech, The RNA World, Gesteland ＆ Atkins(eds.), pp. 239-269, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1993; Pyle, Science 261: 709-714, 1993; Symons, Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 322-330, 1994] 최근 수년 동안에는 시험관내 진화를 통해 수득된 합성 리보자임이 증가되었다[참조: Joyce, Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 331-336, 1994; Breaker ＆ Joyce, Trends Biotech. 12: 268-275, 1994; Chapman ＆ Szostak, Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 618-622, 1994].

DNA가 RNA와 동일한 대부분의 작용성 그룹을 함유한다는 사실을 고려해 보면, DNA 역시 촉매적 활성을 지닐 수 있는 것으로 예상하는 것은 합리적이다. 그러나, 특정의 바이러스 게놈 및 복제 중간체를 제외하고는 생물학적 유기체내의 거의 모든 DNA가 완전한 이중체(duplex)로서 존재하여 이것이 복잡한 2차원 및 3차원 구조를 채택하지 못하게 한다. 따라서, DNA 효소가 자연계에서 발견되지 않은 것은 놀라운 일이 아니다.

본 발명 이전까지는 뉴클레오티드-절단 능력을 지닌 촉매적 DNA 분자의 고안, 합성 및 용도가 기술된 바도 없고 입증된 바도 없다. 따라서, 본원에 기술된 발견 및 발명들은 다른 핵산, 특히 RNA를 절단하는 효소적 DNA 분자를 포함하는 보다 더 효능있는 촉매적 분자를 고안하기 위한 수단으로서의 시험관내 진화의 잠재성을 강조하였다는 점에서 특히 중요하다.

발명의간단한요약

따라서, 본 발명은 특정의 절단 부위에서 기질 핵산(NA) 서열을 절단할 수 있는 합성 또는 조작된(즉, 천연적으로 존재하지 않는) 촉매적 DNA 분자(또는 효소적 DNA 분자)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소적 DNA 분자에 관한 것이다.

한가지 바람직한 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제 활성은 기질 핵산 서열내에 일본쇄 핵산을 포함하는 절단 부위를 한정하는 뉴클레오티드 서열에 대해 특이적이다. 또다른 바람직한 양태에서, 상기 절단 부위는 이본쇄 핵산이다. 유사하게, 기질 핵산 서열은 일본쇄, 이본쇄, 부분 일본쇄 또는 이본쇄, 루프형 또는 이들의 어떠한 조합형일 수 있다.

또다른 양태에서는, 기질 핵산 서열이 하나 이상의 뉴클레오티드 동족체를 포함한다. 한가지 양태에서는, 상기 기질 핵산 서열이 보다 큰 분자의 일정 부분이거나 이에 부착되어 있다.

각종 양태에서, 보다 큰 분자는 RNA, 변형된 RNA, DNA, 변형된 DNA, 뉴클레오티드 동족체, 또는 이들의 복합체로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또다른 예에서, 상기 보다 큰 분자는 핵산 서열과 비-핵산 서열과의 복합체를 포함한다.

또다른 양태에서, 본 발명은 기질 핵산 서열에 하나 이상의 뉴클레오티드 동족체를 포함하는 것에 관한 것이다. 추가의 양태는 일본쇄 핵산이 RNA, DNA, 변형된 RNA, 변형된 DNA, 하나 이상의 뉴클레도티드 동족체, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 본 발명의 한가지 양태에서, 엔도뉴클레아제 활성은 절단 부위에서의 포스포에스테르 결합의 가수분해적 절단을 포함한다.

각종 바람직한 양태에서, 본 발명의 촉매적 DNA 분자는 전부 또는 부분적으로 일본쇄이다. 이러한 촉매적 DNA 분자는 바람직하게는 이들의 촉매적 활성에 부합하는 다양한 형태일 것이라는 것을 고려할 수 있다. 따라서, 한가지 양태에서, 본 발명의 촉매적 DNA 분자는 하나 이상의 헤어핀 루프 구조를 포함한다. 또다른 양태에서는, 촉매적 DNA 분자가 "해머헤드(hammerhead)" 리보자임과 유사한 외형을 가질 것이라는 것을 고려할 수 있다. 다른 양태에서는, 촉매적 DNA 분자가 테트라하이메나 더모필라(Tetrahymena thermophila) 리보자임, 예를 들면, 그룹 I 인트론으로부터 유도된 것과 유사한 형태일 것이라는 것을 고려할 수 있다.

유사하게, 본 발명의 바람직한 촉매적 DNA 분자는 기질 분자의 본래의 배향과 무관하게 부위-특이적 엔도뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있다. 따라서, 한가지 바람직한 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 이러한 효소적 DNA 분자로부터 분리되어 있는, 즉 DNA자임(DNAzyme)에 연결되어 있지 않은 기질 핵산 서열을 절단할 수 있다. 또다른 바람직한 양태에서, 효소적 DNA 분자는 부착된 기질 핵산 서열을 절단할 수 있다: 즉, 상기 분자는 자가-절단과 유사한 반응을 수행할 수 있다.

본 발명은 또한 2가 양이온의 존재를 필요로 하는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소적 DNA 분자(촉매적 DNA 분자, 데옥시리보자임 또는 DNA자임)에 관한 것이다. 각종의 바람직한 또다른 양태에서, 2가 양이온은 Pb²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ 및 Ca²⁺로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또다른 양태는 엔도뉴클레아제 활성이 1가 양이온의 존재를 필요로 하는 것에 관한 것이다. 이러한 또다른 양태에서는, 1가 양이온이 바람직하게는 Na⁺ 및 K⁺로 이루어진 그룹중에서 선택된다.

본 발명의 바람직한 각종 양태에서, 효소적 DNA 분자는 서열 3; 서열 14; 서열 15; 서열 16; 서열 17; 서열 18; 서열 19; 서열 20; 서열 21; 및 서열 22로 이루어진 그룹중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 기타 바람직한 양태에서, 본 발명의 촉매적 DNA 분자는 서열 23; 서열 24; 서열 25; 서열 26; 서열 27; 서열 28; 서열 29; 서열 30; 서열 31; 서열 32; 서열 33; 서열 34; 서열 35; 서열 36; 서열 37; 서열 38; 및 서열 39로 이루어진 그룹중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또다른 바람직한 양태는 본 발명의 촉매적 DNA 분자가 서열 50 및 서열 51로 이루어진 그룹중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것에 관한 것이다. 또한 또다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 촉매적 DNA 분자는 서열 52 내지 서열 101로 이루어진 그룹중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에서 기술한 바와 같이, 본원에 기술된 것과 실질적으로 유사한 서열을 갖는 촉매적 DNA 분자가 또한 고려된다. 따라서, 다양하고도 유용한 기타 효소적 DNA 분자를 생성시키기 위해서는 광범위한 치환, 결실, 삽입, 중복 및 기타 돌연변이가 언급된 분자내에 만들어질 수 있으며; 상기 분자가 본원에 기술된 바와 같은 부위-특이적 절단 활성을 나타내는 한, 이들 분자는 본 명세서의 범위내에 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 바람직하게는 약 1μ M 이하의 기질 결합 친화도를 갖는다. 또다른 양태에서는, 본 발명의 효소적 DNA 분자가 약 0.1μ M 미만의 K_D로 기질과 결합한다.

본 발명은 또한 유용한 교체도(turnover rate)를 갖는 효소적 DNA 분자를 기술한다. 하나의 양태에서, 이러한 교체도는 5h^-1 미만이고, 바람직한 양태에서는 교체도가 약 2h^-1 미만이며, 더욱 바람직한 양태에서는 교체도가 1h^-1 미만이고, 보다 더욱 바람직한 양태에서는 교체도가 0.6h^-1 이하이다.

또다른 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 유용한 교체도를 나타내는데, 여기서 K_obs 는 1min^-1 미만이고, 바람직하게는 0.1min^-1 미만이고, 더욱 바람직하게는 0.01min^-1 미만이며, 보다 더욱 바람직하게는 0.005min^-1 미만이다. 한 양태에서는, K_obs값이 0.002min^-1 이하이다.

본 발명은 또한 당해 DNA 효소의 촉매 속도를 완전히 최적화시킨 양태에 관한 것이다. 따라서, 각종 바람직한 양태에서, Mg²⁺의 존재에 의해 증진된 반응에 대한 K_m은 약 0.5 내지 20mM, 바람직하게는 약 1 내지 10mM, 더욱 바람직하게는 약 2 내지 5mM이다.

본 발명은 또한 절단 부위를 한정하는 뉴클레오티드 서열이 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 양태에 관한 것이다. 각종의 바람직한 기타 양태에서, 본 발명의 촉매적 DNA 분자는 절단 부위를 한정하는 2개 이상의 뉴클레오티드를 인식하여 이를 절단할 수 있다.

각종의 바람직한 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 하나 이상의 기질 결합 영역에 의해 플랭킹된 보존된 코어를 포함한다. 한 양태에서는, 효소적 DNA 분자가 제1 및 제2 기질 결합 영역을 포함한다. 또다른 양태에서는, 효소적 DNA 분자가 2개 이상의 기질 결합 영역을 포함한다.

앞서 인지된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 촉매적 DNA 분자는 또한 보존된 코어를 포함할 수 있다. 한가지 바람직한 양태에서는, 보존된 코어가 하나 이상의 보존된 영역을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서는, 하나 이상의 보존된 영역이 CG; CGA; AGCG; AGCCG; CAGCGAT; CTTGTTT; 및 CTTATTT으로 이루어진 그룹중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다(도 3 참조).

본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 보존된 코어내의 보존된 영역사이에 하나 이상의 가변성 또는 스페이서 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 또다른 양태에서는, 본 발명의 효소적 DNA 분자가 보존된 코어와 기질 결합 영역 사이에 하나 이상의 가변성 또는 스페이서 뉴클레오티드를 추가로 포함한다.

한가지 양태에서, 제1 기질 결합 영역은 바람직하게는 CATCTCT; GCTCT; TTGCTTTTT; TGTCTTCTC; TTGCTGCT; GCCATGCTTT(서열 40); CTCTATTTCT(서열 41); GTCGGCA; CATCTCTTC; 및 ACTTCT로 이루어진 그룹중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또다른 바람직한 양태에서는, 제2 기질 결합 영역은 TATGTGACGCTA(서열 42); TATAGTCGTA(서열 43); ATAGCGTATTA(서열 44); ATAGTTACGTCAT(서열 45); AATAGTGAAGTGTT(서열 46); TATAGTGTA; ATAGTCGGT; ATAGGCCCGGT(서열 47); AATAGTGAGGCTTG(서열 48); 및 ATGNTG로 이루어진 그룹중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 각종 양태에서, 기질 결합 영역은 길이가 다양하다. 따라서, 예를 들면, 기질 결합 영역은 1개의 뉴클레오티드 내지 12개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그러나, 길이가 약 3 내지 25개 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 3 내지 15개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 10개 뉴클레오티드인 기질 결합 영역이 특히 바람직하다는 것을 인지해야 한다. 각종 양태에서, 기질 결합 영역에서의 개개의 뉴클레오티드는 기질 분자의 뉴클레오티드와 상보적 염기쌍을 형성할 수 있으며; 다른 양태에서는, 비-상보적 염기쌍이 형성된다. 상보적 염기쌍과 비-상보적 염기쌍의 혼합물 또한 기술한 본 발명의 양태의 범위내에 속하는 것으로 간주된다.

또다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 촉매적 DNA 분자는 제3 기질 결합 영역을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 바람직한 양태에서는, 제3 결합 영역이 TGTT; TGTTA; 및 TGTTAG로 이루어진 그룹중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 또다른 바람직한 양태는 기질 결합 영역 사이에 하나 이상의 가변성 또는 "스페이서" 영역을 추가로 포함하는 효소적 DNA 분자를 기술한다.

또다른 기술된 양태에서, 본 발명은 다른 DNA 분자 및 올리고뉴클레오티드로부터 분리되고 엔도뉴클레아제 활성을 갖는, 정제된 합성 효소적 DNA 분자에 관한 것이며, 여기서 엔도뉴클레아제 활성은 기질 핵산 서열내의 일본쇄 또는 이본쇄 핵산을 포함하는 절단 부위를 한정하는 뉴클레오티드 서열에 대해 특이적이다. 한 양태에서는, 필수적으로 기질 핵산 서열의 일본쇄 또는 이본쇄 영역으로 구성되는 절단 부위를 한정하는 뉴클레오티드 서열에 대해 특이적인 엔도뉴클레아제 활성을 갖는, 합성된(또는 조작된) 효소적 DNA 분자가 기술되어 있다.

또다른 양태에서, 본 발명은 핵산-함유 기질을 가수분해하여 기질 절단 생성물을 생성시키는 촉매적 활성을 갖는 데옥시리보뉴클레오티드 중합체를 포함하는 효소적 DNA 분자에 관한 것이다. 한 양태에서는, 가수분해는 부위 -특이적 방식으로 발생된다. 앞서 언급한 바와 같이, 상기 중합체는 일본쇄, 이본쇄, 또는 이들 둘다의 몇몇 조합물일 수 있다.

본 발명은 추가로 상기 기질이 핵산 서열을 포함하는 것에 관한 것이다. 각종 양태에서, 이러한 핵산 서열 기질은 RNA, 변형된 RNA, DNA, 변형된 DNA, 하나 이상의 뉴클레오티드 동족체, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 한가지 양태에서는 상기 기질이 일본쇄 분절을 포함하며; 또다른 양태에서는 상기 기질이 이본쇄이다.

본 발명은 또한 핵산-함유 기질을 가수분해하여 절단 생성물을 생성시키는 촉매적 활성을 갖는 데옥시리보뉴클레오티드 중합체를 포함하는 효소적 DNA 분자에 관한 것이다. 한 양태에서, 상기 효소적 DNA 분자는 기질에 대해 유효한 결합 친화도를 지니며 절단 생성물에 대해 유효한 결합 친화도는 결핍되어 있다.

한가지 바람직한 양태에서, 본 발명은 인식 도메인, 가변성 영역 및 스페이서 영역에 의해 플랭킹된 보존된 코어를 한정하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-천연의 효소적 DNA 분자를 기술한다. 따라서, 한가지 바람직한 양태에서는, 상기 뉴클레오티드 서열이 분자의 5'-말단에 연속하거나 이에 인접한 제1 가변성 영역, 이러한 제1 가변성 영역에 대하여 3'-말단에 위치한 제1 인식 도메인, 이러한 제1 인식 도메인에 대하여 3'-말단에 위치한 제1 스페이서 영역, 이러한 제1 스페이서 영역에 대하여 3'-말단에 위치한 제1 보존 영역, 이러한 제1 보존 영역에 대하여 3'-말단에 위치한 제2 스페이서 영역, 이러한 제2 스페이서 영역에 대하여 3'-말단에 위치한 제2 보존 영역, 이러한 제2 보존 영역에 대하여 3'-말단에 위치한 제2 인식 도메인 및 이러한 제2 인식 도메인에 대하여 3'-말단에 위치한 제2 가변성 영역을 한정한다.

또다른 양태에서는, 상기 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 분자의 5'-말단 에 연속하거나 이에 인접한 제1 가변성 영역, 이러한 제1 가변성 영역에 대하여 3'-말단에 위치한 제1 인식 도메인, 이러한 제1 인식 도메인에 대하여 3'-말단에 위치한 제1 스페이서 영역, 이러한 제1 스페이서 영역에 대하여 3'-말단에 위치한 제1 보존 영역, 이러한 제1 보존 영역에 대하여 3'-말단에 위치한 제2 스페이서 영역, 이러한 제2 스페이서 영역에 대하여 3'-말단에 위치한 제2 보존 영역, 이러한 제2 보존 영역에 대하여 3'-말단에 위치한 제2 인식 도메인, 이러한 제2 인식 도메인에 대하여 3'-말단에 위치한 제2 가변성 영역 및 이러한 제2 가변성 영역에 대하여 3'-말단에 위치한 제3 인식 도메인을 한정한다.

앞서의 양태중의 하나의 양태에서는, 당해 분자가 2개의 기질 결합 도메인에 의해 플랭킹된 보존된 코어 영역을 포함하며; 또다른 양태에서는, 상기 보존된 코어 영역이 하나 이상의 보존 도메인을 포함한다. 기타 바람직한 양태에서는, 보존된 코어 영역은 하나 이상의 가변성 또는 스페이서 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 또다른 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 하나 이상의 스페이서 영역을 추가로 포함한다.

본 발명은 추가로 광범위한 조성물에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 언급된 효소적 DNA 분자를 포함하는 조성물이 본원에 고려되어 기술된다. 한가지 또다른 양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 상기 언급된 효소적 DNA 분자의 둘 이상의 집단을 포함하는데, 여기서 각각의 효소적 DNA 분자 집단은 기질내의 상이한 서열을 절단시킬 수 있다. 또다른 양태에서는, 조성물이 상기 언급된 효소적 DNA 분자의 둘 이상의 집단을 포함하는데, 여기서 각각의 효소적 DNA 분자 집단은 상이한 기질을 인식할 수 있다. 각종 양태에서는, 조성물이 1가 또는 2가 양이온을 포함하는 것이 또한 바람직하다.

본 발명은 추가로 본 발명의 효소적 DNA 분자를 생성시키고, 선별하며, 분리하는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 특정 부위에서 핵산 서열(예: RNA)을 절단시키는 효소적 DNA 분자를 선별하는 방법은 다음 단계, 즉 (a) 서열이 천연 또는 합성이든지 간에 추정상의 효소적 DNA 분자(바람직하게는 일본쇄 DNA 분자)의 집단을 수득하는 단계; (b) 뉴클레오티드-함유 기질 서열을 단계 (a)에서의 DNA 분자 집단과 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; (c) 상기 혼합물을, 상기 집단내의 추정상의 효소적 DNA 분자가 기질 서열의 분해를 유발시키기에 충분한 시간 동안 및 예정된 반응 조건하에 유지시킴으로써 기질 절단 생성물을 생성시키는 단계; (d) 기질 서열 및 기질 절단 생성물로부터 DNA 분자 집단을 분리시키는 단계; 및 (e) 특정 부위에서 기질 핵산 서열(예: RNA)을 절단시키는 DNA 분자를 상기 집단으로부터 분리하는 단계를 포함한다.

상기 방법의 추가의 양태에서, 특정 부위에서 기질 핵산 서열을 절단시키는 DNA 분자를 고정화제로 태깅(tagged)시킨다. 한 예로서, 상기 제제는 바이오틴이다.

상기 언급된 방법의 또다른 양태에서, 당해 방법은 본 목적을 위해 조작된 효소적 DNA 분자를 사용하여, 절단시키고자 하는 특정 서열, 예를 들면, 예정된 "표적" 뉴클레오티드 서열을 선별함으로써 시작된다. 따라서, 한 양태에서는, 예비-선별된(또는 예정된) "표적" 서열을 사용하여, 하나 이상의 랜덤한 서열 또는 분절을 함유하는 데옥시리보핵산 서열에 부착시키거나 "태깅(tagging)"시킴으로써 특정 부위에서 기질 핵산 서열을 절단시킬 수 있는 DNA 분자 집단을 생성시킨다. 한 양태에서는, 랜덤한 서열의 길이가 약 40개의 뉴클레오티드이고; 또다른 양태에서는, 랜덤한 서열의 길이가 약 50개의 뉴클레오티드이다. 길이가 1 내지 40, 40 내지 50 및 50 내지 100개의 뉴클레오티드인 랜덤한 서열 또한 본 발명에 의해 고려된다.

본 발명의 한 양태에서, 효소적 DNA 분자 집단을 생성시키기 위해 사용된 뉴클레오티드 서열은 서열 4, 23, 50 및 51로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또다른 양태에서, "표적" 또는 "기질" 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 리보뉴클레오티드 서열[참조: 예를 들면, 서열 4 및 23, 및 서열 49의 관련 부분]을 포함한다. 본 발명은 또한 유용한 "표적" 또는 "기질" 뉴클레오티드 서열이 DNA, RNA 또는 이의 복합체를 포함할 수 있는 것을 고려한다.

또한, 본 발명은 상기 언급된 방법에 있어서, 분리 단계가, 아비딘이 연결되어 있는 고체 표면에 태깅시킨 DNA 분자를 노출시킴으로써, 표지된 DNA 분자가 상기 고체 표면에 부착되게 함을 추가로 포함하는 방법에 관한 것이다. 앞서와 같이, 기질은 RNA, DNA, 이들 모두의 복합체, 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자일 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 특정 절단 부위에서 기질 핵산 서열을 절단할 수 있는 효소적 DNA 분자를 제공하는 단계; 및 (b) 이러한 효소적 DNA 분자를 기질 핵산 서열과 접촉시켜 상기 절단 부위에서 핵산 서열의 특이적 절단을 야기시키는 단계를 포함하는, 특정 절단 부위에서 기질 핵산 서열을 특이적으로 절단하는 방법에 관한 것이다. 이의 한 양태에서, 효소적 DNA 분자는 비-천연(또는 합성)의 DNA 분자이다. 또다른 양태에서는, 효소적 DNA 분자가 일본쇄이다.

