CN109468310B - Dna编码碎片分子库的合成方法和连接基团的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及DNA编码分子库技术领域，具体提供一种DNA编码碎片分子库的合成方法和连接基团的筛选方法。该合成方法包括：提供含有n1序列、非编码区NC且连有三叉结构基团的A链，三叉结构基团的每个叉上具有携带保护基的官能团；含有n2序列的B链；含有n3序列的C链，n1、n2、n3序列为R1、R2、R3结构基团的标签；采用“分组‑合并‑分组”的合成方式获得具有R1、R2和R3结构基团的A5链。本发明首次实现3个碎片分子通过共价键连在一起的碎片分子库的合成，并且该碎片分子库可进一步用于对连接基团的筛选，为碎片分子的快速识别与精准筛选提供多样性的碎片分子库，为DNA编码碎片分子库的药物筛选提供更多可行性。

Description

DNA编码碎片分子库的合成方法和连接基团的筛选方法
技术领域
本发明属于DNA编码分子库技术领域，尤其涉及一种DNA编码碎片分子库的合成方法和连接基团的筛选方法。
背景技术
当代药物研发中，针对疾病的药物靶点，通过构建大型的候选药物分子库，进行高通量、大规模筛选已经成为新药物研发中不可或缺的手段。当今世界上主要的制药公司均拥有大型的分子库和大规模的筛选平台用于新药研发。然而，传统的分子库和筛选由于筛选平台成本高昂、技术门槛高、管理运行复杂等，已经严重制约高通量筛选的发展和应用。近年来，科学家们发展了两种新型的药物筛选方法：基于碎片的药物发现技术(Fragment-Based Drug Discovery；简称FBDD)、DNA编码分子库的合成与筛选技术。其中，Jencks等科学家提出的分子碎片药物设计是把一个已知的药物分子剪裁成多个碎片，这些分子碎片中的一些可能继承了原有活性分子的全部或部分药理性质，再通过筛选这些分子碎片，有可能可以找到更好的药物分子。而DNA编码分子库则是近5～8年中兴起的一种新型超高通量药物筛选技术。在DNA编码分子库中，每一个化合物与一个特异性的DNA链相连接，成为一个特异条形码，从而实现对化合物的特异性编码。无论分子库中含有多少个化合物，均可以实现化合物结构与DNA编码之间的一一对应关系。因此，DNA编码分子库能够在极小的体系中，实现千万乃至上千亿级的高通量筛选，整个分子库的筛选一次就可以完成，而与分子库中化合物的个数无关，在筛选之后，筛选结果可以通过PCR扩增和DNA测序对所筛选出的化合物的DNA条形码进行解码分析，推断出相应的化合物结构，从而获得苗头化合物用于药物的进一步研发。近年来，DNA编码分子库在新药研发领域中已经得到越来越多的认可并被广泛应用，成为大多数药企在新药研发中的一项重要支撑技术。
DNA编码分子库药物筛选技术与传统的高通量筛选相比，在分子库的合成速度、成本、筛选效率以及分子库通量方面展现了极大的优势。在DNA编码分子库药物筛选技术的发展中，DNA编码分子库的合成技术与筛选技术是两个关键点，往往决定着药物筛选的成效。因此，发展新型的DNA编码分子库的合成技术具有十分重要的意义。
而将上述两种强有力的药物发现技术结合起来，合成基于DNA编码的大规模碎片分子库，实现DNA编码的高通量碎片分子库筛选，则能够充分结合基于碎片的药物发现技术和DNA编码分子库的合成与筛选技术的优势，是药物研发中的重要新兴筛选技术。然而，由于DNA固定双链结构的限制，现有的DNA编码碎片分子库存在两个较大的局限：(1)仅能够进行两个碎片之间的排列组合，大大限制了碎片分子库的化学多样性；(2)更为重要的是，仅仅能够筛选碎片本身，而无法筛选碎片之间的连接基团，也就是说，在碎片结构被筛选出来之后，还需要进一步额外的工作，将两个碎片用不同的连接基团进行连接，形成一个个的化合物之后，再进行单独的测试，因此工作量巨大，由此也会导致基于碎片药物发现的效率低下。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA编码碎片分子库的合成方法，以解决现有DNA编码碎片分子库的合成技术中最多只能同时引入两组碎片结构单元而无法为分子库更加丰富的多样性提供可能性的问题。
