JP5950830B2 - Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性の改善 - Google Patents

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、参照によってその全体が援用される２０１０年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／３０５，３３３号の利益を主張する。
配列表情報
本出願と共に出願されたＡＳＣＩＩテキストファイルＣＬ４８４２ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔにおいて電子的に提出された配列表の内容は、参照によってその全体が本明細書中に援用される。
本発明は、一般に、微生物学および生化学の分野に関する。具体的には、本発明は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼポリペプチドを含む組換え宿主細胞、特に酵母細胞に関する。また本発明は、ポリペプチドの発現の増大、細胞のＦｅ−Ｓクラスター生合成活性の調節、またはこれらの組み合わせの結果として、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼポリペプチドの比活性が増大された組換え宿主細胞にも関する。また本発明は、宿主細胞の使用方法と、宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドの同定方法とを含む。
鉄−硫黄（Ｆｅ−Ｓ）クラスターは、これらを含有するタンパク質類の正常な機能に必須である補因子または補欠分子族として役立つ。Ｆｅ−Ｓクラスター含有タンパク質類において、Ｆｅ−Ｓクラスターは、いくつかの役割を果たすことが分かっている。この類のタンパク質は、細胞によって最初に合成されたときにはその適切な機能に必要とされるＦｅ−Ｓクラスターが欠けており、アポタンパク質と呼ばれる。Ｆｅ−ＳクラスターはＦｅ−Ｓクラスター生合成に関与するタンパク質による一連の反応で作られ、アポタンパク質に転移されて、機能性Ｆｅ−Ｓクラスター含有ホロタンパク質を形成する。
適切な機能のためにＦｅ−Ｓクラスターを必要とするそのタンパク質の１つは、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．９）である。ＤＨＡＤは、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、および２，３−ジヒドロキシメチルバレレートからα−ケトメチルバレレートへの変換を触媒する。ＤＨＡＤ酵素は、分枝鎖アミノ酸（すなわち、バリン、イソロイシン、ロイシン）、およびパントテン酸（ビタミンＢ５）を産生する、天然に存在する生合成経路の一部である。また、ＤＨＡＤに触媒される２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換は、特許文献１（参照によって本明細書中に援用される）に開示される多数のイソブタノール生合成経路における共通のステップである。そこには、例えば、イソブタノールの産生のための組換え微生物の操作が開示されている。
この酵素活性を含む生合成経路からの産物の産生の増大（例えば、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、およびイソブタノールの微生物産生の増強を含む）のために、高レベルのＤＨＡＤ活性が所望される。特に、イソブタノールは燃料添加剤として有用であり、その利用が容易であることから、石油化学燃料に対する需要が低減され得る。しかしながら、全ての既知のＤＨＡＤ酵素はその機能のためにＦｅ−Ｓクラスターを必要とするので、これらのタンパク質によって必要とされるＦｅ−Ｓクラスターを提供する遺伝機構を有する宿主において発現されなければならない。酵母では、ミトコンドリアがＦｅ−Ｓクラスター生合成における重要な役割を果たす。ＤＨＡＤが酵母のサイトゾルで機能的に発現されるのであれば、必要なＦｅ−Ｓ前駆体またはシグナルをミトコンドリアから輸送して、サイトゾルのアポタンパク質においてＦｅ−Ｓクラスターを構築するためのシステムが必要とされる。本発明者らの研究よりも前は、酵母が細胞質内に位置する任意のＤＨＡＤのためにＦｅ−Ｓクラスターを提供し得るかどうか（天然の酵母ＤＨＡＤはミトコンドリア内に位置するので）、そしてはさらに重要なことには、細胞質内でいつＤＨＡＤが高レベルで発現されるかはこれまで未知であった。
特定の条件下では、Ｆｅ−Ｓクラスター要求アポタンパク質の合成の速度は、細胞がこれらのためのＦｅ−Ｓクラスターを合成および構築する能力を上回ることもある。これらの条件下で蓄積するクラスターを持たないアポタンパク質は、その正常な機能を実行することができない。このような条件は、１）特に大量での異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の発現、２）正常よりも高レベルでの天然Ｆｅ−Ｓクラスター生合成タンパク質の発現、または３）宿主細胞がＦｅ−Ｓクラスターを合成する能力が衰弱された状態、を含み得る。
米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書
高レベルの異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質を発現する組換え宿主細胞は、少なくとも１つのＦｅ取込み、利用、および／またはＦｅ−Ｓクラスター生合成タンパク質のレベルが変更されれば、Ｆｅ−Ｓクラスターの補体をそのタンパク質に提供することができるという驚くべき発見が本明細書に開示されている。
本明細書には、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が提供されており、前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む。また、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が提供されており、前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている。また、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が提供されており、前記宿主細胞は、鉄代謝またはＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む。また、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドと、鉄代謝またはＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞も提供されている。
実施形態では、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、表７、表８および表９中の遺伝子からなる群から選択される。実施形態では、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＣＣＣ１、ＦＲＡ２、およびＧＲＸ３、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。実施形態では、ポリペプチドは、構成的突然変異体であるポリヌクレオチドによってコードされる。実施形態では、前記構成的突然変異体は、ＡＦＴ１ Ｌ９９Ａ、ＡＦＴ１ Ｌ１０２Ａ、ＡＦＴ１ Ｃ２９１Ｆ、ＡＦＴ１ Ｃ２９３Ｆ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。実施形態において、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含むポリヌクレオチドによってコードされる。実施形態では、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされる。実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換は、ＣＣＣ１、ＦＲＡ２、およびＧＲＸ３、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、これらの突然変異体、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、多数コピーで発現される。実施形態では、前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む。実施形態では、前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている。実施形態では、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成は、内因性Ｆｅ−Ｓクラスター生合成を有する組換え宿主細胞と比較して増大される。
実施形態では、前記宿主細胞は酵母宿主細胞である。実施形態では、前記酵母宿主細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される。
実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、１０−５よりも小さいＥ値で表１２のプロファイルＨＭＭと一致するアミノ酸配列を有し、ここでポリペプチドはさらに、配列番号１６８に相当するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列における位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システイン全てを含む。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、配列番号１６８または配列番号２３２に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約５倍よりも大きい比活性、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約８倍よりも大きい比活性、またはジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約１０倍よりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する。実施形態において、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約３倍よりも大きい比活性、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約６倍よりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは、約０．２５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約０．３Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約０．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約１．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約１．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約２．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約３．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約４．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約５．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約６．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約７．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約８．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約９．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約１０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約２０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、および約５０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する。
