JPH09500787A

JPH09500787A - 蛋白生産、細胞増殖および／または感染症病原体の増殖に対するオリゴヌクレオチド阻害の促進

Info

Publication number: JPH09500787A
Application number: JP7505358A
Authority: JP
Inventors: ダッタグプタ，ナニブフシャン; スリダール，シー・ナガラジャ; カシアン，ダニエル・エル
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1993-07-19
Filing date: 1994-07-19
Publication date: 1997-01-28
Also published as: AU7550594A; CA2166890A1; EP0781332A2; WO1995003406A2; AU689129B2; KR960704034A; WO1995003406A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、標的核酸配列の蛋白生産、および／または外来生物の増殖を阻害するための、１）副標的オリゴヌクレオチド、２）第２の標的オリゴヌクレオチド、または３）非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのいずれかと組み合わされた第１の精製標的オリゴヌクレオチドの使用を特徴とする。副標的オリゴヌクレオチドは標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンを含む。

Description

【発明の詳細な説明】蛋白生産、細胞増殖および／または感染症病原体の増殖に対するオリゴヌクレオチド阻害の促進発明の背景本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムのごときオリゴヌクレオチドの能力の促進に関し、蛋白生産、細胞増殖、および／または外来生物の増殖の阻害に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムのごときオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡのごとき標的ＲＮＡにハイブリダイズし、そのＲＮＡからの蛋白生産を阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を説明するために多くの機構が提案されている。例えば、ヘレン,シー（Helene,C.）およびトウルメ，ジェイ（Toulme,J.），ビオキミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ（B iochimica et Biophysica Acta）第１０４９巻：９９頁（１９９０年）、およびウールマン,イー（Uhlmann,E.）およびペイマン,エイ（Peyman,A.）,ケミカル・レビューズ（Chemical Reviews）第９０巻：５４３頁（１９９０年）参照。提案された機構は、２本鎖に含まれているＲＮＡを分解する細胞性ＲＮＡｓｅＨのためのＤＮＡ：ＲＮＡ基質の形成；早い時期での転写終止を起こさせる発生期のｍＲＮＡへのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション；およびプレｍＲＮＡイントロン／エキソン連結物にハイブリダイズすることによるｍＲＮＡプロセッシングの妨害に関連している。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる核酸活性の阻害に関するこれらおよびいくつかの他の提案された機構は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的ＲＮＡ配列へのハイブリダイズ能力に基づいている。また、オリゴヌクレオチドは配列非特異的機構によりウイルスを阻害する。例えば、マジュムダー（Majumdar）ら,バイオケミストリー（Biochemistry）第２８巻：１３４０頁（１９８９年）には、ＨＩＶ逆転写酵素を阻害するためのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの使用が記載されている。標的核酸配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドおよび核酸標的部位上に存在する相補的ヌクレオチド間の水素結合により生じる。標的核酸配列上の個々のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドにアクセスできない場合、ハイブリダイゼーションは起こらないであろう。ヌクレオチドのアクセス不可能性は、標的核酸および標的核酸に結合している蛋白の２次構造のごとき種々の因子による可能性がある。ホーガン（Hogan）ら,米国特許第５,０３０,５５７号には、診断アッセイにおいて、オリゴヌクレオチドがその標的核酸配列にハイブリダイズするのを助ける「ヘルパー」オリゴヌクレオチドの使用が記載されている。グッドチャイルド,ジェイ（Goodchild,J.）は、ＨＩＶ感染の治療のための触媒ＲＮＡ（リボザイム）および標的遺伝子治療に関する第３回国際シンポジウム（Third International Symposium On Catalytic RNAs（Ribozymes）And Target ed Gene Therapy For The Treatment Of HIV Infection）のアブストラクト（カリフォルニア州サンディエゴ）において、ハンマーヘッド（Hammerhead）リボザイムの品質を改善するための「ファシリテイター（facilitators）」の使用を記載している。ファシリテイターは、リボザイム結合部位に隣接したＲＮＡ基質標的配列に結合するオリゴヌクレオチドである。トゥリス（Tullis）,米国特許第５,０２３,２４３号はアンチセンスヌクレオチドの使用に関する一般的説明を提供する。カジ（Kaji）,米国特許第４,６８９ ,３２０号は、単純ヘルペスウイルスを標的とするヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドで治療した場合、単純ヘルペスでのマウスの死亡率の低下を示すデータを提供する。グッドチャイルド（Goodchild）ら,米国特許第４,８０６,４６３号は、ＨＩＶ感染した培養細胞における、いくつかの異なる特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドのＨＴＬＶ−III（ＨＩＶ）複製および遺伝子発現を阻害する能力を示すデータを提供する。カンチン（Cantin）ら,米国特許第５,１１０,８０２号には、ＨＩＶ複製を阻害するための特別なメチルホスホネート結合オリゴヌクレオチドの使用が記載されている。（これらの米国特許を参照により本明細書に取り入れる）。マツクラ（Matsukura）ら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.）第８６巻：４２４４頁には、ｒｅｖ配列を標的とするホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチドを用いる、宿主細胞を殺さない、ＨＩＶ発現の阻害が記載されている。さらにマツクラらは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート基以外の結合によるオリゴヌクレオチドの使用を議論している。マツクラらによれば、「ある種の化学的に修飾されたオリゴマー（例えば、メチルホスホネート類）は、それらが全くの不溶性で、生物学的効果のためには極端な高濃度を要する。」とされている。リボザイムはアンチセスオリゴヌクレオチドと同様に、相補的核酸配列標的部位へのハイブリダイゼーションに基づいて特異的核酸配列を標的とすることができる。ハイブリダイズしたリボザイムは、核酸配列を開裂することにより、標的核酸配列からの蛋白生産を阻害することができる。ロッシ（Rossi）ら,アシッズ・リサーチ・アンド・ヒュメン・レトロウイルシズ（Acids Research And Human Retroviruses）第８巻：１８３頁（１９９２年）は、リボザイムを可能性のある抗ＨＩＶ治療薬として使用することを議論しており、標的部位のアクセス可能性を減じる能力のある因子について述べている。これらの因子は、伸長した２次構造を有するＨＩＶＲＮＡおよびＲＮＡの結合した細胞性蛋白を包含しうる。リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、細菌、植物、真菌、動物またはヒトのごとき異なる生物に存在する核酸配列の機能化を阻害することができる。例えば、ファング（Fung）らの「ジーン・セラピー・フォー・セル・プロリファレイティブ・ディジージズ（Gene therapy for cell proliferat ive diseases）」と題されたＰＣＴ／ＵＳ９１／０２４７８には、リボザイムをヒトに用いて病的な細胞増殖性疾患を医療するために正の作用をする増殖調節エレメントの機能的発現を阻害することを議論している。ファングらはさらに、アンチセンスＲＮＡを遺伝子発現抑制手段として用いることを述べている。発明の概要本発明は、蛋白生産、細胞増殖および／または外来生物の増殖を阻害するオリゴヌクレオチドの能力を促進するための方法および組成物を特徴とする。特徴とされるオリゴヌクレオチド組成物は、第１の標的オリゴヌクレオチド、および１）副標的オリゴヌクレオチド、２）第２の別の標的オリゴヌクレオチド、または３）非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのいずれかを有する。第１の標的オリゴヌクレオチドは標的核酸配列にハイブリダイズするように設計されている。オリゴヌクレオチドと核酸配列との間のハイブリダイゼーションは相補的水素結合により生じる。標的オリゴヌクレオチドは核酸配列にハイブリダイズするように設計されているが、蛋白合成および／またはウイルス増殖に対する標的オリゴヌクレオチドの効果は相補的核酸配列に対する水素結合により生じる効果に限定されない。例えば、標的オリゴヌクレオチドが蛋白の触媒能を阻害してもよい。副標的オリゴヌクレオチドは、第１の標的オリゴヌクレオチドの標的領域の副標的領域にハイブリダイズするように設計されている。よって、副標的オリゴヌクレオチドは、第１の標的オリゴヌクレオチドの切断された部分を含む。副標的オリゴヌクレオチドの蛋白合成および／またはウイルス増殖阻害能は、標的オリゴヌクレオチドと同様に、ヌクレオチド間の水素結合に関する機構に限定されない。第２の標的オリゴヌクレオチドは、第１の標的オリゴヌクレオチドとは異なる領域にハイブリダイズするように設計されている。好ましくは、第２の標的オリゴヌクレオチドの標的領域は第１の標的オリゴヌクレオチドの標的領域から３ヌクレオチドよりも離れて存在する。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムのごとき標的オリゴヌクレオチドを、ヌクレオチド間の相補的水素結合に基づいて、細胞性およびウイルス性核酸配列とハイブリダイズするように設計することができる。「非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド」は、ホスホロチオエート結合により結合したオリゴヌクレオチドをいい、配列に特異的でない様式で機能することができる。例えば、マジュムダー（Majmdar）ら,上記、これを参照により本明細書に取り入れる。記載されたオリゴヌクレオチド組成物は、標的核酸の核酸活性の阻害に特に有用である。標的核酸の活性は、蛋白生産または核酸複製に必要な活性である。標的核酸は、細菌、植物、真菌、寄生虫、ウイルス、および動物のごとき異なるタイプの生物に存在する核酸を包含する。一般的には、標的核酸の活性は、ＲＮＡ転写、ｍＲＮＡプロセッシング、ｍＲＮＡ安定性、およびＲＮＡおよびＤＮＡ双方の複製を包含する。ウイルス性核酸の活性はウイルス複製に必要な活性である。例えば、複製に必要なＨＩＶ核酸活性は、ＨＩＶＲＮＡの逆転写、ＨＩＶｍＲＮＡの翻訳、ＨＩＶｍＲＮＡのプロセッシング、ゲノムＨＩＶＲＮＡのパッケージング、およびＨＩＶＲＮＡ安定性を包含する。特定のタイプの核酸活性の重要性は、異なるタイプのウイルスにおいて変化しうる。よって、第１の態様において、本発明は、標的核酸によりコードされた蛋白の生産のレベルを減じ、あるいは阻害するための方法および組成物を特徴とする。