KR20010072475A - 재발협착증을 치료하기 위한 ｄｎａ자임 및 치료 방법 - Google Patents

재발협착증을 치료하기 위한 ｄｎａ자임 및 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본원은 15개 뉴클레오타이드의 촉매 도메인, 및 촉매 도메인의 5' 말단에 연속하는 하나의 결합 도메인과 촉매 도메인의 3' 말단에 연속하는 결합 도메인의 두 개의 결합 도메인을 포함하는, c-myc mRNA를 특이적으로 절단하는 DNA자임을 제공한다. 본 발명은 또한, 본원의 DNA자임 및 국소 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 재발협착증의 발병을 억제하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로, 예방학적 유효량의 본원의 약제학적 조성물로 수술가능하게 피복시킨 혈관성형용 스텐트(stent)를 포함하는, 재발협착증의 발병을 억제하기 위한 혈관성형용 스텐트를 제공한다. 최종적으로, 본 발명은 본원의 약제학적 조성물 또는 혈관성형용 스텐트를 수술 환자에게 국부적으로 투여함을 포함하는, 혈관성형 시술을 받는 환자에서 재발협착증의 발병을 억제하기 위한 방법을 제공한다.

Description

재발협착증을 치료하기 위한 ＤＮＡ자임 및 치료 방법{DNAzymes and methods for treating restenosis}
재발협착증
재발협착증은 혈관성형 이후에 종종 발생하는 심각한 의학적 질환이다. 이러한 질환은 모든 혈관성형 환자의 30% 내지 60%가 경험한다.
재발협착증은 적어도 부분적으로는 혈관성형 동안 발생하는 혈관 손상 이후 평활근 세포("SMC")의 과도한 증식에 의해 야기되는 것으로 이해되고 있다. 몇 개의 생물학적 조절 인자는 이러한 SMC 증식을 촉진하는 것으로 생각된다. 이러한 조절 인자는 혈소판-유래 성장 인자("PDGF"), 섬유아세포 성장 인자("FGF") 및 인슐린 성장 인자("IGF")[참조: Ross; Banscota; Libby; Gay]를 포함한다. 이러한조절 인자에 의한 SMC 증식의 유도는 수많은 중요한 유전자의 세포내 상호활성화(transactivation)를 통해 야기된다[참조: Kindy; Gadeau]. 이러한 유전자는 c-myc, c-myb, c-fos 및 PCNA(증식성 세포 핵 항원)을 포함하며, 일반적으로 세포 주기-특이적이다.
특히, c-myc 유전자는 혈관 손상 30분 내지 2시간내에 SMC에서 과발현되며, 12시간 후에 발현은 정상 수준으로 감소된다. 즉, 혈관성형은 혈관 SMC 손상을 야기하며, 이는 손상 30분 후 2시간까지 개시되어 손상 12시간 후에 종료되는 과도한 c-myc 발현을 초래한다.
재발협착증은 현재 방사선 및 약리학적 요법으로 치료하고 있다. 방사선 요법은 치료하고자 하는 부위에 대한 방사능 삽입물 또는 방사능 조성물의 전달을 포함한다. 방사선 요법은 일부 기대되는 결과를 나타내기는 하지만, 관상내 방사능의 장기적인 부작용은 아직 확립되지 못했다. 약리학적 요법과 관련하여, 현재까지 사용되는 항-트롬보틴 및 항-증식 방법 모두는 일반적으로 효과적이지 못하다[참조: Bennet]
DNA자임
사람 유전자 요법에서, 안티센스 핵산 기술은, 발현되는 경우 질병을 야기하며 따라서 바람직하지 못한 유전자를 불활성화시키기 위한 선택할 수 있는 주요한 수단 중 하나이다. 안티센스 방법은 바람직하지 못한 유전자를 암호화하는 mRNA에 상보적이며, 따라서 바람직하지 못한 유전자를 암호화하는 mRNA와 하이브리드화되는 핵산 분자를 사용한다. 상기 하이브리드화는 유전자 발현 억제를 초래한다.
안티센스 기술은 피할 수 없는 단점으로 인해 불리하다. 안티센스 하이브리드화는 DNA/표적 mRNA 이종이합체의 형성을 초래한다. 이러한 이종이합체는 표적 mRNA 성분의 RNAse H-매개된 분해를 위한 기질로서 작용한다. 이러한 경우, DNA 안티센스 분자는 수동적인 방식으로 작용하여, 내인성 RNAse H 효소에 의한 필수적인 절단을 촉진시킬 뿐이다. RNAse H에 대한 이러한 종속성은 표적 mRNA와의 안정한 이종이합체를 형성하는 화학적 성질 및 능력과 관련하여 안티센스 분자를 디자인하는데 한계를 초래한다. 안티센스 DNA 분자는 또한, 비특이적인 활성 및 보다 높은 농도에서는 독성과 관련된 문제로 인해 불리하다.
안티센스 분자에 대한 대안으로서, 촉매적 핵산 분자가 유전자 발현을 억제하는 치료제로서의 가능성을 나타내며, 문헌에서 광범위하게 논의되어 왔다[참조: Haseloff; Breaker (1994); Koizumi; Otsuka; Kashani-Sabet; Raillard; and Carmi]. 따라서, 통상적인 안티센스 분자와는 달리, 촉매적 핵산 분자는 단지 표적 mRNA에 결합하는 대신 이를 실질적으로 절단함으로써 작용한다. 촉매적 핵산 분자는 표적 서열이 특정한 최소한의 필요 조건에 부합하는 경우에만 표적 핵산 서열을 절단할 수 있다. 표적 서열은 촉매적 핵산의 하이브리드화 영역에 대해 상보적이어야 하며, 표적은 절단 부위에 특정 서열을 함유해야만 한다.