상기 방법의 또다른 양태에서, 기질은 핵산을 포함한다. 각종 양태에서, 기질 핵산은 RNA, 변형된 RNA, DNA, 변형된 DNA, 하나 이상의 뉴클레오티드 동족체, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 또다른 양태에서는, 특이적 절단이 효소적 DNA 분자의 엔도뉴클레아제 활성에 의해 유발된다. 반응 조건의 변화, 예를 들면, pH, 온도, 양이온 비율(％), 효소 비율, 기질 비율 및 생성물 비율의 조정이 또한 본발명에 고려된다.

본 발명은 또한, (a) 한정된 절단 부위에서 기질 핵산 서열을 절단시킬 수 있는 촉매적 DNA 분자를 포스포에스테르 결합-함유 기질과 혼합하여 반응 혼합물을 형성시키는 단계; (b) 이러한 혼합물을 효소적 DNA 분자가 포스포에스테르 결합을 절단시킬수 있도록 예정된 반응 조건하에 유지시킴으로써 기질 생성물의 집단을 생성시키는 단계를 포함하는, 포스포에스테르 결합을 절단하는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 효소적 DNA 분자는 포스포에스테르 결합을 부위-특이적 방식으로 절단한다. 또다른 양태에서는, 상기 방법은 (c) 단계 (b)의 생성물을 촉매적 DNA 분자로부터 분리시키는 단계; 및 (d) 부가의 기질을 효소적 DNA 분자에 가하여 새로운 반응 혼합물을 형성시키는 단계를 추가로 포함한다.

또한, 본 발명은 포스포에스테르 결합을 절단시키는 효소적 DNA 분자를 조작하는 방법에 관한 것이다. 하나의 예시 방법은 다음 단계, 즉 (a) 일본쇄 DNA 분자 집단을 수득하는 단계; (b) 유전적 돌연변이를 상기 집단내에 도입하여 돌연변이체 집단을 생성시키는 단계; (c) 상기 돌연변이체 집단으로부터 예정된 선별 기준을 충족시키는 개체를 선별하는 단계; (d) 선별된 개개체를 나머지 돌연변이체 집단으로부터 분리시키는 단계; 및 (e) 선별된 개체를 증폭시키는 단계를 포함한다.

도 1은 표적 RNA 포스포에스테르를 절단하는 DNA를 분리시키기 위한 선별적 증폭 반응도식을 나타낸다. 도시된 바와 같이, 연속된 50개의 랜덤 뉴클레오티드를 함유하는 이본쇄 DNA("N₅₀"으로 표시된 분자)를, 아데노신 리보뉴클레오티드(rA)에 의해 3'-말단이 종결된 5'-바이오틴화 DNA 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시킨다. (바이오틴 표지는 동그라미 쳐진 문자 "B"로 나타낸다). 이러한 프라이머를 Taq 폴리머라제에 의해 연장시켜, 봉매된 단일 리보뉴클레오티드를 함유하는 DNA 생성물을 수득한다. 수득된 이본쇄 DNA를 스트렙트아비딘 매트릭스상에 고정화시키고 바이오틴화 되지 않은 DNA쇄를 0.2N NaOH로 세척함으로써 제거한다. 칼럼을 완충용액으로 재-평형화시킨 후, 이 칼럼을 1mM PbOAc가 첨가된 동일한 용액으로 세척한다. Pb²⁺-의존성 자가 절단이 진행되는 DNA를 칼럼으로부터 방출시키고 용출액을 수집한 다음, PCR로 증폭시킨다. 이어서, 이 PCR 생성물을 사용하여 선별적 증폭 반응의 다음 라운드(round)를 시작한다.

도 2는 납 양이온(Pb²⁺)의 존재하에서, DNA의 개시 풀(GO)과 선별과정의 제1 내지 제5 라운드 후에 수득된 집단(G1-G5)의 자가 절단 활성을 나타낸다. 부호 Pre는 108-뉴클레오티드 전구체 DNA(서열 4)를 나타내고; Clv는 28-뉴클레오티드 5'-절단 생성물(서열 5)을 나타내고; M은 길이가 5'-절단 생성물에 상응하는 프라이머 3a(서열 6)를 나타낸다.

도 3은 선별과정의 5 라운드 후에 집단으로부터 분리시킨 개개의 돌연변이체의 서열 정렬을 나타낸 것이다. 고정된 기질 도메인은 상단에 나타냈으며, 여기서 표적 리보아데닐레이트는 역삼각형을 통해 동정되었다. 추정된 염기쌍 상호작용과 통상 관련된 기질 뉴클레오티드는 세로 막대로 표시된다. 50개의 초기-랜덤화 뉴클레오티드에 상응하는 서열은 기질 도메인에 대해 역평행 방향으로 정렬된다. 모든 변이체는 고정된 서열 5'-CGGTAAGCTTGGCAC-3'(도시되지 않음; 서열 1)에 의해 3'-종결된다. 기질 도메인과의 염기쌍을 형성하는 것으로 예상되는 초기-랜덤화 영역내의 뉴클레오티드는 도 3의 우측과 좌측에 지시되어 있으며; 당해 효소적 DNA 분자의 추정상의 염기쌍-형성 영역은 도시된 각 서열에서 개별적 상자 모양으로 나타내었다. 보존된 영역은 2개의 크고 중앙에 위치한 상자 모양으로 나타내었다.

도 4A 및 4B는 촉매적 교체가 진행되는 분자간 반응에 있어서 RNA 포스포에스테르의 DNA-촉매된 절단을 도시한 것이다. 도 4A는 19량체 기질(3'-TCACTATrAGGAAGAGATGG-5', 서열 2) 및 38량체 DNA 효소(5'-ACACATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGACGCTA-3', 서열 3)간에 형성된 복합체를 다이아그램으로 나타낸 것이다. 상기 기질은 데옥시리보뉴클레오티드에 의해 플랭킹된 단일 아데노신 리보뉴클레오티드(화살표에 인접한 "rA")를 함유한다. 합성 DNA 효소는 도 3에 도시된 가장 자주 발생하는 변이체의 38-뉴클레오티드 부분이다. 추정상의 촉매적 도메인내에 위치한 고도로 보존된 뉴클레오티드는 상자 모양으로 나타내었다. 도시된 바와 같이, 보존된 하나의 서열은 "AGCG"인 반면, 또다른 서열은 "CG"(5'-3' 방향으로 판독함)이다.

도 4B는 시험관내 선별시 사용된 것과 동일한 조건하에서 [5'-³²P]-표지된 기질의 DNA-촉매된 절단에 대한 K_m(마이너스 기울기) 및 V_max(y-절편)을 결정하기 위해 사용된 에디-홉스티(Eadie-Hofstee) 플롯을 나타낸 것이다. 5nM DNA 효소 및 0.125, 0.5, 1, 2 또는 4μ M 기질을 수반하는 반응에 대해서 초기 절단율을 결정한다.

도 5는 선별된 촉매적 DNA의 4가지 그룹의 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 증명하는 폴리아크릴아미드 겔을 도시하는 사진이다. 분자의 Pb²⁺-의존성 그룹의 선별을 대조군(제1 그룹)으로서 병행하는 방식으로 반복한다. 제2 그룹에서는, Zn²⁺가 양이온으로서 사용되고; 제3 그룹에서는, 양이온이 Mn²⁺이며; 제4 그룹에서의 양이온은 Mg²⁺이다. 겔상의 다섯 번째 부위는 마커로서 절단 생성물로만 구성된다.

인지한 바와 같이, 상기 4가지 그룹 각각내에는 3개의 레인이 있다. 3개의 레인 각각에 있어서, 첫 번째 레인은 금속 양이온의 부재하에서는 선별된 집단의 활성이 결핍되어 있음을 나타내고, 두 번째 레인은 금속 양이온의 존재하에서 관찰된 활성을 나타내며 세 번째 레인은 출발 풀(GO)의 활성이 결핍되어 있음을 나타낸다.

도 6A 및 6B는 "전구(progenitor)" 촉매적 DNA 분자, 및 본원에 기술된 선별적 증폭 방법을 통해 수득된 몇몇 촉매적 DNA 분자중의 하나를 각각 2차원적으로 도시한 것이다. 도 6A는 서열 23으로 나타낸 분자의 전반적 형태를 나타내는, 출발 풀로부터의 예시적 분자를 도시하고 있다. 도시된 바와 같이, 각종 상보적 뉴클레오티드가 랜덤한 (N₄₀) 영역을 플랭킹한다. 도 6B는 상기 언급된 과정을 통해 생성된 Mg²⁺-의존성 촉매적 DNA 분자(또는 "DNA자임") 중의 하나의 다이아그램이다. 기질 핵산내의 리보뉴클레오티드의 위치는 도 6A와 6B 모두에서 화살표로 표시하였다.

도 7은 필수적으로 후술될 실시예 5에서 기술한 바와 같이 수행된 시험관내 선별적 증폭의 10라운드 결과중의 일부 결과를 도시한 것이다. 도시된 바와 같이, 촉매의 2개의 부위와 2개의 부류가 표적 서열을 가장 효율적으로 절단하는 것으로 나타났다. 절단 조건은 필수적으로 도 7에 지시된 바와 같은데, 즉 10mM Mg²⁺, pH 7.5 및 37℃이며; 2시간 동안 반응을 수행한 후에 수집한 데이터가 나타나 있다. 절단율(％)은 발생수(여기서는, 0 내지 10)에 대하여 플롯팅하여 나타낸다. 기질내의 지시된 부위에서 표적 서열을 절단할 수 있는 촉매적 DNA 분자의 수/우세는 세로 막대로 나타냈으며, G↓ UAACUAGAGAU에서의 절단은 줄무늬 막대로 나타냈고 GUAACUA↓ GAGAU에서의 절단은 속이 빈(밝은 색조의) 막대로 나타냈다.

도 8은 본 발명의 2가지 촉매적 DNA 분자, 클론 8-17 및 10-23의 뉴클레오티드 서열, 절단 부위 및 교체도를 도시한 것이다. 반응 조건은 도시된 바와 같은데, 즉 10mM Mg²⁺, pH 7.5 및 37℃이다. 클론 8-17로서 동정된 DNA자임은 좌측에 나타냈으며, 여기서 RNA 기질의 절단 부위는 화살표로 지시된다. DNA자임과는 별개인(즉, 분자간 절단이 도시된다) 기질 서열(5'-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3')을 그 자체로서 표지시킨다. 유사하게, 클론 10-23로서 동정된 DNA자임은 우측에 나타냈으며, 여기서 RNA 기질의 절단 부위는 화살표로 지시된다. 다시, 기질 서열이 지시된다. 8-17 효소의 경우, 교체도는 약 0.6hr^-1이고; 10-23 효소의 경우에는 교체도가 약 1hr^-1이다. 비-상보성 쌍을 이루는 것은 마침표(ㆍ)로 표시되는 반면, 상보성 쌍을 이루는 것은 세로선(｜)으로 표시된다.

도 9는 본 발명의 2가지 촉매적 DNA 분자, 클론 8-17 및 10-23의 뉴클레오티드 서열, 절단 부위 및 교체도를 추가로 도시한 것이다. 반응 조건은 도시된 바와 같은데, 즉 10mM Mg²⁺, pH 7.5 및 37℃이다. 도 8에서와 같이, 클론 8-17로서 동정된 DNA자임은 좌측에 나타냈으며, 여기서 RNA 기질의 절단 부위는 화살표로 지시된다. DNA자임과는 별개인(즉, 분자간 절단이 도시된다) 기질 서열(5'-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3')을 그 자체로서 표지시킨다. 유사하게, 클론 10-23로서 동정된 DNA자임은 우측에 나타냈으며, 여기서 RNA 기질의 절단 부위는 화살표로 지시된다. 다시, 기질 서열이 지시된다. 8-17 효소의 경우, K_obs는 약 0.002min^-1이고; 10-23 효소의 경우에는 K_obs가 약 0.01min^-1이다. 비-상보성 쌍을 이루는 것은 마침표(ㆍ)로 표시되는 반면, 상보성 쌍을 이루는 것은 세로선(｜)으로 표시된다.

A. 정의

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "데옥시리보자임"은 효소로서 작용할 수 있는 DNA-함유 핵산을 기술하는데 사용된다. 본 명세서에서는, 용어 "데옥시리보자임"이 엔도리보뉴클레아제 및 엔도데옥시리보뉴클레아제를 포함하지만, 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 데옥시리보자임이 특히 바람직하다. 본원에서 데옥시리보자임과 교환하여 사용된 다른 용어는 "효소적 DNA 분자", "DNA자임" 또는 "촉매적 DNA 분자"이며, 이들 용어는 합성적으로 생성되거나 유기체 또는 다른 공급원으로부터 유도된 것이든지 간에 이들 분자의 효소적 활성 부분을 포함하는 것으로 인지해야 한다.

용어 "효소적 DNA 분자"는 또한, 특정화된 올리고뉴클레오티드 표적 또는 기질에 대해 기질-결합 영역에서의 상보성을 갖는 DNA 분자를 포함하며; 이러한 분자는 또한 올리고뉴클레오티드 기질을 특이적으로 절단시킬 수 있는 효소적 활성을 지닌다. 또다른 방식으로 언급하면, 상기 효소적 DNA 분자는 올리고뉴클레오티드 기질을 분자간 절단시킬 수 있다. 이러한 상보성은 효소적 DNA 분자와 기질 올리고뉴클레오티드의 충분한 하이브리드화가 가능하게 작용하여 기질의 분자간 절단이 초래되게 한다. 100％의 상보성이 바람직하긴 하지만, 75 내지 100％ 범위의 상보성이 또한 유용하며 본 발명의 의해 고려된다.

본 발명의 효소적 DNA 분자는 또한 뉴클레아제 또는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 것으로 기술될 수도 있다. 이들 용어는 본원에서 교환하여 사용할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "효소적 핵산"은 효소적 RNA 또는 DNA 분자, 효소적 RNA-DNA 중합체, 및 이의 효소적 활성 분획 또는 유도체를 포괄하긴 하지만, 효소적 DNA 분자가 본 발명에 따른 효소적 활성 분자의 특히 바람직한 부류이다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "엔도데옥시리보뉴클레아제"는 주로 DNA로 구성된 기질을 절단할 수 있는 효소이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "엔도리보뉴클레아제"는 주로 RNA로 구성된 기질을 절단할 수 있는 효소이다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "염기쌍"(bp)은 아데닌(A)과 티민(T) 또는 우라실(U)과의 조합, 또는 시토신(C)과 구아닌(G)과의 조합을 기술하는데 일반적으로 사용되긴 하지만, 염기 A, T, C 및 G ( 및 U)의 보다 덜 통상적인 동족체가 종종 염기쌍 형성에 관여할 수도 있음을 인지해야 한다. DNA 또는 RNA가 이본쇄 형태일 때 통상적으로 쌍을 이루는 뉴클레오티드가 또한 본원에서 "상보성 염기"로서 지칭될 수 있다.

"상보성 뉴클레오티드 서열"은 일반적으로, 또다른 일본쇄 올리고뉴클레오티 드 상의 서열과 특이적으로 하이브리드화하여, 수소 결합을 형성하기에 충분히 상보적인, 일본쇄 분자내 또는 DNA 또는 RNA 세그먼트내 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다.

"뉴클레오티드"는 일반적으로 당 잔기(펜토즈), 포스페이트 그룹 및 질소 함유 헤테로사이클릭 염기로 구성되는 DNA 또는 RNA의 단량체성 단위를 지칭한다. 이러한 염기는 글리코시드 탄소(펜토즈의 1' 탄소)를 통해 당 잔기에 연결되고 이때 염기와 당의 배합체는 "뉴클레오시드"이다. 뉴클레오시드가 펜토즈의 3' 또는 5' 위치에 결합된 포스페이트 그룹을 함유하면, 이는 뉴클레오티드로서 지칭된다. 작동적으로 연결된 뉴클레오티드의 서열은 전형적으로, "염기 서열" 또는 "뉴클레오티드 서열", 및 이들의 어법상의 동의어로서 지칭되고, 달리 언급되지 않는 한 본원에서는 이의 좌측에서 우측으로의 배향이 통상적인 5'-말단으로부터 3'-말단으로의 방향인 것으로 나타낸다.

"뉴클레오티드 동족체"는 일반적으로 A, T, G, C, 또는 U와는 구조적으로 상이한 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드를 지칭하지만, 핵산 분자에서 정상의 뉴클레오티드를 대체하기에 충분히 유사하다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레오티드 동족체"는 변형된 염기, 상이하거나 독특한 당(즉, "통상의" 펜토즈 이외의 당), 또는 이들의 배합체를 포괄한다. 염기를 변형시킨 동족체의 예는 다음 섹션 C의 목록에 제시되어 있다.

"올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 일본쇄 또는 이본쇄 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "올리고뉴클레오티드" 및 이의 어법상의 동의어는 핵산의 전 범위를 포함할 것이다. 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 리보뉴클레오티드의 직쇄로 구성된 핵산 분자를 지칭한다. 정확한 크기는 당해 분야에 널리 공지된 바와 같은, 궁극적인 사용 조건에 의존하는 많은 요인에 따라 결정될 것이다.

분원에서 사용된 바와 같은 용어 "생리학적 조건"은 포유동물 유기체, 특히 사람에서 발견된 조건들에 필적하는 반응 조건을 제안하는 것을 의미한다. 온도, 양이온의 이용가능성 및 pH 범위 등의 변수가 다음에 보다 상세히 기술된 바와 같이 다양할 수 있지만, "생리학적 조건"은 일반적으로 약 35 내지 40℃, 바람직하게는 37℃의 온도 뿐만 아니라 약 7.0 내지 8.0, 바람직하게는 7.5의 pH를 포함하고 양아온, 바람직하게는 2가 및/또는 1가 양이온의 이용가능성을 추가로 포함하며, 여기서 약 2 내지 15mM Mg²⁺ 및 0 내지 0.1M Na⁺의 농도가 특히 바람직하다. 본원에서 사용된 바와 같은 "생리학적 조건"은 유리 뉴클레오티드 조인자의 존재를 임의로 포함할 수도 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 바람직한 조건은 다음에 보다 상세히 기술될 것이다.

B. 효소적 DNA 분자

각종 양태에서는, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 부가, 결실 및 치환을 포함하는 변형 또는 돌연변이 하나 이상이 조합되어 이루어질 수 있다. 또다른 양태에서는, 이러한 돌연변이 또는 변형은 랜덤하거나 특이적 돌연변이 또는 변형 유발 방법을 사용하여 발생될 수 있다. 이들 돌연변이는, 예를 들면, 루프, 스페이서 영역 또는 인식 서열(또는 도메인)의 길이를 변경시키거나 이의 뉴클레오티드 서열을 변형시킬 수 있다. 첫 번째 촉매적 활성의 효소적 DNA 분자 내에서의 하나 이상의 돌연변이가 두 번째 촉매적 활성의 효소적 DNA 분자 내에서의 돌연변이(들)과 조합하여 양 분자의 돌연변이체를 함유하는 새로운 효소적 DNA 분자를 생성시킬 수 있다.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 당해 분야의 숙련인에게 널리 공지된 각종 방법을 사용하여 도입된 랜덤한 돌연변이를 수반할 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Cadwell and Joyce, PCR Methods and Applications 2: 28-33, 1992]에 기술된 방법이 본원에서 사용하기에 특히 바람직하며, 이중 몇몇 변형은 다음 실시예에 기술된 바와 같다[참조: Cadwell and Joyce, PCR Methods and Applications 3(Sppl.): S136-S140, 1994]. 변형된 PCR 방법에 따르면, 랜덤한 점 돌연변이를 클로닝된 유전자에 도입할 수도 있다.

앞서의 방법은, 예를 들면, 리보자임 암호화 유전자를 서열 분석에 의해 결정된 바와 같이, 위치당 0.66％ ± 0.13％(95％ 신뢰 간격)의 돌연변이율로 변이유발시키는데 사용하여 왔으며, 이러한 방법에서는 염기 치환의 유형에 대한 어떠한 강력한 선호도가 관찰되지 않았다. 이는 본 발명의 효소적 DNA 분자내의 어떠한 위치에서도 랜덤한 돌연변이를 도입할 수 있게 한다.

한정된 또는 랜덤한 돌연변이를 도입하는데 유용한 또다른 방법은 문헌[참조: Joyce and Inoue, Nucleic Acids Research 17: 711-722, 1989]에 기술되어 있다. 이러한 후자의 방법은 이본쇄 DNA의 주형(암호화) 본쇄를 잘라내고, 변이유발된 올리고뉴클레오티드를 혼입시켜 주형 쇄를 작제한 다음, 부분적으로-부정합된 주형을 전사시키는 공정을 수반한다. 이는 선택된 위치에서 공지되거나 랜덤한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 혼입시킴으로써 분자내의 어떠한 위치에서도 한정된 또는 랜덤한 돌연변이를 도입할 수 있게 한다.

본 발명의 효소적 DNA 분자는 경우에 따라 상기 분자의 유형과 기능에 따라서 다양한 길이와 폴딩(folding) 패턴을 지닐수 있다. 예를 들면, 효소적 DNA 분자는 이들을 너무 크거나 거대하게 만듦으로써 분자의 치료학적 유용성을 제한하는 것을 방지하기 위하여, 길이가 약 15 내지 약 400개 이상의 뉴클레오티드일 수 있으나, 길이가 약 250개 뉴클레오티드를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 각종 바람직한 양태에서는, 본 발명의 효소적 DNA 분자의 길이가 약 20개 이상의 뉴클레오티드이긴 하지만, 유용한 분자는 길이가 100개 뉴클레오티드를 초과할 수 있으며 바람직한 분자는 일반적으로 길이가 약 100개 이하의 뉴클레오티드이다.

