CN108624603A - 一种(s)-羰基还原酶及其编码基因与应用 - Google Patents

一种(s)-羰基还原酶及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种来源于红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的羰基还原酶基因、其编码酶，以及含有该基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系及重组菌。本发明公开的羰基还原酶ReADH具有优良的酶学特性，其最适pH值为6.0，最适反应温度为40℃，在30℃下保温24h有良好的稳定性。用本发明的羰基还原酶可以高效转化苯乙酮，转化率大于99％，且合成(S)‑α‑苯乙醇e.e.值是100％，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种(S)-羰基还原酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物催化技术领域，尤其涉及一种(S)-羰基还原酶、其编码基因、含有该基因的载体及重组菌以及在催化不对称还原前手性羰基化合物中的应用。
背景技术
羰基还原酶(EC 1.1.1.184)是众多氧化还原酶中的一种，对酮类、醛类底物有特异性的催化能力，可以将其转化为醇类产物，转化过程中需以辅酶NADP(H)或NAD(H)作为电子受体，具有高度的辅酶依赖性。在自然界中，羰基还原酶的存在非常普遍，从低等微生物如细菌、酵母，到一些高等植物、动物组织中均有分布。而在手性醇的合成应用中，尤以微生物来源的羰基还原酶研究居多。
微生物中存在的羰基还原酶有不同的分类方法，根据催化机理及三维结构主要分为以下几类：醛酮还原酶家族(aldo-keto reductase superfamily,AKR)、短链脱氢酶/还原酶家族(short-chain dehydrogenase/reductase,SDR)、Zn依赖醇脱氢酶/还原酶家族(zinc-dependent alcohol dehydrogenases,ADH)。羰基还原酶中短链脱氢酶每个分子大约有250-350个氨基酸，没有金属离子，不同来源的短链脱氢酶相互之间的同源性较低，多为15％-30％左右。至今为止，在蛋白数据库中已有两万多的短链脱氢酶序列被提交，其中大约有3/4来源于细菌。
随着手性化合物的广泛应用，关于手性化合物高效制备的研究日显重要，特别是在农业、医药以及化工等主要需求领域。具有光学活性的芳基手性醇作为具有高附加值的手性砌块，在医药、农业和精细化工领域扮演了重要的角色。然而目前手性醇的制备主要依赖化学合成，但化学法会造成严重污染，破坏人们的生活环境。生物催化法以其环境友好、反应条件温和、对底物专一等优点逐渐成为了手性醇制备最具前景的研究方向。
羰基还原酶是一种具备高度的化学选择性、区域选择性、立体对映选择性的生物催化剂，通过不对称还原反应可以将潜手性酮底物转化为具有光学纯度的芳基手性醇，是一种高效的生物转化途径。最近几十年越来越多的羰基还原酶被用于手性醇的合成。如Pollard(Pollard D,Truppo M,Pollard J,et al.Effective synthesis of(S)-3,5-bistrifluoromethylphenyl ethanol by asymmetric enzymaticreduction.Tetrahedron:Asymmetry,2006,17(4):554-559)等人为了提高产物(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的时空产率，利用羰基还原酶辅酶再生体系进行不对称转化，反应获得的(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇时空产率高达260g·L-1·d-1；朱敦明等(ZhuD,YangY,HuaL.Stereoselective enzymatic synthesis of chiral alcohols with the use of acarbonyl reductase from Candida magnoliaewithAnti-Prelogenantioselectivity.The Journal ofOrganic Chemistry,2006,71(11):4202-4205)以羰基还原酶Candida magnoliae为生物催化剂催化多种苯乙酮衍生物，反应所得产物的光学纯度均高达99％以上。
(S)-α-苯乙醇，是一种用于合成多类药物的手性中间体，它是免疫增强剂左旋咪唑、治疗哮喘的药物(S)-异丙肾上腺素、抗抑郁药物取舍林等合成的前体。当前(S)-α-苯乙醇的制备主要是通过化学法和生物法来进行。与传统化学合成技术相比，羰基的不对称生物还原具有立体选择性强、催化效率高、反应条件温和、以及生产过程对环境友好等优势。因此，近年来利用羰基还原酶不对称还原苯乙酮成为生产该类手性醇的方法。而开发一些新型、高效、稳定，能够适应多变生产环境的羰基还原酶成为了生物催化工业的核心，对于工业制备(S)-α-苯乙醇具有重要的研究意义和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的羰基还原酶ReADH及其其编码基因。