촉매적 RNA 분자("리보자임")는 잘 기록되어 있으며[참조: Haseloff; Symonds; and Sun], RNA[참조: Haseloff] 및 DNA[참조: Raillard] 분자 모두를 절단할 수 있는 것으로 나타난다. 사실상, 시험관내 선택 및 진화 기술의 발달로 인해, 출발점으로서 공지된 리보자임 또는 랜덤-서열 RNA를 사용하여, 공지된 기질에 대한 신규한 리보자임을 수득하는 것이 가능해 졌다[참조: Pan; Tsang; and Breaker (1994)].
그러나, 리보자임은 자신의 기능을 수행하도록 의도된 세포내에서 효소적 가수 분해에 매우 취약하다. 이는 차례로 이의 약제학적 적용을 제한하게 된다.
최근에, "DNA자임"이라고 불리는 신규한 부류의 촉매적 분자가 제조되었다[참조: Breaker (1995); Santoro]. DNA자임은 일본쇄이며, RNA[참조: Breaker (1994); Santoro] 및 DNA[참조: Carmi] 모두를 절단한다. DNA자임의 일반적인 모델이 제시되어 있으며, "10-23" 모델로서 공지되어 있다. "10-23 모델" 부류의 DNA자임(또한, 간단히 "10-23 DNA자임"으로 인용됨)은 각각 7 내지 9개 데옥시리보뉴클레오타이드의 2개의 기질 인식 도메인에 의해 플랭킹되는 15개 데옥시리보뉴클레오타이드의 촉매 도메인을 갖는다. 시험관내 분석 결과, 이러한 유형의 DNA자임은 생리학적 조건하에서 퓨린:피리미딘 접합부에서 기질 RNA를 효과적으로 절단할 수 있는 것으로 나타난다[참조: Santoro].
DNA자임은 치료제로서 기대된다. 그러나, 공지된 mRNA 분자의 존재로 인해 야기되는 질환에 대한 DNA자임의 성공은 예측가능하지 않다. 이러한 예측 불가능성은 부분적으로 두 가지 인자에 기인한다. 첫째, 특정 mRNA 이차 구조는 표적 mRNA에 결합하고 이를 절단하는 DNA자임의 능력을 방해할 수 있다. 둘째, 표적 mRNA를 발현하는 세포에 의한 DNA자임의 흡수가 치료학적으로 유의한 결과를 허용할 만큼 효과적이지 않을 수 있다. 이러한 이유로 인해, 질환 및 이의 원인이 되는 표적 mRNA에 대한 지식만으로는, 창의적인 단계의 부재하에서 상기 표적 mRNA에 대한 DNA자임의 치료적 성공을 합리적으로 예견할 수 없다.
발명의 요약
본원은, (a) 뉴클레오타이드 서열 GGCTAGCTACAACGA을 가지며 임의의 퓨린:피리미딘 절단 부위에서 mRNA를 절단하는 촉매 도메인, (b) 촉매 도메인의 5' 말단에 인접하는 결합 도메인, 및 (c) 촉매 도메인의 3' 말단에 인접한 또 다른 결합 도메인(이때, 상기 결합 도메인들은 DNA자임-촉매된 절단이 필요한 c-myc mRNA 내의 절단 부위의 퓨린 잔기에 바로 인접한 두 개의 영역 각각에 대해 상보적이어서 이와 하이브리드화하며, 각각의 결합 도메인은 6개 이상의 뉴클레오타이드를 가지며, 결합 도메인 둘 모두의 합한 전체 길이는 뉴클레오타이드 14개 이상이다)을 포함하는, c-myc mRNA를 특이적으로 절단하는 DNA자임을 제공한다.
본 발명은 또한, 본원의 DNA자임 및 국소 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 재발협착증의 발병을 억제하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로, 예방학적 유효량의 본원의 약제학적 조성물로 수술가능하게 피복시킨 혈관성형용 스텐트(stent)를 포함하는, 재발협착증의 발병을 억제하기 위한 혈관성형용 스텐트를 제공한다.
본 발명은 또한 추가로, 예방학적 유효량의 본원의 약제학적 조성물을 혈관성형 시술 동안 수술 환자에게 국소 투여함을 포함하는, 혈관성형 시술 중인 환자에서 재발협착증의 발병을 억제하기 위한 방법을 제공한다.
최종적으로, 본 발명은 본원의 혈관성형용 스텐트를 혈관성형 시술 동안 수술 환자에게 국소 투여함을 포함하는, 혈관성형 시술중인 환자에서 재발협착증의 발병을 억제하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 DNA자임(DNAzyme)을 사용하여 재발협착증(restenosis)의 발병을 억제하는 것에 관한 것이다. DNA자임은 c-myc를 암호화하는 mRNA를 절단시킴으로써 상기 목적을 달성하며, 혈관 평활근 세포내에서 c-myc의 발현은 재발협착증이 발생하는데 필수적이다.
