JP5315232B2 - 4炭素アルコールの発酵生成 - Google Patents
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Description
本願は、米国特許法第119条の下で2006年5月2日出願の米国仮特許出願第60/796816号明細書および2006年12月21日出願の米国仮特許出願第60/871156号明細書の優先権を主張するものである。
i)ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ、
ii)α−アセト乳酸からアセトインへ、
iii)アセトインから2,3−ブタンジオールへ、
iv)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ、および
v)2−ブタノンから2−ブタノールへ
からなる群から選択される生成物の変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1個のDNA分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも1個のDNA分子が前記微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ前記微生物の宿主細胞が2−ブタノールを生成する、組換え微生物の宿主細胞を提供する。
i)ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ、
ii)α−アセト乳酸からアセトインへ、
iii)アセトインから2,3−ブタンジオールへ、および
iv)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物の変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1個のDNA分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも1個のDNA分子が前記微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ前記微生物の宿主細胞が2−ブタノンを生成する、組換え微生物の宿主細胞を提供する。
1)i)ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ、
ii)α−アセト乳酸からアセトインへ、
iii)アセトインから2,3−ブタンジオールへ、
iv)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ、および
v)2−ブタノンから2−ブタノールへ、
からなる群から選択される生成物の変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1個のDNA分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供するステップと、ここで少なくとも1個のDNA分子が前記微生物の宿主細胞に対して異種であり、
2)(1)の宿主細胞を2−ブタノールが生成される条件下の発酵培地内で発酵性炭素(fermentable carbon)基質と接触させるステップと、
を含む、方法を提供する。
1)i)ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ、
ii)α−アセト乳酸からアセトインへ、
iii)アセトインから2,3−ブタンジオールへ、および
iv)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物の変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1個のDNA分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供するステップと、ここで少なくとも1個のDNA分子が前記微生物の宿主細胞に対して異種であり、
2)(1)の宿主細胞を2−ブタノンが生成される条件下の発酵培地内で発酵性炭素基質(fermentable carbon)と接触させるステップと、
を含む、方法を提供する。
表12は、ジオール/グリセロールデヒドラターゼ酵素における大型のαサブユニットのプロファイルHMMの表である。表12はこれとともに電子データで提出されたものであり、参照により本明細書中に援用される。
SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1% SDSの場合での洗浄が含まれる。
炭水化物を使用する微生物が、中央代謝経路としてエムデン・マイヤーホフ・ パルナス(EMP)経路、エントナー−ドドロフ経路およびペントースリン酸回路を用い、成長および維持のためにエネルギーおよび細胞前駆体を生成する。これらの経路は、共通に中間体のグリセルアルデヒド−3−リン酸を有し、最終的にピルビン酸塩が直接にかまたはEMP経路と相まって形成される。糖のピルビン酸塩への変換の組み合わされた反応により、エネルギー(例えばアデノシン−5’−3リン酸、ATP)および還元等価物(例えば還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、NADH、および還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、NADPH)が生成される。NADHおよびNADPHはそれらの酸化形態(各々、NAD+およびNADP+)に再循環されなければならない。無機の電子受容体(例えばO2、NO3 −およびSO4 2−)の存在下で還元等価物を用いるとエネルギープールが増大しうるか、あるいは還元された炭素副産物が形成されうる。
経路1)I−−−>II−−−>III−−−>IV−−−>V(生成物の変換b、c、d、eに対する基質)
2)I−−−>II−−−>VII−−−>IV−−−>V(生成物の変換b、g、h、eに対する基質)
3)I−−−>II−−−>VIII−−−>V(生成物の変換b、i、jに対する基質):これは本発明の経路である。
4)I−−−>IX−−−>X−−−>V(生成物の変換k、l、mに対する基質)
(a)ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ
経路1における初期ステップは、ピルビン酸塩の2分子のα−アセト乳酸の1分子への変換(図1における化合物I)およびチアミンピロリン酸依存性酵素によって触媒される二酸化炭素の1分子への変換である。生成物の変換に対してこの基質を触媒する酵素(一般にアセト乳酸シンターゼまたはアセトヒドロキシ酸シンターゼのいずれかで称される;
EC2.2.1.6[2002年における4.1.3.18から変更])が周知であり、それらはタンパク質新生(proteinogenic)アミノ酸であるロイシンおよびバリンにおける生合成経路ならびに多数の生物における2,3−ブタンジオールおよびアセトインの発酵生成における経路に関与する。
α−アセト乳酸(I)が、アセト乳酸デカルボキシラーゼ(EC4.1.1.5)などの酵素の作用によってアセトイン(II)に変換される。アセト乳酸シンターゼのように、この酵素はチアミンピロリン酸依存性であり、多数の生物による2,3−ブタンジオールおよびアセトインの生成にも関与する。異なる供給源由来の酵素は、大きさ(25〜50キロダルトン)、オリゴマー化(2量体〜6量体)、局在化(細胞外または細胞内)、およびアロステリック調節(例えば分岐鎖アミノ酸による活性化)においてかなり広範に変化する。本発明の目的としては、細胞内位置が細胞外位置よりも好ましいが、他の変化は一般に許容可能である。
アセトイン(II)から3−アミノ−2−ブタノール(III)への生成物の変換に対して基質に効果をもたらしうる生化学的反応には、特に2つの既知のタイプ、すなわち付随するアミノ供与体を用いるピリドキサルリン酸依存性のアミノ基転移およびアンモニアを用いる直接還元的アミノ化(direct reductive amination)が存在する。後者では、還元等価物が還元されたニコチンアミド共同因子(NADHまたはNADPHのいずれか)の形態で供給される。基質としてのアセトインでこの反応を触媒するNADH依存性酵素の例が、イトウ(Ito)ら(米国特許第6,432,688号明細書)によって報告されている。この酵素の任意の立体特異性については評価がなされていない。アセトインから3−アミノ−2−ブタノールへの変換を触媒するピリドキサルリン酸依存性のトランスアミナーゼの例が、シン(Shin)およびキム(Kim)(上記)によって報告されている。この酵素は、本明細書中の実施例13で、アセトインの(R)異性体を3−アミノ−2−ブタノールの(2R、3S)異性体に変換しかつアセトインの(S)異性体を3−アミノ−2−ブタノールの(2S、3S)異性体に変換することが示された。酵素のいずれかのタイプ(すなわちトランスアミナーゼまたは還元性アミナーゼ)がアセトインアミナーゼであると考えられ、かつ2−ブタノールの生成において用いられうる。この群における他の酵素については異なる立体特異性を有しうる。
3−アミノ−2−ブタノール(III)から3−アミノ−2−ブタノールリン酸塩(IV)への生成物の変換に対して基質を触媒する当該技術分野で既知の酵素は全く存在しない。しかし、数種のシュードモナス(Pseudomonas)種およびエルウィニア種が、窒素源としてのエタノールアミンまたは1−アミノ−2−プロパノールの利用を可能にするATP依存性のエタノールアミンキナーゼ(EC2.7.1.82)を発現することが示されている(ジョーンズ(Jones)ら (1973年) Biochem.J. 134:167−182頁)。この酵素が3−アミノ−2−ブタノールに対する活性も有するかまたは同活性を有するように設計可能であることから、アミノブタノールキナーゼがもたらされる可能性が高い。本発明では、実施例14でアミノアルコールキナーゼとして同定されているタンパク質(配列番号24)をコードするエルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカの遺伝子(配列番号123)が記載される。この酵素を用い、3−アミノ−2−ブタノールを3−アミノ−2−ブタノールO−リン酸に変換することが可能である。
3−アミノ−2−ブタノールリン酸塩(IV)の2−ブタノン(V)への生成物の変換に対する基質を触媒することが報告されている酵素は全く存在しないが、基質は少数のシュードモナス種およびエルウィニア種において見出されている、ピリドキサルリン酸依存性のホスホエタノールアミンホスホ−リアーゼ酵素によって用いられるものに酷似している。これらの酵素は、ホスホエタノールアミンおよび2−ホスホ−1−アミノプロパンの両鏡像異性体に対する活性を有し(ジョーンズ(Jones)ら (1973年) Biochem.J. 134:167−182頁)、かつ3−アミノ−2−ブタノールO−リン酸に対する活性も有しうる。本発明では、クラスIIIアミノトランスフェラーゼに対して相同性を有するタンパク質(配列番号126)をコードするエルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカの遺伝子(配列番号125)が記載される。実施例15は、この酵素がアミノプロパノールリン酸塩およびアミノブタノールリン酸塩の基質の双方において活性があることを示す。新規に同定され特徴づけられた酵素は、(R)−3−アミノ−(S)−2−ブタノールと(S)−3−アミノ−(R)-2−ブタノールO−リン酸の混合物、および(R)−3−アミノ−(R)−2−ブタノールと(S)−3−アミノ−(S)−2−ブタノールO−リン酸の混合物の2−ブタノンへの変換を触媒することができた。新規に同定され特徴づけられた酵素は、(R)−2−アミノ−1−プロパノールリン酸塩および(S)−2−アミノ−1−プロパノールリン酸塩の双方((S)−2−アミノ−1−プロパノールリン酸塩の方が好ましい)のプロパノンへの変換も触媒することができた。最も高い活性が提示された天然基質のDL−1−アミノ−2−プロパノールリン酸塩の場合に観察され、それはプロピオンアルデヒドに変換された。
ピルビン酸から2−ブタノールを生成するための全経路における最終ステップが2−ブタノン(V)から2−ブタノール(VI)への還元である。生成物の変換に対するこの基質は、ブタノール脱水素酵素と称されうるアルコール脱水素酵素(酵素に応じ、水素化物の供給源としてNADHまたはNADPHのいずれかを利用するタイプ)の広範なクラスの一部のメンバーによって触媒される。2−ブタノンの還元を触媒する各タイプの酵素は、上記のブタノール脱水素酵素における定義において周知である。
(a)ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ
生成物の変換に対するこの基質は経路1における上記のものと同様である。
生成物の変換に対するこの基質は経路1における上記のものと同様である。
アセトイン(II)のホスホアセトイン(VII)への生成物の変換に対して基質を触媒する酵素が記載されていないが、基質であるアセトインの構造はジヒドロキシアセトンの構造に酷似していることから、アセトインはジヒドロキシアセトンのリン酸化を触媒する酵素であるジヒドロキシアセトンキナーゼ(EC2.7.1.29)に対して許容できる基質でありうる。酵素の基質特異性の改変におけるタンパク質工学技術は周知であり(アンチカイネン(Antikainen)およびマーチン(Martin)(2005年) Bioorg.Med.Chem. 13:2701−2716頁)、それを用い、要求される特異性を有する酵素の生成が可能である。この変換では、リン酸塩部分は任意の高エネルギーの生物学的リン酸供与体により供給可能であり、ここでの共通の基質はホスホエノールピルビン酸(大腸菌のジヒドロキシアセトンキナーゼなどの場合)およびATP(シトロバクター・フロインディイのジヒドロキシアセトンキナーゼなどの場合)である(ガルシア−アレス(Garcia−Alles)ら(2004年) Biochemistry 43:13037−13045頁)。
ホスホアセトイン(VII)から3−アミノ−2−ブタノールO−リン酸(IV)への生成物の変換に対して基質を触媒する酵素についての記載がなされていないが、基質の構造は、ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)の一部の種におけるrtxA遺伝子の5’部分によってコードされる提示されたセリノールリン酸アミノトランスフェラーゼにおける基質であるジヒドロキシアセトンリン酸の構造に酷似している(ヤスタ(Yasuta)ら、上記)。したがって、セリノールリン酸アミノトランスフェラーゼはこのステップにおいて機能的でありうる。
生成物の変換に対するこの基質は経路1における上記のものと同様である。
生成物の変換に対するこの基質は経路1における上記のものと同様である。
(a)ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ
生成物の変換に対するこの基質は経路1における上記のものと同様である。
生成物の変換に対するこの基質は経路1における上記のものと同様である。
アセトイン(II)から2,3−ブタンジオール(VIII)への生成物の変換に対する基質は、還元時に還元等価物の供給源としてNADHまたはNADPHのいずれかを用いうるブタンジオール脱水素酵素により触媒されうる。アセトインに対する活性を有する酵素が、2,3−ブタンジオールを生成する、生物内の同化合物の生成のための経路に関与する。報告された酵素(例えば、クレブシエラ・ニューモニエ由来のBudC(ウイ(Ui)ら(2004年) Letters in Applied Microbiology 39:533−537頁))は一般にNADHを用いる。いずれかの共同因子がこの経路による2−ブタノールの生成における使用として許容できる。
2,3−ブタンジオール(VIII)から2−ブタノン(V)への生成物の変換に対する基質は、ジオールデヒドラターゼ酵素(EC4.2.1.28)およびグリセロールデヒドラターゼ酵素(EC4.2.1.30)により触媒されうる。最もよく特徴づけられたジオールデヒドラターゼは補酵素であるB12依存性のクレブシエラ・オキシトカの酵素であるが、類似の酵素が多数の腸内細菌内に見出される。クレブシエラ・オキシトカの酵素は、基質としてメソ−2,3−ブタンジオールを許容し(バチョブチン(Bachovchin)ら(1977年) Biochemistry 16:1082−1092頁)、所望の生成物である2−ブタノンを生成することが示されている。実施例17は、クレブシエラ・ニューモニエのグリセロールデヒドラターゼによりメソ−2,3−ブタンジオールを2−ブタノンに変換できたことを示している。クレブシエラ・ニューモニエのグリセロールデヒドラターゼの3つのサブユニット(α:配列番号145(コード領域)および146(タンパク質);β:配列番号147(コード領域)および148(タンパク質);ならびにγ:配列番号149(コード領域)および150(タンパク質))を、クレブシエラ・ニューモニエのグリセロールデヒドラターゼのレアクティバーゼ(reactivase)の2つのサブユニット(大型サブユニット、配列番号151(コード領域)および152(タンパク質);ならびに小型サブユニット、配列番号153(コード領域)および154(タンパク質))と併せて発現させることで活性がもたらされた。
a)配列番号8、配列番号10、および配列番号12、
b)配列番号93、配列番号95、および配列番号97、
c)配列番号99、配列番号101、および配列番号103、
d)配列番号105、配列番号107、および配列番号109、
e)配列番号135、配列番号136、および配列番号137、
f)配列番号138、配列番号139、および配列番号140、
g)配列番号146、配列番号148、および配列番号150、
h)配列番号141、配列番号142、および配列番号143、および
i)配列番号164、配列番号165、および配列番号166
これら各々の、大型、中型および小型サブユニットを有する酵素に対して少なくとも80%〜85%の同一性を有するものであり、ここでは少なくとも85%〜90%の同一性がより好ましく、かつギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づくと少なくとも95%の同一性が最も好ましい。
大型サブユニット:配列番号8、99、105、135、138、141、146、および164、
中型サブユニット:配列番号10、101、107、136、139、142、148、および165、
小型サブユニット:配列番号12、103、109、137、140、143、150、および166
の各々の、大型、中型および小型サブユニットを有する酵素に対して少なくとも80%〜85%の同一性を有するものであり、ここでは少なくとも85%〜90%の同一性がより好ましく、かつギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づくと少なくとも95%の同一性が最も好ましい。
生成物の変換に対するこの基質は経路1における上記のものと同様である。
本発明では、ジオールまたはグリセロールデヒドラターゼといった任意の酵素を2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへの変換において使用可能である。ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼにおけるそれぞれ酵素クラスEC4.2.1.28およびEC4.2.1.30での構造/機能の関係性が、本明細書中の実施例18において確立された。機能は実験データにより提供され、構造はバイオインフォマティクス分析により提供される。実験で実証されている活性を有する8種のジオールおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素について分析した。この群(表10に列挙)では、クレブシエラ・オキシトカのジオールデヒドラターゼおよびクレブシエラ・ニューモニエのグリセロールデヒドラターゼの酵素(各々、バコブチン(Bachovchin)ら、(1977年) Biochemistry 16:1082−1092頁および本明細書中の実施例17)はいずれも2,3−ブタンジオールを2−ブタノンに変換することが示された一方で、さらに6種の酵素の活性がそれらの天然基質を用いて明らかにされた(表10中に示される参考文献)。8つのジオールおよびグリセロールデヒドラターゼのこのセットが、HMMERソフトウェアパッケージのhmmsearchアルゴリズムを用いて分析された(バージニア州アッシュバーン(Ashburn)のジャネリア・ファーム・リサーチ・キャンパス(Janelia Farm Research Campus))。hmmsearchアルゴリズムのZパラメータが10億に設定された。タンパク質配列のセットを用いるHMMER分析の出力は、プロファイル隠れマルコフモデル(Profile Hidden Markov Model)(プロファイルHMM)である。プロファイルHMMの背後にある理論は、セットのタンパク質のアラインメントにおいて各位置で生じる各アミノ酸の確率に基づいてタンパク質のセットを特徴づけている、ダービン(Durbin)ら、Biological sequence analysis:probabilistic models of proteins and nucleic acids、ケンブリッジ大学出版局(Cambridge University Press)、1998年;クロー(Krogh)ら、1994年;J.Mol.Biol. 235:1501-1531頁(参照により本明細書中に援用される)に記載されている。
1.小さい、脂肪族、非極性または微極性の残基:Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)、
2.極性のある負に帯電した残基およびそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln、
3.極性のある正に帯電した残基:His、Arg、Lys、
4.大きい、脂肪族、非極性の残基:Met、Leu、Ile、Val(Cys)、および
5.大きい芳香族残基:Phe、Tyr、Trp
a)ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素の大型、中型および小型サブユニットに対応するアミノ酸配列のアラインメントからプロファイル隠れマルコフモデルを生成するステップと、ここで、
i)大型サブユニットが配列番号8、99、105、135、138、141、146、および164からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ii)中型サブユニットが配列番号10、101、107、136、139、142、148、および165からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ
iii)小型サブユニットが配列番号12、103、109、137、140、143、150、および166からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
b)hmmsearchアルゴリズムを用いて、(a)のプロファイル隠れマルコフモデルを用いてジオールおよびグリセロールデヒドラターゼの配列を有するタンパク質配列における少なくとも1つの公的データベースにクエリーを実行し、ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼのアミノ酸配列の第1のデータセットを同定するステップと、ここで、Zパラメータが10億に設定されかつE値パラメータが0.01に設定され、
c)(b)の第1のデータセットから任意の部分配列を除去し、ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼのアミノ酸配列の第2のデータセットを生成するステップと、ここで、ジオールデヒドラターゼおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素が同定される、
を含むプロセスによって同定されるアミノ酸配列を有するジオールおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素を提供する。
a)配列番号8、配列番号10、および配列番号12、
b)配列番号93、配列番号95、および配列番号97、
c)配列番号99、配列番号101、および配列番号103、
d)配列番号105、配列番号107、および配列番号109、
e)配列番号135、配列番号136、および配列番号137、
f)配列番号138、配列番号139、および配列番号140、
g)配列番号146、配列番号148、および配列番号150、
h)配列番号141、配列番号142、および配列番号143、および
i)配列番号164、配列番号165、および配列番号166、
からなる群から選択される、大型、中型および小型サブユニットをコードするアミノ酸配列の3つ全てを含むアミノ酸配列に対し、少なくとも95%の同一性を有する。
(a) ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ
生成物の変換に対するこの基質は経路1における上記のものと同様である。
アセト乳酸塩(I)から2,3−ジヒドロキシ−2−メチル酪酸(IX)への生成物の変換に対する基質は当該技術分野で未知である。しかし、この変換の生成物は発酵液の成分として報告されているが(ジアディ(Ziadi)ら、(1973年)「Comptes Rendus des Seances de l’Academie des Sciences,Serie D:Sciences Naturelles」 276:965−8頁)、形成の機序は未知である。有望な形成の機序は、アセト乳酸塩の電子供与体としてのNADHまたはNADPHによる還元である。2−ブタノールの生成におけるこの経路を用いるため、この反応を触媒する酵素が同定または設計される必要がある。しかし、ケトンからアルコールへの酵素還元における先行技術は十分に確立されている。
2,3−ジヒドロキシ−2−メチル酪酸(IX)から2−ヒドロキシ−2−メチル−3−ホスホブタン酸(X)への生成物の変換に対して基質を触媒する既知の酵素は全く存在しない。しかし、天然には様々な特異性を有する多数のキナーゼが存在する。したがって、酵素がこの活性を用いて単離または設計されうる可能性が高い。
2−ヒドロキシ−2−メチル−3−ホスホブタン酸(X)から2−ブタノン(V)への生成物の変換に対して基質を触媒する既知の酵素は全く存在しない。この反応と先の反応との組み合わせはメバロン酸5−ピロリン酸(M5PP)デカルボキシラーゼにより触媒される多段階ステップの反応に酷似し、それはM5PPから3−ホスホメバロン酸5−PPへの初期リン酸化と、それに続くリン酸塩の脱炭酸化依存性の除去からなる(アルベア(Alvear)ら、(1982年) Biochemistry 21:4646−4650頁)。
生成物の変換に対するこの基質は経路1における上記のものと同様である。
2−ブタノールまたは2−ブタノンの生成における微生物宿主が、細菌、シアノバクテリア(cyanobacteria)、糸状菌および酵母から選択されうる。2−ブタノールまたは2−ブタノンの生成において用いられる微生物宿主は、収量が生成される生成物の宿主に対する毒性により制限されないように、生成物に対して耐性を有する必要がある。2−ブタノールの生成における微生物宿主の選択が下記に詳細に記載される。同様の基準が、2−ブタノンの生成における宿主の選択に適用される。
2−ブタノールまたは2−ブタノンに対する発酵性炭素基質の変換における酵素経路をコードする必須遺伝子を有する組換え生物が、当該技術分野で周知の技術を用いて作成可能である。本発明では、2−ブタノール生合成経路3:アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、ブタンジオール脱水素酵素、ブタンジオールデヒドラターゼ、およびブタノール脱水素酵素;またはブタノール脱水素酵素を除外した2−ブタノン生合成経路3における酵素をコードする遺伝子が、上記の様々な供給源から単離されうる。
大腸菌の形質転換にとって有用なベクターについては一般的であり、先に挙げた企業から市販されている。例えば、2−ブタノール生合成経路の遺伝子は、実施例6および7に記載のように、上記の様々な供給源から単離され、改良されたpUC19ベクター上にクローニングされ、かつ大腸菌NM522に形質転換されうる。あるいは、2−ブタノール生合成経路をコードする遺伝子は、実施例9、10、および11に記載のように、複数のオペロンに分けられ、発現ベクター上にクローニングされ、かつ様々な大腸菌株に形質転換されうる。2−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
限定はされないがpRhBR17およびpDA71を含むロドコッカス・エリスロポリス(R.erythropolis)内での発現においては、一連の大腸菌−ロドコッカスのシャトルベクターが使用可能である(コスティッカ(Kostichka)ら、Appl.Microbiol.Biotechnol. 62:61−68頁(2003年))。さらにロドコッカス・エリスロポリス内での異種の遺伝子発現においては、一連のプロモーターが使用可能である(例えば、ナカシマ(Nakashima)ら、Appl.Environ.Microbiol. 70:5557−5568頁(2004年)、およびタオ(Tao)ら、Appl.Microbiol.Biotechnol. 2005年、DOI10.1007/s00253−005−0064を参照)。ロドコッカス・エリスロポリスの染色体遺伝子における標的遺伝子の破壊が、タオ(Tao)ら、上記、およびブランズ(Brans)ら(Appl.Envion.Microbiol. 66:2029−2036頁(2000年))で記載の方法を用いてもたらされうる。