각종의 치료학적 적용에 있어서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 데옥시리보자임의 효소적 활성 분획을 포함한다. 각종 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 바람직하게는 약 200개 이하의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 양태에서는, 본 발명의 데옥시리보자임이 약 100개 이하의 뉴클레오티드를 포함한다. 또한 기타의 바람직한 양태에서, 본 발명의 데옥시리보자임은 길이가 약 20 내지 75개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 20 내지 65개 뉴클레오티드이다. 기타 바람직한 효소적 DNA 분자는 길이가 약 10 내지 50개 뉴클레오티드이다.

다른 적용에 있어서, 효소적 DNA 분자는 "해머헤드" 리보자임의 형태와 유사한 형태일 수 있다. 이러한 효소적 DNA 분자는 길이가 바람직하게는 약 75 내지 100개 이하의 뉴클레오티드이고, 약 20 내지 50개 뉴클레오티드의 길이가 특히 바람직하다.

일반적으로, 본원에서 기술된 바와 같이 사용하기 위해 분자를 합성하고자 하는 경우에는, 효소적 핵산 분자가 더 클수록, 합성하기가 더욱 어려워진다. 당해 분야의 숙련인은 이러한 고안 제한 사항을 명백히 인지할 것이다. 그럼에도 불구하고, 이와 같이 큰 분자도 본 발명의 범위내에 속한다.

본 발명의 효소적 DNA 분자가 데옥시리보자임의 효소적 활성 분획을 포함할 수 있거나, 또는 한 가지 이상의 돌연변이가 이루어진, 예를 들면, 한 가지 이상의 염기쌍-형성 서열 또는 스페이서 부재 또는 변형이 이루어진 데옥시리보자임을 포함하는데, 단 상기 결실, 부가 또는 변형은 당해 분자의 효소로서의 수행 능력에 불리한 영향을 미치지 말아야한다.

본 발명의 효소적 DNA 분자의 인식 도메인은 전형적으로 촉매적 도메인을 플랭킹하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 전형적으로 높은 서열 특이성을 지닌 당해 효소적 DNA 분자를 제공하면서 기질 핵산 내의 염기의 상보적 서열과 하이브리드화할 수 있는, 약 3 이상 내지 약 30개 염기, 바람직하게는 약 6 내지 약 15개 염기의 서열을 함유한다. 널리 공지된 방법을 통해 인식 부위를 변형 또는 돌연변이시키면, 효소적 핵산 분자의 서열 특이성을 변화시킬 수 있다[참조: Joyce et al., Nucleic Acids Research 17: 711-712, 1989].

본 발명의 효소적 핵산 분자는 또한 변형된 인식 부위 또는 도메인을 갖는 것을 포함한다. 각종 양태에서, 이들 변형된 인식 도메인은 이러한 인식 도메인을 포함하는 효소적 핵산 분자에 독특한 서열 특이성을 부여한다. 인식 도메인에 존재하는 정확한 염기는 절단이 이루어질 염기 서열을 결정한다. 기질 핵산의 절단은 이러한 인식 도메인내에서 일어난다. 이러한 절단으로, 기질 절단 서열상에 2'-, 3'- 또는 2',3'-사이클릭 포스페이트 그룹이 잔존하게 되고 본래의 기질내의 기질 절단 서열의 3' 바로 옆에 본래 존재한 뉴클레오티드상에는 5' 하이드록실이 잔존하게 된다. 인식 서열(내부 가이드 서열)내에 존재하는 염기를 변경시킴으로써 절단을 선택한 부위로 재지시할 수 있다[참조: Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9218-9222, 1989].

더우기, 폴리아민을 가하여 효소적 DNA 분자와 이의 기질간의 인식 및 결합을 촉진시키는 것이 유용할 수 있다. 유용한 폴리아민의 예로는 스페르미딘, 푸트레신 또는 스페르민이 있다. 약 1mM의 스페르미딘 농도가 특정 양태에서 유효할 수 있으며, 약 0.1mM 내지 약 10mM 범위의 농도가 또한 유용할 수도 있다.

각종의 대체 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 핵산 기질, 바람직하게는 RNA 기질을 절단시키는 능력이 증진되거나 최적화되었다. 당해 분야의 숙련인에게 인지된 바와 같이, 효소-촉매된 반응 속도는 기질과 효소 농도에 따라서 다양하며 일반적으로, 높은 기질 또는 효소 농도에서 일정한 수준이 된다. 이러한 효과를 고려하여, 효소-촉매된 반응의 역학이 이러한 반응을 한정하는 다음 용어들로 기술될 수 있다.

RNA 기질을 절단시키는 본 발명의 효소적 DNA 분자의 증진되거나 최적화된 능력은 효소적 DNA 분자의 존재하에서 표지된 RNA 기질의 양을 다양하게 하면서 절단 반응시켜 결정할 수 있다. 상기 기질을 절단하는 능력은 일반적으로, 촉매적 속도(K_cat)를 미카엘 상수(K_M)로 나눈값으로 정의된다. 부호 K_cat는 기질이 포화값에 접근할때의 효소 반응의 최대 속도를 나타낸다. K_M은 반응 속도가 최대치의 절반에 도달하는 기질 농도를 나타낸다.

예를 들면, K_M 및 K_cat에 대한 값은 기질 농도[S]가 효소적 DNA 분자 농도[E] 보다 과량인 실험을 통해 본 발명에서 결정할 수 있다. 기질 농도 범위 전반에 걸친 초기 반응 속도(V₀)는 일반적으로 반응의 처음 5％ 이하인 초기 직선 상으로부터 추정한다. 데이터 지점은 방정식 v= -K_M(V₀/[S]) + V_max으로 제시된 이론적 라인에 대한 제곱법으로 고정시킨다. 따라서, K_cat 및 K_M은 초기 반응 속도 V₀ 및 기질 농도[S]로 결정한다.

각종의 대체 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 핵산 기질, 바람직하게는 RNA 기질을 절단시키는 능력이 증진되거나 최적화되었다. 바람직한 양태에서는, RNA 기질을 절단하는 효소적 DNA 분자의 증진되거나 최적화된 능력은 촉매되지 않은 속도에 비해 약 10 내지 10⁹배 정도 증진된다. 보다 바람직한 양태에서는, 본 발명의 효소적 DNA 분자가 RNA 기질을 "전구" 종에 비해 약 10³ 내지 10⁷배 정도 증진된 속도로 절단시킬 수 있다. 보다 더욱 바람직한 양태에서는, RNA 기질을 절단하는 증진되거나 최적화된 능력이 전구 종에 비해 약 10⁴ 내지 10⁶배 정도 증진된 것으로 나타난다. 당해 분야의 숙련인은 핵산 기질을 절단하는 효소적 DNA 분자의 증진되거나 최적화된 능력이 본 발명의 시험관내 진화 과정 동안에 적용된 선별 제한사항에 따라서 다양할 수 있음을 인지할 것이다.

본 발명의 데옥시리보자임, 및 기타 효소적 DNA 분자 및 뉴클레아제를 변형시키는 각종의 바람직한 방법이 다음 실시예 1 내지 3에 추가로 기술된다.

C. 뉴클레오티드 동족체

앞서 언급한 바와 같이, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레오티드 동족체"는 일반적으로 A, T, G, C, 또는 U와는 구조적으로 상이한 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드를 지칭하지만, 핵산 분자에서 정상의 뉴클레오티드를 대체하기에 충분히 유사하다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레오티드 동족체"는 변형된 염기, 상이하거나 독특한 당, 변형된 포스페이트 골격, 또는 이들의 배합체를 포괄한다. 본 발명에 유용한 뉴클레오티드 동족체의 예로는 다음 표에 수록된 것이 있으며, 이들 대부분은 37CFR§ 1.822(본원에 참조문헌으로 삽입됨)에서 변형된 염기의 승인 목록에서 발견된다.

[표 1]

뉴클레오티드 동족체

기타 유용한 동족체로는 국제공개공보 WO 92/20823(이의 명세서는 본원에서 참조문헌으로서 삽입됨)에 기술된 것, 또는 상기 공보에 기술된 방법에 따라서 제조된 동족체가 있다. 문헌[참조: DeMesmaeker et al., Anqew. Chem. Int, Ed. Engl. 33: 226-229, 1994; DeMesmaeker et al., Synlett: 733-736(1993. 10.); Nielsen et al., Science 254: 1497-1500, 1991; and Idziak et al., Tetrahedron Letters 34: 5417-5420, 1993]에 기술된 동족체가 또한 본 발명에 유용하며, 상기 문헌들은 본원에 참조문헌으로서 삽입된다.

D. 효소적 DNA 분자를 조작하는 방법

본 발명은 예정된 활성을 갖는 핵산 분자의 제조방법에 관한 것이다. 한가지 바람직한 양태에서, 상기 핵산 분자는 효소적 DNA 분자이다. 또다른 양태에서, 목적하는 활성은 촉매적 활성이다.

한가지 양태에서, 본 발명은 "조작되어" 특이적이거나 예정된 반응을 촉매할 수 있는 효소적 DNA 분자의 합성 방법에 관한 것이다. 효소적 DNA 분자를 제조하는 방법은 본원에, 예를 들면, 다음 실시예 1 내지 3에 기술되어 있다. 다른 양태에서는, 본 발명의 효소적 DNA 분자를 조작하여 아데노신 트리포스페이트(ATP)와 같은 작은 분자 또는 리간드를 결합시킬 수 있다[참조: Sassanfar et al., Nature 364: 550-553, 1993].

또다른 양태에서는, 본 발명의 효소적 DNA 분자 집단을 변이유발 조건하에 적용시켜 다양한 돌연변이체 효소적 DNA 분자(이는 "데옥시리보자임" 또는 "DNA자임"으로 불리우기도 함) 집단을 생성시키는 것에 관한 것이다. 그 다음, 목적하는 특징을 갖는 효소적 DNA 분자를 상기 집단으로부터 선별시키고/시키거나 분리시킨 다음 연속적으로 증폭시킨다.

또다른 방법으로는, 효소적 DNA 분자의 인식 도메인의 길이를 변형시킴으로써 효소적 DNA 분자에서 돌연변이를 유발시킬 수 있다. 효소적 DNA 분자의 인식 도메인은 기질 핵산 서열내의 상보성 염기 서열과 결합한다. 인식 도메인의 길이를 변형시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, PCR 방법이 있으며, 이의 유용한 기술은 다음 실시예에 추가로 기재된다.

효소적 DNA 분자의 인식 도메인의 길이를 변형시키는 것은 효소적 DNA 분자의 결합 특이성에 대한 목적하는 효과를 제공할 수 있다. 예를 들면, 인식 도메인 길이의 증가는 효소적 DNA 분자와 기질내 올리고뉴클레오티드의 상보성 염기 서열간의 결합 특이성을 증가시킬 수 있거나 하이브리드 기질 내에서의 특정 서열의 인식을 증진시킬 수 있다. 또한, 인식 도메인 길이의 증가는 기질과의 결합 친화도를 증가시킬 수도 있다. 각종 양태에서는, 이와 같이 변형된 효소적 DNA 분자내 인식 도메인은 효소적 DNA 분자와 이의 기질간의 증가된 결합 특이성 및 친화도를 부여한다.

특정의 올리고뉴클레오티드가 상보성 서열을 지닌 올리고뉴클레오티드 이외의 분자를 인식하여 결합할 수 있는 것으로 최근 밝혀졌다. 이들 올리고뉴클레오티드는 종종 "아프타머(aptamer)"로 명칭된다. 예를 들면, 엘링톤(Ellington)과 스조스택(Szostak)은 각종 유기 염료와 결합할 수 있는 RNA 분자를 기술하고 있는 반면[참조: Nature 346: 818-822, 1990], 보크(Bock) 등은 사람 트롬빈과 결합하는 ssDNA를 기술하고 있다[참조: Nature 355: 564-566, 1992]. 유사하게, 젤리넥(Jellinek) 등은 염기성 섬유아세포 성장 인자에 대한 RNA 리간드를 기술하고 있다[참조: PNAS USA 90: 11227-11231, 1993]. 따라서, 본발명의 촉매적 활성 DNA 효소를 본원에 기술된 방법에 따라서 조작하여 전형적으로 아프타머와 연관된 각종 능력을 발휘할 수 있다는 것이 본원에서 추가로 고려된다.

이로써 당해 분야의 숙련인은 본 발명의 효소적 DNA 분자를, PCR 및 3SR(지속된 서열 복제; 다음 실시예 1 참조)을 포함하는 본원에 기술된 각종 방법으로 어떠한 뉴클레오티드 서열(예: 인식 도메인)에서도 변형시킬 수 있음을 인지해야 한다. 예를 들면, 부가의 뉴클레오티드를 프라이머내에 혼입시킴으로써 상기 부가의 뉴클레오티드를 효소적 DNA 분자의 5' 말단에 가할 수 있다.

본 발명의 효소적 DNA 분자는 부위-지시된 돌연변이 유발과 같은 방법을 사용하여 보다 더 랜덤하지 않은 방식으로 제조하거나 조작할 수 있다. 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이 유발은 필수적으로 문헌[참조: Morinaga et al., Biotechnology 2: 636, 1984]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있으며, 데옥시리보자임에 적용하기 위해 본원에서 기술된 바와 같이 변형시킨다. 효소적 DNA 분자를 조작하는 유용한 방법은 다음 실시예에 추가로 기술된다.

한가지 기술된 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 염기쌍 형성 상호작용을 통해 기질과 상호작용하는 2개의 기질 결합(또는 인식) 도메인 또는 서열에 의해 플랭킹된 보존된 코어를 포함한다. 각종 양태에서는, 상기 보존된 코어가 하나 이상의 보존된 도메인 또는 서열을 포함한다. 또다른 양태에서는, 효소적 DNA 분자가 염기쌍 형성에 수반된 영역들(또는 서열들) 사이에 "스페이서" 영역(또는 서열)을 추가로 포함한다. 또한 또다른 양태에서, 보존된 코어는 하나 이상의 덜 보존된 가변성 또는 "스페이서" 뉴클레오티드에 의해 다양한 간격에서 "차단된다".

각종 양태에서, 효소적 DNA 분자 집단은 2가지 이상의 상이한 유형의 데옥시리보자임 분자로 만든다. 예를 들면, 이의 한가지 양태에서는, 상기 분자가 상이한 서열을 갖는다. 또다른 양태에서는, 데옥시리보자임이 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 연속하거나 인접한 인식 도메인을 한정하는 핵산 서열을 갖는 핵산 분자이다. 각종의 또다른 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 인식 도메인에 대해 3'-말단에 위치한 하나 이상의 스페이서 영역, 인식 영역에 대해 3'-말단에 위치한 하나 이상의 루프 및/또는 스페이서 영역을 추가로 포함할 수 있다. 다른 양태에서는, 본 발명의 데옥시리보자임이 동일한 분자의 다른 영역과 하이브리드화할 수 있는 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 방법에 따라서 생성된 효소적 DNA 분자의 기타 특징들은 본원에 또한 기술되어 있다.

한 양태에서, 변이유발 조건은 한정되거나 랜덤한 뉴클레오티드 치환을 효소적 DNA 분자내에 도입시키는 조건을 포함한다. 전형적인 변이유발 조건의 예로는 본 명세서의 다른 파트에 기술된 조건 및 문헌[참조: Joyce et al., Nucl. Acids Res. 17: 711-722, 1989; Joyce, Gene 82: 83-87, 1989; and Beaudry and Joyce, Science 257: 635-41, 1992]에 기술된 방법이 있다.

기타 양태에서, 본 발명의 돌연변이체 효소적 핵산 분자의 다양한 집단은 정확히 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는 2개 이상의 핵산 분자를 함유하는 것이다. 이의 다른 양태에서는, 이러한 다양한 집단으로부터, 예정된 활성을 갖는 효소적 DNA 분자 또는 기타 효소적 핵산을 예정된 활성을 수행할 수 있는 이의 능력을 기준으로 하여 선별한다. 각종 양태에서, 예정된 활성은 증진된 촉매적 활성, 감소된 K_M, 증진된 기질 결합 능력, 변형된 기질 특이성 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

효소 수행능 측면에서 고려될 수 있는 다른 파라미터로는 촉매적 활성 또는 능력, 기질 결합 능력, 효소 교체도, 피드백 기전에 대한 효소 민감도 등이 있다. 특정 국면에서, 기질 특이성은, 특히 효소가 2개 이상의 경쟁적 기질(이들 각각은 다른 기질(들)에 대하여 상기 효소의 수행능에 영향을 미친다)을 인식하여 이들과 결합할 수 있는 상황하에서 효소 수행능 측면을 고려할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 기질 특이성은 특정의 기질, 예를 들면, 리보뉴클레오티드 단독, 데옥시리보뉴클레오티드 단독, 또는 이들 둘의 복합체를 포함하는 기질에 대한, 본원에서 기술된 바와 같은 효소적 핵산 분자의 특이성을 지칭할 수 있다. 기질 분자는 또한 뉴클레오티드 동족체를 함유할 수 있다. 각종 양태에서, 본 발명의 효소적 핵산 분자는 하이브리드 또는 비-하이브리드 기질의 특정 영역에 우선적으로 결합할 수 있다.

본원에서 "기질 특이성"으로서 인지된 용어 또는 파라미터는 또한 서열 특이성을 포함할 수 있는데, 즉 본 발명의 효소적 핵산 분자는 특정의 핵산 서열을 갖는 핵산 기질을 인식하여 결합할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 효소적 핵산 분자의 기질 인식 도메인이 연속적인 일련의 1개 또는 2개의 리보뉴클레오티드(예, rA)를 갖는 기질 분자에만 결합하는 경우, 상기 효소적 핵산 분자은 이러한 서열이 결핍된 핵산 기질 분자는 인식하지도 않거나 결합하지도 않을 것이다.

선별 공정에 대해 언급해 보면, 각종 양태에서, 선별은 다양한 돌연변이체 효소적 핵산 집단으로부터 예정된 활성을 갖는 돌연변이체 효소적 핵산을 물리적으로 분리시키는 어떠한 방법도 포함한다. 종종, 선별은 크기에 의한 분리, 촉매적 활성의 존재 여부에 의한 분리, 또는 또다른 핵산, 펩티드, 또는 용액중이거나 고체 매트릭스에 부착된 기타 몇몇 분자와 돌연변이체 핵산의 하이브리드화에 의한 분리를 포함한다.

각종 양태에서, 예정된 활성은 이러한 예정된 활성을 갖는 돌연변이체 효소적 핵산이 상기 활성을 통해 몇몇 방식으로 표지되도록 하는 것이다. 예를 들면, 예정된 활성은 효소적 DNA 분자 활성일 수 있는데, 이로써 이의 기질상의 돌연변이체 효소적 핵산의 활성은 상기 기질에 돌연변이체 효소적 핵산이 공유결합되게 한다. 이어서, 상기 돌연변이체 효소적 핵산을 공유결합을 통해 선별한다.

다른 양태에서, 예정된 활성을 갖는 돌연변이체 효소적 핵산을 선별하는 방법으로는 돌연변이체 효소적 핵산을 증폭시키는 방법이 있다[참조: Joyce, Gene 82: 83-87, 1989; Beaudry and Joyce, Science 257: 635-41, 1992]. 예정된 특징 또는 활성을 갖는 효소적 핵산 분자를 선별하는 다른 방법은 다음 실시예에 기술되어 있다.

E. 조성물

본 발명은 또한 본 발명의 효소적 DNA 분자의 하나 이상의 유형 또는 집단을 함유하는 조성물에 관한 것이며; 예를 들면, 상이한 유형 또는 집단은 상이한 뉴클레오티드 서열을 인식하고 이를 절단할 수 있다. 조성물은 리보핵산 -함유 기질을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따르는 조성물은 납 이온, 마그네슘 이온, 또는 본원에서 언급한 바와 같은 기타 2가 또는 1가 양이온을 추가로 포함할 수 있다.

바람직하게는, 효소적 DNA 분자는 약 0.05μ M 내지 약 2μM의 농도로 존재한다. 전형적으로, 효소적 DNA 분자는 기질에 대한 효소적 DNA 분자의 농도비가 약 1:5 내지 약 1:50이 되도록 존재한다. 더욱 바람직하게는, 효소적 DNA 분자는 조성물내에 약 0.1μ M 내지 약 1μM의 농도로 존재한다. 보다 더욱 바람직하게는, 조성물은 효소적 DNA 분자를 약 0.1μ M 내지 약 0.5μM의 농도로 함유한다. 바람직하게는, 기질은 조성물중에 약 0.5μ M 내지 약 1000μM의 농도로 존재한다.

당해 분야의 숙련인은 천연 및 합성 공급원을 포함하여, 수많은 핵산 -함유 기질의 공급원이 있음을 인지할 것이다. 적합한 공급원의 예로는 HIV-1, HIV-2, HTLV-Ⅰ 및 HTLV-Ⅱ을 포함하는 각종 바이러스성 및 레트로바이러스성 제제가 있으나 이에 제한되지는 않는다.