該方法は精製標的オリゴヌクレオチドおよび精製副標的オリゴヌクレオチドの使用を包含する。これらのオリゴヌクレオチドは、標的核酸上の存在する核酸配列を標的とする。標的核酸配列は、蛋白をコードするｍＲＮＡまたは対応するゲノム配列および／もしくは調節配列を包含する。副標的オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンからなる。「精製された」は天然に存在するオリゴヌクレオチドを排除することを意味する。精製オリゴヌクレオチドを、化学合成のごとき当該分野で知られた方法により製造してもよく、例えば、レトロウイルスベクターのような組み換え型核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現により製造してもよい。副標的オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドの標的領域のサブセットを標的とする。図１は、標的領域を示し、サブセット標的領域のいくつかの例を示す。図１の二重線は標的領域またはサブセット標的領域を示す。サブセット標的領域は、標的オリゴヌクレオチドの標的領域にも存在する副標的オリゴヌクレオチドの標的領域の一部である。副標的オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドの標的領域に存在しないヌクレオチドを有していてもよい。図１の実線は、副標的オリゴヌクレオチドに対する標的部位を形成しうる、さらなるヌクレオチドを示す。「切断バージョンからなる」は、副標的オリゴヌクレオチドがただ１つのサブセット標的領域に相補的であり、標的領域に相補的でないさらなるヌクレオチドを含んでいてもよいことを意味する。図２は、標的領域、副標的オリゴヌクレオチド、および標的ヌクレオチドの例を示す。副標的オリゴヌクレオチドは標的オリゴヌクレオチドの核酸配列の一部を含む。副標的オリゴヌクレオチドと標的領域との間の相補的領域はサブセット標的領域である。いかなる理論に拘束されることなく、副標的オリゴヌクレオチドは、核酸配列にハイブリダイズすることにより、あるいは対応する標的オリゴヌクレオチドにアクセスできない蛋白領域に結合することにより、蛋白合成および／またはウイルス増殖の阻害を促進すると考えられる。例えば、副標的オリゴヌクレオチド：標的２本鎖の形成は、標的オリゴヌクレオチド：標的２本鎖の形成のチャンスを増加させることができ、そして／または標的オリゴヌクレオチドとは異なる形態の標的核酸を阻害することができる。異なる形態のＲＮＡは、核酸プロセッシング（例えば、ｍＲＮＡのスプライシング）および細胞内環境の変化により生じる。細胞内環境の変化は、核に対して細胞質中でのような細胞内の異なる微小環境、およびＲＮＡプロセッシングの異なる段階における核酸との蛋白の結合を包含する。好ましくは、図２に示すような副標的オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドに存在するヌクレオチドのみを含み、標的領域のサイズの４０ないし６０％のサブセット標的領域を標的とする。おそらく、副標的オリゴヌクレオチドが大きくなるにつれ、標的オリゴヌクレオチドにアクセス不可能な領域への副標的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの可能性が小さくなる。副標的オリゴヌクレオチドは長さ７ヌクレオチドまたはそれ以上であるべきである。副標的オリゴヌクレオチドが小さくなるほど、副標的オリゴヌクレオチドは非標的配列にハイブリダイズするであろう。非標的配列へのハイブリダイゼーションは望外の毒性を引き起こし、よって、避けるべきである。本明細書記載のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットの糖基はリボース、デオキシリボース、またはＯ−メチルリボースのごときそれらの修飾誘導体であってもよい。ヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合、修飾結合により、またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨害しない非ヌクレオチド部分により結合されていてもよい。修飾結合は、標準的なホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホジチオエート結合、またはホスホロセレネート結合のごとき別の結合で置き換えられている結合を包含する。本明細書記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせを、それぞれ異なる主要な結合を有する２種のオリゴヌクレオチドから作ることができる。「主要な結合」は、オリゴヌクレオチドにおける全結合のうち、最高のパーセンテージで存在する結合のタイプをいう。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、メチルホスホネートまたはホスホロチオエート結合のごときエキソヌクレアーゼ分解に耐性のある結合を有する。別の態様において、蛋白生産を阻害する方法および組成物は、２種の精製標的オリゴヌクレオチドを用いて提供される。２種の精製オリゴヌクレオチドは、同じ蛋白をコードする異なる核酸配列を標的とする。好ましくは、２種のオリゴヌクレオチトは３ヌクレオチドよりも離れた核酸配列を標的とする。もう１つの態様において、外来生物の増殖を阻害する方法および組成物が提供される。記載された方法は、上記の特徴となる組成物；１）２種の精製標的オリゴヌクレオチド、２）精製標的オリゴヌクレオチドおよび精製副標的オリゴヌクレオチド、ならびに３）精製標的オリゴヌクレオチドおよび非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチトの使用を包含する。２種の精製オリゴヌクレオチドは異なる核酸配列を標的とする。好ましくは、これらの異なる核酸配列は３ヌクレオチドよりも離れている。外来生物は、ヒト、動物、および植物のごとき高等生物に感染しうる細菌、真菌、寄生虫、およびウイルスのごとき生物である。寄生虫は、植物、動物、またはヒトのごとき別の生物中またはその表面に生息する生物を包含する。医学的に重要な動物およびヒトの寄生虫は、アメーバ、鞭毛虫、球虫ならびに微胞子虫のごとき腸内原生動物；マラリアのごとき血液原生動物、および線虫、条虫ならびに吸虫のごときぜん虫を包含する。もう１つの態様において、細胞増殖性疾患を治療する方法および組成物が記載されている。細胞増殖性疾患は、ガン細胞において存在するような不適切な病的な細胞増殖、悪性細胞の増殖および良性の増殖性疾患を包含する。細胞増殖性疾患を治療するためのオリゴヌクレオチドの使用はファングら,上記に記載されており、これを参照により本明細書に取り入れる。本明細書記載の方法および組成物は、細胞増殖性疾患の原因となる調節エレメントの合成を阻害するオリゴヌクレオチドの能力を促進する。「調節エレメント」は、細胞増殖および／または細胞分裂を調節する核酸によりコードされた細胞成分である。もう１つの態様において、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.５：ＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧのＨＩＶ核酸および精製副標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイス可能な９ないし１００個のヌクレオチドを必須としてなる精製標的オリゴヌクレオチドからなる治療組成物が提供される。副標的オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンを包含する。該治療組成物は、ウイルス増殖に必要なＨＩＶ核酸の正常な活性を低下させることができる。「ハイブリダイズ」は、オリゴヌクレオチドがその標的核酸と２本鎖を形成でき、標的核酸の正常な活性を低下させることをいう。抗ウイルスオリゴヌクレオチドと標的ＨＩＶ核酸との間のハイブリダイゼーションは、好ましくは、インビボ条件下で標的ウイルス核酸の特異的である。しかしながら、インビボ条件においてウイルス標的部位および非標的細胞性部位の双方と２本鎖を形成できる抗ウイルスオリゴヌクレオチドもやはりインビボにおいて抗ウイルス剤として有用であるかもしれない。インビボでの有効性は、ウイルス核酸活性の阻害と細胞性核酸活性の阻害との間の十分な識別のごとき異なる因子により生じる。「必須としてなる」は、生理学的条件下でハイブリダイズするための標的配列に相補的な十分な隣接ヌクレオチドを有し、それに結合したかかるハイブリダイゼーションを妨害しないさらなるヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを包含することを意味する。好ましくは、核酸配列を必須としてなるとは、オリゴヌクレオチドが、特定の配列に対して０ないし５％のヌクレオチドの相違を有する核酸を含み、特許請求された活性（例えば、抗ＨＩＶ活性）を有し、さらに４個までのヌクレオチドをヌクレオチドを含んでいてもよいことを意味する。「ＲＮＡおよびＤＮＡ誘導体」は、同じ相補的塩基対のハイブリダイゼーション特性を有するＲＮＡおよびＤＮＡ分子をいう。ＲＮＡおよびＤＮＡ誘導体は異なる糖基（すなわち、デオキシリボースに対してリボース）を有し、ＲＮＡ中のウラシルおよびＤＮＡ中のチミジンの存在により異なっていてもよい。好ましくは、標的オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１またはそのＲＮＡ誘導体ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２で示される核酸配列を有する。副標的オリゴヌクレオチドは、好ましくはＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１の４０〜６０％のサイズである。より好ましくは、副標的オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３またはそのＲＮＡ誘導体ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.４により示される。さらに本発明は、上記オリゴヌクレオチドおよびかかるオリゴヌクレオチドをコードしているベクターの使用方法を特徴とする。これらの方法および組成物の特別な適用は、ＨＩＶ核酸活性の阻害に関して記載されている。副標的オリゴヌクレオチドの使用は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を相乗的に増大させ、それにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドのＨＩＶ増殖阻害効率は向上する。向上した効率の利点は、臨床的治療に必要なアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効濃度の減少を包含する。本発明の他の特徴および利点は、本発明の好ましい具体例についての以下の説明および請求の範囲から明らかであろう。図面の簡単な説明図１は、サブセット標的領域のいくつかの例を示す。二重線は標的領域中の核酸を表す。１本線は標的領域の外側の核酸（副標的オリゴヌクレオチドの標的領域の一部）を示す。図２は、標的部位１、副標的オリゴヌクレオチドおよび標的オリゴヌクレオチドを示す。好ましい具体例の説明本発明は、蛋白生産および／または外来生物の増殖を相乗的に阻害する方法および組成物を記載する。特徴となるオリゴヌクレオチド組成物は、第１のオリゴヌクレオチド、および１）副標的オリゴヌクレオチド、２）第２の標的オリゴヌクレオチド、または３）非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのいずれかを包含する。特徴となるオリゴヌクレオチド組成物を、さらなる標的オリゴヌクレオチドおよび／または副標的オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いてもよい。さらなる標的オリゴヌクレオチドは、初めの組成物中に存在する標的オリゴヌクレオチドとは異なる核酸配列を標的とする。同様に、さらなる副標的オリゴヌクレオチドは、初めの組成物中に存在する副標的オリゴヌクレオチドとは異なる副標的領域を標的とする。例えば、第２の標的オリゴヌクレオチドまたは副標的オリゴヌクレオチドを、標的オリゴヌクレオチド／副標的オリゴヌクレオチド組成物と組み合わせて使用してもよい。