本发明的另外一个目的在于提供一种含有上述羰基还原酶ReADH编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系及重组菌。
本发明再一个目的在于提供上述在羰基还原酶ReADH还原苯乙酮生成(S)-α-苯乙醇中的应用。
本发明的技术方案如下：
一种来源于红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的羰基还原酶基因，其核苷酸序列为如下1)-3)中任一所述的基因：
1)SEQ ID NO：1所示的基因；
2)在高严谨条件下与1)所述基因杂交且编码相同蛋白的基因；
3)与1)或2)所述的基因具有90％以上的同源性且编码相同蛋白的基因；
上述高严谨条件为用0.1×SSPE或SSC，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
所述羰基还原酶基因优选由如下方法得到：利用PCR技术，在引物ReADH-F(SEQ IDNO：3)和引物ReADH-R(SEQ ID NO：4)的作用下，以红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)的总基因组DNA为模板，扩增得到羰基还原酶基因序列。
本发明还包括上述羰基还原酶基因编码的羰基还原酶ReADH，是如下a或b的蛋白质：
a、SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b、SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有羰基还原酶活性的衍生蛋白质。如SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列第184位丙氨酸取代天冬氨酸形成的蛋白质仍具有羰基还原酶活性。
优选的，所述SEQ ID NO：2所示序列的羰基还原酶ReADH分子量约为36kDa。
为了使a中的蛋白便于纯化，可在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签中的一种。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tagII 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述b中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b中的蛋白的编码基因可通过将SEQ ID NO：1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明还包括含有上述羰基还原酶基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系及重组菌。
本发明所述含有上述羰基还原酶基因的表达盒，优选还含有T7启动子，Lac I操纵子和T7终止子。
所述重组载体包括上述技术方案所述羰基还原酶编码基因和表达载体，本发明所述羰基还原酶ReADH基因表达的载体可以为pET、pCW、pUC或者pPIC9k等。本发明所述重组载体优选是将上述羰基还原酶编码基因插入pET-28a(+)的多克隆位点得到。具体地讲，是将pET-28a(+)的NdeI和BamHI限制性酶切位点之间的小片段取代为本发明所述羰基还原酶基因得到的重组质粒。
本发明所述转基因细胞系优选为含有携带上述技术方案所述羰基还原酶编码基因质粒的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)株系。
在本发明中，所述羰基还原酶ReADH的表达宿主可以为大肠杆菌、毕赤酵母或链霉菌等。本发明所述重组菌优选将上述羰基还原酶基因通过所述的重组载体导入大肠杆菌(Escherichia coli)中，得到转基因重组菌。所述大肠杆菌优选为BL21(DE3)。
本发明还提供了羰基还原酶ReADH作为生物催化剂在还原苯乙酮生成(S)-α-苯乙醇中中的应用。上述应用中，所述的催化条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择。羰基还原酶ReADH作催化剂时，反应体系为：羰基还原酶ReADH，NADH或NADPH，底物苯乙酮。反应体系的酶浓度、NADH或NADPH量、底物浓度等可以调整。优选的，所述羰基还原酶ReADH与所述苯乙酮的用量比优选为(1～5)U:(0.1～500)mmol，更优选为(3～5)U:(100～200)mmol。所述NADP或NADPH与所述苯乙酮的用量比优选为(0.5～1)mg:(0.1～200)mmol，更优选为(0.6～0.8)mg:(100～150)mmol。本发明中，所述催化的温度优选为30～45℃，更优选为35～40℃；催化的pH值优选为4.5～7.5，更优选为5.0～7.0；催化反应的时间优选为8～24h，更优选为12～20h。