기타 적합한 기질로는 피코르나바이러스, 헤파드나바이러스(예: HBV, HCV), 파필로마바이러스(예: HPV), 감마헤르페스비리내(예: EBV), 림포크립토바이러스, 백혈병 바이러스(예: HTLV-Ⅰ 및 HTLV-Ⅱ), 플라비바이러스, 토가바이러스, 헤르페스바이러스(알파헤르페스바이러스 및 베타헤르페스바이러스 포함), 사이토메갈로바이러스(CMV), 인플루엔자 바이러스, 및 면역결핍 질환 및 증후군을 유발하는 바이러스 및 레트로바이러스(예: HIV-1 및 -2)를 포함하거나 이들에 의해 생성된 것을 포함하는 바이러스성 및 레트로바이러스성 제제가 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, 적합한 기질로는 원숭이 및 고양이의 면역결핍증 바이러스 및 소의 백혈병 바이러스를 포함하는, 사람 이외의 영장류 및 기타 동물을 감염시키는 바이러스성 및 레트로바이러스성 제제가 있으나 이들로 제한되지는 않는다.

마그네슘 이온, 납 이온, 또는 앞서 기술된 바와 같은 또다른 적합한 1가 또는 2가 양이온이 또한 본 조성물중에 약 1 내지 100mM 범위의 농도로 존재할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 예비선별된 이온이 조성물중에 약 2mM 내지 약 50mM의 농도로 존재하며, 약 5mM의 농도가 특히 바람직하다. 당해 분야의 숙련인은 이온 농도가 이의 공급원(예, 마그네슘)의 수용액중에서의 용해도를 제한하고 동일한 조성물에 존재하는 효소적 DNA 분자를 활성 형태로 갖고자 하는 바램에 의해서만 제한된다.

본 발명은 또한 본 발명의 효소적 DNA 분자, 하이브리드 데옥시리보뉴클레오티드-리보뉴클레오티드 분자, 및 상기 언급된 바와 같은 농도의 마그네슘 또는 납 이온을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 앞서 언급된 바와 같이, 기타 1가 또는 2가 이온(예, Ca²⁺)을 마그네슘 대신 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 효소적 DNA 분자, 핵산 -함유 기질(예: RNA), 및 약 1밀리몰 보다 큰 농도의 예비선별된 이온을 함유하는(여기서, 상기 기질은 본 발명의 효소적 DNA 분자 상에 존재하는 인식 도메인 보다 길이가 더 길다) 조성물이 본 발명에 의해 고려된다.

한 양태에서, 조성물은 효소적 DNA 분자-기질 복합체를 포함하며, 여기서 효소적 DNA 분자와 이의 기질 사이의 염기쌍은 접해 있다. 또다른 양태에서, 효소적 DNA 분자와 이의 기질 사이의 염기쌍은 하나 이상의 비-상보적 쌍으로 개입중단된다. 각종의 또다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 1가 양이온, 2가 양이온, 또는 이들 둘 다를 추가로 포함할 수 있다.

또다른 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 2가 양이온의 존재하 또는 부재하에서 효과적으로 작용을 나타낼 수 있다. 이의 한가지 양태에서는, 2가 양이온이 존재하고 Pb²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ 또는 Ca²⁺을 포함한다. 또한, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 1가 양이온의 존재하 또는 부재하에서 효과적으로 작용을 나타낼 수 있다. Pb²⁺ 또는 Mg²⁺에 대해서 상기 언급된 바와 유사한 1가 또는 2가 양이온 농도가 본원에 기술된 바와 같이 유용할 것라는 것이 예상된다.

임의로, 1가 양이온이 2가 양이온에 덧붙여 또는 이에 대한 "대체물"로서 존재할 수도 있다. 예를 들면, 나트륨(Na⁺) 또는 칼륨(K⁺)과 같은 1가 양이온이 해리된 이온으로서 또는 해리될 수 있는 화합물(예, NaCl 또는 KCl)의 형태로서 존재할 수 있다.

한 양태에서, 당해 조성물에 존재하는 1가 양이온의 농도는 0 내지 1.0M의 범위이다. 또다른 양태에서는, 1가 양이온이 약 0 내지 200mM의 범위의 농도로 존재한다. 다른 양태에서는, 1가 양이온이 약 1 내지 100mM의 범위의 농도로 존재한다. 또한, 1가 양이온의 농도는 약 2 내지 50mM의 범위이다. 기타 양태에서는, 1가 양이온의 농도가 약 2 내지 25mM의 범위이다.

F. 효소적 DNA 분자의 사용방법

본원에서 기술된 바와 같은 효소적 DNA 분자의 사용방법은 많다. 앞서 논의된 바와 같이, 이웃하는 핵산 연결-결합(예, 포스포에스테르 결합)을 절단시킬 수 있는 분자는 광범위한 적용을 포괄하는 수 많은 용도를 지닌다. 예를 들면, 본원에 언급된 범위 내에서의 능력, 구조 및/또는 기능을 갖는 효소적 DNA 분자가 약제학적 및 의학적 생성물(예, 창상의 괴사조직제거용, 응괴 해리용 등의 생성물) 뿐만 아니라 가정용품(예, 세제, 치아 위생용 생성물, 고기 연화제)에 유용하다. 상기 언급된 화합물, 조성물 및 방법의 산업적 유용성 또한 본 발명에 고려되고 본 발명의 범주내에 속한다.

본 발명은 또한 어떠한 일본쇄, 루프형, 부분적으로 또는 전부 이본쇄의 핵산도 절단시키는 유용한 방법을 기술하며; 이들 방법의 대다수는 본 발명의 신규한 효소적 활성의 핵산을 이용한다. 각종 양태에서, 기질의 일본쇄 핵산 분절 또는 분획(또는 완전한 기질 자체)은 DNA, 변형된 DNA, RNA, 변형된 RNA, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 기질은, 본 발명의 효소적 핵산 분자가 효소의 인식 서열을 통해 기질 절단 서열과 하이브리드화할 수 있도록 기질 절단 서열에서 또는 근처에서 일본쇄이기만 하면 된다.

본 발명의 방법에 의해 절단될 수 있는 핵산 기질은 화학적으로 합성되거나 효소적으로 생성시킬 수 있거나, 또는 동물 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 세균 세포를 포함하는 파아지, 바이러스, 원핵 세포 또는 진핵 세포 등의 각종 공급원으로부터 분리시킬 수 있다. 화학적으로 합성된 일본쇄 및 이본쇄 핵산은 리서취 제네틱스(Research Genetics; Huntsville, AL)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 수 많은 판매원으로부터 시판되고 있다.

제조업자의 지시에 따라서 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems; Foster City, CA) 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 RNA 기질을 합성할 수도 있다. 일본쇄 파아지가 또한 핵산 기질의 공급원이다[참조: Messing et al., PNAS USA 74; 3642-3646, 1977; and Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103-119, 1985]. 일본쇄 파아지를 함유하는 세균 세포가 또한 적합한 일본쇄 핵산 기질의 즉시 사용되는 공급원일 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 절단될 수 있는 일본쇄 RNA는 피코르나바이러스, 토가바이러스, 오르토마이소바이러스, 파라마이소바이러스, 라브도바이러스, 코로나바이러스, 아레나바이러스, 또는 레트로바이러스와 같은 어떠한 RNA 바이러스에 의해 제공될 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 광범위한 원핵 및 진핵 세포가 적합한 핵산 기질의 우수한 공급원일 수 있다.

본 발명의 방법은 진핵, 원핵, 식물, 동물, 효모 또는 세균 세포를 포함하는 특정 세포 내부에 존재하는, 일본쇄 핵산 또는 루프형이거나 이본쇄 핵산의 일본쇄 분획을 대상으로 하여 사용될 수 있다. 이러한 조건하에서, 본 발명의 효소적 핵산 분자(예, 효소적 DNA 분자 또는 데옥시리보자임)가 항바이러스제 또는 유전자 발현 조절제로서 작용될 수 있다. 이러한 본 발명의 효소적 DNA 분자의 용도의 예는 다음에 추가로 기술된다.

본 발명의 대다수의 방법에서는, 일본쇄 핵산의 절단이 예정된 염기 서열의 3' 말단에서 일어난다. 이러한 예정된 염기 서열 또는 기질 절단 서열은 전형적으로 1 내지 약 10개의 뉴클레오티드를 함유한다. 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 효소적 DNA 분자는 절단 부위의 상류, 또는 상류 및 하류의 뉴클레오티드를 인식할 수 있다. 각종 양태에서는, 효소적 DNA 분자는 절단 부위 상류의 약 2 내지 10개의 뉴클레오티드를 인식할 수 있으며; 다른 양태에서는, 효소적 DNA 분자가 절단 부위 상부의 약 2 내지 10개의 뉴클레오티드 및 상기 절단 부위 하부의 약 2 내지 10개의 뉴클레오티드를 인식할 수 있다. 기타 바람직한 양태는 길이가 약 30개 이하의 뉴클레오티드, 보다 더욱 바람직하게는 길이가 약 20개 이하의 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열을 인식할 수 있는 효소적 DNA 분자를 고려한다.

상기 언급된 방법은 효소적 DNA 분자의 인식 도메인의 뉴클레오티드 서열을 변형시킴으로써 모든 뉴클레오티드 서열에서의 절단을 허용시켜 준다. 이로써 제한 엔도뉴클레아제의 부재하에서도 특정의 선택된 위치에서 일본쇄 핵산의 절단이 가능해진다.

본 발명의 효소적 DNA 분자는, 적절한 절단 부위에서 부위-특이적 가수분해에 의해 효소적 DNA 분자에 부착되어 있는 일본쇄 핵산 기질의 어떠한 분획으로부터도 분리시킬 수 있다. 상기 기질(또는 "절단 생성물")로부터 효소적 DNA 분자를 분리시킴으로써 상기 효소적 DNA 분자가 또다른 절단 반응을 수행할 수 있다.

일반적으로, 핵산 기질은 유효한 양의 본 발명의 효소적 DNA 분자를 사용하여 적당한 핵산 절단 조건, 바람직하게는 생리학적 조건하에서 처리한다. 이러한 핵산 기질이 DNA를 포함하는 경우, 절단 조건은 약 2 내지 10mM 농도의 2가 양이온의 존재를 포함할 수 있다.

효소적 DNA 분자의 유효한 양은 일본쇄 핵산내에 존재하는 예정된 염기 서열을 절단시키는데 필요한 양이다. 바람직하게는, 효소적 DNA 분자는 이러한 DNA 분자 대 기질 절단 부위의 몰비가 1 대 20이 되는 양으로 존재한다. 이러한 비는 사용된 특정의 핵산 절단 조건하에서 특정의 효소적 DNA 분자의 처리 기간과 효능에 따라서 다양할 수 있다.

따라서, 한가지 바람직한 양태에서, 처리 방법은 전형적으로 RNA-함유 기질과 효소를 수용액중에서 혼합하여 절단 혼합물을 형성시키는 단계, 및 이로써 형성된 혼합물을, 효소적 DNA 분자가 RNA에 존재하는 어떠한 예정된 뉴클레오티드 서열에서도 RNA 기질을 절단하기에 충분한 기간 동안 RNA 절단 조건하에서 유지시키는 단계를 수반한다. 각종 양태에서는, 이온 공급원, 즉 1가 또는 2가 양이온, 또는 이들 둘 다가 또한 제공된다.

본 발명의 한 양태에서, 효소적 DNA 분자가 일본쇄 핵산을 절단시키는데 필요한 기간이 예정되었다. 이러한 기간은 약 1분 내지 약 24시간이고 반응물 농도와 반응 온도에 따라서 다양할 것이다. 통상적으로, 이러한 기간은 효소적 DNA 분자가 존재하는 어떠한 예정된 뉴클레오티드 서열에서도 일본쇄 핵산을 절단시키도록 하는 약 10분 내지 약 2시간이다.

본 발명은 핵산 절단 조건이 약 2 내지 100mM 농도의 2가 양이온의 공급원(예, PbOAc)의 존재를 포함하는 것을 추가로 고려한다. 전형적으로, 핵산 절단 조건은 약 2 내지 10mM 농도, 특히 바람직하게는 약 5mM 농도의 2가 양이온을 포함한다.

핵산 절단 조건에 포함되는 최적의 양이온성 농도는 소정의 양이온 농도에서 절단된 일본쇄 핵산의 양을 결정함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 당해 분야의 숙련인은 이러한 최적 농도가 사용된 특정의 효소적 DNA 분자에 따라서 다양할 수 있음을 이해할 것이다.

본 발명은 핵산 절단 조건이 pH 약 6.0 내지 약 9.0을 포함하는 것을 추가로 고려한다. 한가지 바람직한 양태에서는, pH 범위가 약 6.5 내지 8.0이다. 또다른 바람직한 양태에서는, pH가 생리학적 조건에 필적하는데, 즉 pH가 약 7.0 내지 7.8이며, 약 7.5의 pH가 특히 바람직하다.

당해분야의 숙련인은 핵산 절단에 사용된 pH가 효소적 DNA 분자를 활성 형태로 유지시킬 수 있는 pH인 한, 광범위한 pH 범위에 걸쳐 작용할 것이라는 것을 인지할 것이다. 활성 형태의 효소적 DNA 분자는 예정된 뉴클레오티드 서열에서 일본쇄 핵산을 절단시키는 능력으로 용이하게 검정할 수 있다.

각종 양태에서, 핵산 절단 조건은 또한 광범위한 온도를 포함한다. 앞서 언급한 바와 같이, 생리학적 조건에 부합되는 온도 범위가 특히 바람직하긴 하지만, 산업적 적용에 부합되는 온도 범위가 또한 본원에서 고려된다. 한 양태에서는, 이러한 온도 범위가 약 15 내지 약 60℃이다. 또다른 양태에서는, 핵산 절단 조건이 약 30 내지 약 56℃의 온도 범위를 포함한다. 다른 양태에서는, 핵산 절단 조건이 약 35 내지 약 50℃의 온도 범위를 포함한다. 바람직한 양태에서는, 핵산 절단 조건이 약 37 내지 약 42℃의 온도 범위를 포함한다. 핵산 절단 조건에 부합되는 온도 범위는 목적하는 절단 속도, 및 그러한 특정의 온도에서 특정의 효소적 DNA 분자의 안정성에 의해서만 제한된다.

각종의 방법에 있어서, 본 발명은 폴리아민의 존재를 포함하는 핵산 절단 조건을 고려한다. 본 발명을 실시하는데 유용한 폴리아민으로는 스페르미딘, 푸트레신, 스페르민 등이 있다. 이의 한 양태에서는, 폴리아민이 약 0.1mM 내지 약 10mM의 농도로 존재한다. 또다른 양태에서는, 폴리아민이 약 1mM 내지 약 10mM의 농도로 존재한다. 핵산 절단 조건은 또한 약 2mM 내지 약 5mM 농도의 폴리아민의 존재를 포함할 수 있다. 각종의 바람직한 양태에서, 폴리아민은 스페르미딘이다.

G. 벡터

본 발명은 또한, 바람직하게는 본 발명의 효소적 DNA 분자를 표적 세포(예, 식물 또는 동물 세포)내에서 발현시킬 수 있는 방식으로, 벡터내에 놓여진 상기 효소적 DNA 분자를 암호화하는 핵산 분절을 포함하는 발현 벡터를 특징으로 한다.

따라서, 일반적으로, 본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 플라스미드, 코스미드, 파아지미드, 바이러스 또는 파아지 벡터를 포함한다. 바람직하게는, 적합한 벡터는 일본쇄 DNA(ssDNA), 예를 들면, 환상의 파아지미드 ssDNA를 포함한다. 본 발명에 따른 유용한 벡터가 반드시 환상일 필요는 없다는 것을 또한 인지해야 한다.

한가지 양태에서는, 부가의 효소적 DNA-암호화 서열 각각을 플랭킹하는 뉴클레오티드 서열이 제공되는 것이 바람직하며, 이러한 서열은 제1 효소적 DNA 분자에 의해 인식될 수 있다. 개재 또는 플랭킹 서열은 바람직하게는 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고; 더욱 바람직하게는, 상기 개재 또는 플랭킹 서열의 길이가 약 2 내지 20개의 뉴클레오티드, 특히 바람직하게는 약 5 내지 10개의 뉴클레오티드이다.

폴리뉴클레오티드 꼬리(tail)의 부가는 본 발명에 따른 효소적 DNA 분자의 3' 말단을 보호하는데 유용할 수도 있다. 이들은 효소 말단 트랜스퍼라제를 사용함으로써 중합체성 서열을 부착시켜 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 2개 이상의 효소적 DNA 분자를 포함한다. 한 양태에서는, 제1 효소적 DNA 분자가 분자내 절단 활성을 가지며 뉴클레오티드 서열을 인식 및 절단하여 다른 효소적 DNA 서열을 방출시킬 수 있는데, 즉 벡터로부터 다른 효소적 DNA 분자를 "방출"시키도록 작용할 수 있다. 예를 들면, 벡터는, 제1 효소적 DNA 분자를 발현시킬 때, 이러한 제1 분자가 제2 효소적 DNA 분자, 제3 효소적 DNA 분자 등을 암호화하는 부가의 뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 뉴클레오티드 서열을 절단시킬 수 있도록 작제하는 것이 바람직하다. 상기 제1 효소적 DNA 분자(즉, "방출" 분자)가 올리고뉴클레오티드 서열을 분자간 절단시킬 수 있는 것으로 가정해보면, 부가의(예, 제2, 제3 등) 효소적 DNA 분자(즉, "방출된" 분자)가 "방출" 분자와 동일한 특징들을 보유할 필요는 없다. 예를 들면, 한 양태에서는, "방출된"(즉, 제2, 제3 등) 효소적 DNA 분자가 특이적 RNA 서열을 절단할 수 있는 반면, 제1("방출") 효소적 DNA 분자는 "방출된" 분자를 분리시켜 주는 뉴클레아제 활성을 갖는다. 또다른 양태에서는, "방출된" 효소적 DNA 분자가 아미드 결합 -절단 활성을 갖는 반면, 제1("방출") 효소적 DNA 분자는 뉴클레아제 활성을 갖는다.

또다른 방법으로는, 제1 효소적 DNA 분자를 제2(및 제3, 제4 등) 효소적 DNA 분자(들)과는 별개의 벡터상에서 암호화시킬 수 있으며 분자간 절단 활성을 지닐 수 있다. 본원에서 언급한 바와 같이, 제1 효소적 DNA 분자는 자가-절단성 효소적 DNA 분자(예, 데옥시리보자임)일 수 있고 제2 효소적 DNA 분자는 목적하는 어떠한 유형의 효소적 DNA 분자일 수 있다. 벡터가 상기 핵산 서열로부터 DNA를 발현시키는 경우, 이러한 DNA는 적당한 조건하에서 각각의 플랭킹 영역을 절단시키는 능력을 가짐으로써 제2 효소적 DNA 분자의 하나 이상의 복사물을 방출시킨다. 경우에 따라, 몇몇 상이한 제2 효소적 DNA 분자가 동일한 세포 또는 담체내에 위치하여 상이한 데옥시리보자임을 생성시킬 수 있다. 어떠한 하나 이상의 벡터도 "방출" 및 "방출된" 효소적 핵산 서열의 모든 조합으로 하나 이상의 리보자임 또는 데옥시리보자임을 포함할 수 있는데, 이때 상기 조합은 목적하는 결과, 즉 예정된 핵산 서열을 절단시킬 수 있는 효소적 핵산 분자의 방출을 달성시켜야 한다.

본 발명의 효소적 DNA 분자를 분리 및 정제하는 방법이 또한 고려된다. 본원에서 기술된 방법 이외에, 각종 정제 방법(예, HPLC를 사용하는 방법) 및 크로마토그래피 분리 기술이 당해 분야에서 사용가능하다[예를 들면, 본원에서 참조문헌으로 삽입된 국제공개공보 WO 93/23569에 기술된 방법 참조].

본원에서 기술된 양태의 각종 조합이 본 발명의 범주내에 포함된다는 것을 또한 인지해야 한다. 본 발명의 기타 특징 및 이점이 상기 명세서, 다음 실시예 및 청구의 범위로부터 명백할 것이다.

다음 실시예는 본 발명을 예시하는 것이나, 이를 제한하지는 않는다.

실시예 1

효소적 DNA 분자의 시험관내 진화

개요

시험관내 선별 및 시험관내 진화 기술은 새로운 촉매의 조성이나 구조에 관한 사전 지식없이도 이러한 촉매의 분리를 가능하게 한다. 이러한 방법은 신규의 촉매적 특성을 갖는 RNA 효소를 수득하는데 사용하여 왔다. 예를 들면, 납 양이온 사용으로 자기분해적 절단이 진행되는 리보자임을 tRNA^Phe분자의 랜덤화된 풀로부터 유도시켜 왔다[참조: Pan and Uhlenbeck, Biochemistry 31: 3887-3895, 1992]. DNA를 절단시킬 수 있는 그룹 Ⅰ리보자임 변이체[참조: Beaudry and Joyce, Science 257: 635-641, 1992] 또는 변형된 금속 의존성을 지닌 그룹 Ⅰ리보자임 변이체[참조: Lehman and Joyce, Nature 361: 182-185, 1993]를 분리시켰다. 랜덤 RNA 서열의 풀로 출발하여, 폴리머라제-유사 반응을 촉매하는 분자를 수득하였다[참조: Bartel and Szostak, Science 261: 1411-1418, 1993]. 본 실시예에는, 시험관내 진화 과정시의 선별 제한 사항의 변형을 통해 진화된 효소의 특이적 촉매적 특성을 정련시키는 것이 기술되어 있다.