도 1은 문헌[참조: Santoro]에 기술된 "10-23" DNA자임의 구조를 나타낸다. 절단 부위는 X 및 Y 사이의 별표로 나타낸다. 기질 결합 도메인은 N으로 나타낸다.
도 2는 c-myc RNA-절단용 DNA자임 디자인을 나타낸다. c-myc DNA자임의 절단 부위는 사람 c-myc mRNA(2번째 엑손)의 AUG 개시 코돈에서 선택된다. 절단은 지시된 바와 같이 A 및 U 사이에서 일어난다.
도 3은 DNA자임 암(arm) 길이의 최적화 및 화학적 변형을 나타낸다. 상이한 암 길이를 갖는 C-myc 절단용 DNA자임은 "10-23" 모델에 기초하여 디자인한다. 3' 말단에서 3'-3' 말단 염기 역위는C또는G(3' INV)으로 나타낸다.
도 4는 다중 교체도(multiple turnover) 역학의 분석을 나타낸다. 패널 A는 다중 전환율 조건하에서 합성 c-myc mRNA의 절단을 나타내는, PhosphorImager(제조원: Molecular Dynamics)를 사용하여 수득한, 16% 폴리아크릴아미드 겔의 사진농도계 영상을 나타낸다. 모든 반응은 200pM DNA자임 및 2nM, 4nM, 8nM, 16nM 및 32nM 기질 mRNA(지시된 바와 같음)를 사용하여 수행하였다. 각각의 반응을 위한 항온처리 시간(0 내지 60분 범위)은 각각의 레인 상부에 나타낸다. 패널 B는 각각의 기질 농도에 대한 DNA자임 절단 과정(nM)의 플롯을 나타낸다. 이러한 데이터는 패널 A에서 나타낸 절단된 밴드의 사진농도계 측정으로부터 유도된다.
도 5는 c-myc mRNA의 시험관내 절단을 나타낸다. 1.5kb c-myc mRNA 기질은32P-UPT의 존재하에서 pGEM 벡터로부터 전사된다. 절단 반응은 37℃에서 60분 동안 10mM MgCl2, 50mM 트리스·HCl, pH 7.5에서 수행한다.
도 6은 사람 혈청에서 3'-역위된 DNA자임의 안정성 분석을 나타낸다. DNA자임은 AB-유형 사람 혈청(제조원: Sigma)과 함께 항온 처리한다. 샘플을 지시된 바와 같이 상이한 시점에서 수집하고,32P로 표지한다. 표지된 DNA자임을 16% PAGE 겔 상에서 분석한다. 전형적인 겔 패턴은 비변형된(오른쪽 상단부) 및 3' 역위된 DNA자임(오른쪽 하단부)에 대해 나타낸다.
도 7은 SV-LT-SMC에서 c-myc mRNA 절단용 DNA자임의 시험을 나타낸다. 성장-정지된 SMC를 Rs-6(하기됨)로 명명된 10mM 항-c-myc mRNA DNA자임, 10mM 대조군 올리고뉴클레오타이드(역위된 촉매적 코어 서열을 갖는, Rs-6과 동일한 암 서열), 또는 리포좀 단독(DOTAP; 즉 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸설페이트)의 존재하에서 10% FBS-DME(0.5% 태소 혈청을 함유하는 둘비코의 변형된 이글 배지)로 자극한다. 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타낸다.
도 8은 SMC에서의 Rs-6 DNA자임에 대한 투여량-반응 시험을 나타낸다. 시험의 세부 사항은 도 7에 따른다. 데이터는 대조군에 대한 백분율로서 표현된다.
도 9는 DNA자임-처리된 SMC에서 c-myc 발현을 나타낸다. 세포는 실시예 7에 기술된 바와 같이35S-메티오닌으로 표지하며, 면역침전을 수행하여 DNA자임-처리된 SMC에서 c-myc 단백질의 발현 수준을 측정한다.
도 10은 사람 c-myc 유전자의 게놈성 DNA 서열(엑손 1 및 2)을 나타낸다.
본 발명은 DNA자임 기술을 사용하여 재발협착증의 발병을 억제하는 것에 관한 것이다. 혈관성형 동안 동맥 평활근의 물리적 손상에 의해 야기되는 상기 질환의 개시는 손상 직후 수 시간의 c-myc 과발현으로 특성화된다. 이러한 c-myc 과발현은 과도한 SMC 증식을 초래하며, 이러한 과발현의 억제는 차례로 재발협착증의 발병을 억제시킨다. 본 발명은 c-myc mRNA-특이적인 DNA자임을 혈관성형 시술 내내 손상 영역에 적용하여, 상기 mRNA를 절단하여 재발협착증 발병을 억제시킴으로써, c-myc 과발현의 상기 "기회의 창"을 활용한다.
보다 구체적으로, 본원은 (a) 뉴클레오타이드 서열 GGCTAGCTACAACGA을 가지며 지시되는 임의의 퓨린:피리미딘 절단 부위에서 mRNA를 절단하는 촉매 도메인, (b) 촉매 도메인의 5' 말단에 인접한 결합 도메인, 및 (c) 촉매 도메인의 3' 말단에 인접한 또 다른 결합 도메인(이때, 상기 결합 도메인들은 DNA자임-촉매된 절단이 필요한 c-myc mRNA 내의 절단 부위의 퓨린 잔기에 바로 인접한 두 개의 영역 각각에 대해 상보적이며 따라서, 이와 하이브리드화하며, 각각의 결합 도메인은 6개이상의 뉴클레오타이드를 가지며, 결합 도메인 둘 모두의 합한 전체 길이는 뉴클레오타이드 14개 이상이다)을 포함하며, c-myc mRNA를 특이적으로 절단하는 DNA자임을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "DNA자임"은 DNA 또는 RNA일 수 있는, 독특한 표적 핵산 서열을 특이적으로 인식하고 절단하는 DNA 분자를 의미한다.