枯草菌内での遺伝子発現および変異体の生成のための方法もまた当該技術分野で周知である。例えば、2−ブタノール生合成経路の遺伝子は、実施例8に記載のように、上記の様々な供給源から単離され、改良された大腸菌−バチルスのシャトルベクターにクローニングされ、かつ枯草菌BE1010に形質転換されうる。所望の遺伝子は、バチルスの発現ベクターにクローニングされ、株に形質転換されることで生成宿主が作製されうる。あるいは、遺伝子は、当業者に既知の条件付きのレプリコンまたは自殺ベクターを用いてバチルスの染色体に組み込まれうる。例えば、バチルス・ジェネティック・ストック・センター(Bacillus Genetic Stock Center)は極めて多数の組込みベクターを有している。2−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
枯草菌内で複製するプラスミドおよびシャトルベクターの大部分を用い、プロトプラスト形質転換またはエレクトロポレーションのいずれかによりバチルス・リケニフォルミスの形質転換が可能である。2−ブタノールの生成において必要とされる遺伝子をプラスミドのpBE20またはpBE60誘導体にクローニング可能である(ナガラジャン(Nagarajan)ら、Gene 114:121−126頁(1992年))。バチルス・リケニフォルミスを形質転換するための方法が当該技術分野で既知である(例えばフレミング(Fleming)ら、Appl.Environ.Microbiol.、61(11):3775−3780頁(1995年)を参照)。枯草菌内での発現のために作製されたプラスミドをバチルス・リケニフォルミスに形質転換することで、2−ブタノールを生成する組換え微生物宿主の生成が可能である。2−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
プラスミドを、枯草菌(B.subtilis)内での発現にて記載のように作製し、それを用いてパエニバチルス・マセランスをプロトプラスト形質転換により形質転換し、2−ブタノールを生成する組換え微生物宿主を生成することが可能である。2−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
アルカリゲネス・ユートロファス内での遺伝子発現および変異体の生成のための方法は当該技術分野で既知である(例えばタガビ(Taghavi)ら、Appl.Environ.Microbiol.、60(10):3585−3591頁(1994年)を参照)。2−ブタノール生合成経路における遺伝子を、上記の広範な宿主範囲のベクターのいずれかにクローニングし、アルカリゲネス・ユートロファスにエレクトロポレートすることで2−ブタノールを生成する組換え体を生成することが可能である。アルカリゲネス内でのポリ(ヒドロキシ酪酸)経路は詳細な記載がなされており、アルカリゲネス・ユートロファスのゲノムを改良するための種々の遺伝子技術が既知であり、それらのツールは2−ブタノール生合成経路の設計において適用されうる。2−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
シュードモナス・プチダ内での遺伝子発現のための方法は当該技術分野で既知である(例えば、参照により本明細書中に援用されるベン−バサット(Ben−Bassat)ら、米国特許第6,586,229号明細書を参照)。2−ブタノール生合成経路の遺伝子をpPCU18に挿入し、このライゲートされたDNAをエレクトロコンピテントなシュードモナス・プチダのDOT−T1 C5aAR1細胞にエレクトロポレートすることで2−ブタノールを生成する組換え体を生成することが可能である。2−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
乳酸桿菌(Lactobacillus)属はラクトバチルス目(Lactobacillales)の科に属し、かつ枯草菌および連鎖球菌の形質転換で用いられる多数のプラスミドおよびベクターが乳酸桿菌において用いられうる。適切なベクターの非限定例には、pAMβ1およびその誘導体(ルノー(Renault)ら、Gene 183:175−182頁(1996年);およびオサリバン(O’Sullivan)ら、Gene 137:227−231頁(1993年));pMBB1およびpHW800、pMBB1の誘導体(ウィコッフ(Wyckoff)ら、Appl.Environ.Microbiol. 62:1481−1486頁(1996年));pMG1、複合プラスミド(タニモト(Tanimoto)ら、J.Bacteriol. 184:5800−5804頁(2002年));pNZ9520(クレールベゼム(Kleerebezem)ら、Appl.Environ.Microbiol. 63:4581−4584頁(1997年));pAM401(フジモト(Fujimoto)ら、Appl.Environ.Microbiol.67:1262−1267頁(2001年));ならびにpAT392(アーサー(Arthur)ら、Antimicrob.Agents Chemother. 38:1899−1903頁(1994年))が含まれる。プランタラム菌由来の数種のプラスミドが報告されている(ヴァン・クラネンバーグ(van Kranenburg)ら、Appl.Environ.Microbiol. 71(3):1223−1230頁(2005年))。
腸球菌属はラクトバチルス目の科に属し、かつ上記の乳酸桿菌、枯草菌、および連鎖球菌の形質転換において用いられる多数のプラスミドおよびベクターが腸球菌において用いられうる。ラクトコッカス(Lactococcus)由来のnisA遺伝子を用いたエンテロコッカス・フェカーリス(E.faecalis)における発現ベクターも用いられうる(エイケンバウム(Eichenbaum)ら、Appl.Environ.Microbiol. 64:2763−2769頁(1998年))。さらに、エンテロコッカス・フェシウム(E.faecium)の染色体における遺伝子置換用のベクターが用いられうる(ナラーパレディ(Nallaapareddy)ら、Appl.Environ.Microbiol. 72:334−345頁(2006年))。
ペディオコッカス属はラクトバチルス目の科に属し、かつ上記の枯草菌および連鎖球菌の形質転換で用いられる多数のプラスミドおよびベクターがペディオコッカスにおいて用いられうる。適切なベクターの非限定例には、pHPS9(バクチヤロヴァ(Bukhtiyarova)ら、Appl.Environ.Microbiol. 60:3405−3408頁(1994年))が含まれる。ペディオコッカス由来の数種のプラスミドが報告されている(アレグレ(Alegre)ら、FEMS Microbiol.Lett. 250:151−156頁(2005年);シャレック(Shareck)ら、Crit.Rev Biotechnol. 24:155−208頁(2004年))。
本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有する必要がある。適切な基質が、限定はされないが、グルコースおよびフルクトースなどの単糖、乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンまたはセルロースなどの多糖、あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過液、コーンスティープリカー(cornsteep liquor)、砂糖液(sugar beet molasses)、および大麦モルト(barley malt)などの再生可能な原料由来の未精製混合物を含みうる。さらに、炭素基質はまた二酸化炭素または主要な生化学的中間体への代謝変換が実証されているメタノールなどの1炭素基質でありうる。メチロトローフ(methylotrophic)生物が、1炭素基質および2炭素基質に加え、メチルアミン、グルコサミンおよび代謝活性における種々のアミノ酸などの化合物を含有する他の多数の炭素を用いることでも知られている。例えば、メチロトローフ酵母がメチルアミン由来の炭素を用いてトレハロースまたはグリセロールを形成することで知られている(ベリオン(Bellion)ら、Microb.Growth C1 Compd.、[Int.Symp.]、7th(1993年)、415−32頁、マレル J.コリン(Murrell J.Collin);ケリー・ドン P.(Kelly,Don P.)編、英国アンドーバー(Andover)のインターセプト(Intercept)発行)。同様に、カンジダの様々な種がアラニンまたはオレイン酸を代謝することになる(サルター(Sulter)ら、Arch.Microbiol. 153:485−489頁(1990年))。それ故、本発明で用いられる炭素源が基質を有する多種多様な炭素を包含する場合があり、生物の選択によってのみ限定されうると考えられる。
典型的には細胞が、適切な培地内、約25℃〜約40℃の範囲内の温度で成長される。本発明における適切な成長培地は、ルリア・ベルターニ(Luria Bertani)(LB)培養液、サブロー・デキストロース(Sabouraud Dextrose)(SD)培養液または酵母培地(YM)の培養液などの一般的な商業的に調製された培地である。他の限定または合成された成長培地が用いられる場合があり、かつ特定の微生物の成長に適した培地について微生物学または発酵科学に関する当業者は知っているであろう。異化代謝産物抑制を直接的または間接的に調節することで知られる作用物質、例えば環状アデノシン2’:3’一リン酸の使用についても発酵培地内に取り込まれうる。
本プロセスには、発酵のバッチ方法が用いられる。従来のバッチ発酵は、培地の組成物が発酵開始時に設定され、発酵の間に人工的な改変が施されることがない閉鎖系である。したがって、発酵開始時に培地に望ましい生物が接種され、系に何も添加しなくても発酵の生成が可能である。しかし、典型的には「バッチ」発酵は炭素源の添加に関連したバッチであり、pHおよび酸素濃度などの要素を制御する試みがなされることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物およびバイオマス組成物は、最大で発酵が停止する時間まで常時変化する。バッチ培養物内では、細胞が、変化のない誘導期(lag phase)から高成長の対数期(log phase)、最終的に成長率が減少または停止する定常期(stationay phase)にかけて抑制される。定常期における細胞が、未処理の場合、最終的に死滅することになる。対数期における細胞が、一般に最終生成物または中間体の生成の大部分に関与する。
生物学的に生成された2−ブタノールは、ABE発酵における当該技術分野で既知の方法を用いて発酵培地から単離されうる(例えば、デュレ(Durre)、Appl.Microbiol.Biotechnol.49:639−648頁(1998年)、グルート(Groot)ら、Process Biochem.27:61−75頁(1992年)、およびその中の参考文献を参照)。例えば、固体が遠心分離、濾過、デカンテーション、または同様のものにより発酵培地から除去されうる。次いで、2−ブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、または浸透気化法などの方法を用いて発酵培地から単離されうる。これらの同じ方法は、生物学的に生成された2−ブタノンの発酵培地からの単離に適合しうる。
実施例に記載の標準の組換えDNAおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、サムブルック J.(Sambrook,J.)、フリッツ E.F.(Fritsch,E.F.)およびマニアティス T.(Maniatis,T.)「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」;ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989年)(マニアティス(Maniatis))、T.J.シルハヴィ(T.J.Silhavy)、M.L.ベナン(M.L.Bennan)、およびL.W.エンキスト(L.W.Enquist)、「Experiments with Gene Fusions」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1984年)、ならびにアウスベル F.M.(Ausubel,F.M.)ら、「Current Protocols in Molecular Biology」、グリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィレイ−インターサイエンス(Greene Publishing Assoc. and Wiley−Interscience)発行(1987年)により記載されている。
培地内の2−ブタノールおよび2−ブタノンの濃度は、当該技術分野で既知の多数の方法により判定可能である。例えば、特定の高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)法では、屈折率(RI)の検出を伴い、ショーデックス(Shodex)のSH−Gガードカラムとともにショーデックス(Shodex)のSH−1011カラム(双方ともウォーターズ・コーポレーション(Waters Corporation)(マサチューセッツ州ミルフォード(Milford))から購入)を用いた。クロマトグラフ分離を、移動相として0.01M H2SO4を用い、0.5mL/分の流速および50℃のカラム温度で行った。使用条件下で、2−ブタノンおよび2−ブタノールにおける保持時間は各々39.5分および44.3分であった。あるいは、ガスクロマトグラフィー(GC)法の使用が可能である。例えば、特定のGC法では、炎イオン化検出器(FID)を伴い、HP−INNOWaxカラム(30m×0.53mmの内径、1μmの膜厚、デラウェア州ウィルミントン(Wilmington)のアジレント・テクノロジーズ(Agilent Technologies))を用いた。キャリアガスは、一定の上部圧力下、150℃での測定によると4.5mL/分の流速でのヘリウムであり、インジェクタースプリットは200℃で1:25であり、オーブン温度は1分間で45℃、10℃/分で45〜220℃、および5分間で220℃であり、FID検出を、26mL/分のヘリウム補給気体(makeup gas)を用い、240℃で用いた。2−ブタノンおよび2−ブタノールの保持時間は各々3.61分および5.03分であった。
1.i)ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ii)α−アセト乳酸からアセトインへ、
iii)アセトインから2,3−ブタンジオールへ、
iv)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ、および