다윈의 진화론은 다음 3가지 공정을 반복적으로 작동시켜야 한다: (a) 유전적 변이의 도입 공정; (b) 몇몇 적합성 여부 기준을 근거로 하여 개체를 선별하는 공정; 및 (c) 이와 같이 선별된 개체를 증폭시키는 공정. 이들 각각의 공정은 시험관내에서 실현시킬 수 있다[참조: Joyce, Gene 82, 1989]. 특정 유전자를 화학적 변형, 랜덤화된 변이유발성 올리고데옥시뉴클레오티드의 혼입, 또는 폴리머라제에 의한 부정확한 복제에 의해 돌연변이시킬 수 있다[참조: Cadwell and Joyce, PCR Methods and Applications 2; 28-33, 1992; Cadwell and Joyce, PCR Methods and Applications 3(Suppl.): S136-S140, 1994; Chu et al., Virology 98: 168, 1979; Shortle et al., Meth. Enzymol. 100: 457, 1983; Myers et al., Science 229: 242, 1985; Matteucci et al., Nucleic Acids Res. 11: 3113, 1983; Wells et al., Gene 34: 315, 1985; McNeil et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3545, 1985; Hutchison et al., PNAS USA 83: 710, 1986; Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Zakour et al., Nature 295: 708, 1982; Lehtovaara et al., Protein Eng. 2: 63, 1988; Leung et al., Technique 1: 11, 1989; Zhou et al., Nucl. Acids Res. 19: 6052, 1991].

유전자 생성물은, 예를 들면, 리간드와 결합하는 능력 또는 화학적 반응을 수행하는 능력이 있는지의 여부로 선별할 수 있다[참조: Joyce, Id., 1989; Robertson and Joyce, Nature 344: 467, 1990; Tuerk et al., Science 249: 505, 1990]. 선별된 유전자 생성물에 상응하는 유전자는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 상호 프라이머 방법으로 증폭시킬 수 있다[참조: Saiki et al., Science 230: 1350-54, 1985; Saiki et al., Science 239: 487-491, 1988].

또다른 방법으로는, 핵산 증폭을 지속성 서열 복제(3SR)를 이용하여 수행할 수 있다[참조: Guatelli et al., PNAS USA 87: 1874, 1990, 본원에 참조문헌으로 도입됨]. 3SR 방법에 따르면, 표적 핵산 서열을, 레트로바이러스 복제에 필수적인 3가지 효소적 활성, 즉 (1) 역전사효소, (2) RNase H 및 (3) DNA-의존성 RNA 폴리머라제를 사용함으로써 등온 조건하에 시험관내에서 지수적으로 증폭(복제)시킬 수 있다. cDNA 중간체를 통해 레트로바이러스성 RNA 복제과정을 모사함으로써, 상기 반응으로 인해 본래 표적의 cDNA 및 RNA 복사체가 축적된다.

요약하면, 효소적 DNA 분자 집단을 진화시키고자 하는 경우에는, 지속적인 일련의 역전사 및 전사 반응이 cDNA 중간체를 통해 RNA 표적 서열을 복제시켜 준다. 이러한 고안의 결정적인 요소는 다음과 같다: (a) 올리고뉴클레오티드 프라이머가 상기 표적을 특정화할 뿐만 아니라 T7 RNA 폴리머라제 결합 부위를 암호화하는 5' 연장부를 함유하여, 생성된 cDNA가 적격한 전사 주형이 되도록 하고; (b) cDNA 합성을 진행시켜, RNase H에 의한 중간체 RNA-DNA 하이브리드에서 주형 RNA의 분해로 인해 양쇄를 완성시킬 수 있으며; (c) 이러한 반응 생성물(cDNA 및 RNA)이 지수적 복제를 가능케하면서 연속 단계에 대한 주형으로서 작용할 수 있다.

효소적 DNA 분자를 진화시키고자 하는 경우에는, 상기 고안의 각종 결정적 요소가 본 실시예에 기술된 바와 같이 다소 상이하다. 예를 들면, (1) 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표적을 특정화하고 바람직하게는 몇몇 방식으로, 예를 들면, 바이오틴화를 통해 "표식"되거나 표지되어, 생성된 적격한 주형 쇄가 용이하게 동정되며; (2) 사용된 시험관내 선별과정이 바람직하게는 가장 선호되는 방출 기전의 확인에 좌우된다.

다윈의 진화론을 시험관내에서 실현시키는데 있어서의 주요 장애는 둘다 유전형과 관련된 돌연변이와 증폭과정을, 표현형과 관련된 선별과정과 통합시켜야 한다는 것이다. 유전형과 표현형이 동일한 분자내에서 구체적으로 표현되는 핵산 효소의 경우에는, 상기 과제가 간단해진다.

A. 효소적 DNA 분자의 고안

일본쇄 DNA가 관심있는 3차원 구조로 추정될 수 있는 것은 널리 공지되어 있다. "tDNA"의 구조는, 예를 들면, 상응하는 tRNA의 구조와 상당히 유사하다[참조: Paquette et al., Eur. J. Biochem. 189: 259-265, 1990]. 더욱이, 적어도 몇몇 촉매적 활성은 보유하면서, 해머헤드 리보자임내에서 35개 리보뉴클레오티드중의 31개 리보뉴클레오티드 정도를 대체시킬 수 있다[참조: Perreault et al., Nature 344: 565-567, 1990; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 918-921, 1992; Yang et al., Biochemistry 31: 5005-5009, 1992].

시험관내 선별 기술을 랜덤-서열 DNA의 거대 집단에 적용하였는데, 이로써 높은 친화도로 표적 리간드와 결합하는 특이적 DNA "아프타머"를 회수한다[참조: Bock et al., Nature 355: 564-566, 1992; Ellington ＆ Szostak, Nature 355: 850-852, 1992; Wyatt ＆ Ecker, PNAS USA 91: 1356-1360, 1994]. 최근에는, 2개의 그룹이 아프타머, 즉 G-사중선 구조를 형성하고 단백질 트롬빈과 높은 친화도로 결합하는 15량체 DNA의 1차 NMR 구조적 결정을 성취하였다[참조: Wang et al., Biochemistry 32: 1899-1904, 1993; Macaya et al., PNAS USA 90: 3745-3749, 1993]. 이러한 발견은 X-선 결정학적 분석에 의해 확인되었다[참조: Padmanabhan et al., J. Biol. Chem. 268: 17651-17654, 1993].

높은 친화도 및 특이성으로 기질 분자와 결합하는 능력은 우수한 효소의 필수조건이다. 또한, 효소는 자체내에 또는 조인자내에 적절히 위치된 작용성 그룹을 사용하여 특정의 화학적 형질전환을 증진시켜야만 한다. 더욱이, 효소는 반응 전과정에 걸쳐서 변하지 않은채로 유지되어야만 하고 촉매적 교체하에 작동시킬 수 있어야 한다. 효소가, 이의 특정 순서 배열이 촉매적 활성에 영향을 미치는 아단위(subunit)로 구성된, 정보 제공용 거대분자이어야 한다는 필수조건이 첨가될 수도 있다. 이들 기준이 의미론상 근거와 화학적 근거 모두에 대한 논쟁을 일으켰지만, 이들은 단순한 용매 효과에서부터 기질 확산 한계에서 작동하는 생물학적 효소의 화학적 속도 증진 현상을 구별시키는 작용을 한다[참조: Albery ＆ Knowles, Biochemistry 15: 5631-5640, 1976].

다음에 보다 상세히 기술될 바와 같이, 본 발명자들은 랜덤 서열로부터 출발하여 DNA 촉매 및 DNA 효소를 신속하게 수득하는 일반적인 방법을 개발하고자 하였다. 초기 표적으로서, 본 발명자들은 DNA 능력내에서 적합한 것으로 생각되는 반응, 즉 2가 금속 조인자에 의해 보조된, RNA 포스포디에스테르의 가수분해적 절단을 선택하였다. 이는 해머헤드 및 헤어핀 모티브를 포함하는 각종 천연 RNA 효소에 의해 수행된 것과 동일한 반응이다[참조: Forster A. C. ＆ Symons R. H., Cell 49: 211-220, 1987; Uhlenbeck, Nature 328: 596-600, 1987; Hampel ＆ Tritz, Biochemistry 28: 4929-4933, 1989].

최근에, tRNA 분자의 랜덤화된 라이브러리로 시작하여, 중성 pH에서 Pb²⁺-의존성이고 부위-특이적인 RNA 포스포에스테라제 활성을 갖는 리보자임을 수득할 수 있는 것으로 밝혀졌다[참조: Pan ＆ Uhlenbeck, Biochemistry 31: 3887-3895, 1992; Pan ＆ Uhlenbeck, Nature 358: 560-563, 1992]. 이는 tRNA내에서 한정된 부위에서 Pb²⁺ 이온의 특이적 배위에 의존하는[참조: Rubin ＆ Sundaralingam, J. Biomol. Struct. Dyn. 1: 639-646, 1983; Brown et al., Biochemistry 24: 4785-4801, 1985], 효모 tRNA^Phe의 예기치 않은 자가-분해 반응[참조: Dirheimer ＆ Werner, Biochimie 54: 127-144, 1972]과 유사하다.

본원에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 목표는 초기에는 DNA의 5' 말단에 부착된 짧은 리더 서열내에 존재하고 궁극적으로는 신속히 촉매적 교체시키면서 분자간 방식으로 절단될 수 있는 별개의 분자내에 위치된 특정의 RNA 포스포에스테르의 Pb²⁺-의존성 절단을 수행할 수 있는 DNA의 개발을 포함하였다. 이러한 목표는 다음에 추가로 기술되는 바와 같이 성공적으로 달성되었다.

이러한 DNA가 표적 포스포에스테르 및 주변의 뉴클레오티드와 어떻게 상호작용하는지에 관한 어떠한 가정도 하지 않았다. 약 10¹⁴개 랜덤 50량체 서열의 풀로 시작하여, 시험관내 선별과정을 수행한다. 4일간에 걸쳐 5라운드의 선별을 수행한 후에, 집단 전체는 1mM Pb²⁺의 존재하에서 약 0.2min^-1의 속도로 표적 포스포에스테르를 절단시키는 능력을 획득하였다. 이는 동일한 반응 조건하에서 자발적인 절단속도에 비해 약 10⁵배 증가된 것이다.

상기 집단으로부터 개체를 분리하고, 이의 서열을 분석하고 촉매적 활성에 대해 분석한다. 이러한 정보를 근거로 하여, 상기 반응을, 1mM PbOAc의 존재하에서 23℃ 및 pH 7.0에서 1min^-1의 교체도로 진행되는 반응에서, 분자간 포맷으로 전환시킨 다음 단순화하여 38량체 DNA 효소에 의한 19량체 기질의 부위-특이적 절단을 수행할 수 있다.

B. 시험관내 선별 반응 도식

약 10¹⁴개 일본쇄 DNA 분자(이들 모두는 5' 바이오틴 잔기를 함유한다)의 출발 풀을 생성시킨 다음, 연속적으로 단일 리보뉴클레오티드를 포함하는 고정된 도메인, 50개 랜덤 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 잠재적 촉매적 도메인, 및 3' 말단에 위치한 제2의 고정된 도메인을 생성시킨다(도 1).

프라이머 결합 부위에 의해 플랭킹된 50개의 랜덤 뉴클레오티드를 함유한 합성 DNA로 시작하여 중첩(nested) PCR(폴리머라제 연쇄 반응)로 상기 풀을 작제한다. 중첩 PCR 프라이머는 3'-말단 아데노신 리보뉴클레오티드를 갖는 5'-바이오틴화된 합성 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 리보뉴클레오티드-말단처리된 올리고뉴클레오티드는 PCR의 작동하에서(L.E. Orgel, personal communication) 주형-지시된 연장을 효과적으로 개시하며, 이러한 경우에, 단일 봉매된 리보뉴클레오티드를 함유하는 연장 생성물이 생성된다.

도 1은 표적 RNA 포스포에스테르를 절단시키는 DNA를 분리시키기 위한 선별적 증폭 반응도식을 나타낸 것이다. 연속된 50개의 랜덤 뉴클레오티드를 함유하는 이본쇄 DNA를, 아데노신 리보뉴클레오티드(부호 "N" 또는 "rA"로 나타내며, 여기서 N과 rA는 모두 아데노신 리보뉴클레오티드를 나타낸다)에 의해 3'-말단이 종결된 5'-바이오틴화 DNA 프라이머(예, 프라이머 3--3a 또는 3b)를 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 이러한 프라이머를 Taq 폴리머라제에 의해 연장시켜, 봉매된 단일 리보뉴클레오티드를 함유하는 DNA 생성물을 수득한다. 이로써 생성된 이본쇄 DNA를 스트렙트아비딘 매트릭스상에 고정화시키고 바이오틴화되지 않은 DNA쇄를 0.2N NaOH로 세척함으로써 제거한다. 칼럼을 완충용액으로 재-평형화시킨 후, 이 칼럼을 1mM PbOAc가 첨가된 동일한 용액으로 세척한다. Pb²⁺-의존성 자가 절단이 진행되는 DNA를 칼럼으로부터 방출시키고 용출액을 수집한 다음, PCR로 증폭시킨다. 이어서, 이 PCR 생성물을 사용하여 선별적 증폭 반응의 다음 라운드를 시작한다.

이러한 PCR 생성물을 스트렙트아비딘 친화 매트랙스상으로 통과시키면, 이중체 DNA의 5'-바이오틴화 쇄의 비-공유적 부착이 이루어진다. 바이오틴화되지 않은 쇄는 0.2N NaOH로 간단히 세척함으로써 제거하고, 결합된 쇄는 23℃에서 0.5M NaCl, 0.5M KCl, 50mM MgCl₂, 및 50mM HEPES(pH 7.0)을 함유하는 완충액에서 평형시킨다. 이어서, 1mM PbOAc를 동일한 완충액에 제공하면, 표적 포스포에스테르에서 Pb²⁺-의존성 절단이 일어남으로써, 상기 DNA 서브셋트가 스트렙트아비딘 매트릭스로부터 방출된다. 원칙적으로, 개개의 DNA는 각종 수단, 예를 들면, 바이오틴과 스트렙트아비딘간의 상호작용의 파괴 또는 데옥시리보뉴클레오티드 연결중의 한 연결의 절단에 의해 스스로의 방출을 촉진시킬 지도 모른다. 상기 연결의 상대적 불안정성에 근거해 볼 때 리보뉴클레오사이드 3'-O-P 결합의 절단이 가장 설득력있는 방출 기전인 것으로 생각되며, Pb²⁺-의존성 가수분해적 절단이 방출을 가장 신속히 일으키는 것으로 생각된다. 그러나, 원칙적으로, 시험관내 선별 과정은 가장 바람직한 방출 기전을 확인해야 하며 또한 이들 각각은 상기 기전을 가장 잘 수행할 수 있어야 한다.

Pb²⁺의 첨가시 매트릭스로부터 방출된 DNA 분자를 용출액에 수집하고, 에탄올로 침전시켜 농축시킨 다음, 중첩 PCR 증폭을 수행한다. 분자의 출발 풀의 작제에서와 같이, 제1 PCR 증폭은 랜덤한 영역을 플랭킹하는 프라이머(프라이머 1 및 2)를 이용하며 제2 PCR 증폭은 3'-말단의 리보아데닐레이트를 갖는 5'-바이오틴화 프라이머(프라이머 3b)를 이용함으로써, 표적 RNA 포스포에스테르를 재도입시킨다. 전반적인 선별적 증폭과정를 수행하는데에는 3 내지 4시간이 소요된다.

상기 분자를 본 과정의 각 라운드 동안 3가지 방법으로 정제한다: 첫 번째, PCR 증폭 후, 페놀로 2회 추출하고 클로로포름/이소아밀 알콜로 1회 추출한 다음, 에탄올로 침전시켜 정제하고; 두 번째, DNA를 스트렙트아비딘에 부착시킨 후, 바이오틴화되지 않은 모든 분자를 강력한 변성 조건하에서 세척하여 제거함으로써 정제하며; 세 번째, Pb²⁺으로 용출시킨 후, 에탄올로 침전시킴으로써 정제한다. 겔 전기영동 정제 단계가 없으므로, 당해 분자를 특정한 길이로 제한하는 어떠한 선별 압력도 없다.

C. 촉매적 DNA의 선별

본 발명자들은 선별 과정의 엄격성을 점차적으로 증가시키기 위하여, Pb²⁺를 첨가한 후의 반응 시간을 점차적으로 단축시키면서 시험관내 선별 과정의 연속적인 5라운드를 수행하였다. 1 내지 3라운드 동안의 반응 시간은 1시간이고; 4라운드 동안의 반응 시간은 20분이며; 5라운드 동안의 반응 시간은 1분이다. 일본쇄 DNA의 출발 풀을 선별 과정의 각 라운드 후에 수득된 분자 집단과 함께, 시험관내 선별과정시 사용된 것과 동일한 조건하에서 자가-절단 활성에 대해 검정한다(도 2).

이러한 검정을 위해, 5'-바이오틴 잔기 보다는 5'-³²P를 사용하여 당해 분자를 준비함으로써, 출발 물질과 5' 절단 생성물 모두를 검출할 수 있다. 5분간 항온처리한 후에는, 초기 풀(GO) 또는 선별과정의 제1 및 제2 라운드 후에 수득한 집단에서는 검출가능한 활성이 나타나지 않았다. 제3 라운드 후에 수득한 DNA(G3)는 적당한 정도의 활성을 나타내었으며; 이러한 활성은 꾸준히 증가하여, 선별과정의 제5 라운드 후에 수득한 DNA의 경우에는 약 50％ 자가-절단에 도달한다. 절단은 장기간 항온처리한 후일지라도 표적 포스포에스테르에서만 검정되었다. Pb²⁺를 반응 혼합물로부터 생략하는 경우에는 상기 활성이 상실된다.

도 2는 DNA의 출발 풀(GO)과 선별 과정의 제1 내지 제5 라운드 후에 수득된 집단(G1-G5)의 자가 절단 활성을 나타낸다. 반응 혼합물은 50mM MgCl₂, 0.5M NaCl, 0.5M KCl, 50mM HEPES(23℃에서 pH 7.0), 및 3nM [5'-³²P]-표지된 DNA를 함유하며 1mM Pb0Ac의 존재하 또는 부재하에서 23℃하에 5분간 항온처리한다. 부호 Pre는 108-뉴클레오티드 전구체 DNA(서열 4)를 나타내고; Clv는 28-뉴클레오티드 5'-절단 생성물(서열 5)을 나타내고; M은 길이가 5'-절단 생성물에 상응하는 프라이머 3a (서열 6)를 나타낸다.

예시된 28-뉴클레오티드 5' 절단 생성물(Clv)은 바람직하게는 서열 5'-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATN-3'(여기서, "N"은 3' 말단상에 부가의 2', 3'-사이클릭 포스페이트를 갖는 아데노신 리보뉴클레오티드(서열 5)를 나타낸다)을 갖는다. 또다른 양태에서는, "N"이 분자의 3' 말단상에 부가의 2' 또는 3' 포스페이트를 갖는 아데노신 리보뉴클레오티드를 나타낸다.

도 2에서, "G0" 레인 "Pre" 밴드는 각각 50개 랜덤 뉴클레오티드를 포함하는 108-뉴클레오티드 전구체 DNA 샘플링을 포함한다. 따라서, 어떠한 소정의 "Pre" 샘플링도 광범위한 전구체 DNA를 함유할 것이고 각 샘플링은 아마도 전 및 후의 샘플링과는 상이할 것이다. "G1" 내지 "G5" 레인은 촉매적 DNA 분자가 점차적으로 풍부해지는 "Pre" 밴드를 함유하지만, 다수의 상이한 DNA 서열(즉, 50개 뉴클레오티드 랜덤화 도메인에서 상이한)도 여전히 함유한다. "G5 Pre" DNA와 상이한 이들 서열의 샘플은 도 3에 제시된다.