本发明优选用缓冲液调整反应的pH值，所述缓冲液可以为柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸/氢氧化钠或Kpi缓冲液。在本发明具体实施例中优选用Kpi缓冲液调整反应的pH值。反应结束后，乙酸乙酯萃取终止反应，获得产物。经验证该酶能够高选择性(e.e.＝100％)地催化苯乙酮还原为(S)-α-苯乙醇。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种来源于红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的羰基还原酶基因，该羰基还原酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的表达重组质粒pET-28a(+)-adh5，再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌能够表达羰基还原酶ReADH，为转化苯乙酮合成(S)-α-苯乙醇的生物催化合成提供了可供选择的新酶源。
本发明的羰基还原酶ReADH具有优良的酶学特性，该酶的最适pH值为6.0，最适反应温度为40℃，在30℃下保温24h有良好的稳定性。
本发明的羰基还原酶ReADH可以高效转化苯乙酮，转化率大于99％，生成(S)-α-苯乙醇e.e.值是100％。本发明羰基还原酶ReADH的粗酶液转化工艺简单，羰基还原酶ReADH在催化体系中催化活性稳定，在催化苯乙酮还原为(S)-α-苯乙醇中具有较大的工业应用前景。
附图说明
图1为实施例2中重组羰基还原酶的电泳图，其中，M为低分子量标准蛋白质；CK及CK’为对照组全细胞及上清；R及R’为重组羰基还原酶全细胞液及上清粗酶液；
图2为羰基还原酶在不同pH值下的相对酶活性；
图3为羰基还原酶在不同温度下的相对酶活性；
图4为羰基还原酶在不同温度下的稳定性试验结果；
图5为苯乙酮标准品液相检测峰图；
图6为α-苯乙醇消旋体液相检测峰图；
图7为羰基还原酶ReADH催化还原苯乙酮生成(S)-α-苯乙醇的液相检测峰图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例所述引物的合成及测序工作均由华大基因完成。
实施例1羰基还原酶基因的获得
将红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的基因在NCBI中进行比对分析，得到一个羰基还原酶基因序列信息。
通过DNAMAN软件对序列进行分析，设计基因特异引物ReADH-F和ReADH-R，分别引入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点，引物序列如下：
ReADH-F：GGGTTTCATATGAAGGCAATCCAGTACACGAG(NdeⅠ)
ReADH-R：ATTCGCGGATCCCTACAGACCAGGGACCACAACCG(BamHⅠ)。
PCR反应以红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的基因组DNA为模板，ReADH-F、ReADH-R为引物，使用KOD-Plus聚合酶进行扩增。
PCR反应体系如下：DNA模板，约100ng；上下游引物(10μM)，各1.5μL；10×BufferforKOD-Plus，5μL；dNTPs(各2mM)，5μL；MgSO4(25mM)，2μL；KOD-Plus(1.0U/μL)，1μL，加水至总体积50μL。
PCR条件为：94℃2min；94℃15s，56℃30s，68℃1.2min，30个循环；68℃15min。
琼脂糖凝胶试剂盒回收扩增产物，经NdeⅠ和BamHⅠ双酶切后，连接至pET-28a(+)载体，转化E.coliBL21(DE3)，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板筛选阳性转化子并测序验证。
扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1的所示，其可编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的蛋白质。
实施例2羰基还原酶的表达
将实施例1验证正确的阳性转化子于800mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中扩大培养。37℃振荡培养至OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度0.1mM，20℃诱导培养过夜。按上述条件诱导后，于4℃，6000rpm离心20min收集菌体。取适量菌体，按菌体浓度100mg/mL重悬于KPi缓冲液(50mM，pH 7.5)，菌液于冰水浴中超声破碎。离心收集上清，即为重组羰基还原酶粗酶液。
分别收集全细胞液及超声破碎的上清液(粗酶液)经SDS-PAGE(5％浓缩胶，12％分离胶)分离，考马斯亮蓝染色后观察结果。结果如图1所示。
图1表明，重组羰基还原酶ReADH在上述诱导条件下有良好可溶表达，分子量大小约48kDa，因pET-28a(+)载体中携带有一段组氨酸标签，故其分子量比预测偏大。
实施例3羰基还原酶的性质