v)2−ブタノンから2−ブタノールへ
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1個のDNA分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも1個のDNA分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ該微生物の宿主細胞が2−ブタノールを生産する、組換え微生物の宿主細胞。
2.i)ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ、
ii)α−アセト乳酸からアセトインへ、
iii)アセトインから2,3−ブタンジオールへ、および
iv)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1個のDNA分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも1個のDNA分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ該微生物の宿主細胞が2−ブタノンを生産する、組換え微生物の宿主細胞。
3.ピルビン酸からα−アセト乳酸への生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸シンターゼである、上記1または2に記載の宿主細胞。
4.α−アセト乳酸からアセトインへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸デカルボキシラーゼである、上記1または2に記載の宿主細胞。
5.アセトインから2,3−ブタンジオールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがブタンジオール脱水素酵素である、上記1または2に記載の宿主細胞。
6.2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼである、上記1または2に記載の宿主細胞。
7.2−ブタノンから2−ブタノールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがブタノール脱水素酵素である、上記1に記載の宿主細胞。
8.細胞が、細菌、シアノバクテリア、糸状菌および酵母からなる群から選択される、上記1または2に記載の宿主細胞。
9.細胞が、クロストリジウム属、ザイモモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ラクトバチルス属、腸球菌属、ペディオコッカス属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびサッカロミセス属からなる群から選択される属のメンバーである、上記8に記載の宿主細胞。
10.アセト乳酸シンターゼが、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号4、配列番号77、および配列番号79からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記3に記載の宿主細胞。
11.アセト乳酸デカルボキシラーゼが、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号2、配列番号81、および配列番号83からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記4に記載の宿主細胞。
12.ブタンジオール脱水素酵素が、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号6、配列番号85、配列番号87、および配列番号89からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記5に記載の宿主細胞。13.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、配列番号8、99、105、135、138、141、146、および164の大型サブユニット、配列番号10、101、107、136、139、142、148、および165の中型サブユニット、ならびに配列番号12、103、109、137、140、143、150、および166の小型サブユニットを用いて作成されたプロファイル隠れマルコフモデルを用いてクエリーが実行される場合に、0.01以下のE値パラメータを各々与える全長の大型、中型および小型サブユニットを含み、各クエリーがhmmsearchアルゴリズムを用いて実行され、ここで、Zパラメータが10億に設定される、上記6に記載の宿主細胞。
14.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、
a)ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素の大型、中型および小型サブユニットに対応するアミノ酸配列のアラインメントからプロファイル隠れマルコフモデルを生成させ、ここで、
i)大型サブユニットが配列番号8、99、105、135、138、141、146、および164からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ii)中型サブユニットが配列番号10、101、107、136、139、142、148、および165からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ
iii)小型サブユニットが配列番号12、103、109、137、140、143、150、および166からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
b)hmmsearchアルゴリズムを用いて、(a)のプロファイル隠れマルコフモデルを用いてジオールおよびグリセロールデヒドラターゼの配列を有するタンパク質配列における少なくとも1つの公的データベースにクエリーを実行し、ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼのアミノ酸配列の第1のデータセットを同定し、ここで、Zパラメータが10億に設定されかつE値パラメータが0.01に設定され、そして
c)(b)の第1のデータセットから任意の部分配列を取り出し、ジオールおよびグリ
セロールデヒドラターゼのアミノ酸配列の第2のデータセットを生成させ、ここでジオールデヒドラターゼおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素が同定される、
ステップを含むプロセスによって同定される、上記6に記載の宿主細胞。
15.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号8、93、99、105、135、138、141、146、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、200、203、206、209、212、215、218、221、224、227、130、243、254、255、256、257、258および259からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む大型サブユニットを含む、上記6に記載の宿主細胞。
16.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号10、95、101、107、136、139、142、148、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、207、210、213、216、219、222、225、228、231、244、250、252、260、261、262、263、364、265、266、および167からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む中型サブユニットを含む、上記6に記載の宿主細胞。
17.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号12、97、103、109、137、140、143、150、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、199、202、205、208、211、214、217、220、223、226、229、232、234、236、238、240、242、245、248、249、251、253、268、270、271、272、273、および274からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む小型サブユニットを含む、上記6に記載の宿主細胞。
18.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号233、235、237、239、241、246、および247からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合された大型、中型および小型サブユニットを含む、上記6に記載の宿主細胞。
19.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、融合された大型、中型および小型サブユニットを含み、かつ、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、
a)配列番号8、配列番号10、および配列番号12、
b)配列番号93、配列番号95、および配列番号97、
c)配列番号99、配列番号101、および配列番号103、
d)配列番号105、配列番号107、および配列番号109、
e)配列番号135、配列番号136、および配列番号137、
f)配列番号138、配列番号139、および配列番号140、
g)配列番号146、配列番号148、および配列番号150、
h)配列番号141、配列番号142、および配列番号143、および
i)配列番号164、配列番号165、および配列番号166、
からなる群から選択される大型、中型および小型サブユニットをコードするアミノ酸配列の3つ全てを含むアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有する、上記6に記載の宿主細胞。
20.ブタノール脱水素酵素が、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号14、配列番号72、配列番号75、および配列番号91からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記8に記載の宿主細胞。
21.2−ブタノールを生産するための方法であって、
1)i)ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ii)α−アセト乳酸からアセトインへ、
iii)アセトインから2,3−ブタンジオールへ、
iv)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ、および
v)2−ブタノンから2−ブタノールへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1個のDNA分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、ここで少なくとも1個のDNA分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、そして
2)(1)の宿主細胞を2−ブタノールが生産される条件下の発酵培地内で発酵可能な炭素基質と接触させる、
ことを含む、上記方法。
22.2−ブタノンを生産するための方法であって、
1)i)ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ii)α−アセト乳酸からアセトインへ、
iii)アセトインから2,3−ブタンジオールへ、および
iv)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1個のDNA分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、ここで少なくとも1個のDNA分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、そして
2)(1)の宿主細胞を2−ブタノンが生産される条件下の発酵培地内で発酵可能な炭素基質と接触させる、
ことを含む、上記方法。
23.発酵可能な炭素基質が単糖、オリゴ糖、および多糖からなる群から選択される、上記21または22に記載の方法。
24.ピルビン酸からα−アセト乳酸への生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸シンターゼである、上記21または22に記載の方法。
25.α−アセト乳酸からアセトインへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸デカルボキシラーゼである、上記21または22に記載の方法。
26.アセトインから2,3−ブタンジオールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがブタンジオール脱水素酵素である、上記21または22に記載の方法。
27.2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼである、上記21または22に記載の方法。
28.2−ブタノンから2−ブタノールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがブタノール脱水素酵素である、上記21に記載の方法。
29.細胞が細菌、シアノバクテリア、糸状菌、および酵母からなる群から選択される、上記21または22に記載の方法。
30.細胞が、クロストリジウム属、ザイモモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ラクトバチルス属、腸球菌属、ペディ
オコッカス属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびサッカロミセス属からなる群から選択される属のメンバーである、上記29に記載の方法。
31.アセト乳酸シンターゼが、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号4、配列番号77、および配列番号79からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記24に記載の方法。