숏건(shotgun) 클로닝 기술을 이용하여 G5 집단으로부터 개체를 분리하고; 이어서, 이들 서브클론 중의 20개의 완전한 뉴클레오티드 서열을 결정한다(도 3 참조)[또한, 참조: Cadwell and Joyce, PCR Methods and Applications 2; 28-33, 1992; Cadwell and Joyce, PCR Methods and Applications 3(Suppl.): S136-S140, 1994]. 20개 서열 중에서, 5개는 독특하고, 2개는 2회 발견되며, 1개는 3회 발견되고 1개는 8회 발견되었다. 개개의 변이체 모두는 DNA의 출발 풀에서 랜덤화시킨 50-뉴클레오티드 영역내에 공통의 서열 요소를 공유한다. 이들은 모두 2개의 추정된 주형을 함유하는데, 이중 하나는 절단 부위로부터의 바로 상류에 위치한 연속적인 뉴클레오티드에 대한 상보성을 지니며, 다른 하나는 4개 이상의 뉴클레오티드 하류에 위치한 뉴클레오티드에 대한 상보성을 지닌다. 이들 2개의 추정된 주형 영역 사이에는 1 내지 11개 뉴클레오티드의 가변성 도메인, 그 다음에는 고정된 서열 5'-AGCG-3', 3 내지 8개 뉴클레오티드의 두 번째 가변성 영역, 및 마지막으로는 고정 서열 5'-CG-3' 또는 5'-CGA-3'가 놓여진다. 2개의 추정된 주형 영역 외부에 위치한 뉴클레오티드는 서열과 길이 모두가 고도로 가변성이다. 서열분석된 모든 서브클론에서는, 50개의 초기-랜덤화된 뉴클레오티드에 상응하는 영역이 총 50개의 뉴클레오티드 길이를 유지한다.

도 3은 선별과정의 5라운드 후에 집단으로부터 분리시킨 개개의 변이체의 서열 정렬을 나타낸 것이다. 고정된 기질 도메인[5'-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATrAGGAAGAGATGGCGAC-3', 또는 5'-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATNGGAAGAGATGGCGAC-3'(여기서, N은 아데노신 리보뉴클레오티드이다)](서열 13)은 상단에 나타냈으며, 여기서 표적 리보아데닐레이트는 역삼각형으로 동정되었다. 추정된 염기쌍 형성 상호작용에 통상적으로 수반되는 기질 뉴클레오티드는 세로 막대로 표시된다. 50개의 초기-랜덤화 뉴클레오티드에 상응하는 서열은 기질 도메인에 대해 역평행 방향으로 정렬된다. 모든 변이체는 고정된 서열 5'-CGGTAAGCTTGGCAC-3'(서열 1)("프라이머 부위; 도시되지 않음)에 의해 3'-종결된다. 기질 도메인과의 염기쌍을 형성하는 것으로 예상되는 초기-랜덤화 영역내의 뉴클레오티드는 도 3의 우측과 좌측에 지시되어 있으며; 당해 효소적 DNA 분자의 추정상의 염기쌍-형성(또는 기질 결합) 영역은 도시된 각 서열에서 개별적 상자 모양으로 나타내었다. 추정상의 촉매적 도메인내에 고도로 보존된 뉴클레오티드는 2개의 상자 모양으로 나타내었다.

부가의 데이터가 촉매적 도메인의 중요한 2차 구조 모델을 작제하는데 있어 유용할 것으로 예상되긴 하지만, 본 발명자들은 해머헤드 및 헤어핀 리보자임과 마찬가지로, 본 발명의 효소적 DNA 분자의 촉매적 도메인이 염기쌍 형성 상호반응을 통해 기질과 상호작용하는 2개의 기질 결합 영역(또는 인식 도메인)에 의해 플랭킹된 보존된 코어를 함유하는 것으로 여겨진다. 해머헤드 및 헤어핀 리보자임과 유사하게, 당해 촉매적 DNA도 또한 염기쌍 형성에 수반되는 2개의 영역 사이에 쌍을 이루지 않고 연속된 짧은 기질 뉴클레오티드 (이 경우에서는 5'-GGA-3')를 필요로 하는 것으로 여겨진다.

9개의 별개의 돌연변이체 각각이, 기질 도메인과의 상이한 패턴의 예정된 상보성을 나타낸다는 것도 흥미로운 일이다. 몇몇 경우에는, 염기쌍이 근접하여 형성되는 반면, 다른 경우에서는 하나 이상의 비-상보적 쌍에 의해 개입중단된다. 일반적인 경향은 절단 부위로부터 상류에 위치한 뉴클레오티드와의 상호작용이 하류에 위치한 뉴클레오티드와의 상호작용에 비해 보다 단단한 상호작용을 형성하는 것으로 여겨진다. 결합 연구와 부위-지시된 돌연변이 유발 분석은 본 발명자들이 추가의 고찰을 획득하게 해주고 본 추측을 추가로 입증시켜 주어야 한다.

촉매 기능에 대한 서열 요구사항에 관한 추가의 고찰을 획득하기 위하여, 9개 돌연변이체 중에서 6개의 돌연변이체의 자가-절단 활성을 본원에 기술된 선별 조건(도 3 참조)하에서 시험하고 평가한다. 예상대로, 20개 서브클론 중의 8개에서 발견된 서열이 가장 반응성인 것으로 입증되었으며, 이때 최고의 속도 상수는 1.4min^-1이다. 연구된 돌연변이체 모두는 자가-절단 분석에서 활성이며 표적 RNA 포스포에스테르에서의 절단에 상응하는 단일 5'-표지된 생성물을 생성시킨다.

우세한 서브클론을 각종 반응 조건하에서 추가로 분석한다. 이의 자가 절단 활성은 Pb²⁺에 의존적이지만, Mg²⁺가 반응 혼합물로부터 생략되는 경우에는 영향을 받지 않는다. Na⁺ 또는 K⁺로 충족될 수 있는, 1가 양이온에 대한 요구조건이 마찬가지로 존재한다. 0 내지 1.0M(r=0.998) 범위에 걸쳐 1가 양이온의 농도를 증가시키면 반응 속도가 이와 비례해서 증가하였다. 당해 반응에 영향을 미칠 수 있는 기타 변수, 예를 들면, pH, 온도 및 기타 2가 금속의 존재여부가 추가로 평가된다.

실시예 2

재료 및 방법

A. 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 동족체

합성 DNA 및 DNA 동족체를 오페론 테크놀로지(Operon Technologies)로부터 구입한다. 19-뉴클레오티드 기질 5'-pTCACTATrAGGAAGAGATGG-3'(또는 5'-pTCACTATNGGAAGAGATGG-3')(여기서, "N"은 아데노신 리보뉴클레오티드를 나타낸다)(서열 7)을, 주형 5'-CCATCTCTTCCTATAGTGAGTCCGGCTGCA-3'(서열 9)을 사용하여 앞서 기술된 바와 같이[참조: Breaker, Banerji ＆ Joyce, Biochemistry 33: 11980-11986, 1994] 5'-pTCACTATrA-3'(또는 5'-pTCACTATN-3', 여기서 "N"은 아데노신 리보뉴클레오티드를 나타낸다)(서열 8)의 역전사효소 촉매된 연장에 의해 제조한다. 프라이머 3, 즉 5'-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATrA-3'(또는 5'-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATN-3', 여기서 "N"은 아데노신 리보뉴클레오티드를 나타낸다)(서열 6)을 [γ -³²P]ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 5'-표지시키거나(프라이머 3a) [γ-S]ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 5'-티오포스포릴화시킨 다음, 연속적으로 N-요오도아세틸-N'-바이오티닐헥실렌디아민으로 바이오틴화시킨다(프라이머 3b).

B. DNA 풀 제조

DNA의 출발 풀을, 합성 올리고머 5'-GTGCCAAGCTTACCG-N₅₀-GTCGCCATCTCTTCC-3'(서열 4)(여기서, N은 G, A, T 및 C의 등몰 혼합물이다)를 사용하여 PCR로 제조한다. 랜덤화 올리고머 500pmoles, 프라이머 1(5'-GTGCCAAGCTTACCG-3', 서열 10) 1000pmoles, 프라이머 2(5'-CTGCAGAATTCTAATACGACTCACTATAGGAAGAGATGGCGAC-3', 서열 11) 500pmoles, 프라이머 3b 500pmoles, 10μ Ci[α -³²P]dATP 및 0.2U㎕^-1 Taq DNA 폴리머라제를 함유하는 2-㎖ PCR을 50mM KCl, 1.5mM MgCl_2, 10mM Tris-HCl(pH 8.3, 23℃), 0.01％ 젤라틴 및 각 dNTP 0.2mM의 존재하에서 92℃에서 1분, 50℃에서 1분 및 72℃에서 2분 동안 항온처리한 다음, 92℃에서 1분, 50℃에서 1분 및 72℃에서 1분 동안 5주기로 배양한다. 생성된 혼합물을 페놀로 2회 추출한 다음 클로로포름/이소아밀 알콜로 1회 추출하고, DNA를 에탄올로 침전시켜 분리시킨다.

C. 시험관내 선별

DNA의 출발 풀을 완충액 A[1M NaCl 및 50mM HEPES(23℃에서 pH 7.0)] 500μL에 재현탁시키고 스트렙트아비딘 칼럼(AffiniTip Strep 20, Genosys, The Woodlands, TX) 상으로 반복적으로 통과시킨다. 이 칼럼을 완충액 A 100㎕ 용량으로 5회 세척한 다음 0.2N NaCl 100㎕ 용량으로 5회 세척한 후, 완충액 B[0.5M NaCl, 0.5M KCl, 50mM MgCl₂ 및 50mM HEPES(23℃에서 pH 7.0)] 100㎕ 용량으로 5회 평형시킨다. 고정화된 일본쇄 DNA를 1mM PbOAc가 첨가된 완충액 B 20㎕의 용량으로 1시간에 걸쳐 3회 용출시킨다. 전반적인 고정화 및 용출 공정은 23℃에서 수행한다. 용출액을 등용량의 완충액 C[50mM HEPES(23℃에서 pH 7.0) 및 80mM EDTA]에 수집하고 DNA를 에탄올로 침전시킨다.

생성된 DNA를 프라이머 1 20pmole, 프라이머 2 20pmole, 0.05U㎕^-1 Taq DNA 폴리머라제, 50mM KCl, 1.5mM MgCl_2, 10mM Tris-HCl(pH 8.3, 23℃), 0.01％ 젤라틴 및 각 dNTP 0.2mM을 함유하는 100-μL PCR에서, 92℃에서 10초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 30주기로 증폭시킨다. 반응 생성물을 페놀로 2회 추출한 다음 클로로포름/이소아밀 알콜로 1회 추출하고, DNA를 에탄올로 침전시켜 회수한다. 증폭된 DNA 약 4pmole을 프라이머 1 100pmole, 프라이머 3b 100pmole, 20μ Ci[α-³²P]dATP 및 0.1U㎕^-1 Taq DNA 폴리머라제를 함유하고, 92℃에서 1분, 50℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 10주기 동안 증폭시킨 200μ L의 용량으로 제2의 중첩 PCR에 가한다. 이 PCR 생성물을 1회 이상 추출하고 침전시켜 생성된 DNA를 완충액 A 50μ L에 재현탁시킨 다음, 이를 사용하여 선별과정의 다음 라운드를 시작한다.

제3 라운드 말기에서의 중첩 PCR을 100μ L 용량으로 수행하는 것을 제외하고는 제2 및 제3 라운드를 상기에서와 같이 수행한다. 제4 라운드 동안, Pb²⁺의 첨가 후의 용출 시간은 20분으로 단축되었으며(2개의 20㎕ 용출 용량), 회수된 DNA 중 절반만이 15 온도 주기만을 수반하는 제1 PCR에 사용된다. 제5 라운드 동안, 용출 시간은 1분으로 단축되었으며(2개의 20㎕ 용출 용량), 회수된 DNA 중 1/4만이 15 온도 주기를 수반하는 제1 PCR에 사용된다. 선별과정의 제5 라운드 후에 수득된 DNA를 앞서 기술한 바와 같이 서브클로닝한 다음 서열 분석한다[참조: Tsang ＆ Joyce, Biochemistry 33: 5966-5973 (1994)].

D. 촉매적 DNA의 역학적 분석

DNA 집단 및 각종의 서브클로닝된 개체를, 프라이머 3a 10pmole, 유입 DNA 0.5pmole 및 0.1U㎕^-1 Taq 폴리머라제를 함유하는 25-㎕ 반응 혼합물중에서, 상기 언급된 바와 같은 조건하에 92℃에서 1분, 50℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 10주기 동안 비대칭적 PCR에 의해 5'-³²P 표지시켜 제조한다. 생성된 [5'-³²P]-표지된 증폭 생성물을 10％ 폴리아크릴아미드/8M 겔에서 전기영동시켜 정제한다.

DNA를 완충액 B에서 10분 동안 예비 항온처리시킨 후에 자가 절단 검정을 수행한다. 1mM 최종 농도에 PbOAc를 첨가함으로써 반응을 개시하고 등용량의 완충액 C를 첨가함으로써 반응을 종결시킨다. 반응 생성물을 10％ 폴리아크릴아미드/8M 겔에서 전기영동시켜 분리한다. 다중 교체 조건하에서의 역학적 검정은 50㎍㎖^-1 BSA를 포함하는 완충액 B에서 수행하여 재료가 용기 벽에 유착되는 것을 방지한다. 기질 및 효소 분자를 Pb²⁺가 결핍된 반응 완충액에서 5분 동안 별개로 예비 항온처리한 다음, 합하고 1mM 최종 농도에 PbOAc를 첨가함으로써 반응을 개시한다.

실시예 3

분자간 절단시키는 데옥시리보자임의 진화

A. 분자간 포맷으로의 전환

연구된 돌연변이체의 촉매적 도메인과 기질 도메인 사이의 추정된 염기쌍 형성 상호반응의 다양한 패턴을 근거로 해보면, DNA-촉매된 반응을 분자간 포맷으로 전환시키는 것은 상당히 간단할 것으로 여겨진다. 이렇게 하는데 있어서, 본 발명자들은 촉매의 2개의 기질-결합 영역을 단순화시켜 각각의 영역이 기질과 차단되지 않고 연속적인 7 내지 8개의 염기쌍을 형성시키고자 하였다. 또한 본 발명자들은 2개의 염기쌍 형성 영역 및 중재 서열 5'-GGA-3'로 제한된 최소 기질을 제공하고자 하였다(도 4A).

도 4A 및 4B는 촉매적 교체가 진행되는 분자간 반응에 있어서 RNA 포스포에스테르의 DNA-촉매된 절단을 도시한 것이다. 도 4A는 19량체 기질과 38량체 DNA 효소간에 형성된 복합체를 다이아그램으로 나타낸 것이다. 상기 기질은 데옥시리보뉴클레오티드에 의해 플랭킹된 단일 아데노신 리보뉴클레오티드(화살표에 인접한 "rA" 또는 "N")를 함유한다. 합성 DNA 효소는 도 3에 도시된 가장 자주 발생하는 변이체의 38-뉴클레오티드 분획이다. 추정상의 촉매적 도메인내에 위치한 고도로 보존된 뉴클레오티드는 "상자 모양"으로 나타내었다. 도시된 바와 같이, 보존된 하나의 서열은 "AGCG"인 반면, 또다른 서열은 "CG"(5'→3' 방향으로 판독함)이다.

도 4B는 시험관내 선별과정시 사용된 것과 동일한 조건하에서 [5'-³²P]-표지된 기질의 DNA-촉매된 절단에 대한 K_m(마이너스 기울기) 및 V_max(y-절편)을 결정하기 위해 사용된 에디-홉스티(Eadie-Hofstee) 플롯을 나타낸 것이다. 5nM DNA 효소 및 0.125, 0.5, 1, 2 또는 4μ M 기질을 수반하는 반응에 대해서 초기 절단 속도를 결정한다.

촉매적 도메인을 고안하는데 있어서, 본 발명자들은 5' 말단에서 2개의 뉴클레오티드 및 3' 말단에서 11개의 뉴클레오티드 정도로 말단 절단된, 가장 반응성인 돌연변이체의 조성에 대부분 의존하였다. 2개의 주형 영역 사이에 위치한 15개 뉴클레오티드는 변하지 않은 채로 유지시키고 단일 뉴클레오티드를 3' 주형 영역에 삽입시켜 기질과 염기쌍을 형성할 수 있는 연속적인 뉴클레오티드를 형성시킨다. 이 기질을 서열 5'-TCACTATrA·GGAAGAGATGG-3'(또는 5'-TCACTATN·GGAAGAGATGG-3',여기서 "N"은 아데노신 리보뉴클레오티드를 나타낸다)(서열 12)로 단순화하였으며, 상기 서열에서 밑줄친 뉴클레오티드는 촉매적 DNA 분자와의 염기쌍 형성에 수반된 2개의 영역에 상응한다.

오로지 데옥시리보뉴클레오티드로만 구성된 38량체 촉매적 DNA 분자(촉매) 및 그밖의 모든 DNA 서열내에 봉매된 단일 리보뉴클레오티드를 함유하는 19량체 기질을 이용하는 상기 단순화된 반응 시스템은 신속한 교체하에 DNA-촉매된 포스포에 스테르를 효과적으로 절단시켜 준다. 0.01μ M 촉매와 1μ M 기질의 존재하에서 90분간 항온처리하면, 기질의 46％가 절단되는데, 이는 촉매의 46 교체에 상응한다. 이러한 반응의 예비 역학적 분석을 다중-교체 조건하에서 평가함으로써 수행한다. DNA 촉매는 미카엘-멘텐(Michaelis-Menten) 역학을 나타내며, 여기서 k_cat 및 K_m에 대한 값은 각각 1min^-1 및 2μ M이다(도 4B 참조). K_m에 대한 값은 왓슨-크릭 상호작용을 기준으로 한 촉매와 기질간의 예상된 해리 상수보다 상당히 더 크다. 기질을 동일한 반응 조건하(그러나 촉매의 부재하)에서 항온처리하며; 이때 4 × 10^-6min^-1의 k_uncat 값을 수득한다. 이는 pH 7.0 및 37℃에서 0.5mM Pb²⁺의 존재하에서 보다 불안정한 1-니트로페닐-1,2-프로판디올의 가수분해에 대해 보고된 5×10^-3min^-1의 값에 부합된다[참조: Breslow ＆ Huang, PNAS USA 88: 4080-4083, 1991].

포스포에스테르 절단 반응이, 말단 2'(3')-사이클릭 포스페이트를 갖는 5' 생성물 및 말단 5' 하이드록실을 갖는 3' 생성물을 생성시키면서, 인접한 포스페이트상의 리보뉴클레오사이드 2'-하이드록실에 의한 공격을 수반하는 가수분해적 기전을 통해 진행되는 것으로 본 발명에서 추정된다. 이러한 기전의 후원으로, T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 [γ -³²p]ATP를 사용하여 3'-절단 생성물을 효과적으로 인산화시키는데, 이는 유리 5'-하이드록실의 이용가능성과 부합된다(데이터는 제시되지 않음).

B. 토의

시험관내 선별과정의 5라운드 후에, 표적 RNA 포스포에스테르의 효과적인 Pb²⁺-의존성 절단을 촉매하는 일본쇄 DNA 분자 집단을 수득한다. 이러한 집단으로부터 분리된 대표적인 개체의 공통의 특징을 근거로 하여, 촉매적 도메인과 기질 도메인 모두의 단순화된 버전을 작제하여, 분자간 상황에서 신속한 촉매적 교체를 증명한다. 따라서, 38량체 촉매적 도메인은 DNA 효소의 한 예를 제공하거나 "데옥시리보자임"으로 불리울 수 있는 것의 예를 제공한다.

상기 분자가, 신속한 교체가 진행되고 미카엘-멘텐 역학을 따르는 반응에서 화학적 형질전환을 촉진시킬 수 있는, 정보를 지닌 거대분자라는 사실을 근거로 하여 이를 효소로 지칭하는 것은, 효소를 구성하는 것에 관한 모든 사람의 사고를 만족시킬 수 없다. 몇몇 사람들은 효소는 정의상 폴리펩티드이어야만 한다고 주장할 지도 모른다. 그러나, RNA 효소에 관한 개념을 받아드릴 수 있다면, 이와 유사한 관점에서 DNA 효소에 관한 개념도 받아드리는 것이 합리적인 것으로 사료된다. 본 발명자들이 랜덤-서열 DNA의 풀로부터 당해 분자를 얼마나 신속하게 생성시킬 수 있었는지를 고려하면, 합성 DNA 효소의 기타 많은 예가 미래에 나타날 것으로 예상된다.

RNA 포스포에스테르의 Pb²⁺-의존성 절단을 DNA 촉매에 대한 초기 표적으로서 선택하는데, 이는 이러한 반응이, 절단 부위에 인접하여 위치한 2'-하이드록실의 탈양성자화를 촉진시키기 위해, 배위된 Pb²⁺-하이드록실을 적절하게 위치시키는 것만을 요구하는 간단한 반응이기 때문이다[참조: Pan et al., The RNA World, Gesteland ＆ Atkins(eds.), pp. 271-302, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1993]. Pb²⁺는 푸린의 N7 위치, 구아닌의 O6 위치, 우라실의 O4 위치 및 시토신의 N3 위치와 배위하는 것으로 공지되어 있다[참조: Brown et al., Nature 303: 543-546, 1993]. 따라서, RNA에 비교해서 DNA의 당 조성과 형태의 상이성이, DNA가 명확한 Pb²⁺-결합 포켓을 형성하지 못하게 할수는 없을 것으로 여겨진다.