実施形態では、前記組換え宿主細胞はイソブタノールを産生し、実施形態では、前記組換え宿主細胞はイソブタノール生合成経路を含む。
また、本明細書には産物の製造方法も提供されており、本方法は、組換え宿主細胞を提供するステップと、前記産物が産生される条件下、発酵培地中で組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップとを含み、この産物は、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。実施形態では、本方法はさらに、場合により前記産物を回収するステップを含む。実施形態では、本方法はさらに、前記産物を回収するステップを含む。
また、組換え宿主細胞を提供するステップと、イソブタノールが産生される条件下、発酵培地中で組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップとを含む、イソブタノールの製造方法も提供されている。実施形態では、本方法はさらに、場合により前記イソブタノールを回収するステップを含む。実施形態では、本方法はさらに、前記イソブタノールを回収するステップを含む。
また、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換方法も提供されており、本方法は、組換え宿主細胞を提供するステップと、２，３−ジヒドロキシイソバレレートがα−ケトイソバレレートに変換される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。実施形態では、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞と比較して、（ａ）少なくとも約５％、（ｂ）少なくとも約１０％、（ｃ）少なくとも約１５％、（ｄ）少なくとも約２０％、（ｅ）少なくとも約２５％、（ｆ）少なくとも約３０％、（ｇ）少なくとも約３５％、（ｈ）少なくとも約４０％、（ｉ）少なくとも約４５％、（ｊ）少なくとも約５０％、（ｋ）少なくとも約６０％、（ｌ）少なくとも約７０％、（ｍ）少なくとも約８０％、（ｎ）少なくとも約９０％、および（ｏ）少なくとも約９５％からなる群から選択される量で増大される。
また、組換え宿主細胞においてジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドの比活性を増大させるための方法も提供されており、本方法は、組換え宿主細胞を提供するステップと、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドを持たない同一の宿主細胞よりも大きい比活性を有する機能性形態で発現される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。
また、宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるための方法も提供されており、本方法は、組換え宿主細胞を提供するステップと、宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスが増大される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。
また、組換え宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を増大させる方法も提供されており、本方法は、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、前記宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性が増大される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。実施形態では、前記活性の増大は、約１０％よりも多い量、約２０％よりも多い量、約３０％よりも多い量、約４０％よりも多い量、約５０％よりも多い量、約６０％よりも多い量、約７０％よりも多い量、約８０％よりも多い量、約９０％よりも多い量、および約９５％、９８％、または９９％よりも多い量からなる群から選択される量である。実施形態では、活性の増大は、約５倍よりも多い量、約８倍よりも多い量、約１０倍よりも多い量からなる群から選択される量である。実施形態では、活性の増大は、約３倍よりも多い量、および約６倍よりも多い量からなる群から選択される量である。
宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法であって、本方法は、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を測定するステップと、ポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定される異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性と、ポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定される異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性とを比較するステップとを含み、ここで、異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性の増大は、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す。
本明細書には、宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチド同定するための方法が提供されており、本方法は、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性を測定するステップと、変化が存在する場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性と、変化が存在しない場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性とを比較するステップとを含み、ここで、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性の増大は、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す。
実施形態では、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性の変化は、欠失、突然変異、置換、発現、上方制御、下方制御、細胞位置の変更、タンパク質の状態の変更、および／または補因子の付加を含む。実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質はジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有し、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質は、１０−５よりも小さいＥ値で表１２のプロファイルＨＭＭと一致するアミノ酸配列を有し、ここでポリペプチドはさらに、配列番号１６８に相当するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列における位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システイン全てを含む。実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、表７、表８および表９中の遺伝子からなる群から選択される。
また、本明細書において提供される方法によって同定されたポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞も提供される。実施形態では、前記宿主細胞はさらに、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、多数コピーで発現される。実施形態では、前記異種ポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む。実施形態では、前記異種ポリヌクレオチドは、組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている。
実施形態では、前記宿主細胞は酵母宿主細胞である。実施形態では、前記酵母宿主細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、１０−５よりも小さいＥ値で表１２のプロファイルＨＭＭと一致するアミノ酸配列を有し、ここでポリペプチドはさらに、配列番号１６８に相当するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列における位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システイン全てを含む。実施形態では、前記組換え宿主細胞は、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される産物を産生する。実施形態では、組換え宿主細胞はイソブタノールを産生する。実施形態では、前記組換え宿主細胞は、イソブタノール生合成経路を含む。実施形態では、前記イソブタノール生合成経路は、宿主細胞にとって異種であるポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも１つのポリペプチドを含む。実施形態では、前記イソブタノール生合成経路は、宿主細胞にとって異種であるポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも２つのポリペプチドを含む。