一、羰基还原酶酶活测定
羰基还原酶ReADH催化的反应消耗NADH，生成NAD+，导致340nm处吸光值的变化。故羰基还原酶酶活测定方法如下：
200μL反应体系中含有50mM，pH 7.5的KPi缓冲液，终浓度10mM的苯乙酮，终浓度0.5mM的NADH及10μL ReADH粗酶液。在340nm下测定其吸光值的变化。
酶活力定义为：在上述条件下，每分钟催化生成1μmol的NAD(H)的酶量定义为1个酶活单位。
酶活的计算公式为：酶活(U/mL)＝EW×0.2×103/(6.22×0.5×10)
其中，EW：1min内340nm处最终吸光度值与初始吸光度值的差值；0.2：反应液的体积；6.22：摩尔消光系数；0.5：光程距离；10：粗酶液体积。
二、羰基还原酶的最适pH
将上述酶活测定中的缓冲液换成如下不同pH值的4种不同缓冲液：柠檬酸/柠檬酸钠(pH 3.0-6.5)、磷酸氢二钠/磷酸二氢钠(pH 6.0-8.0)、Tris-HCl(pH 7.5-9.0)，甘氨酸/氢氧化钠(pH 8.5-10.5)，分别测定羰基还原酶ReADH的酶活，酶活力测定方法同上，以酶活力最高点作为100％，确定其活力达最高时的缓冲液pH值。结果如表2和图2所示。
表2不同pH值下ReADH的相对酶活及标准差
图2中，带有“◆”的曲线为ReADH在柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中的相对酶活；带有“□”的曲线为ReADH在磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中的相对酶活；带有“▲”的曲线为ReADH在Tris-HCl缓冲液中的相对酶活；带有“×”的曲线为ReADH在甘氨酸/氢氧化钠缓冲液中的相对酶活。
由表1和图2表明，羰基还原酶ReADH的最适pH为6.0，在pH为4.5～8.5的范围内，羰基还原酶ReADH的酶活性能够达到58％以上。
三、羰基还原酶的最适温度及温度稳定性
酶活最适温度的测定：将酶活反应体系中的缓冲液换成其最适pH的缓冲液，然后分别在30-60℃下按照上述方法测定羰基还原酶ReADH的酶活，酶活力测定方法同上，以酶活力最高点作为100％，确定其活力达最高时的反应温度。结果如图3所示。
图3表明，羰基还原酶ReADH的最适温度为40℃。
温度稳定性测定：将羰基还原酶ReADH的粗酶液分别在30℃、35℃、40℃保温8h、12h、24h，然后置于冰水浴中冷却30min，最后在最适的pH及温度条件下测定残余酶活力，酶活力测定方法同上。以未经处理的酶液作为对照。结果如表3和图4所示。
表3为不同温度下ReADH的残余酶活及标准差
表3和图4表明，羰基还原酶ReADH在30℃保温处理24h后，残余酶活仍可达到80％左右，在该温度下有良好稳定性，适用于苯乙酮的催化还原反应中。
实施例3羰基还原酶在苯乙酮催化还原反应中的应用
一、反应的建立
建立1mL苯乙酮催化还原反应体系如下：
1mL缓冲液(50mM，pH 7.5，KPi)中，含有底物苯乙酮100mM(10％DMSO助溶)，NADH0.5mg/mL，甲酸钠300mM，羰基还原酶ReADH 1U，甲酸脱氢酶适量。30℃，200rpm，反应24h。
二、反应的检测
反应结束后，向各反应液中加入1mL乙酸乙酯萃取，涡旋振荡3min，离心(14000rpm，2min)。收集上层萃取液于通风橱风干。风干后复溶于等体积流动相溶液中，涡旋振荡后过0.22μm膜，待液相条件进行检测。
液相检测使用 OD-H柱子，流动相以体积比计，为90％正己烷+10％异丙醇，流速：0.8mL/min，柱温：30℃，可变波长扫描紫外检测器(VWD)，检测波长为220nm。根据峰面积计算苯乙酮的转化率及及产物(S)-α-苯乙醇的光学纯度。
液相结果如图4～7所示。
图5为苯乙酮标准品液相检测峰图，其保留时间在6.4min左右；图6为-苯乙醇消旋体液相检测峰图，其中(S)-α-苯乙醇的保留时间在8.4min左右；图7为羰基还原酶ReADH催化还原苯乙酮生成(S)-α-苯乙醇的反应结果，可见底物苯乙酮基本消耗完全，生成大量(S)-α-苯乙醇，而无R构型α-苯乙醇生成。通过计算，羰基还原酶ReADH对苯乙酮转化率达大于99％，生成(S)-α-苯乙醇e.e.值是100％。表明该反应有较高的转化率且反应条件温和高效，在催化苯乙酮还原为(S)-α-苯乙醇中有良好应用潜力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河北省科学院生物研究所
<120> 一种(S)-羰基还原酶及其编码基因与应用
<130> GW2018I0838
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1047
<212> DNA
<213> Rhodococcus erythropolis
<400> 1
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<211> 348
<212> PRT
<213> Rhodococcus erythropolis
<400> 2