그밖의 모든 DNA 서열내에 단일 리보뉴클레오티드를 함유하는 기질을 선택하는데, 이는 상기 기질이 절단에 유리한 득특한 부위를 제공하고 생성된 어떠한 촉매적 활성도 DNA에 기인된 것이라는 것을 보장해 주기 때문이다. 기질 인식은 촉매와 기질간의 염기쌍 형성 상호작용의 두 영역에 의존하는 것으로 여겨진다. 그러나, 이들 두 영역사이에 위치한 쌍을 이루지 않은 기질 뉴클레오티드, 5'-GGA-3'가 기질 인식, 금속 배위, 또는 촉매적 기능의 다른 국면에 있어서 중요한 역할을 할 수도 있다.

모든-RNA 분자, 기타 RNA-DNA 복합체, 및 하나 이상의 뉴클레오티드 동족체를 함유하는 분자가 허용가능한 기질일 수 있는 것으로 또한 예상된다. 본원에서 기술된 바와 같이, 당해 시험관내 진화 과정을 성공적으로 사용하여 목적하는 특이성을 갖는 효소적 DNA 분자를 생성시킬 수 있으며; 이와 함께 추가의 분석이 현재 진행중이다.

또한, 효소와 기질간의 추정된 염기쌍 형성 상호반응이 서열 측면에서 보편화될 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 연구가 본원에 기술된 방법을 사용하여 진행중이다. 본원에 기술된 Pb²⁺-의존성 데옥시리보자임은 또한 DNA의 구조적 특성과 효소적 특성을 조사하기 위한 모델 화합물인 것으로 간주될 수 있다.

DNA 촉매를 신속하게 개발하기 위해 본원에서 이용된 방법들은 타당한 보편성을 지닐 것이며, 이로써 본 발명자들은 잠재적인 촉매적 도메인에 부착된 표적 연결의 절단을 유발시키는 다른 조인자를 이용할 수 있다. 이에 대하여, 생리학적 조건하에서 표적 RNA를 특이적으로 절단시키는 Mg²⁺-의존성 DNA 효소의 개발은 다른 양이온의 존재하에서 작용하는 DNA 효소의 개발에서와 같이(실시예 4 참조) 흥미로운 일이다. 이러한 분자는 표적 mRNA를 특이적으로 불활성화시키기 위한 전통적인 안티센스 및 리보자임 접근법에 대한 대체안을 제공해줄 것이다.

이로써 DNA는 효소적 활성을 나타낼 수 있는 생물학적 거대분자의 목록에 제시된 RNA 및 단백질에 합류하게 된다. DNA가 완전한 정도로 촉매적 능력을 나타내는지는 더 조사해야 하지만, 이들 조사는 본 연구에서 이용된 것과 같은 시험관내 선별과정을 근거로 하여 신속하게 진행되어야 한다.

DNA 효소는 다른 거대분자 촉매에 비해 몇몇 중요한 이점을 부여한다. 첫째, 상기 효소는 대부분의 실험실이 자동화 DNA 합성기를 사용하기가 쉽고 DNA 포스포르아미다이트의 비용이 그리 많이 들지 않는 경우에 제조하기가 용이하다는 것이다. 둘째, 상기 효소는 특히 RNA에 비해 매우 안정한 화합물이어서, 이들을 생물리학적 연구에 사용하기가 용이해진다는 것이다. 셋째, 상기 효소를, 현재 RNA 절단 활성이 결여되어 있는 안티센스 DNA을 사용하는 치료학적 적용에 응용할 수 있는 것으로 기대된다. 시험관내 선별과정은 포스포로티오에이트-함유 DNA와 같은, 뉴클레아제-내성 화합물을 포함하는 DNA 동족체를 사용하여 수행할 수 있는데, 이때 상기 동족체는 데옥시뉴클레오사이드 5'-트리포스페이트의 형태로 제조될 수 있고 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 의한 기질로서 허용되어야 한다. 최종적으로, DNA 효소는 촉매 기능에 관한 거대분자 기준에 대한 우리의 이해에 대한 새로운 관찰 기회를 부여한다는 것이다. 예를 들면, 동일한 화학적 형질전환을 촉매하는 단백질계, RNA계 및 DNA계 효소에 관한 비교 분석을 수행하는 것은 흥미로울 것이다.

실시예 4

기타 촉매적 DNA 그룹

DNA의 출발 풀이 40개의 랜덤 뉴클레오티드를 함유하는 분자를 포함한다는 것을 제외하고는, 필수적으로 상기 실시예 2.B.에서 기술된 바와 같이 PCR로 DNA의 출발 풀을 제조한다. 따라서, 본 실시예에 기술된 DNA의 출발 풀은 합성 올리고머 5'-GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rAGG AAG AGA TGG CGA CAT CTC N₄₀GT GAC GGT AAG CTT GGC AC 3'(서열 23)(여기서, N은 G, A, T 및 C의 등몰 혼합물이고 DNA 분자는 표적 rA 다음의 포스포에스테르를 절단시키는 능력에 대해 선별한다)를 사용하여 PCR로 제조한다(도 6A 참조).

선별적 증폭 과정을 Pb²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, 또는 Mg²⁺의 존재하에서 수행함으로써, 4가지 이상의 촉매적 DNA 분자 "그룹"을 생성시킨다. 도 5에 예시된 바와 같이, 특이적 활성을 입증하는 촉매적 DNA 분자는 각종 양이온의 존재하에서 생성된다.

도 5는 선별된 촉매적 DNA의 4가지 그룹의 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 입증하는 폴리아크릴아미드 겔을 도시하는 사진이다. 분자의 Pb²⁺-의존성 그룹의 선별을 대조군으로서 병행하는 방식으로 반복한다. 3개의 레인 각각에 있어서, 첫 번째 레인은 금속 양이온의 부재하에서는 선별된 집단의 활성이 결핍되어 있음을 나타내고, 두 번째 레인은 금속 양이온의 존재하에서의 보존된 활성을 나타내며 세 번째 레인은 출발 풀(GO)의 활성이 결핍되어 있음을 나타낸다. 현재, 반응성 순서는 상응하는 금속-수산화물의 pK_a를 반영하여 Pb²⁺＞Zn²⁺＞Mn²⁺＞Mg²⁺의 순으로 관찰된다.

미리 선별된 2가 양이온의 존재하에서 선별적 증폭 과정의 5(G5) 또는 6(G6) 라운드 후에, 목적하는 엔도뉴클레아제 활성을 수득한다. Mg²⁺의 존재하에서의 선별적 증폭과정에 관한 다음 설명은 예시를 위해 제시된 것이다.

시험관내 선별적 증폭과정의 6라운드를 상기 실시예 2에 기술된 방법에 따라서 수행하는데, 단 사용된 2가 금속은 1mM Pb²⁺가 아니라 1mM Mg²⁺이다[거의 동일한 과정을 기술하고 있는, 본원에 참조 문헌으로 삽입된 문헌 Breaker and Joyce, Chem. ＆ Biol. 1: 223-229, 1994 참조].

개개의 클론을 다음 제6 라운드로부터 분리하고 이들 클론중의 24개 클론의 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 서열 모두는 5' GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGA TGG CGA CA(서열 23, 1번 위치에서 44번 위치까지)으로 시작하여 CGG TAA GCT TGG CAC 3'(서열 23, 93번 위치에서 107번 위치까지)로 종결된다.

출발 풀에서 TCTC N₄₀ GTGA(서열 23, 45번 위치에서 92번 위치까지)에 상응하는 중간 분절은 다음과 같이 변화된다:

괄호안의 처음 수는 특정 서열을 갖는 클론의 수를 지시한다. 초기에 랜덤화된 뉴클레오티드 위치 이외의 뉴클레오티드 위치에서 몇몇 돌연변이(굵은 활자로 부각됨)가 발생한 것을 인지해야 한다.

24개 클론중에서 5개의 클론에서 발견된 상기 두 번째로 목록된 서열(즉, 서열 25)을 추가의 연구에 대한 리드(즉, 주요한) 화합물로서 선택한다. 이의 절단 활성을 pH 7.0에서 23℃에서 각종 2가 금속의 1mM 농도 및 1M NaCl의 존재하에서 측정한다.

금속 k_obs(min^-1)

부재 n.d.

Mg²⁺ 2.3 x 10^-3

Mn²⁺ 6.8 x 10^-3

Zn²⁺ 4.2 x 10^-2

Pb²⁺ 1.1 x 10^-2

따라서, 리드 화합물은, 이를 Mg²⁺의 존재하에서 활성을 나타내는 것으로 선별하긴 하지만, 4가지 2가 금속 모두의 존재하에서도 활성을 나타낸다. 역으로, Mn²⁺, Zn²⁺, 또는 Pb²⁺의 존재하에서 활성을 나타내는 것으로 선별된 DNA 분자는 Mg²⁺의 존재하에서는 어떠한 활성도 나타내지 않았다.

또한, 모두 포스포로티오에이트-함유 DNA 동족체로서 제조되는 경우, Mg²⁺의 존재하에서 시험관내 선별과정의 제6 라운드 후에 수득된 DNA 집단은 관찰된 ~ 10^-3 min^-1의 속도에서 Mg²⁺-의존성 절단 활성을 나타내었다. 포스포로티오에이트-함유 동족체는 각 입체중심에 R_p형태를 지니도록 효소적으로 제조한다. 이러한 화합물은 변형되지 않은 DNA에 비해 세포내 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 비교적 내성이 있다.

15％의 빈도수(3가지 가능한 염기 치환 각각에 대한 5％ 확률)로 돌연변이를 도입시키면서, 리드 화합물을 40개 뉴클레오티드 위치(밑줄침)에서 재-랜덤화한다. 이와 같이 재-랜덤화된 집단을 대상으로 시험관내 선별과정의 부가의 7 라운드를 수행한다. 마지막 4 라운드 동안, 1mM Pb²⁺의 존재하에서 반응성인 분자를 상기 집단으로부터 제거시킨 후에 나머지를 1mM Mg²⁺의 존재하에서 반응시킨다. 개개의 클론을 제7 라운드 후에 분리하고 이들 클론중의 14개 클론의 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 서열 모두는 5' GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGA TGG CGA CAT CTC(서열 23, 1번 위치에서 48번 위치까지)으로 시작하여 GTG ACG GTA AGC TTG GCA C 3'(서열 23, 89번 위치에서 107번 위치까지)로 종결된다.

40개 부분적으로-랜덤화된 위치(N₄₀, 서열 23, 49번 위치에서 88번 위치까지)에 상응하는 중간 세그먼트는 다음과 같이 변화한다:

괄호안의 수는 상기 특정 서열을 갖는 클론의 수를 지시한다. 굵게 나타낸 뉴클레오티드는 리드 화합물과 비교하여 상이한 것이다.

이들 클론의 절단 활성에 관한 형식적인 분석이 진행되고 있다. 상기 집단은 사실상, Pb²⁺의 존재하에서의 활성에 필적할만한 수준으로, 관찰된 ~ 10^-2 min^-1의 속도에서 Mg²⁺-의존성 절단 활성을 나타내었다.

도 6A 및 6B는 "전구" 촉매적 DNA 분자, 및 본원에 기술된 선별적 증폭 방법을 통해 수득된 몇몇 촉매적 DNA 분자중의 하나를 각각 2차원적으로 도시한 것이다. 도 6A는 서열 23으로 나타낸 분자의 전반적 형태를 나타내는, 출발 풀로부터의 예시적 분자를 도시하고 있다. 도시된 바와 같이, 각종 상보적 뉴클레오티드가 랜덤한 (N₄₀) 영역을 플랭킹한다.

도 6B는 상기 언급된 과정을 통해 생성된 Mg²⁺-의존성 촉매적 DNA 분자(또는 "DNA자임") 중의 하나의 다이아그램이다. 기질 핵산내의 리보뉴클레오티드의 위치는 화살표로 표시하였다. (도시된 분자는 본원에서 서열 25로 동정된 서열 뿐만 아니라 서열 23의 "시작" 및 "종결" 서열을 포함한다).

엔도뉴클레아제 활성은 본원에서 기술된 바와 같이, 시험관내 진화를 통해 앞서 언급한 "그룹" 각각에서 지속적으로 증진되기 때문에, 바람직한 특이성이 증가하는 효소적 DNA 분자가 본원에 기술된 지침에 따라 성공적으로 생성될 수 있을 것으로 예상된다.

실시예 5

보다 큰 RNA 서열의 절단

전술한 것의 연장으로서, 본 발명자들은 상기 입증된 바와 같은 그밖의 모든-DNA 기질내에 봉매된 단일 리보뉴클레오티드 보다는 모든-RNA 기질을 절단시키는 DNA 효소를 개발하였다[참조: R.R.Breaker ＆ G.F. Joyce, Chem. ＆ Biol. 1: 223-229, 1994; R.R.Breaker ＆ G.F. Joyce, Chem. ＆ Biol. 2: 655-660, 1995]. 표적 서열로서, 본 발명자들은 서열 5' GUAACUAGAGAU 3'(서열 49)을 갖는, HIV-1 RNA의 U5 LTR 영역내에 고도로 보존된 12개의 연속된 뉴클레오티드를 선택하였다.

앞서 실시예에서 기재된 방법을 수행하여, 본 발명자들은 다음 조성을 갖는 1014개 DNA의 풀을 생성시켰다:

5'-GGAAAA r(GUAACUAGAGAU) GGAAGAGATGGCGAC N₅₀ CGGTAAGCTTGGCAC-3'(서열 50)(여기서, N은 데옥시리보뉴클레오티드 G, A, T 및 C의 등몰량 혼합물이고 "r(GUAACUAGAGAU)"로서 동정된 서열은 리보뉴클레오티드를 구성한다. (임의로, 초기 5' 뉴클레오티드는, 예를 들면, 5' 말단에서 리보뉴클레오티드 분획 앞의 서열에 부가의 dA 잔사를 가함으로써, 초기 서열이 "GGAAAAA"로서 판독되도록 하고 서열 50이 길이 99개 잔기가 되도록 함으로써 변형시킬 수 있다. 명백하게, 이는 본원에서 상세히 기술된 바와 같이, 특이적 효소적 DNA 분자를 조작하기 위하여 만들어질 수 있는 변형들 중의 단지 한 예이다.)

이로써 생성된 효소적 DNA 분자를, 봉매된 RNA 표적 서열내에 위치한 포스포에스테르를 절단시키는 능력에 대해 선별한다. pH 7.5 및 37℃에서 10mM Mg²⁺의 존재하에서의 상기 효소적 DNA 분자의 활성을 근거로 하여, 시험관내 선별적 증폭과정의 10 라운드를 수행한다. 선별 과정 동안, "바람직한" 절단 부위에 대한 경쟁이 있었을 뿐만 아니라 이러한 바람직한 부위에서 절단시키는 "최상의" 촉매에 대한 경쟁이 있었다. 촉매의 두 부위 및 두 그룹이 가장 효과적인 절단 능력을 보유하는 것으로 나타났다(도 7참조).

도 7은 필수적으로 본원에서 기술된 바와 같이 수행된 시험관내 선별적 증폭의 10 라운드 결과중의 일부 결과를 도시한 것이다. 도시된 바와 같이, 촉매의 두 부위와 두 그룹이 표적 서열을 가장 효율적으로 절단하는 것으로 나타났다. 절단 조건은 필수적으로 도 7에 지시된 바와 같은데, 즉 10mM Mg²⁺, pH 7.5 및 37℃이며; 2시간 동안 반응을 수행한 후에 수집한 데이터가 나타나 있다. 절단율(％)은 발생수(여기서는, 0 내지 10)에 대하여 플롯팅하여 나타낸다. 기질내의 지시된 부위에서 표적 서열을 절단할 수 있는 촉매적 DNA 분자의 수/우세는 세로 막대로 나타냈으며, G↓ UAACUAGAGAU에서의 절단은 줄무늬 막대로 나타냈고 GUAACUA↓ GAGAU에서의 절단은 속이 빈(밝은 색조의) 막대로 나타냈다. 도 7에서는, 본원에서와 같이, 화살표(↓)가 절단이 일어나는 2개의 이웃한 뉴클레오티드 사이의 부위를 지시한다.

선별적 증폭 과정의 제8 및 제10 라운드 후에 수득한 집단으로부터의 다양한 개체를 클로닝한다. 제8 라운드로부터의 29 개체 및 제10 라운드로부터의 32 개체의 뉴클레오티드 서열을 결정한다(각각 표 2 및 3 참조).

각각의 표 2 및 3에서 상단의 "뉴클레오티드 서열" 아래에는 출발 풀에서 랜덤화된 50개의 뉴클레오티드에 상응하는 각각의 동정된 클론 분획을 나타내며(즉, N₅₀); 이로써, 소정의 클론의 전체 뉴클레오티드 서열은 일반적으로, "N₅₀" 분절 앞의, 후의 및 이를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 기질 서열은 부착되어 있으며 자가-절단은 일어나지 않은 것으로 추정된다. 예를 들면, (자가 -절단되지 않은) 클론의 전체 서열은 일반적으로, 서열 50의 1번에서 33번까지의 잔기, 이어서 랜덤화된 N₅₀ 영역을 나타내는 잔기, 이어서 서열 50의 84번에서 98번까지의 잔기 또는 서열 51의 1번에서 34번까지의 잔기, 이어서 랜덤화된 N₅₀ 영역을 나타내는 잔기, 이어서 서열 51의 85번에서 99번까지의 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 각 클론의 N₅₀ (또는 N₄₀ )영역--또는 이의 분획--이 특정의 효소적 DNA 분자의 특이성 및/또는 활성을 결정하는데 있어서 특히 중요하다. 이는 기질과 DNA자임이 별개의 분자인 반응에서 특히 명백하다(예를 들면, 도 8 및 9 참조).

제8 또는 제10 라운드 후에 수득한 개체에 대한 클론 번호를 각각 8-x 또는 10-x으로 명명한다. 서열 번호도 또한 기재되어 있으며 각 클론의 "N₅₀" 영역에 상응한다.

[표 2]

8번째 증폭 라운드로부터 클로닝된 개체

[표 3]

10번째 증폭 라운드로부터 클론된 개체

이어서, 각종 클론의 자가-절단 활성을 측정한다. 클론 8-5, 8-17 및 10-3은 부위 5' GUAACU↓ AGAGAU 3'에서 효과적으로 절단하는 것으로 밝혀진 반면, 클론 10-14, 10-19 및 10-27은 부위 5' G↓ UAACUAGAGAU 3'에서 효과적으로 절단하는 것으로 밝혀졌다. 분자의 RNA 분획을 서열 5' GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG 3'(서열 51의 잔기 1번에서 24번까지)로 연장시키는 경우, 클론 8-17, 10-14 및 10-27은 완전한 활성을 보유하는 반면, 클론 8-5, 10-3 및 10-19는 감소된 활성을 나타낸다. 연속적으로, 클론 10-23은 연장된 RNA 도메인을 수반하는 자가-절단 반응에서 고수준의 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

당해분야의 숙련인이 동일한 것을 인지하지 못하는 경우에도, 본 발명의 명세서의 교시에 따라서 조작된 폴리뉴클레오티드 분자의 "N₅₀" 분절 앞의 뉴클레오티드 서열과 상기 분절 다음의 뉴클레오티드 서열을 각종 방법으로 변형시켜 특정 특이성의 효소적 DNA 분자를 생성시킬 수 있다는 것을 또한 인식해야 한다. 예를 들면, 서열 51의 1번에서 24번까지의 잔기가 본원에서 RNA 뉴클레오티드로서 기술되긴 하지만, 이들은 또한 DNA, RNA 또는 이의 복합체를 포함할 수도 있다. (따라서, 예를 들면, 서열 51은 1번에서 7번까지의 핵산 잔기가 DNA를 포함하고, 8번에서 19번까지의 잔기가 RNA를 포함하며 20번에서 99번까지의 잔기가 DNA를 포함하는 등이 되도록 용이하게 변형시킬 수 있다.) 유사하게, "N₅₀" 영역 다음의 뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 이의 복합체를 포함할 수도 있다. "N₅₀"(또는 "N₄₀"--실시예 4참조) 영역 앞의 영역과 다음 영역의 길이는 분원에서 기술된 바와 같이 다양할 수도 있다. 추가로, N₅₀ 또는 N₄₀ 영역 앞의 및/또는 다음 서열은 단축시키거나, 연장시키거나, 또는 결실시킬 수 있다.

더욱이, 상기 언급된 바와 같이, 본 발명자들은 HIV-1 RNA의 특이적 영역을 본 실시예에 기술된 방법에서 표적 서열로서 선별하였으며; 이러한 서열이 표적으로서 사용될 수 있는 유일한 서열은 아니다. 명백하게, 당해 분야의 숙련인은 본원에 기술된 교시를 수행하여 다른 표적 서열에 대한 특이성을 갖는 효소적 DNA 분자를 조작하고 고안할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 이러한 표적 서열을, 서열 50 및 51에 나타낸 바와 같이, 작제하거나 DNA, RNA 또는 이의 복합체를 포함하는 더 큰 서열내로 삽입시킬 수 있다.

효소 도메인과 기질 도메인을 별개의 분자로 분할시킴으로써 자가-절단 반응을 분자간 절단 반응으로 용이하게 전환시킨다. 클론 8-17 및 10-23을 원형(prototype) 분자로서 선택한다. 이들 모두는 다중 교체가 진행되는 반응에서 별개의 모두-RNA 기질의 절단에서 DNA 효소로서 작용하는 것으로 나타났다(도 8). 연속적으로, 기질 결합 암(arm)을, 절단 부위를 경계짓는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 각 측면상에 7개 염기쌍으로 감소시킨다(도 9).