実施形態では、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する本発明のポリペプチドのモノマーは、（ａ）少なくとも約１０％、（ｂ）少なくとも約１５％、（ｃ）少なくとも約２０％、（ｄ）少なくとも約２５％、（ｅ）少なくとも約３０％、（ｆ）少なくとも約３５％、（ｇ）少なくとも約４０％、（ｈ）少なくとも約４５％、（ｉ）少なくとも約５０％、（ｊ）少なくとも約６０％、（ｋ）少なくとも約７０％、（ｌ）少なくとも約８０％、（ｍ）少なくとも約９０％、および（ｎ）少なくとも約９５％からなる群から選択されるＦｅ−Ｓクラスター負荷を有する。
Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からのＩｌｖＤ遺伝子の過剰発現のためのベクターのベクターマップを示す。 染色体におけるＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からのＩｌｖＤ遺伝子の過剰発現のための組込みベクターのベクターマップを示す。 ＡＦＴ１またはＡＦＴ１突然変異体をクローン化するために使用され、対象となる他の遺伝子のために有用なセントロメアベクターのベクターマップを示す。 精製Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤのＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを示す。 精製Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤのＥＰＲスペクトルを示す。 イソブタノールの生合成のための生合成経路を示す。 Ａは、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）ｎｉｆ遺伝子の概略図を示す。Ｂは、付加的なアゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）ｎｉｆ遺伝子の概略図を示す。Ｃは、ＮＦＵがペルスルフィドレダクターゼとしての役割を果たす式の概略図を示す。 ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）ｎｉｆ遺伝子の概略図を示す。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｉｓｃ遺伝子の概略図を示す。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｓｕｆ遺伝子の概略図を示す。 サイトゾル［２Ｆｅ−２Ｓ］生合成および構築システムの概略図を示す。 Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのＩｌｖＤ遺伝子の過剰発現のためのベクターのベクターマップを示す。
表１２は、２００９年９月２９日に出願された米国特許出願第１２／５６９，６３６号明細書に記載される通りに作成された、検定された機能を有する酵素に基づくジヒドロキシ酸デヒドラターゼのためのプロファイルＨＭＭの表である。表１２は本明細書と共に電子的に提出され、参照によって本明細書中に援用される。
本明細書には、Ｆｅ−Ｓクラスターが負荷されたＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の画分を増大させる方法が記載される。また、ＤＨＡＤ酵素などの機能性Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質と、少なくとも１つの異種のＦｅ取込み、利用、またはＦｅ−Ｓクラスター生合成タンパク質とを発現する組換え宿主細胞、機能性ＤＨＡＤ酵素を発現し、Ｆｅ利用またはＦｅ−Ｓクラスター生合成に関与する天然タンパク質において少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む組換え宿主細胞、あるいはこれらの組み合わせを含む組換え宿主細胞も記載される。さらに、本発明は、宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法を記載する。また、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を変更するポリペプチドを同定するための方法も記載される。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本出願が支配するであろう。また、文脈によって他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書において言及される全ての刊行物、特許および他の参考文献は、全ての目的のためにその全体が参照によって援用される。
本発明をさらに定義するために、本明細書において以下の用語および定義が提供される。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」もしくは「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはこれらの他のあらゆる変化形は、記載される完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）または完全体のグループの包含を意味するが、任意の他の完全体または完全体のグループの排除は意味しないと理解されるであろう。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの要素だけに限定されるのではなく、明白に記載されていないか、あるいはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素も含み得る。さらに、反対する明確な記載がない限り、「または（ｏｒ）」は包括的な「または」を指し、排他的な「または」を指さない。例えば、条件ＡまたはＢは以下のいずれか１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在し）かつＢが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在せず）かつＢが真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢの両方が真である（または存在する）。
本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という用語、または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」もしくは「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」などの変化形は、本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、列挙される任意の完全体または完全体のグループの包含を示すが、指定の方法、構造、または組成物に付加的な完全体または完全体のグループを追加することはできない。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語、または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」もしくは「から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの変化形は、本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、列挙される任意の完全体または完全体のグループの包含を示し、場合により、指定の方法、構造または組成物の基本的または新規の特性を実質的に変化させることのない、列挙される任意の完全体または完全体のグループの包含も示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。
また、本発明の要素または成分に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その要素または成分の例の数、すなわち発生の数に関して非限定的であることが意図される。そのため、「ａ」または「ａｎ」は１つまたは少なくとも１つを含むように読み取られるべきであり、要素または成分の単数の語形は、その数が明らかに単数形であることを意味しない限りは複数形も含む。
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書で使用される場合、非限定的な用語であり、どれか１つの特定の本発明の実施形態を指すことは意図されず、本出願で開示される全ての可能性のある実施形態を包含する。
本明細書で使用される場合、使用される本発明の原料または反応物の量を修飾する「約」という用語は、例えば、実際に濃縮物または溶液の製造のために使用される典型的な測定および液体処理手順によって、これらの手順における不注意な誤差によって、組成物の製造または方法の実行のために使用される原料の製造、供給源、または純度の差異によって、そして同様のことによって生じ得る数量の変動を指す。また「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されているかどうかにかかわらず、特許請求の範囲はその量と同等の量を含む。一実施形態では、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、好ましくは、報告される数値の５％以内を意味する。
「イソブタノール生合成経路」という用語は、ピルベートからイソブタノールを産生するための酵素経路を指す。
「通性嫌気性菌」という用語は、好気環境および嫌気環境の両方において増殖することができる微生物を指す。
「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物によって代謝されることが可能な炭素源、特に、単糖、オリゴ糖、多糖類、および一炭素基質、またはこれらの混合物からなる群から選択される炭素源を指す。
「Ｆｅ−Ｓクラスター生合成」という用語は、Ｆｅ−Ｓクラスターの生合成（例えば、Ｆｅ−Ｓクラスターの構築および負荷を含む）を指す。「Ｆｅ−Ｓクラスター生合成遺伝子」、「Ｆｅ−Ｓクラスター生合成タンパク質」または「Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路」という用語は、Ｆｅ−Ｓクラスターの生合成（例えば、Ｆｅ−Ｓクラスターの構築および負荷を含む）に関与するようなポリヌクレオチド／遺伝子およびコード化ポリペプチドを指す。
「Ｆｅ取込みおよび利用」という用語は、Ｆｅの感知、取込み、利用、および恒常性などの、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成をもたらすことができるプロセスを指す。「Ｆｅ取込みおよび利用遺伝子」は、Ｆｅの取込み、利用、および恒常性に関与するようなポリヌクレオチド／遺伝子およびコード化ポリペプチドを指す。これらのポリヌクレオチド／遺伝子のいくつかは、文献において記載されており、そして以下にさらに説明される「Ｆｅレギュロン」に含有される。本明細書で使用される場合、Ｆｅ取込みおよび利用遺伝子ならびにＦｅ−Ｓクラスター生合成遺伝子は、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードすることができる。