본원의 DNA자임은 RNA 분자를 절단하며, 도 1에 나타낸 바와 같이, 역사적 사실에 입각한 이유로 인해 그렇게 명명된, "10-23" 모델에 속한다. 이러한 유형의 DNA자임은 문헌[참조: Santoro]에 기술되어 있다. 10-23 DNA자임에 대한 RNA 표적 서열의 필수 조건은 NNNNNNNR*YNNNNNN, NNNNNNNNR*YNNNNN 또는 NNNNNNR*YNNNNNNN(여기서, R*Y는 절단 부위이고, R은 A 또는 G이고, Y는 U 또는 C이며, N은 G, U, C 또는 A이다)으로 이루어지는 임의의 RNA 서열이다.
본 발명의 변수 내에서, 결합 도메인 길이(또한 본원에서 "암 길이"로 인용됨)는 임의 변경이 가능하며, 동일하거나 상이할 수 있다. 7+7, 8+8 및 9+9 같은 다양한 변경이 고려되며, 하기 실시예에서 보다 충분히 예증된다. 결합 도메인 길이가 길면 길수록, 이는 상보적인 mRNA 서열에 보다 견고하게 결합될 것이라는 것은 잘 확립되어 있다. 따라서, 바람직한 양태에서, 각각의 결합 도메인은 9개 뉴클레오타이드 길이이다. 한 가지 양태에서, 본원의 DNA자임은 서열 TGAGGGGCAGGCTAGCTACAACGACGTCGTGAC(또한 본원에서 "Rs-6"으로 인용됨)을 갖는다.
DNA자임-기초 치료를 적용하는 경우, DNA자임은 세포내 환경에서 분해에 대해 가능한 한 안정해 지는 것이 중요하다. 이를 달성하는 한 가지 수단은 DNA자임의 하나 이상의 말단에서 3'-3' 역위를 혼입하는 것이다. 보다 구체적으로, 3'-3' 역위(또는 본원에서 간단하게 "역위"로 인용됨)는 말단 뉴클레오타이드 및 이의 인접한 뉴클레오타이드의 3' 탄소 사이에 공유적 인산 결합을 의미한다. 이러한 유형의 결합은 인접한 뉴클레오타이드의 3' 및 5' 탄소 사이의 정상적인 인산 결합에 반대되며, 이후, 용어 "역위"라 한다. 따라서, 바람직한 양태에서, 3'-말단 뉴클레오타이드 잔기는 촉매 도메인의 3' 말단과 인접한 결합 도메인에서 역위된다. 역위에 부가하여, 본원의 DNA자임은 변형된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 예를 들면, N3'-P5' 포스포르아미데이트 결합, 및 펩타이드-핵산 결합을 포함한다. 이들은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Wagner].
본 발명에서, c-myc mRNA 내의 모든 인접한 퓨린:피리미딘 뉴클레오타이드 쌍은 절단 부위로서 작용할 수 있다. 바람직한 양태에서, 퓨린:우라실은 바람직한 퓨린:피리미딘 절단 부위이다.
절단 부위를 함유하는 c-myc mRNA 영역은 임의의 영역일 수 있다. 예를 들면, DNA자임-촉매된 절단이 바람직한 c-myc mRNA내의 위치는 해독 개시 부위, 스플라이싱 인식 부위, 5' 비해독 영역 및 3' 비해독 영역일 수 있다. 한 가지 양태에서, 절단 부위는 해독 개시 부위에 위치한다.
사람 c-myc mRNA 및/또는 이를 암호화하는 DNA의 서열은 공지되어 있다[참조: Bernard]. 본원에서 사용되는 바와 같이, "c-myc mRNA"은 도 10에서 나타낸 사람 c-myc DNA 서열에 의해 또는 임의의 천연 발생적인 이의 다형태에 의해 암호화되는 임의의 mRNA 서열을 의미한다. c-myc mRNA은 성숙 및 미성숙 mRNA 모두를 포함한다. 본 발명의 변수 내에서, c-myc 절단 부위, 각각의 결합 영역의 필수 서열, 및 결과적인 전체 DNA자임의 서열을 측정하는 것은 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA자임을 포함하는, 재발 협착증의 발병을 억제하기 위한 약제학적 조성물 및 국소 투여를 위해 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 제공한다.
본 발명에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 기술 분야의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템중 임의의 하나를 사용하여 국소 투여될 수 있다. 예를 들어, 하기에 논의된 바와 같이, 카데터 및 국소 주사 및 피복된 스텐트를 통해 국소 투여될 수 있다.
국소 투여용 약제학적 담체는 전달될 활성제와 담체를 배합하는 방법에서와 같이 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 통상적으로 사용되는 다수의 담체를 사용하는 하기의 전달 시스템은 본 발명의 조성물을 투여하기 위해 고려될 수 있는 많은 양태중 단지 대표되는 하나이다.