도 8은 본 발명의 2가지 촉매적 DNA 분자, 클론 8-17 및 10-23의 뉴클레오티드 서열, 절단 부위 및 교체도를 도시한 것이다. 반응 조건은 도시된 바와 같은데, 즉 10mM Mg²⁺, pH 7.5 및 37℃이다. 클론 8-17로서 동정된 DNA자임은 좌측에 나타냈으며, 여기서 RNA 기질의 절단 부위는 화살표로 지시된다. DNA자임과는 별개인(즉, 분자간 절단이 도시된다) 기질 서열(5'-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3')을 그 자체로서 표지시킨다. 유사하게, 클론 10-23로서 동정된 DNA자임은 우측에 나타냈으며, 여기서 RNA 기질의 절단 부위는 화살표로 지시된다. 다시, 기질 서열이 지시된다. 8-17 효소의 경우, 교체도는 약 0.6hr^-1이고; 10-23 효소의 경우에는 교체도가 약 1hr^-1이다.

도 8에 도시된 바와 같이, 별개의 기질 분자를 절단시킬 수 있는 클론 8-17 촉매적 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:

5'-CTTCCACCTTCCGAGCCGGACGAAGTTACTTTTT-3'(서열 56의 1번에서 34번까지의 잔기). 도 8에서, 별개의 기질 분자을 절단시킬 수 있는 클론 10-23 촉매적 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:

5'-CTTTGGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCC-3'(서열 85의 3번에서 33번까지의 잔기).

도 9는 본 발명의 2가지 촉매적 DNA 분자, 클론 8-17 및 10-23의 뉴클레오티드 서열, 절단 부위 및 교체도를 추가로 도시한 것이다. 반응 조건은 도시된 바와 같은데, 즉 10mM Mg²⁺, pH 7.5 및 37℃이다. 도 8에서와 같이, 클론 8-17로서 동정된 DNA자임은 좌측에 나타냈으며, 여기서 RNA 기질의 절단 부위는 화살표로 지시된다. DNA자임과는 별개인(즉, 분자간 절단이 도시된다) 기질 서열(5'-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3')을 그 자체로서 표지시킨다. 유사하게, 클론 10-23로서 동정된 DNA자임은 우측에 나타냈으며, 여기서 RNA 기질의 절단 부위는 화살표로 지시된다. 다시, 기질 서열이 지시된다. 8-17 효소의 경우, K_obs는 약 0.002min^-1이고; 10-23 효소의 경우에는 K_obs가 약 0.01min^-1이다.

도 9에 도시된 바와 같이, 별개의 기질 분자를 절단시킬 수 있는 클론 8-17 촉매적 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:

5'-CCACCTTCCGAGCCGGACGAAGTTACT-3'(서열 56의 4번에서 30번까지의 잔기). 도 9에서, 별개의 기질 분자를 절단시킬 수 있는 클론 10-23 촉매적 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:

5'-CTAGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCC-3'(서열 85의 5번에서 33번까지의 잔기, 여기서 "CTA"는 5' 말단에서 "TTG"로 치환된다).

RNA-절단 DNA 효소의 촉매 속도는 아직까지 완전히 최적화되지 않았다. 상기 언급된 바와 같고 앞서의 연구에서 보고된 바와 같이, 본 발명자들은 원형 분자를 부분적으로 랜덤화시키고 선별적 증폭과정의 부가의 라운드를 수행함으로써 촉매 속도를 증진시킬 수 있었다. 그러나, 본 발명자들은 pH 7.5 및 37℃에서 측정된 Mg²⁺에 대한 K_m값이 8-17 및 10-23 DNA 효소의 경우에 각각 약 5mM 및 2mM이라는 것을 밝혀냈으며; 이는 세포내 조건에 명백히 부합된다.

특정 양태와 실시예를 포함하는 상기 명세서는 본 발명을 예시하고자 한 것이며 이로써 본 발명이 제한되지는 않는다. 수 많은 기타 변이와 변형이 본 발명의 요지 및 범주를 벗어나지 않는 한 이루어질 수 있다.

서열 목록

(1) 일반적 정보:

(ⅰ) 출원인: 더 스크립스 리서취 인스티튜트

(ⅱ) 발명의 명칭: 효소적 DNA 분자

(ⅲ) 서열 수: 101

(ⅳ) 서신 주소:

(A) 수신인: 더 스크립스 리서치 인스티튜트

(B) 가: 티피씨-8 노쓰 토레이 파인즈 로오드 10666

(C) 시: 라 졸라

(D) 주: 캘리포니아

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 92037

(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 매체 유형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0. 버전 #1.25

(ⅵ) 현 출원 데이터:

(A) 출원번호: PCT/US 95/

(B) 출원일: 1995년 12월 1일

(C) 분류:

(ⅶ) 선 출원 데이터:

(A) 출원번호: US 08/472,194

(B) 출원일: 1995년 6월 7일

(ⅶ) 선 출원 데이터:

(A) 출원번호: US 08/349,023

(B) 출원일: 1994년 12월 2일

(ⅷ) 변리사/대리인 정보:

(A) 성명: 로간 아프릴 씨

(B) 등록번호: 33,950

(C) 참조/도켓 번호: 463.2 PC

(ⅸ) 전신 정보:

(A) 전화번호: (619) 554-2937

(B) 팩시밀리: (619) 554-6312

(2) 서열 1에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 15 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 1]

(2) 서열 2에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 20 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅸ) 양태:

(A) 명칭/키: misc_difference

(B) 위치: 대체(8, " ")

(D) 기타 정보: /표준명= "아데노신 리보뉴클레오티드"

[서열 2]

(2) 서열 3에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 38 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 3]

(2) 서열 4에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 80 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 4]

(2) 서열 5에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 28 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅸ) 양태:

(A) 명칭/키: misc_feature

(B) 위치: 28

(D) 기타 정보: /표준명= "2' 3' 사이클릭 포스페이트"

(ⅸ) 양태:

(A) 명칭/키: misc_difference

(B) 위치: 대체(28, " ")

(D) 기타 정보: /표준명= "아데노신 리보뉴클레오티드"

[서열 5]

(2) 서열 6에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 28 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅸ) 양태:

(A) 명칭/키: misc_difference

(B) 위치: 대체(28, " ")

(D) 기타 정보: /표준명= "아데노신 리보뉴클레오티드"

[서열 6]

(2) 서열 7에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 19 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅸ) 양태:

(A) 명칭/키: misc_difference

(B) 위치: 대체(8, " ")

(D) 기타 정보: /표준명= "아데노신 리보뉴클레오티드"

[서열 7]

(2) 서열 8에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 8 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅸ) 양태:

(A) 명칭/키: misc_difference

(B) 위치: 대체(8, " ")

(D) 기타 정보: /표준명= "아데노신 뉴클레오티드"

[서열 8]

(2) 서열 9에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 9]

(2) 서열 10에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 15 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 10]

(2) 서열 11에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 43 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 11]

(2) 서열 12에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 19 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅸ) 양태:

(A) 명칭/키: misc_difference

(B) 위치: 대체(8, " ")

(D) 기타 정보: /표준명= "아데노신 리보뉴클레오티드"

[서열 12]

(2) 서열 13에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 43 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅸ) 양태:

(A) 명칭/키: misc_difference

(B) 위치: 대체(28, " ")

(D) 기타 정보: /표준명= "아데노신 리보뉴클레오티드"

[서열 13]

(2) 서열 14에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 14]

(2) 서열 15에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 15]

(2) 서열 16에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 16]

(2) 서열 17에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 17]

(2) 서열 18에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 18]

(2) 서열 19에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 19]

(2) 서열 20에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 20]

(2) 서열 21에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 21]

(2) 서열 22에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 22]

(2) 서열 23에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 107 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅸ) 양태:

(A) 명칭/키: misc_difference

(B) 위치: 대체(28, " ")

(D) 기타 정보: /표준명= "아데노신 리보뉴클레오티드"

/표지= rA

[서열 23]

(2) 서열 24에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 24]

(2) 서열 25에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 48 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 25]

(2) 서열 26에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 46 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 26]

(2) 서열 27에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 27]

(2) 서열 28에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 28]

(2) 서열 29에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 48 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 29]

(2) 서열 30에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 42 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 30]

(2) 서열 31에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 31]

(2) 서열 32에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 32]

(2) 서열 33에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 33]

(2) 서열 34에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 34]

(2) 서열 35에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 35]

(2) 서열 36에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 36]

(2) 서열 37에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 37]

(2) 서열 38에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 38]

(2) 서열 39에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 39]

(2) 서열 40에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 10 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 40]

(2) 서열 41에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 10 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 41]

(2) 서열 42에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 12 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 42]

(2) 서열 43에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 10 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 43]

(2) 서열 44에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 11 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 44]

(2) 서열 45에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 13 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 45]

(2) 서열 46에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 14 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 46]

(2) 서열 47에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 11 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 47]

(2) 서열 48에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 14 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

[서열 48]

(2) 서열 49에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 12 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: RNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 49]

(2) 서열 50에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 98 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

(ⅸ) 양태:

(A) 명칭/키: misc_difference

(B) 위치: 7. .18

(D) 기타 정보: /주= "7번 내지 18번 위치는 RNA이고 나머지 서열은 DNA이다."

[서열 50]

(2) 서열 51에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 99 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

(ⅸ) 양태:

(A) 명칭/키: misc_feature

(B) 위치: 1. .24

(D) 기타 정보: /주= "1번 내지 24번 위치는 RNA이고 나머지 서열은 DNA이다."

[서열 51]

(2) 서열 52에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 52]

(2) 서열 53에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 53]

(2) 서열 54에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 54]

(2) 서열 55에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 55]

(2) 서열 56에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 56]

(2) 서열 57에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 57]

(2) 서열 58에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 58]

(2) 서열 59에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 59]

(2) 서열 60에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 60]

(2) 서열 61에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 61]

(2) 서열 62에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 62]

(2) 서열 63에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 63]

(2) 서열 64에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 64]

(2) 서열 65에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 65]

(2) 서열 66에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 66]

(2) 서열 67에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 67]

(2) 서열 68에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 68]

(2) 서열 69에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 69]

(2) 서열 70에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 70]

(2) 서열 71에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 71]

(2) 서열 72에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 72]

(2) 서열 73에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 73]

(2) 서열 74에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 74]

(2) 서열 75에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 48 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 75]

(2) 서열 76에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 76]

(2) 서열 77에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 77]

(2) 서열 78에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 78]

(2) 서열 79에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 79]

(2) 서열 80에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 80]

(2) 서열 81에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 81]

(2) 서열 82에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 82]

(2) 서열 83에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 36 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 83]

(2) 서열 84에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 84]

(2) 서열 85에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 47 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 85]

(2) 서열 86에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 51 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 86]

(2) 서열 87에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 48 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 87]

(2) 서열 88에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 88]

(2) 서열 89에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 89]

(2) 서열 90에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 90]

(2) 서열 91에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 91]

(2) 서열 92에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 92]

(2) 서열 93에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 93]

(2) 서열 94에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 94]

(2) 서열 95에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 95]

(2) 서열 96에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 49 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 96]

(2) 서열 97에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 97]

(2) 서열 98에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 48 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 98]

(2) 서열 99에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 99]

(2) 서열 100에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 46 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 100]

(2) 서열 101에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 50 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄 형태: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅲ) 추정 서열: 없음

(ⅳ) 안티-센스: 없음

[서열 101]

Claims (39)

1. 제1 기질 결합 영역 및 제2 기질 결합 영역에 의해 플랭킹된 보존된 코어 영역을 포함하며, 당해 보존된 코어 영역의 뉴클레오티드 서열이 CCGAGCCGGACGA 또는 GGCTAGCTACAACCA의 서열을 포함하는, 부위-특이적 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 DNA 분자.
2. 제1항에 있어서, 엔도뉴클레아제 활성이, 기질 핵산 서열내에 일본쇄 핵산을 포함하는 절단 부위를 한정하는 뉴클레오티드 서열에 대해 특이적인 촉매적 DNA 분자.
3. 제1항에 있어서, 촉매적 DNA 분자의 일부가 변형된 RNA, 변형된 DNA, 뉴클레오티드 동족체, 또는 이들의 조성물인 촉매적 DNA 분자.
4. 제2항에 있어서, 기질 핵산이 RNA, DNA, 변형된 RNA, 변형된 DNA, 뉴클레오티드 동족체, 또는 이들의 복합체인 촉매적 DNA 분자.
5. 제2항에 있어서, 엔도뉴클레아제 활성이 절단 부위에서 포스포에스테르 결합을 가수분해에 의해 절단시킴을 포함하는 촉매적 DNA 분자.
6. 제1항에 있어서, 일본쇄인 촉매적 DNA 분자.
7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 헤어핀 루프(hairpin loop) 구조를 포함하는 촉매적 DNA 분자.
8. 제1항에 있어서, 기질 핵산 서열이 이에 부착된 상태인 촉매적 DNA 분자.
9. 제1항에 있어서, 기질 핵산 서열이 부착되지 않은 상태인 촉매적 DNA 분자.
10. 제1항에 있어서, 엔도뉴클레아제 활성이 Mg²⁺의 존재에 의해 증진되는 촉매적 DNA 분자.
11. 제1항에 있어서, 기질 결합 친화도가 1μ M 이하인 촉매적 DNA 분자.
12. 제1항에 있어서, 0.1μ M 미만의 K_D로 기질과 결합되는 촉매적 DNA 분자.
13. 제2항에 있어서, 절단 부위를 한정하는 뉴클레오티드 서열이 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 촉매적 DNA 분자.
14. 제1항에 있어서, 엔도뉴클레아제 활성이 2가 양이온의 존재에 의해 증진되는 촉매적 DNA 분자.
15. 제14항에 있어서, 2가 양이온이 Pb²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ 및 Ca²⁺로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 촉매적 DNA 분자.
16. 제1항에 있어서, 엔도뉴클레아제 활성이 1가 양이온의 존재에 의해 증진되는 촉매적 DNA 분자.
17. 제16항에 있어서, 1가 양이온이 Na⁺ 및 K⁺로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 촉매적 DNA 분자.
18. 제1항에 있어서, 보존된 코어와 제1 기질 결합 영역 또는 제2 기질 결합 영역 사이에 하나 이상의 스페이서(spacer) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 촉매적 DNA 분자.
19. 제1항에 있어서, 보존된 코어가 하나 이상의 보존된 영역을 포함하는 촉매적 DNA 분자.
20. 제19항에 있어서, 보존된 코어내의 보존된 영역들 사이에 하나 이상의 가변성 또는 스페이서 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 촉매적 DNA 분자.
21. 제1항에 있어서, 제1 기질 결합 영역이 CATCTCT; GCTCT; TTGCTTTTT; TGTCTTCTC; TTGCTGCT; GCCATGCTTT; CTCTATTTCT; GTCGGCA; CATCTCTTC; 및 ACTTCT로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 촉매적 DNA 분자.
22. 제1항에 있어서, 제2 기질 결합 영역이 TATGTGACGCTA; TATAGTCGTA; ATAGCGTATTA; ATAGTTACGTCAT; AATAGTGAAGTGTT; TATAGTGTA; ATAGTCGGT; ATAGGCCCGGT; AATAGTGAGGCTTG; 및 ATGNTG로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 촉매적 DNA 분자.
23. 제1항에 있어서, TGTT; TGTTA; 및 TGTTAG로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 기질 결합 영역을 추가로 포함하는 촉매적 DNA 분자.
24. 제23항에 있어서, 기질 결합 영역들 사이에 하나 이상의 스페이서 영역을 추가로 포함하는 촉매적 DNA 분자.
25. 제1항에 따르는 촉매적 DNA 분자의 둘 이상의 집단을 포함하며, 각각의 촉매적 DNA 분자 집단이 기질내의 상이한 뉴클레오티드 서열을 절단시킬 수 있는 조성물.
26. 제1항에 따르는 촉매적 DNA 분자의 둘 이상의 집단을 포함하며, 각각의 촉매적 DNA 분자 집단이 상이한 기질을 인식할 수 있는 조성물.
27. a. 일본쇄 DNA 분자 집단을 수득하는 단계;

    b. 단계 a.에서 수득한 일본쇄 DNA 분자 집단을 뉴클레오티드-함유 기질 분자와 혼합하여 혼합물을 형성시키는 단계;

    c. 상기 집단내의 일본쇄 DNA 분자가 상기 기질 서열을 절단시키기도록 함으써, 기질 절단 생성물을 생성시키는 단계:

    d. 상기 기질 서열 및 기질 절단 생성물로부터 일본쇄 DNA 분자 집단을 분리시키는 단계; 및

    e. 특정 부위에서 뉴클레오티드-함유 기질을 절단시키는 일본쇄 DNA 분자를 상기 집단으로부터 분리시키는 단계를 포함하여, 특정 부위에서 기질 핵산 서열을 절단시키는 촉매적 DNA 분자를 선별하는 방법.
28. 제27항에 있어서, 기질이 RNA를 포함하는 방법.
29. 제27항에 있어서, 특정 부위에서 기질을 절단시키는 DNA 분자를 고정화제로 태깅(tagging)시키는 방법.
30. 제29항에 있어서, 고정화제가 바이오틴을 포함하는 방법.
31. 제29항에 있어서, 분리단계 e가, 태깅된 DNA 분자를 아비딘-결합된 고체 표면에 노출시킴으로써, 태깅된 DNA 분자가 고체 표면에 부착되게 하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
32. a. 특정의 절단 부위에서 기질 핵산 서열을 절단시킬 수 있는 촉매적 DNA 분자를 포스포에스테르 결합 -함유 기질과 혼합하여 반응 혼합물을 형성시키는 단계; 및

    b. 상기 촉매적 DNA 분자가 상기 포스포에스테르 결합을 절단시키도록 함으로써 기질 생성물의 집단을 생성시키는 단계를 포함하여, 포스포에스테르 결합을 절단하는 방법.
33. 제32항에 있어서, a. 촉매적 DNA 분자로부터 생성물을 분리시키는 단계; 및 b. 상기 촉매적 DNA 분자에 부가의 기질을 가하여 새로운 반응 혼합물을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
34. 제32항에 있어서, 기질이 RNA를 포함하는 방법.
35. 제32항에 있어서, 예정된 반응 조건이 1가 양이온, 2가 양이온, 또는 이들 모두의 존재를 포함하는 방법.
36. a. 일본쇄 DNA 분자 집단을 수득하는 단계;

    b. 상기 집단에 유전적 돌연변이를 도입하여 돌연변이체 집단을 생성시키는 단계;

    c. 상기 돌연변이체 집단으로부터 기질 내의 포스포에스테르 결합을 절단시키는 개체를 선별하는 단계;

    d. 선별된 개체를 나머지 돌연변이체 집단으로부터 분리시키는 단계; 및

    e. 선별된 개체를 증폭시키는 단계를 포함하여, 포스포에스테르 결합을 함유하는 기질에서 포스포에스테르 결합을 절단시키는 촉매적 DNA 분자를 조작하는 방법.
37. 하나 이상의 인식 도메인, 가변성 영역 및 스페이서 영역에 의해 플랭킹된 보존된 코어를 한정하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 당해 보존된 코어의 뉴클레오티드 서열이 CCGAGCCGGACGA 또는 GGCTAGCTACAACGA의 서열을 포함하는, 비-천연의 촉매적 DNA 분자.
38. 제37항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 분자의 5'-말단에 연속하거나 인접한 제1 가변성 영역, 이러한 제1 가변성 영역에 대해 3'-말단에 위치된 제1 인식 도메인, 이러한 제1 인식 도메인에 대해 3'-말단에 위치한 제1 스페이서 영역, 이러한 제1 스페이서 영역에 대해 3'-말단에 위치한 제1 보존된 영역, 이러한 제1 보존된 영역에 대해 3'-말단에 위치한 제2 스페이서 영역, 이러한 제2 스페이서 영역에 대해 3'-말단에 위치한 제2 보존된 영역, 이러한 제2 보존된 영역에 대해 3'-말단에 위치한 제2 인식 도메인 및 이러한 제2 인식 도메인에 대해 3'-말단에 위치한 제2 가변성 영역을 한정하는 촉매적 DNA 분자.
39. 제37항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 분자의 5'-말단에 연속하거나 인접한 제1 가변성 영역, 이러한 제1 가변성 영역에 대해 3'-말단에 위치한 제1 인식 도메인, 이러한 제1 인식 도메인에 대해 3'-말단에 위치한 제1 스페이서 영역, 이러한 제1 스페이서 영역에 대해 3'-말단에 위치한 제1 보존된 영역, 이러한 제1 보존된 영역에 대해 3'-말단에 위치한 제2 스페이서 영역, 이러한 제2 스페이서 영역에 대해 3'-말단에 위치한 제2 보존된 영역, 이러한 제2 보존된 영역에 대해 3'-말단에 위치한 제2 인식 도메인, 이러한 제2 인식 도메인에 대해 3'-말단에 위치한 제2 가변성 영역 및 이러한 제2 가변성 영역에 대해 3'-말단에 위치한 제3 인식 도메인을 한정하는 촉매적 DNA 분자.

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