32.アセト乳酸デカルボキシラーゼが、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号2、配列番号81、および配列番号83からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記25に記載の方法。
33.ブタンジオール脱水素酵素が、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号6、配列番号85、配列番号87、および配列番号89からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記26に記載の方法。
34.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、配列番号8、99、105、135、138、141、146、および164の大型サブユニット、配列番号10、101、107、136、139、142、148、および165の中型サブユニット、ならびに配列番号12、103、109、137、140、143、150、および166の小型サブユニットを用いて作成されたプロファイル隠れマルコフモデルを用いてクエリーが実行される場合に、0.01以下のE値パラメータを各々与える全長の大型、中型および小型サブユニットを含み、各クエリーがhmmsearchアルゴリズムを用いて実行され、ここで、Zパラメータが10億に設定される、上記27に記載の方法。
35.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、
a)ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素の大型、中型および小型サブユニットに対応するアミノ酸配列のアラインメントからプロファイル隠れマルコフモデルを生成させ、ここで、
i)大型サブユニットが配列番号8、99、105、135、138、141、146、および164からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ii)中型サブユニットが配列番号10、101、107、136、139、142、148、および165からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ
iii)小型サブユニットが配列番号12、103、109、137、140、143、150、および166からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
b)hmmsearchアルゴリズムを用いて、(a)のプロファイル隠れマルコフモデルを用いてジオールおよびグリセロールデヒドラターゼの配列を有するタンパク質配列における少なくとも1つの公的データベースにクエリーを実行し、ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼのアミノ酸配列の第1のデータセットを同定し、ここでZパラメータが10億に設定されかつE値パラメータが0.01に設定され、そして
c)(b)の第1のデータセットから任意の部分配列を取り出し、ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼのアミノ酸配列の第2のデータセットを生成させ、ここでジオールデヒドラターゼおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素が同定される、
ステップを含むプロセスによって同定される、上記27に記載の方法。
36.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号8、93、99、105、135、138、141、146、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、200、203、206、209、212、215、218、221、224、227、130、243、254、255、256、257、258および259からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む大型サブユニットを含む、上記27に記載の方法。
37.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号10、95、101、107、136、139、142、148、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、207、210、213、216、219、222、225、228、231、244、250、252、260、261、262、263、364、265、266、および167からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む中型サブユニットを含む、上記27に記載の方法。
38.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号12、97、103、109、137、140、143、150、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、199、202、205、208、211、214、217、220、223、226、229、232、234、236、238、240、242、245、248、249、251、253、268、270、271、272、273、および274からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む小型サブユニットを含む、上記27に記載の方法。
39.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号233、235、237、239、241、246、および247からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合された大型、中型および小型サブユニットを含む、上記27に記載の方法。
40.ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、融合された大型、中型および小型サブユニットを含み、かつ、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、
a)配列番号8、配列番号10、および配列番号12、
b)配列番号93、配列番号95、および配列番号97、
c)配列番号99、配列番号101、および配列番号103、
d)配列番号105、配列番号107、および配列番号109、
e)配列番号135、配列番号136、および配列番号137、
f)配列番号138、配列番号139、および配列番号140、
g)配列番号146、配列番号148、および配列番号150、
h)配列番号141、配列番号142、および配列番号143、および
i)配列番号164、配列番号165、および配列番号166、
からなる群から選択される大型、中型および小型サブユニットをコードするアミノ酸配列の3つ全部てを含むアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有する、上記27に記載の方法。
41.ブタノール脱水素酵素が、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、およびGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるClustal Wのアラインメント法に基づき、配列番号14、配列番号72、配列番号75、および配列番号91からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記28に記載の方法。
42.上記21に記載の方法により生産される、2−ブタノールを含有する発酵生産物培地。
43.上記22に記載の方法により生産される、2−ブタノンを含有する発酵生産物培地。
アセト乳酸シンターゼのクローニングおよび発現
この実施例の目的は、大腸菌内でアセト乳酸シンターゼ酵素をコードするbudB遺伝子のクローニングおよび発現を行うことであった。PCRを用い、budB遺伝子をクレブシエラ・ニューモニエ株ATCC25955のゲノムDNAから増幅した。
アセト乳酸シンターゼをコードするbudB配列を、プライマー対のB1(配列番号15)およびB2(配列番号16)を用いるPCRにより、クレブシエラ・ニューモニエ(ATCC25955)のゲノムDNAから増幅した。他のPCR増幅試薬(例えばKod HiFi DNAポリメラーゼ(ウィスコンシン州マディソン(Madison)のノヴァゲン(Novagen Inc.);カタログ番号71805−3))は製造業者のキットで供給されたものであり、それらを製造業者のプロトコルに準じて使用した。クレブシエラ・ニューモニエのゲノムDNAをGentra Puregene Puregeneキット(ミネソタ州ミネアポリス(Minneapolis)のジェントラ・システムズ(Gentra Systems,Inc.);カタログ番号D−5000A)を用いて調製した。増幅をDNA Thermocycler GeneAmp 9700(カリフォルニア州フォスターシティ(Foster city)のPEアプライド・バイオシステムズ(PE Applied Biosystems))で行った。酵素のオープンリーディングフレーム(ORF)のヌクレオチド配列および予測されたアミノ酸配列は各々、配列番号3および配列番号4として示される。
アセト乳酸デカルボキシラーゼのクローニングおよび発現
この実施例の目的は、大腸菌内でアセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素をコードするbudA遺伝子のクローニングおよび発現を行うことであった。PCRを用い、budA遺伝子をクレブシエラ・ニューモニエ株ATCC25955のゲノムDNAから増幅した。
ブタンジオール脱水素酵素のクローニングおよび発現
この予想実施例の目的は、大腸菌内でブタンジオール脱水素酵素をコードするbudC遺伝子のクローニングおよび発現を行う方法を記載することである。PCRを用い、budC遺伝子をクレブシエラ・ニューモニエ株IAM1063のゲノムDNAから増幅する。
ブタンジオールデヒドラターゼのクローニングおよび発現
この予想実施例の目的は、大腸菌内でブタンジオールデヒドラターゼをコードするpddA、pddBおよびpddC遺伝子のクローニングおよび発現を行う方法を記載することである。PCRを用い、pddA、pddBおよびpddC遺伝子をクレブシエラ・オキシトカATCC8724のゲノムDNAから増幅する。
ブタノール脱水素酵素のクローニングおよび発現
この予想実施例の目的は、大腸菌内でブタノール脱水素酵素をコードするsadh遺伝子のクローニングおよび発現を行う方法を記載することである。PCRを用い、sadh遺伝子をロドコッカス・ルバー株219のゲノムDNAから増幅する。
2−ブタノール生合成経路内での遺伝子における形質転換ベクターの作成
この予想実施例の目的は、2−ブタノール生合成経路(すなわち上記の経路3)内での遺伝子における形質転換ベクターの調製について記載することである。大腸菌は、大部分の生物のようにグルコースを最初にピルビン酸に変換する。酵素は経路3に従ってピルビン酸を2−ブタノールに変換する必要があった、すなわち、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、ブタンジオール脱水素酵素、ブタンジオールデヒドラターゼ、およびブタノール脱水素酵素は、budA、budB、budC、pddA、pddB、pddCおよびsadh遺伝子によってコードされる。組換え生物内での2−ブタノール生合成経路の構築を簡素化するため、経路内での5ステップをコードする遺伝子は2つのオペロンに分かれる。上流経路は、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびブタンジオール脱水素酵素により触媒される最初の3つのステップを含む。下流経路は、ブタンジオールデヒドラターゼおよびブタノール脱水素酵素により触媒される最後の2つのステップを含む。
budABCコード領域を、プライマー対のB11およびB12(各々、配列番号25および26として与えられる)(表4)を用いるPCRにより、クレブシエラ・ニューモニエのゲノムDNAから増幅する。フォワードプライマーにはEcoRI制限部位およびリボソーム結合部位(RBS)を組み込む。リバースプライマーにはSphI制限部位を組み込む。PCR産物をpCR4 Blunt−TOPOにクローニングし、pCR4 Blunt−TOPO−budABCが生成される。
pddABCコード領域を、プライマーのB13およびB14(各々、配列番号27および28として与えられる)(表4)を用いるPCRによりクレブシエラ・オキシトカATCC8724のゲノムDNAから増幅し、2.9kbpの産物が生成される。フォワードプライマーにはEcoRIおよびPmeI制限部位およびRBSを組み込む。リバースプライマーにはBamHI制限部位を組み込む。PCR産物をpCRBlunt II−TOPOにクローニングし、pCRBluntII−pddが生成される。
大腸菌内での2−ブタノール生合成経路の発現
この予想実施例の目的は、大腸菌内で2−ブタノール生合成経路の発現を行う方法を記載することである。
枯草菌内での2−ブタノール生合成経路の発現
この予想実施例の目的は、枯草菌内で2−ブタノール生合成経路の発現を行う方法を記載することである。
2−ブタノール生合成経路内での遺伝子における形質転換ベクターの作成
この実施例の目的は、2−ブタノール生合成経路(すなわち上記の経路3)内で遺伝子を保有する組換え大腸菌宿主を調製することであった。大腸菌は、大部分の生物のようにグルコースを最初にピルビン酸に変換する。酵素は経路3においてピルビン酸を2−ブタノンに変換する必要があった、すなわち、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、ブタンジオール脱水素酵素、およびブタンジオールデヒドラターゼは、budA、budB、budC、pddA、pddB、およびpddC遺伝子によってコードされる。経路の最終ステップでは、ブタノール脱水素酵素は2−ブタノンを2−ブタノールに変換する。この最終ステップを行う脱水素酵素は不定(promiscuous)であり、多数の生物内に見出されうる。組換え生物内での2−ブタノール生合成経路の構築を簡素化するため、経路内での5ステップをコードする遺伝子は複数のオペロンに分かれた。上流経路のオペロンは、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびブタンジオール脱水素酵素により触媒される最初の3つのステップを含み、それを発現ベクター上にクローニングした。下流経路は、再活性化因子(モリ(Mori)ら、J.Biol.Chem.272:32034頁(1997年))を含むブタンジオールデヒドラターゼおよびブタノール脱水素酵素により触媒される最後の2つのステップを含んだ。ジオールデヒドラターゼは触媒反応中に自殺による不活化を被る可能性がある。ddrAおよびddrBによってコードされる再活性化因子タンパク質(GenBank AF017781、配列番号70)は不活性酵素を再活性化する。ddrAおよびddrB遺伝子はジオールデヒドラターゼのオペロンに隣接する。デヒドラターゼ/再活性化因子およびブタノール脱水素酵素に対するオペロンのいずれかを別の発現ベクター上にクローニングするか、またはデヒドラターゼ/再活性化因子のオペロンを別の発現ベクター上に単独にクローニングし、かつ最終ステップをデモンストレーションとしての宿主内での内因性の活性により提供した。