국소 전달 시스템은 예를 들어, 겔 및 용제를 포함하고 가용화제, 침투 증진제(예: 지방산, 지방산 에스테르, 지방 알콜 및 아미노산) 및 친수성 중합체(예: 폴리카보필 및 폴리비닐피롤리돈)와 같은 부형제를 함유할 수 있다. 바람직한 양태에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 리포좀 또는 생분해성 중합체이다. 본 발명에 사용될 수 있는 리포좀의 예는 (1) 1:1.5(M/M)의 양이온성 지질 N,NI,NII,NIII-테트라메틸-N,NI,NII,NIII-테트라팔미틸스퍼민과 디올레오일 포스파티딜-에탄올아민(DOPE)의 리포좀 제형인 셀펙틴(CellFectin)(제조원: GIBCO BRL); (2) 2:1(M/M)의 양이온성 지질과 DOPE의 리포좀 제형인 시토펙틴 GSV(제조원: Glen Research); (3) DOTAP (N-[1-(2,3-디올레오일옥시)-N,N,N-트리메틸-암모늄메틸설페이트)(제조원: Boehringer Manheim); 및 (4) 3:1(M/M)의 다중 양이온성 지질 DOSPA와 중성 지질 DOPE의 리포좀 제형인 리포펙트아민(제조원: GIBCO BRL)과 같은 리포좀을 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 예방학적 유효 투여량의 약제학적 조성물로 작동적으로 피복시킨 혈관 성형 스텐트를 포함하는, 재발 협착증의 발병을 억제하기 위한 혈관 성형 스텐트를 제공한다.
또 다른 용어, 예를 들어, "정맥내 스텐트" 또는 단순히 "스텐트"로 공지된 혈관 성형 스텐트는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들은 통상적으로 수술 외상으로 인해 혈관 조직이 뜻하지 않게 내부로 성장하는 것과 같은 신체적 비정상으로 인한 혈관 폐쇄를 예방하는데 사용된다. 이들은 흔히, 이의 작용에 적합한 관상으로 확장하는 격자형 구조를 갖고 임의로 생분해될 수 있다.
본 발명에서, 스텐트는 당해 기술분야에 공지된 임의의 적합한 수단을 사용하여 본 발명의 조성물로 작동적으로 피복시킬 수 있다. 여기서, "작동적으로 피복된" 스텐트는 피복된 스텐트가 투여되는 경우 약제학적 조성물이 주변 조적으로적시에 방출되도록 하는 방식으로 이를 피복시킨다는 것을 의미한다. 상기 피복 방법은 예를 들어, 중합체 폴리피롤을 사용할 수 있다. 스텐트 및 이를 피복시키기 위한 방법 및 조성물은 미국 특허 제60/091,217호에서 상세하게 논의되고 있다.
통상적인 컴퓨터 계산 방법을 사용한 동물 데이터를 기준으로 본 발명의 조성물의 예방학적 유효 투여량을 결정할 수 있다. 한 양태에서, 예방학적 유효 투여량은 본 발명의 DNA자임 0.1mg 내지 약 1g을 포함한다. 또 다른 양태에서, 예방학적 유효 투여량은 본 발명의 DNA자임 약 1mg 내지 약 100mg을 포함한다. 추가의 양태에서, 예방학적 유효 투여량은 본 발명의 DNA자임 약 10mg 내지 50mg을 포함한다. 여전히 추가의 양태에서, 예방학적 유효 투여량은 본 발명의 DNA 자임 약 25mg을 포함한다.
본 발명은 추가로 혈관 성형 시기 즈음에 환자에게 본 발명의 예방학적 유효량의 약제학적 조성물을 국소적으로 투여하는 것을 포함하는, 혈관 성형을 받은 환자의 재발 협착증의 발병을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 혈관 성형 시점 즈음에 본 발명의 약제학적 조성물을 투여한다는 것은 수술 바로 전 또는 후에 또는 수술 동안에 수행될 수 있다는 것을 의미한다. 카데터 전달과 같은 공지된 방법에 따라 투여될 수 있다. 재발 협착증의 발병을 억제한다는 것은 혈관 성형후에 나타나는 재발 협착증의 중증성을 감소시키거나 전반적으로 재발 협착증의 발병을 예방한다는 것이다. 바람직한 양태에서, 재발 협착증의 발병을 억제한다는 것은 전반적으로 재발 협착증의 발병을 예방한다는 것을 의미한다.
최종적으로, 본 발명은 본 발명의 혈관 성형 스텐트를 혈관 성형 시기에 환자에게 국소적으로 투여하는 것을 포함하는 혈관 성형을 받은 환자의 재발 협착증의 발병을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 하기의 실시예를 참조로 보다 명백하게 이해되지만 당해 기술분야의 기술자는 이후에 청구항에서 보다 완전하게 기술된 바와 같이 실시예가 단지 본 발명을 예시하는 것이라는 것을 인지할 것이다. 추가로, 다양한 문헌이 본원 전반에 걸쳐 인용되고 있다. 이들 문헌은 본 발명이 속하는 당해 기술 분야를 보다 완전하게 설명하기 위해 참조로서 본원에 인용되고 있다.