同様に、第３の標的オリゴヌクレオチドを、２種の標的オリゴヌクレオチドを含有する組成物と組み合わせて使用することができる。相乗的阻害とは、同じ濃度で組み合わされた場合の、各オリゴヌクレオチド単独での阻害の総和よりも大きい阻害をいう。本発明は、蛋白生産および／またはウイルス増殖を相乗的に阻害するためのオリゴヌクレオチド組成物をいかにして製造し、使用するのかを説明する。好ましくは、相乗的阻害は、個々のオリゴヌクレオチドの阻害の総和の少なくとも１０倍である。より好ましくは、相乗的阻害は少なくとも１００倍である。最も好ましくは、相乗的阻害は少なくとも１０００倍である。ヒトの治療および所望の植物系統の選択をはじめとする、標的オリゴヌクレオチドの多くの用途が知られている。標的オリゴヌクレオチドが蛋白生産の阻害および／またはウイルス増殖の阻害に使用されるこれらのタイプまたは他のタイプの応用における標的オリゴヌクレオチドの効果を促進するために、本明細書記載の組成物および方法を用いることができる。ＨＩＶ複製を阻害するための本明細書記載の方法および組成物の使用例を以下に示す。例は本発明を限定しない。当業者は、本願を指標として、異なる生物における異なる領域を標的とする同様のオリゴヌクレオチド組成物を容易に設計し合成できることを認識するであろう。提案された機構観察された効果を説明しうる多くの機構が存在する。これらの機構は以下のものを包含する：１．配列特異的でない阻害剤として作用するより長いオリゴヌクレオチド（非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）の作用と標的オリゴヌクレオチドの作用との間の相乗性。より長い非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えばマツクラら,上記に記載されたホスホロチオエートＣ₂₈は、配列特異的でない様式でＨＩＶ逆転写酵素を阻害することができる。好ましくは、非標的ホスホロチオエートは１５ヌクレオチドまたはそれより長い。より長い非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと標的オリゴヌクレオチドとの混合物は、ＨＩＶ逆転写酵素に対する配列特異的でない阻害および標的遺伝子（例えばｒｅｖまたはｔａｔ）に対する配列特異的（アンチセンス）阻害の相乗効果を示す可能性がある。この場合において、２種のオリゴヌクレオチドは、ウイルス生活環の異なる段階において、ウイルス複製／発現機構の異なる成分に対して作用するであろう。２．２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせは、細胞中への治療的オリゴヌクレオチドの取り込みを競奏的に促進する作用をするかもしれない。増加した取り込みは、１のタイプのオリゴヌクレオチドだけよりも細胞中へと容易に取り込まれる凝集、ネットワーク、または他の複合体を形成する２つのタイプのオリゴヌクレオチドの組み合わせから生じる。これらの複合体は、性質が非特異的であってもよく、また、塩基対形成および部分的に相補的な領域の集合から生じてもよい。かかる複合体は受容体により容易に結合するかもしれない。例えば、大型のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＣＤ４受容体に結合でき、ＨＩＶの受容体への結合を阻害することができる。結合が共同的な電荷−電荷相互作用によるものの場合、より大きなオリゴヌクレオチドは（そしておそらく大小のオリゴヌクレオチドの複合体も）細胞表面により強固に結合するはずである。３．相乗効果は、強固な２次構造の領域に結合する他のオリゴヌクレオチドの能力を高める１のオリゴヌクレオチドによるものであルかもしれない。副標的オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドがアクセスできないオープンな領域に結合し、次いで、構造的領域を開くことができる。例えば、副標的オリゴヌクレオチドは、コアウイルス核酸を開くとこができる。レトロウイルスは各ウイルス粒子につき２コピーのゲノムＲＮＡを有する。これらのコピーは、ウイルスコア中で互いに強固に絡まっているかまたは複合体化している。その２本の鎖間には鎖間塩基対形成が存在する可能性がある。オリゴヌクレオチドの一方は１本の鎖に結合でき、この鎖間塩基対形成を破壊し、かくして他のオリゴヌクレオチドがこの標的部位に結合することを可能にすることができる。この機構は、同じ極性を有する両方のＨＩＶ鎖（プラス鎖）に基づいているが、標的オリゴヌクレオチドおよび副標的オリゴヌクレオチドの両方ともが同じ極性を有し（この機構においてはマイナス鎖）、かつ重複している（一方は他方の切断バージョンである）。４．より小さい副標的オリゴヌクレオチドは、ウイルス粒子を透過する可能性かあるが、より大きいオリゴヌクレオチドは透過できない。よって、相乗作用は、感染細胞中にあるより大きいオリゴヌクレオチドの効果およびウイルス粒子の高度に防御された環境内に存在するより小さいオリゴヌクレオチドの効果によるものであるかもしれない。５．２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせは、細胞内での該２種のオリゴヌクレオチドの保持を促進するかもしれない。治療的オリゴヌクレオチドに関する１の問題は、オリゴヌクレオチドの逆拡散あるいは細胞からの他の出口である。２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせは、細胞の外では相互作用することはない。しかしながら、細胞内の電荷を帯びた環境では、それらは複合体化または凝集して細胞からの流出を制限するようになるかもしれない。よって、オリゴヌクレオチドの細胞内濃度は、結果として生じるそれらの治療活性の向上に関連する長い時間にわたり高いレベルに到達しこれを維持するかもしれない。６．２種のオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを結合する異なる蛋白に別々に結合することにより作用するかもしれない。副標的オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドにアクセスできない結合蛋白の一部分によりよく結合しうるが、より長い標的オリゴヌクレオチドはよりアクセス可能な部位によく結合しうるであろう。例えば、より小さいオリゴヌクレオチドは、より大きいオリゴヌクレオチドが適合しない酵素の活性部位中に結合しうるであろう。他方、より長い標的オリゴヌクレオチドは、より短い副標的オリゴヌクレオチドよりも、アクセス可能性が問題とならない蛋白によく結合するかもしれない。この場合において、より長いオリゴヌクレオチドにおける塩基数の増加は、蛋白への結合を増大させるかもしれない。よって、２種のオリゴヌクレオチド（うち１種は他方の切断バージョン）は、それぞれがより強固に結合し、おそらくは排他的に別々の蛋白の結合することにより、相乗的に作用するかもしれない。核酸の２次および３次構造が１のまたは他の標的オリゴヌクレオチド分子をより強固に結合させる場合の核酸への結合について、同じ機構を適用することができる。７．分子はウイルス生活環の異なった時点で作用するかもしれない。異なる蛋白および核酸が、アクセス可能であるかアクセス不可能であるか、重要であるか重要でないかにかかわらず、ウイルス生活環の種々の段階において発現され、プロセッシングされている。ウイルス生活環の１の段階よりも多い段階での阻害は、副標的／標的オリゴヌクレオチドの組み合わせ、または２種の標的オリゴヌクレオチドの組み合わせとの間の相乗効果を引き起こす可能性がある。８．１のオリゴヌクレオチドが他のオリゴヌクレオチドよりも早く取り込まれる動力学を有するかもしれないが、いったん細胞に入ると両方とも同じ速度で分解される可能性がある。２種のオリゴヌクレオチドはともに、長時間にわたり、有効な細胞内濃度を維持する可能性がある。その効果は、患者に間隔をあけて投与するのと同様のものであろう。２種の治療的オリゴヌクレオチドの分解の動力学または流出の動力学が異なる場合に、同様の効果が生じるはずである。９．オリゴヌクレオチドは、飲作用による大量の液体の取り込みにより細胞に入る可能性がある。２種のオリゴヌクレオチドは相乗的に作用して（例えば、複合体形成、別々の動力学、または適当な輸送機構に対するより大きいオリゴヌクレオチドの配列特異的でない影響により）、飲作用胞から細胞質中へのオリゴヌクレオチドの流出を促進しうるであろう。１０．２種のオリゴヌクレオチドは、単一のポリペプチド鎖をコードしているｍＲＮＡ分子中の異なる領域、または２種の異なる形態のｍＲＮＡ分子に結合する可能性がある。例えば、標的配列は、ウイルスゲノムＲＮＡ分子内、および統合されたウイルスＤＮＡからの転写ならびに／またはＲＮＡプロセッシングにより生じたより短いｍＲＮＡ内に含まれる可能性がある。異なる構造形態のこれらのＲＮＡは、分子内フォールディング、ウイルス構造中へのパッケージング（アッセンブリー過程におけるパッケージングを含む）、および／または核酸を結合する蛋白との結合により存在する可能性がある。複数の標的オリゴヌクレオチドを用いれば、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドが標的分子に結合し、その活性に影響するというチャンスが増加する。この可能性のある機構のリストは完全なリストを意図するものではない。さらなる機構が以下に記載され、本発明がさらに説明される。副標的オリゴヌクレオチドの組み合わせ標的オリゴヌクレオチドおよび副標的オリゴヌクレオチドから製造された組成物を用いて特定の蛋白の生産および／または外来生物の増殖の阻害を行ってもよい。副標的オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドの標的領域を標的とするオリゴヌクレオチドである。これらの「サブセット標的部位」は標的オリゴヌクレオチドの標的領域の小型バージョンである。副標的オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドに存在しないさらなるオリゴヌクレオチドであってサブセット標的領域とのハイブリダイゼーションを妨害しないさらなるオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。外来生物は、ヒト、他の動物、および植物のごとき高等生物に感染しうるウイルス、真菌、および寄生虫のごとき生物である。外来生物がウイルスである場合、ウイルス核酸活性の阻害は核酸のパッケージングの阻害を包含し、蛋白合成の阻害のみを包含するのではない。上記のごとく、副標的オリゴヌクレオチドがその効果を発揮することのできるいくつかの可能な機構が存在する。いかなる理論にも拘束されることなく、副標的オリゴヌクレオチドは、主に、標的オリゴヌクレオチドにアクセスできない核酸配列にハイブリダイズすることにより、機能を果たすと考えられる。おそらく、副標的オリゴヌクレオチド：標的２本鎖は、標的オリゴヌクレオチド：標的２本鎖の形成を促進し、そして／または標的オリゴヌクレオチドとは異なる形態の標的核酸を阻害する。上記のごとく、核に対する細胞質におけるがごとき局部的微小環境の変化およびＲＮＡプロセッシングの異なる段階における蛋白の結合によりＲＮＡが１の細胞下コンパートメントから他のコンパートメントへと移動するので、異なる形態のＲＮＡが生じうる。副標的オリゴヌクレオチドは１の形態のＲＮＡに結合しうるが、標的オリゴヌクレオチドは異なる形態のＲＮＡに結合する。さらに、副標的オリゴヌクレオチド：サブセット標的２本鎖は、標的領域を標的オリゴヌクレオチドに対して開くこと、あるいは核酸に結合した蛋白を除去することにより、標的オリゴヌクレオチド：標的２本鎖の形成を促進することができる。副標的オリゴヌクレオチドは標的配列のサブセットを標的とする。よって、副標的オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドにアクセスできない核酸の領域にハイブリダイズすることができる。しかしながら、標的オリゴヌクレオチドは、副標的オリゴヌクレオチドよりも長い標的配列に相補的な隣接したオリゴヌクレオチド鎖を有している。結果として、標的オリゴヌクレオチドはその対応する副標的オリゴヌクレオチドと置き換わることができるかもしれない。標的オリゴヌクレオチド：標的２本鎖は、いったん形成されると、標的核酸配列に対する相補性の増加のために、副標的オリゴヌクレオチド：サブセット標的２本鎖よりも安定となりうる。分子内水素結合または核酸結合蛋白のごとき因子により、より安定なオリゴヌクレオチド：標的２本鎖は、「除去」される可能性が低い。