budABコード領域を、プライマー対のBABC FおよびBAB R(各々、配列番号33および34として与えられる)(表4を参照)を用いるPCRによりK.ニューモニエ(K.pneumoniae)ATCC25955のゲノムDNAから増幅し、2.5kbpの産物が生成された。フォワードプライマーにはSacIおよびEcoRI制限部位ならびにリボソーム結合部位(RBS)を組み込んだ。リバースプライマーにはSpeI制限部位を組み込んだ。PCR産物をpCR4 Blunt−TOPOにクローニングし、pCR4Blunt−TOPO−budABが生成された。プラスミドDNAをTOPOクローンから調製し、遺伝子の配列をプライマーのM13 Forward(配列番号35)、M13 Reverse(配列番号36)、N83 SeqF2(配列番号37)、N83 SeqF3(配列番号38)およびN84 SeqR4(配列番号39)を用いて検証した(表5を参照)。
大腸菌Top10/pTrc99a−budABCの3種の独立の単離物におけるブタンジオールの生成について負の対照として大腸菌Top10/pCL1925−Kodd−ddr(下記)を用いて試験した。株を、100μg/mLのカルベニシリンを含有するLB培地内で成長させた。得られた細胞を用い、100μg/mLのカルベニシリンを有するTM3a/グルコース培地125mLを含有する振とうフラスコ(約175mLの全容量)に接種した。さらに、pTrc99a−budABCを保有する株が接種されたフラスコは0.4mMイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)を含有した。TM3a/グルコース培地は、(1リットル当たり)10gグルコース、13.6g KH2PO4、2.0gクエン酸一水和物、3.0g (NH4)2SO4、2.0g MgSO4・7H2O、0.2g CaCl2・2H2O、0.33gクエン酸鉄アンモニウム、1.0mgチアミン・HCl、0.50g酵母抽出物、および微量元素溶液10mLを含有し、NH4OHでpH6.8に調整されている。微量元素の溶液は、クエン酸・H2O(4.0g/L)、MnSO4・H2O(3.0g/L)、NaCl(1.0g/L)、FeSO4・7H2O(0.10g/L)、CoCl2・6H2O(0.10g/L)、ZnSO4・7H2O(0.10g/L)、CuSO4・5H2O(0.010g/L)、H3BO3(0.010g/L)、およびNa2MoO4・2H2O(0.010g/L)を含有した。空気抜きキャップで覆ったフラスコに約0.03単位の初期OD600で接種し、300rpmの振とう下、34℃でインキュベートした。
ジオールデヒドラターゼ(GenBank D45071、配列番号69)および再活性化因子(GenBank AF017781、配列番号70)オペロンを、プライマーDDo For(配列番号44)およびDDo Rev(配列番号45)を用い、単一の単位としてクレブシエラ・オキシトカATCC8724からPCR増幅した。フォワードプライマーには最適化された大腸菌RBSおよびHindIII制限部位を組み込んだ。リバースプライマーにはXbaI制限部位を組み込んだ。5318bpのPCR産物をpCR4Blunt−TOPOにクローニングし、得られたpCR4Blunt−TOPO−Kodd−ddrのクローンを、プライマーのM13 Forward(配列番号35)、M13 Reverse(配列番号36)、DDko seq F2(配列番号46)、DDko seq F5(配列番号47)、DDko seq F7(配列番号48)、DDko seq F9(配列番号49)、DDko seq R1(配列番号50)、DDko seq R3(配列番号51)、DDko seq R7(配列番号52)、およびDDko seq R10(配列番号53)を用いて配列決定した。予想配列を有する挿入物を有するクローンを同定した。
異種のアルコール脱水素酵素活性をもたらすため、アシネトバクター・エスピー由来のシクロヘキサノール脱水素酵素をコードするchnA遺伝子(チャン(Cheng)ら、J.Bacteriol.182:4744−4751頁(2000年))を、ジオールデヒドラターゼオペロン、pCL1925−Kodd−ddrを用いてpCL1925ベクターにクローニングした。配列番号71(Genbank番号:AF282240、配列番号73)として与えられるchnA遺伝子を、プライマーのChnAF(配列番号54)およびChnAR(配列番号55)を用い、アシネトバクター(Acinetobacter)に由来するシクロヘキサノールの遺伝子クラスターを保有するコスミドpDCQ2、から増幅した。得られた828bpのPCR産物をpCR4Blunt−TOPOにクローニングすることでpCR4Blunt−TOPO−chnAが生成され、形質転換体を、プライマーのM13 Forward(配列番号35)およびM13 Reverse(配列番号36)を用いるコロニーPCRによりスクリーニングした。正確なクローニングにより約1kbpのPCR産物が生成され、プライマーのM13 Forward(配列番号35)およびM13 Reverse(配列番号36)を用いる配列決定を行った。
過剰発現された内因性アルコール脱水素酵素を用いる大腸菌内での2−ブタノール生合成経路の発現
この実施例の目的は、数種の大腸菌株内で2−ブタノール生合成経路を発現させることであった。
大腸菌は、1,3−プロパンジオール脱水素酵素として同定された天然遺伝子(yqhD)を有する(米国特許第6,514,733号明細書)。配列番号74で与えられるyqhD遺伝子は、NADH依存性のブタノール脱水素酵素であり得るクロストリジウム内の遺伝子adhBに対して40%の同一性を有する。yqhD遺伝子を、λRed技術(ダツェンコ(Datsenko)およびワーナー(Wanner)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640頁(2000年))を用い、大腸菌株MG16551.6yqhD::Cm(国際公開第2004/033646号パンフレット)内のグルコースイソメラーゼのプロモーター1.6GI(配列番号67)の変異体の構成的発現下に置いた。同様に、天然プロモーターを1.5GIプロモーター(国際公開第2003/089621号パンフレット)(配列番号68)と置換することでMG16551.5yqhD::Cm株が生成されたことから、MG1655 1.6yqhD::Cmの1.6GIプロモーターが1.5GIプロモーターと置換された。1.5GIおよび1.6GIのプロモーターが−35領域内で1bpだけ異なることにより、プロモーターの強度が改変される(国際公開第2004/033646号パンフレット)。天然yqhDプロモーターを1.5GIまたは1.6GIのいずれかのプロモーターと置換する間、yqhオペロンにおける推定上の転写調節因子をコードするyqhC遺伝子が除去された。ブタノール脱水素酵素活性を当該技術分野で周知の方法を用いる酵素アッセイにより確認した。
実施例9に記載の経路のプラスミドのpCL1925−Kodd−ddrおよびpTrc99a−budABCを大腸菌株MG1655のMG1655 1.6yqhDおよびMG1655 1.5yqhDに同時形質転換した。後者2つの株は、ブタノール脱水素酵素活性も有する1,3−プロパンジオール脱水素酵素YqhDを過剰発現する。本質的には上記のように、株における2−ブタノンおよび2−ブタノールの生成について試験した。細胞を、(0.1mg/LのビタミンB12、適切な抗生物質およびIPTGを有する)50mLもしくは150mLのいずれかのTM3a/グルコース培地(各々、中程度の酸素条件および低い酸素条件を表す)を有する振とうフラスコ(約175mLの全容量)に接種した。スペクチノマイシン(50μg/mL)およびカルベニシリン(100μg/mL)を各々、プラスミドのpCL1925−Kodd−ddrおよびpTrc99a−budABCに対して用いた。フラスコに0.04単位以下の初期OD600で接種し、フラスコを300rpmの振とう下、34℃でインキュベートした。培地50mLを有するフラスコを空気抜きキャップで覆う一方、培地150mLを有するフラスコを密封キャップで覆って換気を最小限にした。IPTGは時刻0では0mMもしくは0.04mMの濃度で存在した。2−ブタノンおよび2−ブタノールの生成における分析結果を表7に示す。2−ブタノール生合成経路を含むすべての大腸菌株が、低い酸素条件下および中程度の酸素条件下で2−ブタノンを生成し、低い酸素条件下で2−ブタノールを生成した。
大腸菌内での異種のアルコール脱水素酵素による2−ブタノール生合成経路の発現
実施例9に記載のプラスミドのpCL1925−KoDD−ddr::ter−T5chnAおよびpTrc99a−budABCを、2−ブタノールの生成の実証のため、大腸菌株のMG1655およびMG1655 ΔyqhCDに形質転換した。
アミノ:ピルビン酸トランスアミナーゼ(APT)のクローニング
ビブリオ・フルビアリス(Vibrio Fluvialis)JS17由来のアミノ:ピルビン酸トランスアミナーゼ(APT)がシン(Shin)らにより同定された(Appl.Microbiol Biotechnol.(2003年)61:463−471頁)。アミノ酸配列(配列番号122)がω−アミノ酸:ピルビン酸トランスアミナーゼと有意な相同性を有することが見出された(シン(Shin)およびキム(Kim)(J.Org.Chem.67:2848−2853頁(2002年))。ビブリオ・フルビアリスAPTがアセトインに対するトランスアミナーゼ活性を有することが示された。
ビブリオ・フルビアリスAPTのアラニン:アセトインアミノトランスフェラーゼ活性の特徴づけ
容量5mLのLB培養液+100μg/mLのアンピシリンにTOP10/pBAD:APT1細胞の新しいコロニーを接種した。培養物を振とう下(225rpm)、37℃で約16時間インキュベートした。この培養物の一定分量300μLを用い、同じ培地300mLに接種し、それを振とう下(225rpm)、37℃でインキュベートした。培養物が0.8のOD600に達した際、L−アラビノースを添加して最終濃度を0.2%(w/v)にした。培養物をさらに16時間インキュベートし、次いで収集した。細胞を100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.8)で1回洗浄し、次いで−80℃で凍結保存した。
エルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカのアミノアルコールキナーゼおよびアミノアルコールO−リン酸リアーゼにおける同定およびクローニング
この実施例の目的は、エルウィニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora)細菌に由来するアミノアルコールキナーゼおよびアミノアルコールO−リン酸リアーゼをコードする配列の同定およびクローニングについて記載することである。これら2種の酵素は、図1に示される、3−アミノ−2−ブタノールから2−ブタノンへの中間体3−アミノ−2−ブタノールリン酸塩を介する変換における経路1の一部である。
ATP依存性のアミノアルコールキナーゼおよびアミノアルコールO−リン酸リアーゼの活性が、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)P6(NCIB10431)、シュードモナス・プチダNCIB 10558(ジョーンズ(Jones)ら、(1973年) Biochem.J.134:167−182頁)、エルウィニア・カロトボーラ、エルウィニア・アマナス(Erwinia amanas)、エルウィニア・ミレティエ(Erwinia milletiae)、およびエルウィニア・アトロセプチカ(Erwinia atroseptica)(ジョーンズ(Jones)ら、(1973年) Biochem.J.134:959−968頁)を含むいくつかのシュードモナス種およびエルウィニア種において検出されている。これらの研究では、上記の種の抽出物が、アミノプロパノールO−リン酸からプロピオンアルデヒドを通じてのアミノプロパノールの酵素変換およびエタノールアミンO−リン酸からアセトアルデヒドを通じてのエタノールアミンの変換における活性を有することが示された。
エルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカ(ATCC番号:BAA−672D)のゲノムDNAをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)から入手した。推定上のアミノアルコールキナーゼ(KA)およびアミノアルコールO−リン酸リアーゼ(AT)をコードするオペロン配列はKA−AT(配列番号275)と称された。
このオペロンを、プライマーOT872(配列番号127)およびOT873(配列番号128)を用い、Phusion DNAポリメラーゼ(フィンザイム(Finnzymes);マサチューセッツ州イプスウィッチ(Ipswich)のニュー・イングランド・バイオラブズ(New England Biolabs)による)により、エルウィニアのゲノムDNAから増幅した。2.4kbのDNA断片をPCR反応により得て、それはKA−ATオペロンの大きさに対応する。PCR産物をEcoRIおよびPstI制限酵素で消化し、ベクターpKK223−3(ニュージャージー州ピスカタウェイ(Piscataway)のアマシャム・バイオサイエンシーズ(Amersham Biosciences))にクローニングし、それを同じ制限酵素で消化した。これにより、tacプロモーターの制御下で推定上のエルウィニアアミノアルコールキナーゼ−リアーゼのオペロンを有するプラスミドpKK223.KA−ATが生成された。同様に、プラスミドのpKK223.KAおよびpKK223.ATを作製し、それら別々のベクター内に推定上のエルウィニアキナーゼおよび推定上のエルウィニアリアーゼのコード領域が各々tacプロモーターの制御下で配置された。KAコード領域(配列番号123)のPCRクローニングにおいてはプライマーのOT872(配列番号127)およびOT879(配列番号129)を用いる一方、ATコード領域(配列番号125)のPCRクローニングにおいてはプライマーのOT873(配列番号128)およびOT880(配列番号130)をPCR増幅において用い、それにより1.1kbおよび1.3kbのPCR産物が各々生成された。各PCR産物をEcoRIおよびPstIで消化し、ベクターpKK223−3にライゲートすることでpKK223.KAおよびpKK223.ATが生成された。