실시예 1
항-c-myc DNA자임의 시험관내 특성화
시험관내 DNA자임의 효능은 수회의 전환율 조건하에 RNA 절단 비율을 측정함으로써 결정한다. 이들 실험을 위해 200pM로 고정된 효소 농도[E]를 10배 초과하는 기질의 농도[S]의 범위를 사용한다. DNA자임 및32P-표지된 합성 RNA 기질을 50mM 트리스.HCl, pH 7.5, 10mM MgCl2및 0.01% SDS중에서 37℃에서 10분동안 별도로 예비 평형화시킨다. 시간 0에서 DNA자임과 기질 모두를 혼합함으로써 반응을 개시한다. 반응이 진행되는 동안 다양한 시점에서 연속적으로 일정액을 채취하여 이를 90% 포름아미드, 20mM EDTA 중에서 퀀칭시키고 염료를 부과하여 분석한다. 이들 샘플중에 생성물 단편과 미반응된 기질을 16%의 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동하여 분리한다. 각각의 시점에서 반응의 정도는 PhosphoImager(Molecular Dynamics)를 통해 나타나는 겔 이미지의 밀도 측정기로 결정한다. kobs(이들 시간 대 실험 값의 기울기로부터 유도됨) 값을 사용하여 변형된 에디-홉스티 플롯(kobs대 kobs/[S])에 최적인 선을 생성시킨다. 상기 방법으로, km및 kcat값은 각각 회귀선의 네가티브 기울기 및 y 절편으로서 주어진다.
다중 전환율 동력학을 사용하여 시험관내 짧은 합성 c-myc RNA 서열에 대한 DNA자임-촉매된 절단의 효율을 조사한다(도 4). 3개의 변형된 DNA자임과 대칭적인 7, 8 및 9개의 염기쌍 기질-결합 암(arm)을 갖는 이의 변형되지 않는 대조구를 과량의32P-표지된 합성 c-myc RNA와 반응시킨다. kobs의 값으로부터 동력학 계수 km및 kcat를 결정한다(표 1)
kcat/km비율에 의해 측정된 바와 같이 각각의 DNA자임의 전체 촉매적 효율은 변형된 종류와 변형되지 않은 종류간에 상당히 다양하게 나타난다. 짧은 암의 DNA자임(7 + 7 bp)에서, 염기의 역위된 변형이 kcat/km을 3배 감소시킨다. 절단 활성에 네가티브 효과와는 대조적으로, 긴(9+9 bp) 암 버젼의 상대적 효능은 역위된 염기 변형으로 10배 증가한다. 중간 길이(8+8 bp) 결합 암 DNA자임은 변형에 대해 최소한의 영향을 받고 kcat/km의 값이 2배 증가됨을 보여준다. 따라서, 3' 역위된 말단 염기의 효과는 기질-결합 암의 길이에 의존한다. 짧은(7+7 bp) 암 DNA자임에서는변형이 촉매 효율에 치명적인 것으로 밝혀졌다. 그러나 긴(9+9 bp) 암 분자에서 이것은 실질적으로 촉매 활성을 개선시킨다. 변형되지 않는 DNA자임 활성은 8개 염기쌍의 기질 결합 암을 갖는 경우 최적이다. 짧은(7 bp) 암 DNA자임에서 전체 효율은 주로 보다 높은 Km(3.4 내지 24nM)에 의해 보다 저하된다. 8bp 초과의 긴 암을 갖는 DNA자임(예: 9bp)에서 Km(3.4 내지 7nM)이 상대적으로 증가하고 kcat(0.11 내지 0.06min-1)이 감소하는 결과로서 저하된다.
따라서, 변형되지 않은 버젼에서 c-myc mRNA-절단 DNA자임에 대한 최적의 절단 효율은 8bp에서 관찰된다. 7 및 9bp 버젼의 변형되지 않은 c-myc DNA 자임 모두는 kcat/km에 대한 각각의 이의 값에 따라 보다 낮은 전체 효율을 갖는다.
이들 3개의 상이한 크기의 c-myc-절단 분자의 동력학 프로필은 3'-말단 뉴클레오타이드 역위를 내포함으로써 상당히 변화된다. 이러한 DNA 변형이 c-myc RNA 절단에 미치는 영향은 특히 짧은 7bp 암 DNA자임에서 명백하다. 상기 분자는 실질적으로 변형되지 않은 버젼과 비교하여 kcat/km값에 대해 덜 효율적이다. 그러나, 촉매 효율에서의 이러한 감소는 또 다른 2개의 뉴클레오타이드를 첨가하여 회복되고 심지어 8bp 변형된 버젼에서는 증진된다. 이것은 짧은 DNA자임에서 활성의 감소가 DNA/RNA 상호작용(뉴클레오타이드 역위에 의해 발생함)에 대한 일부 방해로 인한 것임을 지적하고 이것은 암 길이를 8bp로 증가시켜 회복될 수 있다. 촉매 효율이, 변형된 DNA자임의 암 길이를 9bps로 추가로 증가시킴으로써 약간 개선될 수있다는 것이 밝혀졌다. 이것은 암 길이를 8bp에서 9bp로 증가시키는 경우 관찰되는 활성의 급격한 감소를 나타내는 변형되지 않는 DNA자임에서의 상황과는 대조적이다.