进一步地，本发明还提供基于该DNA编码碎片分子库的连接基因的筛选方法。
本发明是这样实现的：
一种DNA编码碎片分子库的合成方法，包括以下步骤：提供A链、B链、C链；
所述A链含有n1序列、非编码区NC且所述A链连接有三叉结构基团，所述三叉结构基团的每个叉上具有官能团，每个所述官能团携带有保护基；
所述B链含有n2序列，所述n2序列为R2结构基团的标签；
所述C链含有n3序列，所述n3序列为R3结构基团的标签；
采用“分组-合并-分组”的合成方式，获得具有R1、R2和R3结构基团的A5链，所述n1序列为R1结构基团的标签。
相应地，一种连接基团的筛选方法，包括以下步骤：
提供如上所述的DNA编码碎片分子库；
提供具有n4序列的D链，所述D链修饰一个具有三叉结构的连接基团L，所述D链的非编码区NCr与所述DNA编码碎片分子库中的非编码区NC的碱基互补；
将所述DNA编码碎片分子库与固载的靶点蛋白进行孵育，洗脱掉与靶点蛋白没有亲和力或者亲和力较弱的DNA编码碎片分子库，获得与靶点蛋白有较强亲和力的DNA编码碎片分子库化合物；
将所述D链与所述与靶点蛋白有较强亲和力的DNA编码碎片分子库化合物混合并孵育，使所述D链非编码区NCr的DNA与所述与靶点蛋白有较强亲和力的DNA编码碎片分子库化合物携带的非编码区NC的DNA耦合，同时所述化合物中的3个碎片分子转移至所述连接基团L上，并向其中加入DNA聚合酶，使所述D链的DNA发生延展，以复制3个碎片分子对应的n1、n2、n3序列，获得具有三个碎片分子和连接基团L且被n1、n2、n3、n4序列编码的双链DNA。
本发明的有益效果如下：
相对于现有技术，本发明提供的DNA编码碎片分子库的合成方法，首次实现将三个碎片分子通过共价键连接在一起以获得DNA编码碎片分子库，由于其一次性实现对三个碎片进行排列组合，从而可以获得更加复杂、多样性的DNA编码碎片分子库，为直接对碎片的连接基团进行编码和筛选提供了更为精准的方案，同时也可以极大的提高碎片分子库的筛选效率。
本发明提供的连接基团的筛选方法，通过具有三个碎片分子的DNA编码碎片分子与DNA标记的目标连接基团进行孵育、延展等，实现一次性对碎片分子和连接基团的编码和筛选，为连接基团的编码和筛选提供了精准快捷的手段，该编码和筛选方法极大的降低了碎片分子筛选的工作量，并提高碎片药物分子发现的效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的A链、B链、C链、D链的结构示意图；
图2是本发明提供的DNA编码碎片分子库的合成过程示意图；
图3是本发明提供的连接基团的编码和筛选流程示意图；
图4是本发明提供的DNA编码碎片分子库的合成及连接基团的编码、筛选凝胶电泳追踪的凝胶电泳图；
图5是对本发明提供的DNA编码碎片分子库的合成方法获得的含有生物素的碎片分子库对链霉亲和素(streptavidin)蛋白的筛选过程示意图；
图6是对本发明提供的DNA编码碎片分子库的合成方法获得的含有生物素的碎片分子库对链霉亲和素(streptavidin)蛋白的筛选前后n2区域的序列对比图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1、2，本发明提供一种DNA编码碎片分子库的合成方法。该合成方法包括以下步骤：
步骤S01.提供A链、B链、C链；
所述A链含有n1序列、非编码区NC且所述A链连接有三叉结构基团，所述三叉结构基团的每个叉上具有官能团，每个所述官能团携带有保护基；
所述B链含有n2序列，所述n2序列为R2结构基团的标签；