プラスミドのpKK223.KA−AT、pKK223.KA、pKK223.ATおよびpKK223−3を大腸菌MG1655株に形質転換した。形質転換体を、1%グルコース、単独の窒素源としての0.5%アミノプロパノール、1mMのIPTGおよび100μg/mLのアンピシリンを含有するMOPS最少培地プレート上に再ストリークした。KA−AT、KAおよびAT遺伝子の発現をIPTGにより誘導した。対照プレートにはIPTGが全く含まれなかった。プレートを37℃で7日間インキュベートした。IPTGを有するプレート上で、MG1655/pKK223.KA−AT株のみが成長した一方、他の3つの株全部が成長しなかった。IPTGの添加を伴わないプレート上で、MG1655/pKK223.KA−AT株が成長したが、コロニーはIPTGを有するプレート上でのコロニーよりも有意に小さく、それはKAおよびATにおける未誘導細胞内でのより低い発現レベルに対応する。他の3つの株の中でこのプレート上で成長したものは全くなかった。これは、推定上のエルウィニアのKAおよびAT遺伝子の同時発現により大腸菌株MG1655/pKK223.KA−ATにおける単独の窒素源としてのアミノプロパノールの利用を可能にする十分な酵素活性がもたらされたことを示す。KAまたはATのいずれかの各個別の酵素の発現が、インビボでかかる酵素活性をもたらすのに十分ではなかった。
エルウィニアの推定上のアミノアルコールキナーゼおよびアミノアルコールO−リン酸リアーゼのインビトロ活性
エルウィニアのKA−ATオペロンのpBAD.HisBベクターへのサブクローニングおよびタンパク質発現の誘導
pKK223.KA−ATベクターからMG1655細胞内で発現されたエルウィニアの推定上のKAおよびAT酵素のタンパク質発現レベルをSDS−PAGE分析により分析した。エルウィニアのAT酵素の発現レベルは比較的低く、ここで新しいタンパク質バンドが細胞抽出物の可溶性画分中で46kDの正確な分子量で検出された一方、KA酵素において予測された大きさでは新しいタンパク質バンドが全く検出されなかった。
(R,R)−3−アミノ−2−ブタノールO−リン酸の基質をホスホエタノールアミンについてのフェラーリ(Ferrari)およびフェラーリ(Ferrari)によって報告された方法(米国特許第2730542号明細書[1956年])に基づく方法により合成した。すなわち、50%(w/v)水溶液中の10mmolのH3PO4を、(R,R)−3−アミノ−2−ブタノール(ミシガン州ヴィクスバーグ(Vicksburg)のブリッジ・オーガニクス(Bridge Organics))の50%(w/v)溶液と氷上で撹拌しながら混合させた。混合後、溶液を室温にゆっくりと温め、次いで真空下で撹拌し、70℃に加熱した。70℃で1時間後、温度を185℃にゆっくりと上昇させ、そこでさらに2時間維持した。その時点で反応物を室温まで冷却し、真空を開放した。残留原料を水中に溶解し、NMRによる分析によると、出発原料の80%が20%が未反応のままの生成物に変換させることが示された。さらに生成物が観察されることはなかった。
アミノプロパノールO−リン酸リアーゼのアッセイをジョーンズ(Jones)ら(1973年、Biochem.J. 134:167−182頁)およびG.ゴリ(G.Gori)ら(1995年、Chromatographia 40:336頁)で記載のように実施した。アミノプロパノールO−リン酸からのプロピオンアルデヒドの形成をMBTHを用いて比色分析でアッセイした。それによりアルデヒド形成の検出が可能である。反応を以下のように行った。反応物1mL中で、大腸菌TOP10/pBAD.KA−ATの100μgの細胞を含有しない抽出物を、0.1mM PLPとともにpH7.8の100mMトリス−HCl中の10mM DL−1−アミノ−2−プロパノールO−リン酸に添加した。反応物を37℃で10分間および30分間インキュベートするとともに、反応混合物の一定分量100μLを各時点で除去し、375mMグリシン−HCl、pH2.7中の6mg/mLのMBTH100μLと混合した。この混合物を100℃で3分間インキュベートし、氷上で15〜30秒間冷却し、3.3mg/mL FeCl3.6H2O1mL(10mM HCl中)を添加した後、室温で30分間インキュベートした。アルデヒド−MBTH付加体を含有する反応混合物の吸光度を670nmで測定した。アッセイの結果を表9に挙げる。アミノプロパノールリン酸塩基質、PLPおよび細胞を含有しない抽出物の存在下で、0.3以下の対照のバックグラウンドよりも高いAbs670により示されるようにアルデヒドの形成を検出した。基質または細胞を含有しない抽出物のいずれかの不在下で、アルデヒドの形成が全く検出されなかった。添加されたPLPの不在下で、おそらくは細胞を含有しない抽出物中でのPLPの存在に起因し、やや少量のアルデヒドが検出された。未誘導のTOP10/pBAD.KA−AT−培養物の細胞を含有しない抽出物から、反応物中で任意の検出可能なアルデヒドが生成されなかった。これらの結果によると、推定上のエルウィニアアミノアルコールO−リン酸リアーゼがアミノプロパノールO−リン酸からプロピオンアルデヒドへの変換を触媒しないことが示された。
アミノブタノールO−リン酸基質に対するアミノアルコールO−リン酸リアーゼの活性を、上記と同じ条件下で試験した。反応を、大腸菌TOP10/pBAD.KA−ATの100μgの細胞を含有しない抽出物、0.1mM PLPとともにpH7.8の100mMトリス−HCl中の10mMのアミノブタノールO−リン酸(実施例15に記載の(R,R)+(S,S)の混合物または(R,S)+(S,R)異性体の混合物のいずれか)を含有する反応物1mL中で37℃で一晩行った。反応混合物の一定分量100μLを除去し、2−ブタノン生成物を一般的方法に記載のMBTH誘導体化方法を用いて検出した。誘導体化された2−ブタノン異性体を表す2つのピークが観察された。したがって、エルウィニアのアミノアルコールO−リン酸リアーゼは、アミノプロパノールリン酸ホスホリアーゼに加えてアミノブタノールリン酸ホスホリアーゼである。
アミノプロパノールO−リン酸およびアミノブタノールO−リン酸の様々な立体異性体に対するエルウィニアのアミノアルコールO−リン酸リアーゼの活性を上記と同じ条件下で試験した。エルウィニアのアミノアルコールO−リン酸リアーゼの存在下で、(R)および(S)−2−アミノ−1−プロパノールO−リン酸の双方を酵素によりプロパノンに変換したが、生成物収量は(S)異性体の場合に著しく多かった。酵素は3−アミノ−2−ブタノールO−リン酸異性体の両混合物からブタノンも生成し、より多量の生成物収量が(R,S)および(S,R)基質異性体を有する反応物中に見出された。プロパノンおよびブタノン生成物の双方を、一般的方法に記載のようにMBTHにより誘導体化してHPLCにより検出した。
エルウィニアのアミノアルコールキナーゼおよび大腸菌内でのアミノアルコールO−リン酸リアーゼにおける発現レベルを改善するため、両酵素(各々、EKA:配列番号155およびEAT:配列番号156と称される)におけるコドンが最適化されたコード領域をDNA2.0(カリフォルニア州レッドウッド・シティ(Redwood City))により合成した。各コード領域をクローニングにおける制限部位(EKAは5’BbsIおよび3’EcoRIを有する)、HindIII部位(EATは5’EcoRIを有する)および3’HindIII部位を含む5’および3’テール(tails)とともに合成した。EKAおよびEATのコード領域は、DNA2.0のpJ51ベクター内に存在するプラスミドのpEKAおよびpEATとしてDNA2.0から提供された。EKAの最適化されたコード領域をpEKAのBbsIおよびHindIIIで消化された断片をNcoIIおよびHindIII部位の間のpBAD.HisBベクターにライゲートすることによりサブクローニングすることで、プラスミドpBAD.EKAが生成された。得られたプラスミドでは、コード領域がHisタグの5’側であることから、エルウィニアのアミノアルコールキナーゼに融合されたN末端His6タグにおけるコード領域を、プライマー配列番号157および配列番号158を用いるQuickChange部位特異的突然変異誘発反応を行うことにより作成し、ベクターpBAD.His−EKAが生成された。
His6で標識されたエルウィニアのアミノアルコールキナーゼのキナーゼ活性を、ADP Questアッセイ(カリフォルニア州フレモント(Fremont)のディスカバーエックス(DiscoveRx))により製造業者の使用説明書に準じて分析する。これは基質としてアミノプロパノールまたはアミノブタノールのいずれかを用いるアミノアルコールキナーゼ反応の生成物であるADPの蓄積を測定する生化学的アッセイである。10mMの基質を、反応物0.2mL中で、100mMトリス−HCl、pH7.8、10mM MgCl2、2mM KCl、0.1mM ATPの中でHis6で標識されたエルウィニアのアミノアルコールキナーゼと混合し、37℃で1時間インキュベートする。ADP試薬A(100μL)およびADP試薬B(200μL)を添加し、混合物を室温で30分間インキュベートする。活性を示す蛍光シグナルを530nmの励起波長および590nmの放射波長で測定する。
経路3全体の発現
ベクターpCLBudAB−ter−T5chnAの作成
ベクターpTrc99a::BudABC(実施例9に記載)をEcoRIで消化し、DNAをKlenow DNAポリメラーゼで処理して末端を平滑化する。次いで、平滑化されたベクターをSpeIで消化することでbudAおよびbudB遺伝子を有する2.5kbの断片が生成される。ベクターpCL1925−ter−T5chnA(実施例9に記載)をHindIIIで消化し、DNAをKlenow DNAポリメラーゼで処理して末端を平滑化する。次いで、平滑化されたベクターをXbaIで消化することで4.6kbの断片が生成され、次いでそれをpTrc99a::BudABC由来のbudAB断片にライゲートする。pCLBudAB−ter−T5chnAと称される得られたプラスミドを用いて大腸菌Top10細胞を形質転換し、単一のコロニーにおける適切なプラスミド構造について、プライマーのpCL1925vecF(配列番号62)およびN84seqR3(配列番号159)を用いるPCRによりスクリーニングする。プラスミドを、1.4kbの予想サイズのPCR産物を生成する単一のコロニーから調製する。
APT遺伝子を、プライマーのAPTfor(配列番号162;5’がRBSおよびSmaI部位を含む)およびAPTrev(配列番号163;3’にSmaI部位が付加)を用いるPCRによりベクターpBAD.APT(実施例12に記載)から増幅する。1.7kbpの予想サイズの産物をゲル精製し、SmaIで消化し、平滑末端を生成する。ベクターpKK223.KA−AT(実施例14に記載)をPstIで消化し、DNAをKlenow DNAポリメラーゼで処理して末端を平滑化する。得られたDNA断片をSmaIで消化したPCR産物とライゲートし、ライゲーション産物を用いて大腸菌Top10細胞を形質転換する。アンピシリンに耐性がある各コロニーをプライマーのOT872(配列番号127)およびAPTrev(配列番号163)を用いるPCRによりスクリーニングする。4.1kbpの予想サイズのPCR産物の存在が、APTをコードする遺伝子が存在しかつKAおよびATをコードする遺伝子と同じ方向に方向付けられていることを示す。挿入物の配列をプライマーのAPTseqRev(配列番号160)およびAPTseqFor(配列番号161)を用いて検証する。このプラスミドはpKK223.KA−AT−APTと称される。全部で3つの遺伝子の適切な発現について、LB+100μg/mLのアンピシリン内のTop10/pKK223.KA−AT−APTの培養物5mLを振とう下、37℃で成長させることにより検証する。OD600が約0.8に達する場合、プラスミド上での遺伝子の発現が、IPTGの添加で0.4mMにすることにより誘導される。発現を上記のSDS PAGEおよび活性についてのアッセイにより評価する。
大腸菌株MG1655をpKK223.KA−AT−APTおよびpCLBudAB−ter−T5chnAの双方を用いて形質転換し、形質転換体を、プラスミドの存在を示すアンピシリンおよびスペクチノマイシン耐性に対して選択する。細胞を、(適切な抗生物質を有する)50mLもしくは150mLのTM3a/グルコース培地(各々、中程度の酸素条件および低い酸素条件を表す)を有する振とうフラスコ(約175mLの全容量)に接種する。IPTGを0.4mMに添加し、pKK223.KA−AT−APTからの遺伝子の発現を誘発する。負の対照としてMG1655細胞を抗生物質を含有しない同じ培地内で成長させる。フラスコに0.01以下の初期OD600で接種し、フラスコを300rpmの振とう下、34℃で24時間インキュベートする。培地50mLを有するフラスコを空気抜きキャップで覆う一方、培地150mLを有するフラスコを密封キャップで覆って換気を最小限にする。2−ブタノール生合成経路を含むMG1655/pKK223.KA−AT−APT/pCLBudAB−ter−T5chnA株が低い酸素条件下および中程度の酸素条件下で2−ブタノンおよび2−ブタノールの双方を生成する一方、負の対照株は2−ブタノンまたは2−ブタノールのいずれにしても検出可能なレベルで生成することはない。
グリセロールデヒドラターゼおよびブタンジオールデヒドラターゼ活性の特徴づけ
グリセロールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.30)およびジオールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.28)は構造的に関連性がある一方、当該技術分野では基質特異性を含む様々な差異に基づいて区別されることが多い。この実施例では、グリセロールデヒドラターゼがメソ−2,3−ブタンジオールを2−ブタノンに変換することを示す。グリセロールデヒドラターゼの複数のサブユニット(α:配列番号145(コード領域)および146(タンパク質);β:配列番号147(コード領域)および148(タンパク質);およびγ:配列番号149(コード領域)および150(タンパク質))をコードするクレブシエラ・ニューモニエ遺伝子、ならびにグリセロールデヒドラターゼレアクティバーゼの複数のサブユニット(大型サブユニット、配列番号151(コード領域)および152(タンパク質);および小型サブユニット、配列番号153(コード領域)および154(タンパク質))をコードするクレブシエラ・ニューモニエ遺伝子を含む組換え大腸菌株KLP23/pSYCO12が、エムプテージ(Emptage)ら、米国特許第6,514,733号明細書および国際公開第2003089621号パンフレット(これらは参照により本明細書中に援用される)にて記載されている。KLP23/pSYCO12の細胞を含有しない粗抽出物を当業者に既知の方法により調製した。酵素アッセイを、光の不在下、12μMの補酵素B12および10mMのメソ−2,3−ブタンジオールを有するpH8.2の80mMヘペス緩衝液中、37℃で行った。2−ブタノンの形成をHPLC(屈折率検出を有するショーデックス(Shodex) SH−1011カラムおよびSH−Gガードカラム;0.5mL/分の流速および50℃のカラム温度での移動相として0.01M H2SO4;2−ブタノンの保持時間=40.2分)により監視した。グリセロールデヒドラターゼの調製による2−ブタノン形成の速度が粗タンパク質に対して0.4nmol/min/mgであると判断した。