オリゴヌクレオチド：ＲＮＡ２本鎖の安定性の増加の利点はハイブリッド阻害翻訳の効率を高めることを包含し、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＤＮＡである場合には、ＲＮＡｓｅＨによる認識および分解の可能性を増加させることを包含する。向上したリボザイム：標的２本鎖の安定性の利点は、酵素による消化のために基質ＲＮＡを正しく配置しておくことを包含する。相乗効果は、上記の提案された機構の１つまたはそれ以上による活性ｍＲＮＡ転写物の減少により生じうる。活性ｍＲＮＡ転写物は、完全な機能的蛋白に翻訳されうるｍＲＮＡ転写物をいう。核酸の核酸活性を阻害するオリゴヌクレオチドは、蛋白をコードする活性ｍＲＮＡ転写物の数または能力を減じる可能性がある。例えば、プレｍＲＮＡイントロン／エキソン接合点へのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションはプレｍＲＮＡのｍＲＮＡへのプロセッシングを妨害する可能性があり、そのことにより活性ｍＲＮＡ転写物の数が減少する。好ましくは、標的領域は長さ１６ないし１００ヌクレオチドの間、より好ましくは長さ２４ないし５０ヌクレオチドである。好ましくは、副標的オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドにのみ存在するヌクレオチドを含んでおり、標的領域の４０ないし６０％のサイズのサブセット標的領域を標的とする。おそらく、副標的オリゴヌクレオチドは大型化するにつれ、標的オリゴヌクレオチドと同様に作用し、そのことにより、標的／副標的オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる相乗効果が減少する。例えば、副標的オリゴヌクレオチドのサイズが大きくなるにつれ、標的オリゴヌクレオチドにアクセスできない領域への副標的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの可能性が減少する。副標的オリゴヌクレオチドは長さ７ヌクレオチドまたはそれ以上であるべきである。副標的オリゴヌクレオチドが小さくなるにつれ、副標的オリゴヌクレオチドが非標的配列のハイブリダイズする可能性が小さくなるであろう。非標的配列へのハイブリダイゼーションは細胞毒性を引き起こすかもしれない。好ましくは、標的オリゴヌクレオチドの対する標的領域はインビボにおいて２次構造を形成する。２次構造は核酸活性に関連しており、よって、かかる領域は核酸活性の阻害にとり良い標的でありうる。例えば、核酸の構造化された領域は、しばしば、酵素および遺伝子発現の調節に関与する結合蛋白による認識部位である。２次構造を含む領域は、標的オリゴヌクレオチドに対してよりアクセスしにくいと考えられる。副標的オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドにアクセスできない標的領域にハイブリダイズすることにより機能するので、副標的オリゴヌクレオチドは、強力な２次構造に含まれない領域よりも２次構造に含まれる領域に対してより大きな効果を有する可能性がある。２次構造を有すると考えられる領域を、当該分野で知られた方法により同定することができる（例えば、ズカー,エム（Zuker,M.）,メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）,第１９０巻,２６２ページ（１９７９年））。２種の標的オリゴヌクレオチド２種の標的オリゴヌクレオチドからなる組成物を用いて特定の蛋白の生産および／または外来生物の増殖を阻害してもよい。好ましくは、２種のオリゴヌクレオチドは、同じ蛋白または異なる蛋白をコードしていてもよい、３ヌクレオチドよりも離れた核酸配列を標的とする。相乗的に作用すると考えられる２種の標的オリゴヌクレオチドの組み合わせの例は、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.６のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ｐｏｌを標的とする）である。標的オリゴヌクレオチドを標的核酸領域にハイブリダイズさせ、その標的核酸によりコードされる蛋白の生産を阻害することができる。完全には相補的でない核酸は生理学的条件下で互いにハイブリダイズするかもしれないが、一般的には、完全に相補的な最長の鎖がハイブリッドの安定性を決定する。特定の配列にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドは、適当な融解温度（Ｔｍ）（５０％のオリゴヌクレオチドがその標的核酸にハイブリダイズする温度）を有するべきである。プローブ長およびヌクレオチド組成（Ａ＋Ｔに対するＧ＋Ｃのパーセンテージ）を変更することにより、適当なＴｍを得ることができる。プローブ長およびヌクレオチド組成は、生理学的温度（３７℃ ）よりも約２〜１０℃高いＴｍをもたらすべきである。オリゴヌクレオチド上の相補的領域が長いほど標的配列に対する水素結合が多くなり、一般的には、Ｔｍが高くなる。Ｇ−Ｃ塩基対はＡ−Ｔ塩基対よりも強力な水素結合を示し、それゆえ高い熱安定性を示すので、ＧおよびＣのパーセンテージの増大もまたＴｍを上昇させる。アーノルド（Arnold）らの「ホモジーニアス・プロテクション・アッセイ（Homogeneous Protection Assay）」と題されたＥＰＯ出願番号８８３０８７６７（公開番号３０９２３０）、およびネルソン（ Nelson）ら,「ノンアイソトーピック・ＤＮＡプローブ・テクニックス（Nonisot opic DNA Probe Techniques）」２７５頁（サンジエゴのアカデミックプレス（A cademic Press）（クリッカ（Kricka）編））によるハイブリダイゼーション・プロテクション・アッセイ（ＨＰＡ）によりハイブリダイゼーションを測定することのような当該分野で既知の方法を用いてＴｍを決定することができる（これらの文献を参照により本明細書に取り入れる）。アーノルド（Arnold）らの「アクリジニウム・エステル・ラベリング・アンド・ピューリフィケイション・オブ・ヌクレオチド・プローブス（Acridinium Ester Labeling and Purification o f Nucleotide Probes）」と題されたＰＣＴ／ＵＳ８８／０３３６１（参照により本明細書に取り入れる）に記載のごとく、オリゴヌクレオチドをアクリジニウムエステル誘導体で標識することができる。以下の方法でＨＰＡを用いてＴｍを測定することができる。オリゴヌクレオチドをアクリジニウムエステルで標識する。コハク酸リチウム緩衝液（０.１Ｍコハク酸リチウム緩衝液（ｐＨ５.０）、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＥＧＴＡ、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム）中で、過剰量の核酸標的を用いてオリゴヌクレオチド：標的ハイブリッドを形成させる。次いで、核酸ハイブリッドを含有する溶液の一部をコハク酸リチウム緩衝液で希釈する。その一部を、予想されるＴｍから２〜５℃きざみで温度を上昇させた種々の温度で５分間インキュベーションする。次いで、溶液を温和なアルカリ性のホウ酸緩衝液（０.１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ^RＸ−１００）で希釈し、低温で１０分間インキュベーションする。これらの条件下で、１本鎖オリゴヌクレオチドに結合したアクリジンエステルが加水分解されるが、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに結合したアクリジニウムエステルは比較的加水分解から防御される。よって、加水分解処理後に残存するアクリジニウムエステル量は、試料中に存在するハイブリッド分子の数に比例する。残存しているアクリジニウムエステルを、過酸化水素およびアルカリを溶液に添加することによる化学発光をモニターすることにより測定することができる。化学発光をルミノメーター（例えばＧｅｎ−ＰｒｏｂｅＬＥＡＤＥＲ^RＩまたはＬＥＡＤＥＲ^R５０）で測定することができる。得られたデータを、温度に対する最大シグナルのパーセントとしてプロットする（通常は低温からプロット）。このアッセイにおいて、Ｔｍは、最大シグナルの５０％が残存する温度であると決定される。さらに、上記方法以外に、当該分野でよく知られたアイソトープ法によりＴｍを決定してもよい（例えば、ホーガン（Hogan）ら,上記参照）。標的オリゴヌクレオチドの最適なオリゴヌクレオチドサイズには異なる作用機構および細胞への取り込みを考慮されるべきである。標的オリゴヌクレオチドは、好ましくは、長さ１８ないし１００ヌクレオチドであり、より好ましくは、これらのヌクレオチドは長さ１８ないし５０ヌクレオチドである。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは長さ２０ないし３５オリゴヌクレオチドである。標的配列に相補的な長い核酸配列を有するオリゴヌクレオチドは、短いオリゴヌクレオチドと比べると、標的特異性の増加およびオリゴヌクレオチド：標的２本鎖の安定性の増加をはじめとするいくつかの利点を提供する。オリゴヌクレオチド：標的２本鎖の安定性の増加は、異なる様式でオリゴヌクレオチドの核酸阻害効果を容易にする可能性がある。例えば、主たる効果が翻訳抑制である場合、２本鎖の増加した安定性は、リボゾームのオリゴヌクレオチド置換を妨害することにより、翻訳抑制を増大させることができる。ありうる機構の別の例は、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素でのＤＮＡ：ＲＮＡＨＩＶ２本鎖のＲＮＡ鎖の分解を包含する。この場合、２本鎖の安定性の増大は、２本鎖が酵素作用を受けるという可能性を増加させる。ＲＮａｓｅＨ活性により分解されるためには、ＤＮＡ：ＲＮＡＨＩＶ２本鎖中の抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドが、好ましくは、３個またはそれ以上の隣接したしたホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を有することである。長いオリゴヌクレオチドにあり得る不利は、オリゴヌクレオチドの取り込みの減少および細胞毒性効果の増加を包含する。これらの効果の程度は、少なくとも一部は、オリゴヌクレオチドのサイズおよびオリゴヌクレオチド結合のタイプにより決定される。例えば、ホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドを用いた場合、生じ得る細胞毒性効果はより著しい。いかなる理論にも拘束されずに、２種の標的オリゴヌクレオチドは、いずれかのＲＮＡ核酸オリゴヌクレオチドのみよりも、特定のＲＮＡ核酸を強く阻害することにより、それらの効果を発揮すると考えられる。異なる形態のＲＮＡへのハイブリダイゼーションまたは特定の形態のＲＮＡに対するより効率的な阻害により、さらなる阻害が生じるかもしれない。非標的および標的オリゴヌクレオチドの組み合わせ好ましくは、非標的および標的オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてレトロウイルスを阻害する。非標的オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合により結合されたより長いオリゴヌクレオチドある。好ましくは、非標的オリゴヌクレオチドは２０ないし１００ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは、２５ないし５０ヌクレオチドの長さである。いかなる理論にも拘束されずに、非標的オリゴヌクレオチドは、配列特異的でない様式で、主として逆転写酵素を阻害することにより機能すると考えられる。しかしながら、上記のごとく、より長い鎖のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、細胞中への標的オリゴヌクレオチドの取り込みをも増加させるかもしれない。よって、非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＨＩＶのごときレトロウイルスの阻害に特に有用であるが、非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの用途をレトロウイルスに限定するものではない。