所述C链含有n3序列，所述n3序列为R3结构基团的标签。
步骤S02.采用“分组-合并-分组”的合成方式，获得具有R1、R2和R3结构基团的A5链，所述n1序列为R1结构基团的标签。
下面对本发明的技术方案做详细的解释说明。
请参阅图1，本发明涉及的A链，是DNA链，该DNA链具有n1序列和非编码区NC，n1序列可以作为R1结构基团的标签，在后续将A链与具有R1结构基团的化合物进行特异性连接时，即可作为R1结构基团的标签，该非编码区NC可与D链中的DNA非编码区NCr发生碱基配对，形成双链DNA。该n1序列上面修饰一个三叉结构基团，每个所述三叉结构基团的每个叉上具有官能团，并且该官能团上携带保护基。
优选地，每个官能团上所携带的保护基与其他官能团上所携带的保护基均不相同，以便于后续采用“分组-合并-分组”合成方式合成DNA编码碎片分子库引入结构基团时，通过控制反应条件而有效控制结构基团的接入部位，避免引入的一个结构基团与多个官能团发生反应而导致其他后续的结构基团无法引入。
优选地，所述官能团为巯基，其保护基为叔丁基硫基﹑三苯甲基﹑苯甲酰基等等中的任意三种。巯基官能团作为A链三叉结构基团上的官能团，且连接有三个不同的保护基时，在反应中根据反应条件的不同，易于进行选择性脱保护后发生加成或者取代反应，使得R1结构基团、R2结构基团、R3结构基团被连入A链里。
步骤S02.所述“分组-合并-分组”(即split-pool-split)的合成方式，具体可参阅图2，包括以下步骤：
(a).将具有R1结构基团的化合物与A链进行反应，使所述R1结构基团与其中一个所述官能团发生反应，获得具有R1结构基团的A1链；如在磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)或者二硫代苏糖醇(DTT)的作用下，将A链中带有三种类型巯基保护基中的一个二硫键切断，使得携带R1结构基团的化合物中的R1结构基团连接至巯基端，得到相应的巯基化合物，具体得到A1链。
(b).采用DNA连接酶将A1链与B链连接，获得A2链，使得n2序列与n1序列组合到一起，其中n1序列成为R1结构基团的标签。
(c).在酸性条件下，将巯基官能团上的三苯甲基(Trt)保护基脱除后，加入具有R2结构基团的化合物，使其与A2链进行反应，并且引入R2结构基团，获得具有R1和R2结构基团的A3链，其中n2序列成为R2结构基团的标签。
(d).采用DNA连接酶将A3链与C链连接，获得A4链，使得C链的n3序列与n1、n2序列组合到一起。
(e).在碱性条件下，使A4链上的硫酯保护基脱除，并加入具有R3结构基团的化合物，使其与所述A4链反应，获得具有R1、R2和R3结构基团的A5链，其中n3序列成为R3结构基团的标签。
如果在n1﹑n2﹑n3三个编码区域包含a﹑b﹑c种不同的DNA序列，而与之相对应的DNA编码的结构单元则为：A链(a种)﹑B链(b种)﹑C链(c种)。这样就能够一步在分子库中生成a×b×c种不同的化合物组合。举例来说，如果a＝b＝c＝1000，则该分子库的规模为：10003＝109个化合物，具有极大的化学多样性，能够实现极高通量的分子库筛选。值得指出的是，本申请提出的方法中，对结构基团的要求较低，仅仅需要简单的羧酸即可；而羧酸则是最为广泛，最容易商业获得的结构基团，因此为构建大规模DNA编码碎片分子库带来了优势，当然也可以是其他结构基团。
由此，本发明DNA编码碎片分子库的合成方法可以获得DNA编码碎片分子库，首次实现了三种碎片分子通过共价键连接在一起的碎片分子库的合成，为后续的精准筛选提供了碎片分子库，提高筛选的准确性和效率。
相应地，基于上述合成的DNA编码碎片分子库，本发明还提供一种连接基团的筛选方法。请参阅图3，该连接基团的筛选方法，包括以下步骤：