이들 결과는 8bp가 변형되지 않은 DNA자임에 의한 c-myc RNA 절단에 대한 최적의 길이임을 입증한다. 9bp의 암길이는 3'-역위된 DNA자임에서 최적의 촉매 절단 활성을 제공하는 것으로 나타난다. 9bp의 암을 갖는 변형되지 않은 DNA자임에서 나타나는 촉매 효율의 감소는 부분적으로 kcat의 보다 낮은 값으로서 명백해지는 바와 같이 효소 전환율이 감소한다는 것을 반영한다. 이러한 보다 낮은 전환율은 아마도 반응 산물에 대해 DNA자임이 친화성을 나타내어 이러한 친화성이 산물의 분해를 느리게하는 결과이다. 활성의 이러한 감소는 말단 염기 역위에 의해 변형된 DNA에서 회피되고 이것은 아마도 효소-산물 상호작용이 불안정화된 결과이다.
c-myc-절단 DNA자임의 동력학
DNA자임 암 길이 변형 Kcat(min-1) Km(nM) Kcat/Km(pM-1·min-1)
Rs-1 7 + 7 없음 0.25 23 10.8
Rs-2 7 + 7 3' 역위 0.16 50 3.2
Rs-3 8 + 8 없음 0.11 3.4 32
Rs-4 8 + 8 3' 역위 0.24 4 60
Rs-5 9 + 9 없음 0.06 7 8.6
Rs-6 9 + 9 3'역위 0.26 4 65
c-myc RNA 절단의 동력학은 3개의 상이한 길이의 DNA자임(변형된 것과 변형되지 않은 것 모두)에 대해 분석되고 이 모두는 개시 코돈을 표적화한다. 10mMMgCl2및 50mM 트리스.HCl(pH 7.5)의 존재하에서 10배이상의 초과된 기질과 함께 다중 전환율 조건하에서 반응을 수행한다.
실시예 2
완전한 길이의 c-myc mRNA의 시험관내 절단
완전한 길이의 c-myc RNA를 사용하여 자극된 생리학적 조건(10mM MgCl2, pH 7.5, 37℃)하에서 다양한 형태의 c-myc mRNA를 절단하는 DNA자임 능력을 추가로 테스트한다. 긴 기질(c-myc mRNA) 10nM 및 DNA자임 50nM을 사용하여 1회의 전환율 조건하에서 절단 반응을 수행한다. 도 5는 모든 DNA자임이 20 내지 50%의 절단율로 c-myc mRNA를 효과적으로 절단하는 것을 보여준다. 예상된 바와 같이, 보다 긴 암을 갖는 DNA자임은 보다 효율적으로 기질을 절단한다. 3' 역위된 염기 변형은 7 + 7 암 DNA자임의 절단 효율을 감소시키지만 9+9 암 DNA자임의 절단 효율을 증가시킨다. 흥미롭게도, 예비 가열되고 예비 가열되지 않은 DNA자임간의 절단효율에는 차이가 없다. 이러한 결과는 c-myc mRNA내 절단 부위에 대한 접근 가능성이 mRNA의 2차 구조에 의해 영향 받지 않는다는 것을 지적한다.
실시예 3
DNA자임의 화학적 변형 및 안정성
하기 방법으로 100% 사람 AB 혈청내 DNA자임의 안정성을 분석한다. 간략하게, 150μM의 비표지된 DNA자임을 37℃에서 100% 사람 혈청 100㎕중에서 반응시키고 5㎕의 2개의 샘플을 0, 2, 8, 24, 48 및 72시간의 시점에서 제거한다. 샘플링하는 즉시, 295㎕ TE(10mM 트리스.Cl, pH 7.5, 1mM EDTA)를 5㎕ 적정액에 첨가하고 페놀/클로로포름 추출을 수행한다. 각각의 시점에서의 모든 샘플을 γ-32P-ATP로 말단 표지시키고 추가의 정제 또는 침전 없이 16% PAGE 겔상에서 직접 수행하여 모든 온전한 DNA자임 및 분해 산물을 보여준다. 결과는 3' 말단에서 3'-3' 역위가 사람 혈청(t12=20시간)중에서 DNA자임 안정성을 상당히 개선시킨다는 것을 보여주는 반면에 변형되지 않은 DNA자임은 2시간 미만의 반감기를 나타낸다(도 6).
실시예 4
SMC 증식의 DNA자임-매개된 억제
항-c-myc DNA자임 활성을 혈관 SV40LT(시미안 바이러스 40 대형 T 항원) 평활근 세포(Simons)에서 테스트한다. 0.5% FBS-DMEM중에서 성장을 정지시킨후 10% FBS-DMEM을 첨가하여 G0 단계의 SMC를 방출시킨다. 동시에 세포를 DNA자임 또는 DOTAP에 의해 전달되는 대조구 올리고뉴클레오타이드(즉, 역위된 촉매 코어 서열)에 노출시킨다. DNA 자임 성장 억제 능력을 전달한지 72시간후에 측정한다. 도 7에 나타낸 상이한 DNA자임에 대한 데이터는 SMC 수가 30% 내지 80% 감소한 범위를 나타내는 반면에 대조구에서는 어떠한 감소가 관찰되지 않는다. 이들 분석 결과를 기준으로하여 대부분의 효과적인 분자, Rs-6(3' 역위된 염기를 갖는 9/9 암)의 활성을 투여량-반응 분석으로 추가로 조사한다(도 8). 대조구와 비교하여 Rs-6은50nM만큼 낮은 농도에서 SMC 성장을 억제한다.