センスおよびアプタマーオリゴヌクレオチドセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸上に存在する核酸配列と同じ核酸配列を有するオリゴヌクレオチドである。センスオリゴヌクレオチドは特定の蛋白標的に指向される。アプタマー（Aptamer）（エリントン（Ellington）およびソスタク（Szostak）,ネイチャー（Nature）第３４６巻：８１２頁（１９９０年））は、特定の蛋白標的への結合能に関して選択されるオリゴヌクレオチドである。特異的な標的に指向されたアプタマーは該特異的な標的に結合することができる。アプタマーは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡから形成されていてもよく、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。いかなる理論にも拘束されずに、センスオリゴヌクレオチドは、核酸活性に関与する蛋白を阻害することにより核酸活性を阻害すると考えられる。核酸活性に関与する蛋白は、核酸からの蛋白の生産を引き起こすリボゾーム結合蛋白およびｔＲＮＡシンセターゼのごとき蛋白（例えば、転写および／または翻訳に関与する蛋白）を包含する。同様に、アプタマーは、酵素または他の高分子の活性部位に特異的に結合することにより機能すると考えられ、その標的の正常な生物学的活性を阻害する。センスまたはアプタマーオリゴヌクレオチド、および標的オリゴヌクレオチドの組み合わせは、同じまたは異なる核酸もしくは蛋白標的を標的とする場合、およびこれらに指向される場合に、相乗効果を示す。例えば、核酸を標的とする標的オリゴヌクレオチドおよび核酸活性に関与する蛋白に指向されるセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせは、標的およびセンスオリゴヌクレオチドが単独で作用するよりも標的核酸を強く阻害する。標的／センスまたはアプタマーオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて生合成または調節経路に関与する１種より多い蛋白の生産を阻害することもできる。かかる組み合わせは、いずれかの化合物の単独使用よりも外来生物の増殖の阻害において有効であるはずである。よって、いずれかのオリゴヌクレオチドの単独作用では生合成または調節経路を完全にはブロックしないかもしれず、あるいは特定の核酸を完全には阻害できないかもしれない、標的オリゴヌクレオチド／センスまたはアプタマーオリゴヌクレオチドの組み合わせは、本明細書記載の他のオリゴヌクレオチドの組み合わせ（例えば、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ、標的オリゴヌクレオチド／エンハンサーの組み合わせ、または標的オリゴヌクレオチド／非標的オリゴヌクレオチドの組み合わせ）と同様に、いずれかのオリゴヌクレオチドが単独で作用するよりも有効であるかもしれない。しかしながら、経路のいくつかの蛋白の生産を阻害すること、あるいは複数の方法で単一の核酸を阻害することは、完全にまたはほとんど完全に経路をブロックし、あるいは特定の核酸を阻害することができる。特定の蛋白に対して指向されるセンスまたはアプタマーオリゴヌクレオチドの選択方法は当該分野で知られている。これらの方法の例は、ミルズ（Mills）ら, プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第５８巻：２２４ページ（１９６７年）、グリーン（Green）ら,ネイチャー（Nature）第３４７巻：４０６ページ（１９９０年）、およびトゥエルク（Tuerk）とゴールド（Gold）,サイエンス（Scienc e）第２４９巻：５０５ページ（１９９０年）に記載された方法であり、これらは所望の特性を有するＲＮＡ分子を選択するためのインビトロ発展方法の使用を示すものである。エリントンおよびソスタク,ネイチャー第３４６巻：８１８ページ（１９９０年）、およびボック（Bock）ら,ネイチャー第３５５巻：５６４ページ（１９９２年）には、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの選択が記載されている。当該分野は、最近になって、バーク（Burke）およびベルザル−ヘランツ（Ber zal-Herranz）,FASEB J,第７巻：１０６ページ（１９９３年）により論評された。これらの文献を参照により本明細書に取り入れる。治療的活性本発明の１の使用は、標的オリゴヌクレオチドの治療効率を高めることである。標的オリゴヌクレオチド／副標的オリゴヌクレオチド、２種の標的オリゴヌクレオチド、または標的オリゴヌクレオチド／非標的オリゴヌクレオチドの組み合わせの医療への使用は、一般的には、必須の細胞性核酸活性よりも標的核酸活性を阻害することを包含する。必須の細胞性核酸活性は、細胞増殖および機能化に必要な核酸活性である。標的核酸と非標的の必須の細胞性核酸を十分に識別できない標的オリゴヌクレオチドまたは副標的オリゴヌクレオチドは、生じ得る細胞毒性のために、あまり好ましくない。一般的には、薬剤濃度を低下させることにより、所望でない毒性を低下または除去することができる。しかしながら、より低い濃度は治療的に効果がないかもしれない。相乗的に作用する記載されたオリゴヌクレオチド組成物は、低オリゴヌクレオチド濃度で標的核酸を阻害する。結果として、有効濃度において毒性がありすぎるかもしれないオリゴヌクレオチドを、無毒の低濃度で有効に使用することができる。よって、個々のオリゴヌクレオチドがそれらの有効濃度において十分に識別しない場合でも、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせは、標的および非標的核酸の識別を可能にすることができる。インビボでの試験の前に、標的オリゴヌクレオチドまたは副標的ヌクレオチドが特定の標的にハイブリダイズする能力を評価することができる。例えば、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション挙動を、本質的に生理学的な条件下で測定することができる。同様に、リボザイムがその標的核酸配列にハイブリダイズし開裂する能力を、本質的に生理学的な条件下でアッセイすることができる。細胞内環境が非常に複雑で、完全にはわかっていないので、インビボ条件下での正確な２本鎖化は極めて困難である。さらにそのうえ、細胞内には多くの核酸結合蛋白が存在し、それらが標的配列のアクセス可能性および活性に影響するかもしれない。インビボでのハイブリダイゼーションをインビトロにおいてモデル化することができる（例えば、細胞または細胞外液体において見られる条件に近似した標準的溶液を用いて）。コーン（Kohne）の米国特許第４,８５１,３３０号、またはマニアティス（Maniatis）ら,モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning ）（ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Harbor Sp ring Press），１９８２年）にしたがって、インビトロ定量的アッセイを用いてハイブリダイゼーションを調べることができる。オリゴヌクレオチドのスクリーニングアッセイを用いて、異なる条件下でオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズする能力を試験することができる。好ましくは、核酸標的配列をオリゴヌクレオチドと接触させ、ＲＮＡｓｅＨを添加し、次いで、緊縮ハイブリダイゼーション条件下でアクリジニウムエステルプローブを用いて残存する標的配列の量を測定することにより、アッセイを行う。ネルソン（Nelson）ら,ノンアイソトーピック・ＤＮＡ・プローブ・テクニックス（Nonisotopic DNA Probe Techniques）（クリッカ（Kricka）編,アカデミック・プレス（Academic Press），１９９２年）中、２７５〜３１１頁、「ディテクション・オブ・アクリジニウム・エステルズ・バイ・ケミルミネッセンス（ Detection Of Acridiniumu Esters By Chemiluminescence）」（参照により本明細書に取り入れる）には、標的ヌクレオチド配列のアッセイのためのアクリジニウムエステル標識プローブの使用が記載されている。１本鎖オリゴヌクレオチドに結合したアクリジニウムエステルは加水分解に感受性があり、弱アルカリ条件で化学発光を発しない。しかしながら、ハイブリダイズした核酸（例えば、プローブ：ｍＲＮＡ）に存在するアクリジニウムエステルは、加水分解に比較的耐性がある。プローブ：ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを、過酸化水素、次いで、アルカリを添加することによりアクリジニウムエステルから生じる化学発光により測定することができる。化学発光をルミノメーター（例えば、ＬＥＡＤＥＲ１^TM、ＬＥＡＤＥＲ５０^TM、ＬＥＡＤＥＲ２５０^TMおよびＬＥＡＤＥＲ４５０^TM、ルミノメーターはジェン・プローブ・インコーポレイテッド（Gen Probe Incorporated）から市販されている）にて測定することができる。以下のようにオリゴヌクレオチドスクリーニングアッセイを行うことができる。１）水性の生理学的緩衝液のごとき溶液中でオリゴヌクレオチドをその標的核酸配列にハイブリダイズさせる。標的核酸の例は精製ＨＩＶｍＲＮＡである。１００μｌの生理学的緩衝液中の０.９ｐｍｏｌの標的ｍＲＮＡ、０.１ｐｍｏｌのアクリジニウムエステル標識プローブを用いて、３７℃で２時間、ハイブリダイゼーションを行うことができる。最適なＲＮａｓｅＨ酵素活性のための１ｘ最終緩衝液濃度において反応物を分配して２系にする。２）イー・コリ（E.coli）のＲＮａｓｅＨ（メリーランド洲ゲイサースバーグのライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）製、０．４Ｕ／反応）を２系になった反応物の一方に添加する。他方にはＲＮａｓｅを添加せず、（−）ＲＮａｓｅ対照として役立てる。反応を３７℃で１時間行い、９５℃で５分間変性させ、次いで、直接氷上に置くことにより反応停止する。３）反応物の一部を適当なホスホジエステルアクリジニウムエステル−プローブとハイブリダイズさせる。適当なアクリジニウムエステル標識プローブは、試験オリゴヌクレオチドと同じ核酸配列とハイブリダイズすることができ、相補的領域にアクリジニウムエステルを含むことができる。アクリジニウムエステル標識プローブを６０℃で１時間ハイブリダイズさせる。標的核酸配列以外の領域にハイブリダイズすると考えられるアクリジニウムエステループローブを用いて対照のハイブリダイゼーションを行う。４）反応物の一部をハイブリダイゼーション緩衝液（０.１Ｍコハク酸リチウム緩衝液（ｐＨ５.０）、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２ｍＭエチレングリコールビス（ベーターアミノエチルエーテル）Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ '四酢酸（ＥＧＴＡ）、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム）中に希釈する。１２ｘ７５ｍｍのルミノメーター試験管中で、５０マイクロリットルの複製物を、３００μｌの０.１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ^RＸ−１００とともに、６０℃で十分加水分解されるまで加水分解する（通常６〜８分）。１.５ＮＮａＯＨ、０.１％Ｈ₂Ｏ₂を１回添加して化学発光を生じさせ、ルミノメーターで測定する。当業者に理解されるように、本法の変法を行うことができる。例えば、異なる量の試薬およびインキュベーション時間を用いてアッセイを行うことができる。本明細書記載の組成物が必須の細胞性核酸活性を阻害する場合であっても、あるタイプの細胞を標的とすることにより、やはりそれらは治療薬として使用されうる。例えば、ＨＩＶ感染細胞を標的とする認識分子を含有するリポソームを用いて治療組成物をＨＩＶ感染細胞だけに送達してもよい。オリゴヌクレオチドの合成ホスホジエステル結合ならびに修飾結合を有するオリゴヌクレオチドを、当該分野で知られた方法により合成することができる。