「比活性」という用語は、本明細書で使用される場合、所与の量のタンパク質における活性の単位であるであると定義される。従って、比活性は直接的に測定されないが、１）酵素サンプル１ｍｌ当たりの単位（単位／ｍｌ）における活性を、２）そのサンプル中のタンパク質の濃度で割ることによって計算され、従って、比活性は単位／ｍｇで表現される。純粋で完全に活性な酵素のサンプルの比活性は、その酵素の特徴である。タンパク質の混合物のサンプルの比活性は、対象となる活性酵素から構成されるそのサンプル中のタンパク質の相対的な画分の尺度である。本発明のポリペプチドの比活性は、約０．２５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約０．３Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約０．４Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約０．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約０．６Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約０．７Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約０．８Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約０．９Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約１．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約１．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約２．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約２．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約３．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約３．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約４．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約５．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約５．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約６．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約６．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約７．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約７．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約８．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約８．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約９．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約９．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約１０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、約２０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、または約５０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性から選択され得る。一実施形態では、本発明のポリペプチドの比活性は、約０．２５Ｕ／ｍｇよりも大きい。別の実施形態では、比活性は、約１．０Ｕ／ｍｇよりも大きい。さらに別の実施形態では、比活性は、約２．０Ｕ／ｍｇよりも大きいか、あるいは約３．０Ｕ／ｍｇよりも大きい。
「ポリヌクレオチド」という用語は単一の核酸および複数の核酸を包含することが意図され、核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、全長ｃＤＮＡ配列、またはその断片（非翻訳５’および３’配列ならびにコード配列を含む）のヌクレオチド配列を含有することができる。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成することができ、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡでも修飾ＲＮＡまたはＤＮＡでもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、そして一本鎖またはより一般的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成することができる。「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
ポリヌクレオチド配列は、「単離された」（その天然環境から取り出されている）とみなされることもある。例えば、ベクター中に含有されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードする異種ポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されていると考えられる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の精製（部分的または実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。本発明に従う単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、さらに、合成的に生成されたその分子を含む。ＤＮＡのポリマー形態の単離ポリヌクレオチド断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントから構成され得る。
「遺伝子」という用語は、特異的タンパク質として発現されることが可能なポリヌクレオチドを指し、場合により、コード配列の前の制御配列（５’非コード配列）およびコード配列の後の制御配列（３’非コード配列）が含まれる。「天然遺伝子」は、その独自の制御配列を有する天然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に見出されない制御およびコード配列を含む、天然遺伝子でない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる源に由来する制御配列およびコード配列、あるいは同じ源に由来するが、天然に見出されるものとは異なった形で配列された制御配列およびコード配列を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されたコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないにもかかわらず、コード領域の一部と考えることができるが、フランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物（例えば、単一のベクター）、あるいは別個のポリヌクレオチド構築物（例えば、別箇の（異なる）ベクター）に存在することができる。さらに、どのベクターも、単一のコード領域を含有してもよいし、あるいは２つ以上のコード領域を含んでいてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、異種のコード領域をコードしてもよい。
「内因性」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドに関連して使用される場合、生物のゲノム中のその天然位置にある天然ポリヌクレオチドまたは遺伝子を指すか、あるいは天然ポリペプチドの場合は、ゲノム中のこの位置から転写および翻訳される。
「異種」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドに関連して使用される場合、通常は宿主生物中に見出されないポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドを指す。また「異種」は、対応する天然遺伝子とは異なる形態でソース生物中に再導入された（例えば、生物のゲノム中のその天然位置にない）天然コード領域またはその一部も含む。異種ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、例えば、遺伝子導入によって、宿主生物中に導入され得る。異種遺伝子は、天然宿主中に再導入された非天然制御領域を有する天然コード領域を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。
「組換え遺伝子発現要素」という用語は、タンパク質のコード配列の前の制御配列（５’非コード配列）およびコード配列の後の（３’終結配列）を含む、１つまたは複数の特異的タンパク質を発現する核酸断片を指す。キメラ遺伝子は、組換え遺伝子発現要素である。オペロンのコード領域は、作動可能に連結されたプロモーターおよび終結領域と共に、組換え遺伝子発現要素を形成することができる。
「制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、転写終結シグナル、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含むことができる。
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節することができる核酸配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよいし、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されてもよいし、さらに、合成核酸セグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、あるいは異なる発達段階で、あるいは異なる環境または生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることは当業者によって理解される。ほとんどの時点でほとんどの細胞型において遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。一方、「誘導性プロモーター」は、プロモーター特異的シグナルまたは分子によってプロモーターが誘導またはオンにされる場合に遺伝子の発現を引き起こす。さらに、ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全には画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることが認識される。