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Val Ile Gly Thr Gly Gly Leu Gly His Val Ala Ile Gln Leu Leu Arg
180 185 190
His Leu Ser Ala Ala Thr Val Ile Ala Leu Asp Val Ser Ala Asp Lys
195 200 205
Leu Glu Leu Ala Thr Lys Val Gly Ala His Glu Val Val Leu Ser Asp
210 215 220
Lys Asp Ala Ala Glu Asn Val Arg Lys Ile Thr Gly Ser Gln Gly Ala
225 230 235 240
Ala Leu Val Leu Asp Phe Val Gly Tyr Gln Pro Thr Ile Asp Thr Ala
245 250 255
Met Ala Val Ala Gly Val Gly Ser Asp Val Thr Ile Val Gly Ile Gly
260 265 270
Asp Gly Gln Ala His Ala Lys Val Gly Phe Phe Gln Ser Pro Tyr Glu
275 280 285
Ala Ser Val Thr Val Pro Tyr Trp Gly Ala Arg Asn Glu Leu Ile Glu
290 295 300
Leu Ile Asp Leu Ala His Ala Gly Ile Phe Asp Ile Ala Val Glu Thr
305 310 315 320
Phe Ser Leu Asp Asn Gly Ala Glu Ala Tyr Arg Arg Leu Ala Ala Gly
325 330 335
Thr Leu Ser Gly Arg Ala Val Val Val Pro Gly Leu
340 345
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggtttcata tgaaggcaat ccagtacacg ag 32
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attcgcggat ccctacagac cagggaccac aaccg 35

Claims (10)

1.一种来源于红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的羰基还原酶基因，其核苷酸序列为如下1)-3)中任一所述的基因：
1)SEQ ID NO：1所示的基因；
2)在高严谨条件下与1)所述基因杂交且编码相同蛋白的基因；
3)与1)或2)所述的基因具有90％以上的同源性且编码相同蛋白的基因；
上述高严谨条件为用0.1×SSPE或SSC，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述SEQ ID NO：1核苷酸序列由红平红球菌总DNA为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物扩增得到。
3.一种由权利要求1或2所述羰基还原酶基因编码的(S)-羰基还原酶ReADH。
4.根据权利要求3所述的(S)-羰基还原酶ReADH，其特征在于，是如下a或b的蛋白质：
a、SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b、SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有羰基还原酶活性的衍生蛋白质。
5.根据权利要求3所述的(S)-羰基还原酶ReADH，其特征在于，所述羰基还原酶ReADH的氨基末端或羧基末端连接有下列标签：Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagII或c-myc。
6.含有权利要求1或2所述(S)-羰基还原酶基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系及重组菌。
7.权利要求3～5任意一项所述的(S)-羰基还原酶ReADH作为生物催化剂在还原苯乙酮生成(S)-α-苯乙醇中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
将所述羰基还原酶ReADH在NADH或NADPH的存在下对底物苯乙酮进行催化反应，得到(S)-α-苯乙醇，所述催化反应的温度为30～45℃，催化反应的pH值为4.5～7.5，催化反应的时间为8～24h。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述羰基还原酶ReADH与所述苯乙酮的用量比为(1～5)U:(0.1～500)mmol。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述NADH或NADPH与所述苯乙酮的用量比为(0.5～1)mg:(0.1～200)mmol。
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