실시예 5
항-c-myc DNA자임의 SMC 세포 주기에 대한 효과
또한 SMC 증식에 대한 DNA자임의 영향을 2개의 독립적인 기술, 즉, DNA 세포-주기 분석 및 유사분열 지수의 결정을 사용하여 평가한다. 혈청을 자극한지 72시간후에 DNA 히스토그램을 작성한다. 이러한 72시간 간격후에 자극되지 않은 세포의 74%가 G0/G1중에 잔류하는 반면에 이와 비교되는 자극된 세포에서는 65%만이 잔류한다. 그러나, DNA자임 Rs-6을 첨가하여 G0/G1단계에 잔류하는 자극된 세포의 비율은 71%로 증가한다. 대조적으로, 불활성화된 DNA자임 대조구(Rs-8)는 SMC 주기에 대해 어떠한 효과를 갖지 않는다. 이들 결과는 자극한지 72시간후에 SMC 집단중의 유사분열 지수(즉, 현미경적으로 측정되는 바와 같은 1000개의 세포당 유사분열체의 수)를 정량함으로써 확인된다.
혈청-자극된 평활근 세포 증식에 대한 항-c-myc DNA자임의 효과
G0/G1(%) S(%) G2/M(%) 유사분열 지수(%)
자극되지 않음 73.66 8.56 13.39 0.5
DOTAP 65.24 12.59 16.62 1.9
Rs-6 70.81 9.93 14.12 0.3
Rs-8(대조군) 67.81 12.33 15.19 2.2
실시예 6
DNA자임-형질 감염된 SMC내 c-myc 단백질의 발현
분자 수준에서 항-c-myc DNA자임의 효능을 입증하기 위해, DNA자임-처리된 SMC에서 c-myc 단백질의 발현은 면역 침전에 의해 분석한다. 간략하게, SMC는 72시간동안 무혈청 배지에서 성장을 정지시킨 다음 37℃에서 1시간동안 met-비함유 배지(5% 투석된 태아 소 혈청을 함유)중에서 배양시킨다. 배지를 제거한 후에, 세포에 5% 투석된 태아 소 혈청, 100mCi/ml의35S-Met 및 5mM DNA자임을 함유하는 met-비함유 배지로 대체하고 추가로 2시간동안 배양한다. 세포 용해물을 기술된 바와 같은 프로토콜을 사용하여 제조하고 c-myc 단백질을 아가로스-결합된 항-c-myc 항체를 사용하여 검출한다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 항-c-myc DNA자임으로 SMC의 처리는 대사적으로 표지된 물질의 면역 침전에 의해 측정된 바와 같이 c-myc 단백질의 합성을 상당히 억제시킨다. 대조군 올리고뉴클레오타이드(Rs-8)를 사용한 SMC 항온처리는 c-mys 발현에 효과가 없다.

Claims (11)

  1. (a) 뉴클레오타이드 서열 GGCTAGCTACAACGA을 갖고 지시된 퓨린: 피리미딘 절단 부위에서 mRNA를 절단하는 촉매 도메인,
    (b) 촉매 도메인의 5' 말단에 인접하는 결합 도메인, 및
    (c) 촉매 도메인의 3' 말단에 인접하는 또 다른 결합 도메인을 포함하며; 상기 결합 도메인은, DNA자임-촉매된 절단이 필요한 c-myc mRNA내 절단 부위의 퓨린 잔기에 바로 인접한 2개의 영역 각각과 상보적이어서 이와 하이브리화하고, 각각의 결합 도메인은 6개 이상의 뉴클레오타이드를 가지며, 결합 도메인 둘 모두를 합한 전체 길이가 뉴클레오타이드 14개 이상임을 특징으로하는, c-myc mRNA를 특이적으로 절단하는 DNA자임.
  2. 제1항에 있어서, 결합 도메인의 길이가 9개의 뉴클레오타이드인 DNA자임.
  3. 제1항에 있어서, 3'-말단 뉴클레오타이드 잔기가 촉매 도메인의 3' 말단에 인접하는 결합 도메인에서 역위되어 있는 DNA자임.
  4. 제1항에 있어서, TGAGGGGCAGGCTAGCTACAACGACGTCGTGAC의 서열을 갖는 DNA자임.
  5. 제1항에 있어서, c-myc mRNA내 절단 부위가 퓨린:우라실인 DNA자임.
  6. 제1항에 있어서, c-myc mRNA내 절단 부위가 해독 개시 부위, 스플라이스 인식 부위, 5' 비해독 영역 및 3' 비해독 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 영역내에 위치하는 DNA자임.
  7. 제1항에 따른 DNA자임 및 국소 투여용으로 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 재발 협착증의 발병을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 리포좀 및 생분해성 중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  9. 제7항에 따른 예방학적 유효 투여량의 약제학적 조성물로 수술가능하게 피복시킨 혈관 성형용 스텐트를 포함하는, 재발 협착증의 발병을 억제하기 위한 혈관 성형용 스텐트(stent).
  10. 제7항에 따른 예방학적 유효 투여량의 약제학적 조성물을 혈관 성형 시술 즈음에 환자에게 국소적으로 투여하는 것을 포함하는, 혈관 성형을 받는 환자의 재발 협착증의 발병을 억제하기 위한 방법.
  11. 제9항에 따른 혈관 성형용 스텐트를 혈관 성형 시술시에 환자에게 국소적으로 투여하는 것을 포함하는, 혈관 성형을 받는 환자의 재발 협착증의 발병을 억제하기 위한 방법.
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