「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような単一の核酸断片における核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現をもたらすことができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、そのコード配列と作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結され得る。
「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および蓄積を指す。また発現は、ｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳を指すこともある。プロセスは、細胞内で発現されるポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドの機能性存在の出現（遺伝子ノックダウンを制限なしに含む）ならびに一過性発現および安定発現の両方を含む。
「過剰発現」という用語は、本明細書で使用される場合、同一または関連のポリヌクレオチドまたは遺伝子の内因性発現よりも高い発現を指す。また、異種ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、同等の内因性遺伝子の発現よりもその発現が高ければ、あるいは、ポリヌクレオチドまたは遺伝子を過剰発現しない手段によって導入された同じポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現よりもその発現が高ければ、過剰発現される。例えば、ポリヌクレオチドは、低コピー数プラスミド（ほんの限られたまたは少数のコピー中に存在する）から宿主細胞において発現され、同じポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミド（多数コピー中に存在する）から宿主細胞において過剰発現され得る。宿主細胞においてポリヌクレオチドのコピーを増大させることができる限り、任意の手段を使用してポリヌクレオチドを過剰発現させることができる。高コピー数プラスミド、または制御可能なコピー数を有するプラスミドの使用に加えて、ポリヌクレオチドは、多数の染色体組込みによって過剰発現され得る。
組換え宿主細胞における本発明のポリペプチドの発現または過剰発現は、当業者に知られているあらゆる方法に従って定量化することができ、例えば、細胞タンパク質全体のパーセントによって表すことができる。タンパク質全体のパーセントは、細胞タンパク質全体の約０．００１％よりも多い量、細胞タンパク質全体の約０．０１％よりも多い量、細胞タンパク質全体の約０．１％よりも多い量、細胞タンパク質全体の約０．５％よりも多い量、細胞タンパク質全体の約１．０％よりも多い量、細胞タンパク質全体の約２．０％よりも多い量、細胞タンパク質全体の約３％よりも多い量、細胞タンパク質全体の約４．０％よりも多い量、細胞タンパク質全体の約５％よりも多い量、細胞タンパク質全体の約６．０％よりも多い量、細胞タンパク質全体の約７．０％よりも多い量、細胞タンパク質全体の約８．０％よりも多い量、細胞タンパク質全体の約９．０％よりも多い量、細胞タンパク質全体の約１０％よりも多い量、または細胞タンパク質全体の約２０％よりも多い量から選択される量であり得る。一実施形態では、発現されるポリペプチドの量は、細胞タンパク質全体の約０．５％よりも多い。別の実施形態では、発現されるポリペプチドの量は、細胞タンパク質全体の約１．０％よりも多い、または細胞タンパク質全体の約２．０％よりも多い。
本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は核酸断片の宿主生物への転移を指し、選択を有するまたは有さない遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物と称される。
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の中心的な代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、任意のソースに由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（線状または環状）であってもよく、ここで、多数のヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞内に導入することができる独特の構成に結合または組換えられている。
本明細書で使用される場合、「コドン縮重」という用語は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝コードの性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」をよく知っている。そのため、宿主細胞における発現の改善のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
種々の宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域を指すような「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく、宿主生物の典型的なコドン使用を反映するための、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変を指す。このような最適化は、その生物の遺伝子中でより頻繁に使用される１つまたは複数のコドンによる、少なくとも１つ、または２つ以上、またはかなりの数のコドンの置換を含む。
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における偏差は、遺伝子をコードする配列における変動を可能にする。各コドンは３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを構成するヌクレオチドは４つの特定の塩基に限定されるので、６４個の可能なヌクレオチドの組み合わせが存在し、そのうち６１個がアミノ酸をコードする（残りの３個のコドンは翻訳を終了させるシグナルをコードする）。「遺伝コード」は、表１のように本明細書においてどのアミノ酸が再現されるかをどのコドンがコードするかを示す。結果として、多数のアミノ酸が２つ以上のコドンによって指定される。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは４つのトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは６つによってコードされるが、トリプトファンおよびメチオニンはただ１つのトリプレットによってコードされる。この縮重によって、ＤＮＡ塩基組成は、ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく広範囲にわたって変化することができる。
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多数の生物は、成長しているペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードするために特定のコドンの使用に対するバイアスを示す。生物間のコドン使用における差異であるコドン選択またはコドンバイアスは遺伝コードの縮重によって提供され、多数の生物の間で十分に実証されている。コドンバイアスはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、これは次に、特に、翻訳中のコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用能に依存していると考えられる。細胞中で選択されるｔＲＮＡが優勢であることは、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。
様々な種類の動物、植物および微生物種に対して多数の遺伝子配列が利用可能であれば、相対的なコドン使用頻度を計算することが可能である。コドン使用表は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００８年３月２０日訪問）で入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｌｅａｓｅ １２８．０［２００２年２月１５日］から計算される酵母のためのコドン使用表は、以下の表２のように再現される。この表はｍＲＮＡ命名法を使用するので、ＤＮＡ中に見出されるチミン（Ｔ）の代わりに、この表では、ＲＮＡ中に見出されるウラシル（Ｕ）が使用される。表２は、頻度が６４個の全てのコドンに対してではなく各アミノ酸に対して計算されるように適合されている。
Figure 0005950830
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この表または類似の表を用いることによって、当業者は任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用して、ポリペプチドをコードするが所与の種にとって最適なコドンを使用するコドン最適化コード領域の核酸断片を生じることができる。
コドンを最適化頻度でランダムに割り当てて所与のポリペプチド配列をコード化することは、各アミノ酸のコドン頻度を計算し、次にコドンをポリペプチド配列にランダムに割り当てることによって手作業で行うことができる。さらに、種々のアルゴリズムおよびコンピュータソフトウェアプログラムは、当業者にとって容易に利用可能である。例えば、ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手可能なＬａｓｅｒｇｅｎｅ Ｐａｃｋａｇｅにおける「ＥｄｉｔＳｅｑ」機能、ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手可能なＶｅｃｔｏｒＮＴＩ Ｓｕｉｔｅにおける折り返し翻訳（ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）機能、およびＡｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能なＧＣＧ−Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅにおける「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅ」機能である。さらに、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｅｎｇ（２００８年４月１５日訪問）における「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」機能、およびｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｐｂｉ．ｎｒｃ．ｃａ：８０９０／ＥＭＢＯＳＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ（２００２年７月９日訪問）において利用可能な「ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ」機能など、種々の資源がコドン最適化コード領域配列にとって公的に入手可能である。所与の頻度に基づいてコドンを割り当てるために基本的なアルゴリズムを構築することも、基本的な数学関数を用いて当業者により容易に達成され得る。