例えば、カルサーズ（Caruth ers）ら,メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）第１５４巻２８７ページ（１９８７年）には、ホスホジエステル結合によりヌクレオチドを結合するための標準的なホスホラミダイト固相化学の使用が記載されており；バット（Bhatt）,米国特許第５,２５２,７２３号には、ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドの合成方法を記載されており；さらにクレム（Kl em）ら,「インプルーブド・プロセス・フォー・ザ・シンセシス・オブ・オリゴマーズ（Improved Process for the Synthesis of Oligomers）」と題されたＰＣＴＷＯ９２／０７８６４において、メチルホスホネート結合をはじめとする異なるヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドの合成が記載されている。オリゴヌクレオチドの投与本発明を、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、および細胞増殖性障害をはじめとする異なる疾患を治療するためのヒト用治療薬として使用してもよい。記載されたオリゴヌクレオチドを用い、異なる処方および投与経路経路を用いて、患者を治療することができる。適当な投与経路は、筋肉内、エアロゾル、経口（錠剤、液状懸濁物、またはピル形態）、局所、全身、眼、静脈内、腹腔内および鞘内を包含する。毒物学、薬物動態学、吸収、分配、代謝および排泄のごとき薬学的考察をするべきである。これらの考察は、オリゴヌクレオチドがその標的部位に到達する能力、外来生物の増殖または宿主核酸を阻害する能力、および患者に悪影響を及ぼす副作用を起こし得る能力に関連する。異なる薬学的考察を、当該分野で知られた方法により評価することができる。オリゴヌクレオチドのまま、発現ベクター（オリゴヌクレオチドをコードしている）を介して、イオン導入法を用いることにより、あるいは生理学的に許容される処方として、記載されたオリゴヌクレオチドを導入してよい。適当な処方は、リポソーム、放出調節担体、イオン対分子、共有結合付加物、および他の医薬上適当な送達方法を包含する。異なるタイプの送達方法は本発明において有用である。それは、オリゴヌクレオチド修飾、粒子担体薬剤送達ビヒクル、およびレトロウイルス発現ベクターを包含する。ホスホジエステル結合により結合したオリゴヌクレオチドはゆっくりと細胞に取り込まれる。細胞への取り込みを促進するために、オリゴヌクレオチドをホスホジエステル結合において修飾してその電荷を減少させてもよい。例えば、個々のヌクレオチドをメチルホスホネート結合により結合してもよい。電荷を減少させるオリゴヌクレオチドの修飾は、これらの大型分子の細胞への取り込みを促進するための１つのアプローチに過ぎない。ヌクレアーゼ分解に対する感受性を低下させるように修飾を設計することもできる（例えば、ホスホロチオエート結合を使用）。全身投与および局所投与双方のために薬剤送達ビヒクルを選択することができる。除放性リザーバーといて役立つように、あるいはその内容物を標的細胞に直接送達するようにこれらのビヒクルを設計することができる。直接送達薬剤ビヒクルを用いる利点は、１回の取り込みで複数の分子が送達されることである。かかるビヒクルは、かかるビヒクルなしでは血流から急速に除去されてしまう薬剤の循環半減期を延長することが示されている。このカテゴリーに属するかかる特別な薬剤送達ビヒクルのいくつかの例は、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体付着性微小球である。薬剤送達としてのリポソームの使用はいくつかの利点を提供する。リポソームは細胞内安定性を向上させ、取り込み効率を向上させ、生物学的活性を改善する。リポソームは、細胞膜を形成している脂質と同様の様式で配列された脂質からなる中空小胞である。リポソームは、水溶性化合物を封入するための内部水性空間を有し、直径０.０５ないし数ミクロンのサイズ範囲である。いくつかの研究は、リポソームが核酸を細胞に送達でき、核酸は生物学的に活性のままであることを示している。例えば、もともと研究の道具として設計されたリポソーム送達ビヒクルであるリポフェクチン（Lipofectin）は、無傷の核酸分子を細胞に送達することができる。リポソームを使用することの特別な利点は以下のことを包含する。それらは成分的に無毒で生分解性である；それらは長い循環半減期を示す；組織を標的とする認識分子をその表面に容易に結合させることができる。最終的に、液状懸濁物または凍結乾燥製品のいずれにせよ、リポソームに基づく医薬品のコスト的に効率のよい製造は、満足な薬剤送達システムとしてのこの方法の有効性を示した。記載されたオリゴヌクレオチドを全身的に投与してもよい。全身的な吸収は、血流中での薬剤の蓄積と、その後の全身への分配をいう。全身的吸収を誘導する投与経路は、静脈、皮下、鼻腔内、鞘内および眼からの経路を包含する。これらの各投与経路は、オリゴヌクレオチドをアクセス可能な障害細胞に曝露する。皮下投与は、リンパネットワークを通して循環系へと進む局所的なリンパ節中に投与を行うものである。循環系への導入速度は、分子量またはサイズの関数であることが示されている。オリゴヌクレオチドを修飾して細胞中に拡散させることができ、あるいはリポソームは未修飾または修飾オリゴヌクレオチドの細胞への送達に直接的に関与することもできる。オリゴヌクレオチドをリンパ球およびマクロファージの表面に結合させることのできるリポソーム処方も有用である。この処方は、マクロファージおよびリンパ球の感染細胞に対する免疫認識特異性を利用することにより、ＨＩＶ細胞への向上した送達を提供するであろう。腹腔内投与もまた、導入速度を調節するオリゴヌクレオチド−送達ビヒクル複合体の分子量またはサイズに関連して、循環系中への導入を誘導する。選択した送達方法は、障害細胞における組成物の細胞内蓄積引き起こすであろう。核送達は使用できるがあまり好ましくない。特定のコンパートメント中のオリゴヌクレオチドの蓄積は、オリゴヌクレオチドの電荷および化学的性質により大きく影響されるであろう。最も好ましい送達方法は、リポソーム（１０〜４００ｎｍ）、ヒドロゲル、放出調節性ポリマー、マイクロインジェンクションまたはエレクトロポーレーション（エクスビボでの治療用）および他の医薬上許容されるビヒクルを包含する。正確な用量および投与回数は、臨床試験による有効性のデータに依存するであろう。送達ビヒクル、疾病の指示、投与経路、およびオリゴヌクレオチドを結合している結合のごときいくつかの因子が用量に影響するであろう。考えられる用量は０.００１〜２００ｍｇ／体重ｋｇ／日である。治療期間は疾病の徴候の経過により延長されるであろう。１日に複数回の投与は局所適用、眼への適用および膣への適用について考えられる。細胞内でのオリゴヌクレオチドの治療レベルの確定は、取り込みおよび分解の速度に依存する。分解速度を低下させることは、オリゴヌクレオチドの細胞内半減期を延長させる。よって、化学修飾されたオリゴヌクレオチド、例えば、ホスフェート骨格の修飾を伴ったものが好ましい。エイズ治療薬オリゴヌクレオチドは異なるＨＩＶ活性を標的とするとができる。しかしながら、いくつかの標的化は、ホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドを用いても行われ得る。ホスホロチオエート結合はオリゴヌクレオチドの安定性を増大させ、オリゴヌクレオチドの取り込みを容易にし、大体は配列依存的と思われる機構によりオリゴヌクレオチドがＨＩＶ増殖を阻害することを可能にする。よって、ホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチドは、その核酸配列に基づいて標的化することによりＨＩＶを阻害することができ、さらに特異的核酸配列に依存しない機構により、他のＨＩＶ標的部位を阻害することができる。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドはウイルス逆転写酵素を阻害することができ、さらにＣＤ４受容体へのｇｐ１２０の結合およびＰＫＣのリン酸化活性を阻害しうる。ウイルス逆転写酵素阻害効果は、ホスオロチオエートオリゴヌクレオチドのサイズが大きくなるにつれて増大し、他のウイルス逆転写酵素に適用可能と思われる。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、コーエン（Cohen）ら,米国特許５,２６４,４２３号、およびキンチントン（Kinchington）ら,アンタイバイラル・リサーチ（Antiviral Research）第１７巻：５３〜６２頁,１９９２年に記載されている。ＨＩＶ標的部位の例は、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ．５により示されるＨＩＶ核酸配列（「標的部位１」）である。標的部位１は、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、およびｈｅｆをコードするエキソン中に存在する。１個よりも多い遺伝子中の同じ標的部位の存在は、ＨＩＶゲノム中で重複しているエキソンによる。エキソンの重複の結果、ＨＩＶゲノム中のいくつかの遺伝子は多くの同じ核酸配列を含むこととなる（シュワルツ（Schwartz）ら,ジャーナル・オブ・ウイロロジー（Journal of Virology）第６４巻：２５１９頁（１９９０年））。標的部位１は、２次構造を有すると考えられるＨＩＶゲノムの保存的領域である。２次構造は、相補的ヌクレオチド間の分子内水素結合の形成から生じる。２次構造が弱いほど、分子内水素結合の形成の可能性が低くなる。保存的領域は、インビボにおいて特定の核酸にハイブリダイズでき、その結果各ＨＩＶ株における核酸活性を阻害する、少なくとも３種の異なる株のＨＩＶに存在する核酸領域である。当該分野で知られた標準的方法（例えば、異なる株の１次構造を比較し、次いで、特定の核酸へのハイブリダイズについて試験する）を用いて保存的領域を同定することができる。好ましくは、保存的領域は、２種の異なるＨＩＶ株間において１０％未満の相違を有する。標的部位１は、２次構造の形成に関与すると考えられるいくつかのヌクレオチド領域を有する。特に、標的部位１は、３つの隣接したＣ残基を含む領域および４つの隣接したＧ残基を含む１つの領域を有する。これらの領域は、２次構造の形成に関与しうる。２次構造は標的機能に関連している。したがって、２次構造の領域へのハイブリダイゼーションは、核酸活性を阻害するための特に有効な手段でありうる。しかしながら、２次構造を標的にすることに関する問題は、オリゴヌクレオチド：標的２本鎖を形成することである。２次構造を形成する分子内水素結合は、オリゴヌクレオチド：標的２本鎖の形成を阻害すると考えられる。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは、患者に重大な影響を与えずにウイルス増殖を阻害することにより、治療薬として有効に機能しうる。治療薬としての使用において、いくつかの副作用が存在しうる。生存の見込みおよび免疫系の応答の増大のごとき患者にとって全体的な有益性を提供することにより、全体的な治療効果を得ることができる。投与規則のごとき考慮を包含する標準的な医療方法を用いて不利な効果を減じることができる。例えば、低い治療指数を有する抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを、連続した期間にわたり、低濃度で使用することができる。ＨＩＶ核酸と必須の細胞性核酸とを十分に識別できず、必須の細胞性機能の阻害と同程度にＨＩＶ核酸を阻害する抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは、あまり好ましくない。かかるオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ感染細胞にのみ送達されることにより（例えば、ＨＩＶ感染細胞を標的とする認識分子を含むリポソームを用いて）、治療薬として作用しうる。細胞アッセイおよび試験動物のごときモデルを用いて治療的に投与する前にオリゴヌクレオチドの毒性を評価することができる。細胞のアッセイを用いて、薬剤の細胞毒性効果およびそのＨＩＶ増殖阻害能を測定することができる（例えば、ウェイスロウ（Weislow）ら,ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティ（J.Natl.Cancer Inst）第８１巻：５７７〜５８６頁,１９８９年参照）。好ましくは、試験動物を用いて抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの毒性を測定する。