実験的に証明されたジオール/グリセロールデヒドラターゼにおけるプロファイルHMMの生成および検証を通じてのジオール/グリセロールデヒドラターゼの構造分析
ジオールデヒドラターゼおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素は各々、酵素のクラス4.2.1.28および4.2.1.30に属する。両方のクラスにおける酵素は各々、3つのサブユニット、すなわち大型(αとも称される)、中型(βとも称される)および小型(γとも称される)の複合体である。一部のグリセロールデヒドラターゼでは、大型および中型サブユニットは融合されることが見出された。
クレブシエラ・オキシトカブタンジオールデヒドラターゼ酵素をジオールおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素のファミリーを同定するためのプロトタイプ(prototype)酵素として用いた。α(GenBank番号:BAA08099;配列番号8)、β(GenBank番号:BAA08100;配列番号10)およびγ(GenBank番号:BAA08101;配列番号12)サブユニットのアミノ酸配列の各々を、デフォルトパラメータを用いるGenBankの非冗長タンパク質データベースに対するBLASTp探索におけるクエリー配列として機能させた。関連性のある一致を有する配列を抽出した。関連性を、E値スコア、タンパク質の定義、一致したタンパク質におけるGenBankレポートに含まれる詳細、およびトピックスに関する文献レビューにより判断した。大型サブユニットにおいては、BLAST出力はe−20から1.5のE値へのE値における急激な減少を示した。1.5以上のE値を有するすべての配列一致が、それらがデヒドラターゼであることに矛盾する定義づけを有した。これらの配列の多数をDNAに特異的なRNAポリメラーゼのβサブユニットと称した。およそe−20のE値で一致があり、それは部分配列であった。E値が1.5未満である場合、アノテーションを全く有しない配列を含めた。
上記の分析を通じて同定された各配列においては、その生化学的機能の実験的証拠を得るための探索をBRENDA、UniProtおよびNCBI Entrezデータベースにおいて行った。BRENDAは、実験に関する文献から引用されかつ関連データベース(ケルン大学バイオインフォマティクス・センター(Cologne University Bioinformatics Center)と連携した酵素の速度論的、物理的、かつ生化学的特性についての詳細な情報を含むヒトでキュレートされた(human−curated)データベースである。UniProt Knowledgebaseは、Swiss−Protデータベースのヒトでキュレートされた部分およびTrEMBLデータベースのマシンでアノテートされた補足部分から構成される。キュレートされたSwiss−Protデータベース(スイス・バイオインフォマティクス研究所(Swiss Institute of Bioinformatics))は、ドメインアーキテクチャ、翻訳後修飾および配列変異体を含む高レベルのタンパク質アノテーションを提供する。NCBI Entrezは、PubMed、Nucleotide and Protein Sequences、Protein Structures、Complete Genomes、およびTaxonomyを含む主要なデータベースにおける、NCBI(メリーランド州ベテスダ(Bethesda)の国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information))で用いられる統合されたテキストベースの探索および検索システムである。
この分析を行うため、95%を超えて同一の極めて冗長な配列を、実験的に検証された全機能配列が保持される以外は、大型、中型または小型サブユニットにおける配列セットから除去した。タンパク質の(末端が)切断された配列または部分配列も除去した。残存する配列に対し、デフォルトパラメータを用いるClustal Wを用い、多重配列アラインメントを行った。大型サブユニットにおける同一性(%)は97.6%(最高の%は複数の実験的に検証された配列から得られる)〜42.8%の範囲であった。中型サブユニットにおける同一性(%)は91.9%〜26.4%の範囲であった。小型サブユニットにおける同一性(%)は85.2%〜20.5%の範囲であった。これらの同一性(%)は、実験的に検証された配列における同一性(%)に類似する範囲である。
酵素のジオール/グリセロールデヒドラターゼファミリーのサブユニットのセットにおける他の構造/機能の特徴づけを、HMMER(バージニア州アッシュバーン(Ashburn)のジャネリア・ファーム・リサーチ・キャンパス(Janelia Farm Research Campus))から入手可能なユーザーガイドに従い、HMMERソフトウェアパッケージ(プロファイルHMMの背後にある理論が、R.ダービン(R.Durbin)、S.エディ(S.Eddy)、A.クロー(A.Krogh)、およびG.ミッチソン(G.Mitchison)、Biological sequence analysis:probabilistic models of proteins and nucleic acids、ケンブリッジ大学出版会(Cambridge University Press)、1998年;クロー(Krogh)ら、1994年;J.Mol.Biol. 235:1501-1531頁に記載)を用いて行った。
機能的に検証されたジオール/グリセロールデヒドラターゼの大型サブユニットにおける8つの配列(配列番号8、99、105、135、138、141、146、および164)を、デフォルトパラメータを用いるClustal Wを用いて整列した。中型サブユニット配列のセット(配列番号10、101、107、136、139、142、148、および165)ならびに小型サブユニット配列のセット(配列番号12、103、109、137、140、143、150および166)についても同様に行った。
hmmbuildプログラムを、アラインメント配列の各セットに対し、デフォルトパラメータを用いて実行した。Hmmbuildは多重配列アラインメントファイルを読み込み、新しいプロファイルHMMを作成し、プロファイルHMMを保存してファイルする。このプログラムを用い、上記のサブユニット配列の各セットにおいて、未較正のプロファイルが多重アラインメントから生成された。
各プロファイルHMMを、Profile(用いられる合成配列のデフォルト数が5,000)を有する多数の合成されたランダム配列をスコアリングし、同スコアのヒストグラムに対する極値分布(extreme value distribution)(EVD)に適合し、かつここでのEVDパラメータを含むHMMファイルを再保存するというhmmcalibrateを用いて読み込んだ。プロファイルをタンパク質配列データベースに対して探索する場合、これらのEVDパラメータ(μおよびλ)を用い、ビットスコアのE値が計算される。hmmcalibrateは2つのパラメータをHMMファイルに一行に「EVD」というラベルを書き込む、すなわち、これらのパラメータは、SWISS−PROTとほぼ同じ長さおよび残基組成物のランダムに生成される配列に対して計算されたスコアのヒストグラムに最適である極値分布(EVD)のμ(位置)およびλ(大きさ)パラメータである。この較正を、各プロファイルHMMにつき1回行った。
各プロファイルHMMを、hmmfileからプロファイルHMMを読み込みかつ有意に類似した配列と一致する配列ファイルを探索するhmmsearchを用いて評価した。探索された配列ファイルはGenBank非冗長タンパク質データベースであった。データベースのサイズ(Zパラメータ)を10億に設定した。このサイズの設定により、現行データベースに対する有意なE値が予測可能な未来での有意性を維持することが保証される。E値カットオフを10に設定した。
大型(α)サブユニット:8、93、99、105、135、138、141、146、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、200、203、206、209、212、215、218、221、224、227、130、243、254、255、256、257、258、および259。
融合された大型+中型サブユニット(大型サブユニットおよび中型サブユニット部分は各々、大型のProfileおよび中型のProfileに一致する):233、235、237、239、241、246、および247。
中型(β)サブユニット:10、95、101、107、136、139、142、148、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、207、210、213、216、219、222、225、228、231、244、250、252、260、261、262、263、364、265、266、および167。
小型(γ)サブユニット:12、97、103、109、137、140、143、150、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、199、202、205、208、211、214、217、220、223、226、229、232、234、236、238、240、242、245、248、249、251、253、268、270、271、272、273、および274。
Claims (10)
- i)ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ii)α−アセト乳酸からアセトインへ、
iii)アセトインから2,3−ブタンジオールへ、
iv)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ、および
v)2−ブタノンから2−ブタノールへ、
の生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする異種DNA分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで該微生物の宿主細胞が2−ブタノールを生産する、組換え微生物の宿主細胞。 - i)ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ、
ii)α−アセト乳酸からアセトインへ、
iii)アセトインから2,3−ブタンジオールへ、および
iv)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ、
の生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする異種DNA分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで該微生物の宿主細胞が2−ブタノンを生産する、組換え微生物の宿主細胞。 - 2−ブタノールを生産するための方法であって、
1)i)ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ii)α−アセト乳酸からアセトインへ、
iii)アセトインから2,3−ブタンジオールへ、
iv)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ、および
v)2−ブタノンから2−ブタノールへ、
の生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする異種DNA分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、そして
2)(1)の宿主細胞を2−ブタノールが生産される条件下の発酵培地内で発酵可能な炭素基質と接触させる、
ことを含む、上記方法。 - 2−ブタノンを生産するための方法であって、
1)i)ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ii)α−アセト乳酸からアセトインへ、
iii)アセトインから2,3−ブタンジオールへ、および
iv)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ、
の生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする異種DNA分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、そして
2)(1)の宿主細胞を2−ブタノンが生産される条件下の発酵培地内で発酵可能な炭素基質と接触させる、
ことを含む、上記方法。 - 細胞が、細菌、シアノバクテリア、糸状菌および酵母からなる群から選択される、請求項1または2に記載の組換え微生物の宿主細胞。
- 細胞が、クロストリジウム属、ザイモモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ラクトバチルス属、腸球菌属、ペディオコッカス属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびサッカロミセス属からなる群から選択される属のメンバーである、請求項5に記載の組換え微生物の宿主細胞。
- 請求項1、5または6のいずれか1項に記載の組換え微生物の宿主細胞を含む、請求項3に記載の方法により生産される、2−ブタノールを含有する発酵生産物培地。
- 請求項2、5または6のいずれか1項に記載の組換え微生物の宿主細胞を含む、請求項4に記載の方法により生産される、2−ブタノンを含有する発酵生産物培地。
- 組換え微生物の宿主細胞が、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、および酵母からなる群から選択される、請求項3または4に記載の方法。
- 組換え微生物の宿主細胞が、クロストリジウム属、ザイモモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ラクトバチルス属、腸球菌属、ペディオコッカス属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびサッカロミセス属からなる群から選択される属のメンバーである、請求項9に記載の方法。
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