コドン最適化コード領域は、「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎｅｒ」（ｈｔｔｐ：／／ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．ｂｉｏｓｃｉ．ｕｍｂｃ．ｅｄｕ／ｃｏｄｏｎ／ｓｇｄ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）などのソフトウェアパッケージを含む、当業者に知られている種々の方法によって設計することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は単一の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直線的に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、任意のアミノ酸鎖または２つ以上のアミノ酸の鎖を指し、産物の特定の長さを指さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、またはアミノ酸鎖もしくは２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または交換可能に使用することができる。ポリペプチドは天然の生物学的ソースに由来してもよいし、あるいは組換え技術によって作製されてもよいが、必ずしも指定される核酸配列から翻訳されるわけではない。化学合成を含む任意の方法で生成することができる。
「単離」ポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然または自然環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現される組換えで産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドなので、本発明の目的では単離されていると考えられる。
本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、例えば、変異誘発などの組換えＤＮＡ技術を用いて作製された、アミノ酸の挿入、欠失、突然変異、および置換によって、ＤＨＡＤなどの特に列挙される本発明のポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。どのアミノ酸残基が対象となる活性を消滅させることなく置換、付加、または欠失され得るかを決定するためのガイダンスは、特定のポリペプチドと、相同ポリペプチド（例えば、酵母または細菌）との配列を比較し、相同性の高い領域（保存領域）において成されるアミノ酸配列の変化の数を最小限にすることによって、あるいはコンセンサス配列によりアミノ酸を置換することによって見出すことができる。
あるいは、これらの同一または類似のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド変異体は、遺伝コードの「冗長性」を用いることによって、合成または選択され得る。種々の制限部位を生じるサイレント変化などの種々のコドン置換を導入して、発現のためのプラスミドまたはウイルスベクターへのクローニングを最適化することができる。ポリヌクレオチド配列の突然変異はポリペプチドまたはポリペプチドに付加された他のペプチドのドメインに反映され、ポリペプチドの任意の部分の特性を修飾することができる。例えば、突然変異は、標的タンパク質の発現を低減または除去するために使用可能であり、全遺伝子または遺伝子の一部の欠失、タンパク質が発現されないかあるいはより低いレベルで発現されるような遺伝子（プロモーターまたはコード領域のいずれかの）へのＤＮＡ断片の挿入、機能性タンパク質が発現されないような終止コドンまたはフレームシフトを付加するコード領域への突然変異の導入、そして非機能性または酵素活性の低いタンパク質が発現されるようにアミノ酸を改変するためのコード領域への１つまたは複数の突然変異の導入が含まれるが、これらに限定されない。
アミノ酸「置換」は、類似の構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換、すなわち保存的アミノ酸置換の結果であってもよいし、あるいは、異なる構造および／または化学特性を有するアミノ酸による１つのアミノ酸の置換、すなわち非保存的アミノ酸置換の結果であってもよい。「保存的」アミノ酸置換は、関連する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含み、極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含み、正帯電（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含み、そして負帯電（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。あるいは、「非保存的」アミノ酸置換は、これらのアミノ酸のいずれかの極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性における差異を選択することによって行うことができる。「挿入」または「欠失」は、組換えタンパク質により構造的または機能的に許容される変異の範囲内であり得る。可能とされる変異は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ポリペプチド分子においてアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に行い、得られた組換え変異体を活性についてアッセイすることによって、実験的に決定することができる。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを用いるコンピュータ自動化配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同であると推定的に同定するためには、１０以上の近接アミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、配列依存性の遺伝子同定法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離法（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイツハイブリダイゼーション）において、２０〜３０の近接ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用されてもよい。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するために十分な配列を含む。本明細書は、特定のタンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告されるような配列の利益を得て、開示される配列の全てまたは実質的な部分を当業者に既知の目的のためにこれから使用することができる。従って、本発明は、添付の配列表において提供されるような完全な配列と、上記で定義したこれらの配列の実質的な部分とを含む。
「相補的」という用語は、互いにハイブリッド形成することができるヌクレオチド塩基間の関係を表すために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデニンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的であり、そしてＲＮＡに関して、アデニンはウラシルに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。
「同一性パーセント」という用語は、当該技術分野において知られているように、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列の間または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、このような配列のストリング間の一致によって決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）、２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）、３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）、４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）、および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載される方法を含むが、これらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アライメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを用いて実施され得る。配列の多重アライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖと標識されるアライメント法に相当する「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖアライメント法」（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）によって記載される）を含む数種類のアルゴリズムを包含し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムにおいて見出される「Ｃｌｕｓｔａｌアライメント法」を用いて実施される。多重アライメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いるタンパク質配列のペアワイズアライメントおよび同一性パーセントの計算のためのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸については、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを用いた配列のアライメントの後、同じプログラム内の「配列距離」表を見ることによって「同一性パーセント」を得ることが可能である。さらに、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアライメント法」も利用可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗと標識されるアライメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）によって記載される）に相当し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラムにおいて見出される。多重アライメントのためのデフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いた配列のアライメントの後、同じプログラム内の「配列距離」表を見ることによって「同一性パーセント」を得ることが可能である。