本発明の異なる態様および具体例を説明するために実施例が提供され、実施例は開示された発明を何ら限定するものではない。実施例１：ＨＩＶの阻害ＨＩＶに感染したＨＴ４−６Ｃ細胞を用いた場合の副標的オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの相乗的ＨＩＶ複製阻害能を下に示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的部位１を標的とした。アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸配列をＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１に示す。核酸配列がＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３で示される副標的オリゴヌクレオチドはＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１の切断バージョンである。副標的オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド基はホスホロチオエート基により結合されており、デオキシリボース部分を含んでいた。３７℃で８〜１０分間トリプシン−ＥＤＴＡを用いてＨＴ４−６Ｃ細胞を剥離させた。次いで、細胞を１００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞を５〜１０ｍｌの維持培地（１０％ウシ胎児血清、５００ユニット／ｍｇのペニシリン、５００ユニット／ｍｇのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミンを含有するダルベッコの改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）に再懸濁した。週に１回細胞を全体積２００ｍｌの維持培地中３ｘ１０⁴個／ｍｌの濃度として２個の７５ｃｍ2のＴフラスコに分けることにより細胞を維持した。０日目に、細胞を２４ウェル組織培養プレート（ファルコン＃３０４７）中にウェルあたり２.４ｘ１０⁴個の濃度で撒いた。細胞を３７℃で一晩インキュベーションした。翌日、培地を吸い出し、感染の多重度（ＭＯＩ）０.０３のＨＩＶウイルス２００μｌを各ウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃で２時間インキュベーションした。２時間のインキュベーション後、細胞を最終濃度の１ .２５倍の濃度の８００μｌの薬剤で処理した（ダルベッコの修飾イーグル培地中）。アンチセンスオリゴヌクレオチド／副標的オリゴヌクレオチドの組み合わせを異なる割合で用いた。表１は、１：１ないし１０：１の割合のアンチセンスオリゴヌクレオチド：副標的オリゴヌクレオチドの組み合わせを示す。処理細胞を３７℃で３日間インキュベーションした。４日目に、１ｍｌ／ウェルの１００％メタノールでプレートを１５分間固定した。次いで、ウェルを吸引し、０.３％クリスタルバイオレット染料０.５ｍｌをウェルに添加した。５分後、ウェルを水洗し乾燥させた。顕微鏡を用いてプラークを数えた。掲載した濃度はオリゴヌクレオチドの合計量を意味する。プラーク数はウェル１個あたりのプラークの平均数である。減少％は薬剤を含むウェル１個につき観察されたプラーク数を薬剤を含まないウェル１個あたりのプラーク数（１６１個／ウェル）で割ったものである。表１に示すように、副標的オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせは、いずれかのオリゴヌクレオチドを単独で作用させた場合よりも約１０００倍有効であった。アンチセンスオリゴヌクレオチドのみは、副標的オリゴヌクレオチドのみよりもＨＩＶ複製を阻害したように思われたが、ＡＺＴほどではなかった。アンチセンスオリゴヌクレオチド／副標的オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いるＨＩＶ阻害はＡＺＴよりも大きかった。アンチセンス／副標的オリゴヌクレオチドの組み合わせがＨＩＶ複製を阻害する能力は、副標的オリゴヌクレオチドに対する標的オリゴヌクレオチドの割合により影響されるように思われた。１０対１の割合が１対１の割合よりも有効であった。実施例２：インビボ毒物学試験動物において、オリゴヌクレオチドの組み合わせが器官または血液組織において大まかな形態学的変化を引き起こす能力を調べることにより、インビボ毒物学について調べることができる。例えば、毒物学的研究を以下のように行うことができる。１）尾内の静脈からオリゴヌクレオチドを試験マウスに注射する。対照マウスにはオリゴヌクレオチドを欠いた対照溶液を与える。２）器官、組織および血液パラメーターに対する試験オリゴヌクレオチドの影響を、異なる時点（例えば、ｔ＝０および２４時間目）において測定する。毒性効果を示し得る血液パラメーターは、血小板数、赤血球数、白血球数およびヘモグロビン数の変化を包含する。基準となる毒性効果をモニターすべき重要な器官および組織の例は、脾臓、肝臓、腎臓および胸腺である。実施例３：ＨＩＶ防御アッセイ抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドおよび細胞増殖の測定のための標準的方法を用いてＨＩＶ防御アッセイを行うことができる。細胞増殖の測定として使用できる方法は、細胞の代謝状態を測定するための２,３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ,シグマ・ケミカル（Sigma Chemical）社製）のごとき染料の使用、核酸の複製を測定するためのＢＵｄＲ（ブロモデオキシウラジン）のごとき放射性または修飾ヌクレオチド前駆体の使用、および宿主核酸の生成を測定するための宿主核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの使用を包含する。蛍光、化学発光、酵素または放射性標識のごとき検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチドを用いて、細胞増殖を測定するための宿主相補的オリゴヌクレオチドを用いるアッセイを行うことができる。ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡに存在する宿主核酸配列のごとき宿主核酸配列の領域にハイブリダイズするようにオリゴヌクレオチドを設計することができる。かかるヌクレオチド配列領域の例は当該分野において知られており、標準的方法により得ることができる。宿主細胞の増殖を試験するための宿主標的核酸の好ましい源はｒＲＮＡである。ｒＲＮＡの特徴を示す核酸配列を有する核酸は、一般的には、ｍＲＮＡに存在する核酸配列よりもずっと豊富に細胞中に存在する。ＨＩＶはＣＤ４抗原を有する細胞（ＣＤ４⁺）に感染する。主要な標的細胞集団はＴヘルパーリンパ球および単球／マクロファージ系統の細胞である。ＨＩＶ防御アッセイを、ＨＩＶ感染の疑いのあるヒト由来のかかる細胞について行うことができる。患者から得たかかる細胞についてインビトロで直接行うことができ、あるいは、ＣＤ４⁺細胞から得た溶解物を用いて行うこともできる。単離細胞よりもＨＩＶ細胞変性効果に感受性のある細胞を感染させるために溶解物を用いることができる。ＨＩＶ防御アッセイを以下のように行うことができる。１）患者からＣＤ４⁺細胞を単離する。好ましい細胞はＴリンパ球である。２）抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの存在下（処理細胞）または不存在下（対照細胞）における細胞増殖に適合する条件下で細胞をインキュベーションする。細胞増殖に適合する条件の例は、エス・ガートナー（S.Gartner）およびエム・ポポビッチ（M.Popovic）,１９９０年,テクニークス・イン・ＨＩＶ・リサーチ（T echniques in HIV Research）（エイ・アラルドチーニ（A.Alaldocini）およびビー・ディー・ウォーカー（B.D.Walker）編、ニューヨークのストックトン・プレス（Stockton Press）中、ウイルス・アイソレイション・アンド・プロダクション（Virus Isolation and Production）,５３〜７０頁に記載されている。３）細胞をオリゴヌクレオチドに曝露した後の１またはそれ以上の時点において処理細胞および対照細胞の増殖を測定する。対照細胞の正常な増殖はＨＩＶ感染のごときウイルス感染のないことを示す。対照細胞の増殖を健康であることが分かっている同タイプの細胞と比較することにより、正常な増殖を決定することができる。対照細胞の正常な増殖以下のものは、ＨＩＶのごときある種の細胞の疾患の存在を示す。処理細胞において抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドがＨＩＶ細胞毒性に対して防御を行う能力は、疾患がＨＩＶによるものであり、試験した抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて患者を治療することができることを示す。異なるＨＩＶ株の核酸配列における多様性のため、このアッセイにおいて抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの組み合わせがＨＩＶ細胞毒性を阻害できないことは、時として、正確にＨＩＶの存在を示さないことがある。よって、ＨＩＶ防御アッセイを、ＨＩＶの存在を検出するための当該分野で知られた他のアッセイとともに用いるべきである。好ましくは、アッセイを用いて、ＨＩＶ感染患者を治療するための特別なオリゴヌクレオチドの適性に関する初期の決定を行う。他のアッセイによりＨＩＶに感染していると決定されたが、ＨＩＶ防御アッセイにおいては決定されなかった患者を、異なるオリゴヌクレオチドの組み合わせに関連した防御アッセイを用いて再検査すべきである。他の具体例は以下の請求の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 9051−4ＣＡ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｈ 21/04 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 ＢＣ１２Ｎ 5/10 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (72)発明者カシアン，ダニエル・エルアメリカ合衆国92124カリフォルニア州、サンディエゴ、タンバー・ロード3911番