步骤S01.采用本发明提供的DNA编码碎片分子库的合成方法，获得如上所述的DNA编码碎片分子库，该DNA编码碎片分子库的DNA链上具有非编码区NC；
步骤S02.提供具有n4序列的D链，所述D链修饰一个具有三叉结构的连接基团L，所述D链的非编码区NCr与所述DNA编码碎片分子库中的非编码区NC的碱基互补；
步骤S03.将所述DNA编码碎片分子库与固载的靶点蛋白进行孵育，一定时间后，进行洗脱，与靶点蛋白亲和力较弱或者没有亲和力的DNA编码碎片分子被洗脱，而有较强亲和力的DNA编码碎片分子则留在体系中，获得与靶点蛋白有较强亲和力的DNA编码碎片分子库化合物；
步骤S04.将所述D链和与靶点蛋白有较强亲和力的DNA编码碎片分子库化合物进行混合并孵育，由于D链非编码区NCr的DNA和与靶点蛋白有较强亲和力的DNA编码碎片分子库化合物携带的非编码区NC的DNA耦合，同时与靶点蛋白结合得到的化合物中的3个碎片分子转移至所述连接基团L上，如果该连接基团L在获得三个碎片分子之后，仍然能够与靶点蛋白相结合，则留在固载的蛋白之上，如果不能与靶点蛋白相结合，则被洗脱。向其中与靶点蛋白相结合的部分中加入DNA聚合酶(DNA polymerase)，使所述D链的DNA发生延展，以复制3个碎片分子对应的n1、n2、n3序列，获得具有三个碎片分子和连接基团L且被n1、n2、n3、n4序列编码的双链DNA。
最后，还包括在变性条件下，进行洗脱，对双链DNA进行分离，再通过PCR扩增和DNA测序就可以识别靶点蛋白能够结合的碎片组合，以及它们之间的连接基团L的结构。
在上述连接基团的编码和筛选过程中，连接基团L是各种类型的连接基团，由此可以寻找到合适于三个碎片分子的连接基团。
优选地，所述连接基团L的三叉结构为三叉氨基结构。
以三叉氨基结构作为连接基团L上的修饰基团，胺基能够与DNA编码碎片分子库中的N-羟基丁二酰亚胺活化酯部分迅速发生反应，生成酰胺键，并且其中三个碎片分子被转移到D链的连接基团上。
进一步优选地，所述三叉氨基结构中包含烃基﹑烷氧基﹑芳基或者杂芳基等等。
上述术语“烃基”表示烷基、烯基或炔基。“芳基”表示苯基或者有取代基的苯基。“杂芳基”表示吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪和嘧啶等等。
上述步骤S03的孵育时间为2～16h，经过孵育，洗脱掉与靶点蛋白没有亲和力或者亲和力较弱的DNA编码碎片分子库，由此获得与靶点蛋白有较强亲和力的DNA编码碎片分子库化合物。
步骤S04的孵育时间为2～16h。
为更好的说明本发明的技术方案，下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种DNA编码碎片分子库的合成方法及其对连接基团的编码与筛选方法，其合成路径请参阅图2，具体包括以下步骤：
S1.提供如图1所示的A链、B链、C链、D链，总共有260个不同的DNA序列标签，分别对260个不同的结构基团进行编码，其中，A链对应的序列和相应的结构基团种类为100种、B链对应的序列和相应的结构基团为50种、C链对应的序列和相应的结构基团为90种，D链对应的连接基团L的种类为20种；
S2.按照图2所示的合成流程，合成100×50×90＝450000个化合物的DNA编码碎片分子库。在整个碎片分子库中，设计了有一个特殊的“AAAA”编码，用于对分子库中唯一含有生物素基团的结构单元进行编码(位于n2区域)。
由于生物素是一个已知的，能够与链霉亲和素(streptavidin)蛋白质选择性结合，并具有高结合力的配体。因此，在合成该碎片分子库之后，进一步对streptavidin蛋白质靶点的筛选，并进行了D链连接基团的编码和筛选，最后通过PCR扩增和DNA测序对所筛选出的化合物进行了解码。
具体结果如图4、图5、图6所示。其中图4为凝胶电泳进行合成追踪。从图4可知DNA编码碎片分子库的合成过程以及DNA编码碎片分子库对连接基团进行筛选后的DNA变化情况。
从图5、图6的测序数据可知，在筛选之前，生物素的编码区域(n2序列)为乱码，表明为混合序列，和预期一致；但是在筛选完成之后，n2序列清晰的显出TTTT的序列被富集。由于测序数据显示的是分子库中DNA的反义序列，因此实际对应的分子库编码序列为“AAAA”，因此证明了生物素的编码AAAA被富集。与此同时，通过对连接基团L的筛选，精准的找到了连接包含生物素在内的3个碎片最好的连接基团为赖氨酸的衍生物。
对以上数据充分证明了本发明的DNA编码碎片分子库技术和对连接基团的筛选技术，实现了3个结构基团的碎片分子库的合成、表征，以及针对于蛋白质靶点的筛选和解码。需要指出的是，本发明在实际应用中，各个编码区域不仅仅限于上述实例中的四个碱基，而一般具有大约12个碱基；而理论上12个碱基的编码能力为：412，因此能对更大规模的分子库进行编码。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种DNA编码碎片分子库的合成方法，其特征在于，提供A链、B链、C链；
所述A链含有n1序列、非编码区NC且所述A链连接有三叉结构基团，所述三叉结构基团的每个叉上具有官能团，每个所述官能团携带有保护基；所述官能团为巯基；所述保护基为叔丁基硫基﹑三苯甲基﹑苯甲酰基；
所述B链含有n2序列，所述n2序列为R2结构基团的标签；
所述C链含有n3序列，所述n3序列为R3结构基团的标签；
采用“分组-合并-分组”的合成方式，获得具有R1、R2和R3结构基团的A5链，且所述n1序列为R1结构基团的标签。
2.如权利要求1所述的DNA编码碎片分子库的合成方法，其特征在于，所述“分组-合并-分组”的合成方式包括以下步骤：
将具有R1结构基团的化合物与A链进行反应，使所述R1结构基团与其中一个所述官能团发生反应，获得具有R1结构基团的A1链；
采用DNA连接酶将A1链与B链连接，获得A2链；
将具有R2结构基团的化合物与A2链进行反应，使所述R2结构基团与其中一个所述官能团发生反应，获得具有R1和R2结构基团的A3链；
采用DNA连接酶将A3链与C链连接，获得A4链；
将具有R3结构基团的化合物与所述A4链反应，使所述R3结构基团与其中剩余的所述官能团发生反应，获得具有R1、R2和R3结构基团的A5链。
3.一种连接基团的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供如权利要求1～2任一项所述的合成方法合成的DNA编码碎片分子库；
提供具有n4序列的D链，所述D链修饰一个具有三叉结构的连接基团L，所述D链的非编码区NCr与所述DNA编码碎片分子库中的非编码区NC的碱基互补；
将所述DNA编码碎片分子库与固载的靶点蛋白进行孵育，洗脱掉与靶点蛋白没有亲和力或者亲和力较弱的DNA编码碎片分子库，获得与靶点蛋白有较强亲和力的DNA编码碎片分子库化合物；
将所述D链与所述与靶点蛋白有较强亲和力的DNA编码碎片分子库化合物混合并孵育，使所述D链非编码区NCr的DNA与所述与靶点蛋白有较强亲和力的DNA编码碎片分子库化合物携带的非编码区NC的DNA耦合，同时所述化合物中的3个碎片分子转移至所述连接基团L上，并向其中加入DNA聚合酶，使所述D链的DNA发生延展，以复制3个碎片分子对应的n1、n2、n3序列，获得具有三个碎片分子和连接基团L且被n1、n2、n3、n4序列编码的双链DNA。
4.如权利要求3所述的连接基团的筛选方法，其特征在于，还包括对所述的双链DNA进行PCR扩增、测序，识别所述靶点蛋白特异结合的碎片组合及连接基团L。
5.如权利要求3所述的连接基团的筛选方法，其特征在于，所述连接基团L的三叉结构为三叉氨基结构。
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