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸からの蛋白生産を阻害するための方法であって、該核酸上に存在する核酸配列領域を標的とする精製標的オリゴヌクレオチドおよび精製副標的オリゴヌクレオチドからなる組成物を該核酸に提供する工程を特徴とし、該副標的オリゴヌクレオチドが該標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンからなる方法。２．さらに第２の精製副標的オリゴヌクレオチドからなり、該第２の副標的オリゴヌクレオチドが該副標的オリゴヌクレオチドとは異なる該標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンからなる請求項１記載の方法。３．該組成物が、該標的オリゴヌクレオチドおよび該副標的オリゴヌクレオチドを単独で作用させるよりも蛋白生産を少なくとも１０倍阻害する請求項１記載の方法。４．該副標的オリゴヌクレオチドまたは該標的オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合、ホスホジエステル結合、およびメチルホスホネート結合からなる群より選択される少なくとも１種の結合からなる請求項３記載の方法。５．該副標的オリゴヌクレオチドおよび該標的オリゴヌクレオチドがそれぞれ少なくとも１つのホスホロチオエート結合からなる請求項４記載の方法。６．核酸からの蛋白生産を阻害するための方法であって、該蛋白をコードしている該核酸上に存在する異なる核酸配列領域を標的とする２種の精製オリゴヌクレオチドに該核酸を接触させることを特徴とし、該核酸配列領域が３ヌクレオチドよりも離れている方法。７．第２の生物の細胞または体液中に存在する第１の生物の増殖を阻害うるための方法であって、該外来生物の異なる核酸配列領域を標的とする２種の精製オリゴヌクレオチドに該第１の生物の核酸を接触させる工程を特徴とし、該核酸配列領域が３ヌクレオチドよりも離れている方法。８．該第１の生物が、細菌、真菌、寄生虫、およびウイルスからなる群より選択される請求項７記載の方法。９．該異なる核酸配列領域がともにＨＩＶゲノムの領域からなる請求項８記載の方法。１０．該精製オリゴヌクレオチドのそれぞれが、ホスホロチオエート結合、ホスホジエステル結合、およびメチルホスホネート結合からなる群より選択される少なくとも１種の結合からなる請求項９記載の方法。１１．該精製オリゴヌクレオチドのそれぞれが少なくとも１つのホスホロチオエート結合からなる請求項１０記載の方法。１２．第２の生物の細胞または体液中に存在する第１の生物の増殖を阻害するための方法であって、該第１の生物の核酸を標的とする精製標的オリゴヌクレオチドおよび精製副標的オリゴヌクレオチドに該第１の生物の核酸を接触させるエ程を特徴とし、該副標的オリゴヌクレオチドが該標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンからなる方法。１３．さらに第２の精製副標的オリゴヌクレオチドからなり、該第２の精製副標的オリゴヌクレオチドが該副標的オリゴヌクレオチドとは異なる該標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンからなる請求項１２記載の方法。１４．該第１の生物が、真菌、細菌、寄生虫、およびウイルスからなる群より選択される請求項１２記載の方法。１５．該核酸がＨＩＶゲノム領域からなる請求項１４記載の方法。１６．配列番号：副標的オリゴヌクレオチドに対する該標的オリゴヌクレオチドの割合が約１０対１である請求項１５記載の方法。１７．該副標的オリゴヌクレオチドまたは該標的オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合、ホスホジエステル結合、およびメチルホスホネート結合からなる群より選択される少なくとも１種の結合からなる請求項１５記載の方法。１８．該副標的オリゴヌクレオチドおよび該標的オリゴヌクレオチドがそれぞれ少なくとも１つのホスホロチオエート結合からなる請求項１７記載の方法。１９．生物の増殖を阻害するための方法であって、精製標的オリゴヌクレオチドおよび非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに該生物を接触させる工程を特徴とし、該標的オリゴヌクレオチドが該生物の核酸配列領域を標的とする方法。２０．該生物がレトロウイルスである請求項１９記載の方法。２１．該レトロウイルスがＨＩＶである請求項２０記載の方法。２２．該標的オリゴヌクレオチドが、メチルホスホネート結合、ホスホジエステル結合、およびホスホロチオエート結合からなる群より選択される少なくとも１種の結合からなる請求項２１記載の方法。２３．該標的オリゴヌクレオチドの主要な結合がホスホロチオエート結合である請求項２２記載の方法。２４．核酸からの蛋白生産を阻害するための組成物であって、該核酸上に存在する核酸配列領域を標的とする精製標的オリゴヌクレオチドおよひ精製副標的オリゴヌクレオチドからなり、該副標的オリゴヌクレオチドが該標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンからなる組成物。２５．さらに第２の精製副標的オリゴヌクレオチドからなり、該第２の精製副標的オリゴヌクレオチドが該副標的オリゴヌクレオチドとは異なる該標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンからなる請求項２４記載の方法。２６．該副標的オリゴヌクレオチドに対する該標的オリゴヌクレオチドの割合が約１０対１である請求項２４記載の組成物。２７．該副標的オリゴヌクレオチドまたは該標的オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合、ホスホジエステル結合、およびメチルホスホネート結合からなる群より選択される少なくとも１種の結合からなる請求項２４記載の組成物。２８．該副標的オリゴヌクレオチドおよび該標的オリゴヌクレオチドがそれぞれ少なくとも１つのホスホロチオエート結合からなる請求項２７記載の組成物。２９．核酸からの蛋白生産を阻害するための組成物であって、該核酸上に存在する異なる核酸配列領域を標的とする２種の精製オリゴヌクレオチドからなり、該核酸配列領域が３ヌクレオチドよりも離れている組成物。３０．さらに第３の標的オリゴヌクレオチドからなり、該第３の標的オリゴヌクレオチドが該２種の精製オリゴヌクレオチドのいずれとも異なる該核酸上に存在する核酸配列領域を標的とする組成物。３１．生物の増殖を阻害するための組成物であって、該生物の異なる核酸配列領域を標的とする２種の精製オリゴヌクレオチドからなり、該核酸配列領域が３ヌクレオチドよりも離れている組成物。３２．該生物が、真菌、細菌、寄生虫、およびウイルスからなる群より選択される請求項３１記載の組成物。３３．該異なる核酸配列領域がともにＨＩＶゲノムの領域からなる請求項３２記載の組成物。３４．該２種の精製オリゴヌクレオチドのそれぞれが、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、およびホスホジエステル結合からなる群より選択される少なくとも１種の結合からなる請求項３２記載の方法。３５．該精製オリゴヌクレオチドのそれぞれが少なくとも１つのホスホロチオエート結合からなる請求項３４記載の方法。３６．生物の増殖を阻害するための組成物であって、生物の核酸を標的とする精製標的オリゴヌクレオチドおよび精製副標的オリゴヌクレオチドからなり、該副標的オリゴヌクレオチドが該標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンからなる組成物。３７．さらに第２の精製副標的オリゴヌクレオチドからなり、該第２の精製副標的オリゴヌクレオチドが該精製副標的オリゴヌクレオチドとは異なる該標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンからなる請求項３６記載の組成物。３８．該生物が、真菌、細菌、寄生虫、およびウイルスからなる群より選択される請求項３６記載の組成物。３９．該核酸がＨＩＶゲノムの領域からなる請求項３８記載の組成物。４０．該副標的オリゴヌクレオチドまたは該標的オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合、ホスホジエステル結合、およびメチルホスホネート結合からなる群より選択される少なくとも１種の結合からなる請求項３９記載の組成物。４１．該副標的オリゴヌクレオチドおよび該標的オリゴヌクレオチドのそれぞれが少なくとも１つのホスホロチオエート結合からなる請求項４０記載の方法。４２．核酸からの蛋白生産を阻害するための組成物であって、該核酸を標的とする標的オリゴヌクレオチドおよび蛋白もしくは酵素に指向されたセンスまたはアプタマーオリゴヌクレオチドからなる組成物。４３．生物の増殖を阻害するための組成物であって、標的オリゴヌクレオチドおよびセンスオリゴヌクレオチドまたはアプタマーからなり、該標的オリゴヌクレオチドが核酸を標的とし、該センスオリゴヌクレオチドまたはアプタマーが酵素もしくは蛋白に指向されている組成物。４４．生物の増殖を阻害するための組成物であって、精製標的オリゴヌクレオチドおよび非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドからなり、該標的オリゴヌクレオチドが該生物の核酸を標的とする組成物。４５．さらに精製副標的オリゴヌクレオチドからなり、該副標的オリゴヌクレオチドが該標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンからなる請求項４４記載の組成物。４６．該生物がレトロウイルスである請求項４５記載の組成物。４７．該レトロウイルスがＨＩＶである請求項４６記載の組成物。４８．該標的オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合、ホスホジエステル結合、およびメチルホスホネート結合からなる群より選択される少なくとも１種の結合からなる請求項４７記載の組成物。４９．該標的オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのホスホロチオエート結合からなる請求項４８記載の組成物。５０．細胞増殖性疾患を治療するための組成物であって、該細胞増殖性疾患の原因となる調節エレメントをコードしている核酸に存在する２つの異なる核酸配列領域を標的とする２種の精製標的オリゴヌクレオチドからなり、該核酸配列領域が３ヌクレオチドよりも離れている組成物。５１．細胞増殖性疾患を治療するための組成物であって、精製標的オリゴヌクレオチドおよび精製副標的オリゴヌクレオチドからなり、該精製標的オリゴヌクレオチドが該細胞増殖性疾患の原因となる調節エレメントをコードしている核酸を標的とし、該副標的オリゴヌクレオチドが該標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンからなる組成物。５２．望ましくない細胞増殖を阻害するための組成物であって、精製標的オリゴヌクレオチドおよび非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドからなり、該精製標的オリゴヌクレオチドが該細胞増殖性疾患の原因となる調節エレメントをコードしている核酸を標的とする組成物。５３．ヒトにおける細胞増殖性疾患を治療または予防するための方法であって、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の組成物をヒトに投与する工程を特徴とする方法。５４．ＨＩＶに感染したヒトを治療するための治療組成物であって、ＳＥＱ. ＩＤ.ＮＯ.５：ＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧで示されるＨＩＶ核酸に完全に相補的な少なくとも９個の隣接したヌクレオチドからなる長さ９ないし１００ヌクレオチドの精製標的オリゴヌクレオチド、および該標的オリゴヌクレオチドの切断バージョンからなる精製副標的オリゴヌクレオチドよりなり、ＨＩＶ増殖を阻害することのできる治療組成物。５５．該副標的オリゴヌクレオチドが該標的オリゴヌクレオチドの４０ないし６０％のサイズである請求項５４記載の組成物。５６．該標的オリゴヌクレオチドがＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１：ＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＣＣＣＣＴＣＧＧＧまたはそのＲＮＡ等価物であるＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２：ＣＵＵＣＧＧＧＣＣＵＧＵＣＧＧＧＵＣＣＣＣＵＣＧＧＧで示されるヌクレオチド配列を有する請求項５５記載の治療組成物。５７．該副標的オリゴヌクレオチドがＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３：ＧＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＣＣＣまたはそのＲＮＡ等価物であるＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.４：ＧＣＣＵＧＵＣＧＧＧＵＣＣＣで示されるヌクレオチド配列を有する請求項５６記載の治療組成物。５８．該副標的オリゴヌクレオチドまたは該標的オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合、ホスホジエステル結合、およびメチルホスホネート結合からなる群より選択される少なくとも１種の結合からなる請求項５５記載の治療組成物。５９．該副標的オリゴヌクレオチドおよび該標的オリゴヌクレオチドがそれぞれ少なくとも１つのホスホロチオエート結合からなる請求項５６または５７記載の治療組成物。６０．請求項５４記載の治療組成物を患者に投与する工程を特徴とする、ＨＩＶに感染した患者の治療方法。６１．各オリゴヌクレオチド単独の作用の治療効果の和よりも少なくとも１０倍相乗的に作用する２種の精製標的オリゴヌクレオチドからなる、ヒトの苦痛を治療するための治療組成物。６２．該苦痛が、望ましくない細胞増殖、または生物による感染からなる群より選択される請求項６１記載の治療組成物。