他の種からのポリペプチド（ここで、このようなポリペプチドは、同一または類似の機能または活性を有する）の同定において、あるいは対応するポリヌクレオチドの記述において、多数の配列同一性レベルが有用であることは当業者によって十分に理解されている。同一性パーセントの有用な例としては、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５５％〜１００％の任意の整数の百分率が本発明の記述において有用であり得る。適切なポリヌクレオチド断片は上記の相同性を有するだけでなく、通常、少なくとも５０個のヌクレオチド、少なくとも１００個のヌクレオチド、少なくとも１５０個のヌクレオチド、少なくとも２００個のヌクレオチド、または少なくとも２５０個のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。さらに、上記の相同性を有する適切なポリヌクレオチド断片は、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、または少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでもよいし、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、１．）ＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））、３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、４．）ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が含まれ得るが、これらに限定されない。本出願との関連において、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、他に指定されない限り、分析結果が、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、最初の初期化の際にソフトウェアと共に最初にロードされた値またはパラメータの任意のセットを意味するであろう。
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野においてよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」と称する）によって、そしてＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）によって、そしてＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版）（１９８７）によって記載されている。
Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の機能
Ｆｅ−Ｓクラスターを含有するタンパク質の機能は様々である。これらの機能を分類するためのより完全な取り組みの１つは、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｒｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ ｃｌｕｓｔｅｒｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００５．７４：ｐ．２４７−２８１から適合された以下の表において与えられる。
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上記種類のメンバーのうちの１つまたは複数へのＦｅ−Ｓクラスターの負荷の供給および効率の増大は商業的および／または医学的な利益を有し得ると考えられる。当業者によって認識され得る多数の可能性のうち、３つの例が与えられる。１）Ｆｅ−Ｓクラスター含有酵素が発酵産物への経路において使用され、産物への経路において高フラックスを維持するために高レベルで発現される必要がある場合（例えば、イソブタノールへの経路におけるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）。２）Ｆｅ−Ｓクラスター含有酵素が発酵産物への経路において使用され、Ｆｅ−Ｓクラスターが触媒作用中に代謝回転を受ける場合（例えば、グルコースからビオチンへの商業的発酵におけるビオチンシンターゼ）。３）良好な健康のために重要なＦｅ−Ｓクラスター含有タンパク質の正常な濃度が低いような病的状態（例えば、フリードライヒ運動失調症の場合）。
ＤＨＡＤおよびＤＨＡＤアッセイ
ＤＨＡＤは、デヒドラターゼ（より適切にはヒドロリアーゼ）類のＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質である。ＤＨＡＤ酵素をコードする遺伝子は、組換え宿主細胞においてＤＨＡＤ活性の発現を提供するために使用することができる。ＤＨＡＤは、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換および２，３−ジヒドロキシメチルバレレートからα−ケトメチルバレレートへの変換を触媒し、Ｅ．Ｃ．４．２．１．９として分類される。組換え宿主細胞における使用に適したＤＨＡＤのコード配列は、細菌、真菌、または植物源に由来することができる。使用され得るＤＨＡＤは、［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターまたは［２Ｆｅ−２Ｓ］を有することができる。表４ａ、４ｂ、５、および６には、本発明において使用され得る典型的なＤＨＡＤのコード領域およびタンパク質の配列番号が記載されている。記載された特定の配列に対して少なくとも約９５％の同一性を有するタンパク質は単純化のために省略されているが、表４ａ、４ｂ、５、および６に記載されるタンパク質のいずれかに対して少なくとも約９５％の配列同一性を有し、ＤＨＡＤ活性を有するタンパク質（単純化のために省略されたものを含む）は、本明細書において開示されるように使用可能であると理解される。付加的なＤＨＡＤタンパク質およびそのコード化配列は、当業者に周知であるように、公開データベースのＢＬＡＳＴ検索によって同定することができる。通常、本明細書において提供されるものなどの既知のＤＨＡＤ配列による公的に入手可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上記）検索は、本発明の細胞において発現され得るＤＨＡＤおよびそのコード化配列を同定するために使用される。例えば、表３のＤＨＡＤタンパク質のいずれかに対して少なくとも約８０〜８５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８５〜９０％、少なくとも約９０〜９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を有するＤＨＡＤタンパク質は、本発明の細胞において発現され得る。同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ２５０シリーズのデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗアライメント法に基づく。
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付加的な［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤは、２００９年９月２９日に出願された米国特許出願第１２／５６９，６３６号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載される分析を用いて同定することができる。分析は次の通りである：８つの機能的に検証されたＤＨＡＤのアミノ酸配列に基づいてプロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を作成した。プロファイルＨＭＭの適用については記載されている。例えば、Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１−１５３１（１９９４）およびＤｕｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｍａｒｋｏｖ ｃｈａｉｎｓ ａｎｄ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌｓ，”ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照されたい。プロファイルＨＭＭは、試験配列が特定の配列ファミリーに属するかどうかを決定するために使用することができる多重配列アライメントで構築された統計モデルである。同文献参照。プロファイルＨＭＭは、まず従来の配列アライメントツールを用いて機能的に検証された配列のアライメントを作成することによって構築することができる。次に、この配列アライメントを使用して、位置特異的スコアリングシステムを使用する公的に入手可能なソフトウェアプログラム（例えば、ＨＭＭＥＲ）を用いてプロファイルＨＭＭを構築し、入力配列の多重アライメントにおける種々のアミノ酸位置での保存の程度についての情報を得る。より具体的には、式：ｌｏｇ＿＿２（ｐ＿ｘ）／（ｎｕｌｌ＿ｘ）に比例する、「一致」状態（すなわち、一致状態エミッションスコア）または「挿入」状態（すなわち、挿入状態エミッションスコア）にあるアミノ酸残基のスコアが獲得される。同文献参照。この式において、項「ｐ＿ｘ」は、プロファイルＨＭＭによる、アライメント内の特定の位置におけるアミノ酸残基の確率であり、項「ｎｕｌｌ＿ｘ」はＮｕｌｌモデルによる確率である。同文献参照。Ｎｕｌｌモデルは、アミノ酸の分布から誘導されるアミノ酸のそれぞれに対するエミッション確率の予め計算されたセットを有する単純な１つの状態の確率モデルである。同文献参照。「状態」遷移スコアはログオッズパラメータとしても計算され、Ｌｏｇ＿＿２（ｔ＿ｘ）に比例する。同文献参照。この式において、項「ｔ＿ｘ」は、エミッタまたは非エミッタ状態への遷移の確率である。同文献参照。プロファイルＨＭＭを作成するための特定の統計的分析に関するさらなる詳細は、Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１−１５３１（１９９４）およびＤｕｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｍａｒｋｏｖ ｃｈａｉｎｓ ａｎｄ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌｓ，”ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）、ならびに米国特許出願第１２／５６９，６３６号明細書において入手可能である。
プロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）は、ニトロソモナス・ユーロパエア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ）（ＤＮＡ配列番号３０９、タンパク質配列番号３１０）、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３（ＤＮＡ配列番号２９７、タンパク質配列番号２９８）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（ＤＮＡ配列番号１６７、タンパク質配列番号１６８）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＤＮＡ配列番号１６３、配列番号１６４）、ラルストニア・メタリデュランス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）（ＤＮＡ配列番号３４５、タンパク質配列番号３４６）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ＤＮＡ配列番号３４３、タンパク質配列番号３４４）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ配列番号２３１、タンパク質配列番号２３２）からの８つの機能的に検証されたＤＨＡＤのアミノ酸配列に基づいて作成した。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現される場合に、フラボバクテリウム・ジョンソニアエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）（ＤＮＡ配列番号２２９、タンパク質配列番号２３０）からのＤＨＡＤがジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有することを発見し、Ｐｒｏｆｉｌｅを作成するために使用した。プロファイルＨＭＭは、ＨＭＭＥＲ（Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡ）から利用可能であるユーザーガイドに従って、ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージ（プロファイルＨＭＭの背後にある理論は、Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｓ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｋｒｏｇｈ，ａｎｄ Ｇ．Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９８、Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１−１５３１に記載されている）を用いて作成される。ＨＭＭＥＲソフトウェアプログラムの出力は、入力配列を特徴付けるプロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）である。８つのＤＨＡＤタンパク質に対して作成されたプロファイルＨＭＭは、２００９年９月２９日に出願された米国特許出願第１２／５６９，６３６号明細書において、そして表１２において与えられる。
各位置についての表１２の最初の行には、各アミノ酸がその「状態」（一致状態エミッションスコア）にある確率が報告される。第２行目には挿入状態エミッションスコアが報告され、第３行目には状態遷移スコアが報告される。各位置について最高確率が協調される。これらのスコアを「Ｅ値」（期待値）に変換することができ、これは、全く偶然に得ることが期待され得るプロファイルＨＭＭへのヒットまたは一致の数である。プロファイルＨＭＭに対して１０−５よりも小さいＥ値を有するタンパク質の一致は、そのタンパク質がプロファイルＨＭＭを構築するために使用されるシードタンパク質との著しい配列類似性を共有し、そのタンパク質がプロファイルＨＭＭによって表されるファミリーに属することを示す。
１０−５よりも小さいＥ値でプロファイルＨＭＭと一致するタンパク質はどれも、［４Ｆｅ−４Ｓ］ＤＨＡＤ、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤ、アラボネートデヒドラターゼ、およびホスホグルコネートデヒドラターゼを含むＤＨＡＤ関連タンパク質である。実施形態では、プロファイルＨＭＭに一致する配列は、次に、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤの位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システインの存在について分析される。３つの保存システイン全ての存在は、［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを有するタンパク質に特有である。３つの保存システインを有するタンパク質は、アラボネートデヒドラターゼおよび［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤを含む。［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤは、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤまたはアラボネートデヒドラターゼ中に存在することが分かっている特徴的な保存アミノ酸を分析することによって、アラボネートデヒドラターゼと識別することができる。これらの特徴的なアミノ酸は、［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤまたはアラボネートデヒドラターゼ中に、それぞれ以下の位置において存在する（９０％よりも大きい発生率で）：８８アスパラギン対グルタミン酸、１１３非保存対グルタミン酸、１４２アルギニンまたはアスパラギン対非保存、１６５非保存対グリシン、２０８アスパラギン対非保存、４５４ロイシン対非保存、４７７フェニルアラニンまたはチロシン対非保存、および４８７グリシン対非保存。
さらに、本明細書において提供されるＤＨＡＤコード領域の配列は、事実上他の相同体を同定するために使用することができる。このような方法は、当該技術分野においてよく知られており、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離するために使用され得る種々の方法は、２００９年９月２９日に出願された米国特許出願第１２／５６９，６３６号明細書に記載されており、このような方法は参照によって本明細書中に援用される。
異種ＤＨＡＤを発現するように操作された細胞におけるＤＨＡＤ活性の存在は、当該技術分野において既知の方法を用いて確認することができる。一例として、そして本明細書の実施例において実証されるように、細菌ＤＨＡＤを発現するように操作された細胞からの粗抽出物は、ジニトロフェニルヒドラジンを用いる、ＦｌｉｎｔおよびＥｍｐｔａｇｅ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３（８）：３５５８−６４）によって記載されるようなＤＨＡＤアッセイにおいて使用することができる。別の例では、ＤＨＡＤ活性は、内因性ＤＨＡＤ活性を持たない酵母株において、本明細書に開示される方法によって同定可能な異種ＤＨＡＤを発現させることによってアッセイされ得る。ＤＨＡＤ活性が存在する場合、酵母株は分枝鎖アミノ酸の非存在下で増殖し得る。また、ＤＨＡＤ活性は、より間接的な方法、例えば、ＤＨＡＤ活性を必要とする経路の下流産物についてアッセイすることなどによって確認することもできる。経路中間体としてα−ケトイソバレレートまたはα−ケトメチルバレレートを有する産物はどれも、ＤＨＡＤ活性のためのアッセイにおいて測定され得る。このような産物のリストには、バリン、イソロイシン、ロイシン、パントテン酸、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、およびイソブタノールが含まれるが、これらに限定されない。
ＤＨＡＤ活性の過剰発現
本出願人らは、異種ＤＨＡＤの発現は、宿主細胞において発現されるとＤＨＡＤ活性を提供できることを見出した。本明細書に記載されるように同定され得るＤＨＡＤの発現は、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換または２，３−ジヒドロキシメチルバレレートからα−ケトメチルバレレートへの変換を含む生合成経路にＤＨＡＤ活性を提供することができる。さらに、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）［２Ｆｅ−２Ｓ］ＤＨＡＤは、２００９年９月２９日に出願された関連の米国特許出願第１２／５６９，６３６号明細書（参照によって本明細書中に援用される）において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）［４Ｆｅ−４Ｓ］ＤＨＡＤの空気中での感受性と比較してより高い空気中の安定性を有することが示されており、これは、異種宿主細胞においてより良い活性を得るために望ましい。
さらに、本明細書に記載されるように、より高いレベルでの異種ＤＨＡＤタンパク質の発現は、宿主細胞において発現されると増大したＤＨＡＤ活性を提供できることが分かった。組換えポリヌクレオチドの高発現は、少なくとも２つの方法で達成することができる：１）組換えポリヌクレオチドを含むプラスミドのコピー数を増大させることによる、あるいは２）対象の遺伝子の多数コピーを宿主細胞の染色体内に組み込むことによる。本明細書において例示されるように、異種ＤＨＡＤの多数コピーの発現は、異種ＤＨＡＤの比活性の増大を提供する。
組換えポリヌクレオチドは、通常、リボソーム結合部位および終結調節領域と共にコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、形質転換のために使用されるキメラ遺伝子の一部としてコード配列を用いて発現のためにクローン化される。コード領域は形質転換のための宿主細胞に由来し、ＤＨＡＤをコードする天然遺伝子に対して天然でない制御配列と結合されてもよい。あるいは、コード領域は別の宿主細胞に由来してもよい。
様々な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターは一般的であり、文献に記載されている。通常、ベクターは、選択可能なマーカー、ならびに所望の宿主における自己複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。さらに、適切なベクターは、コード領域ＤＮＡ断片が間に挿入され得る転写開始調節および転写終結調節領域を有するプロモーター領域を含むことができ、挿入されたコード領域の発現を提供する。調節領域は両方とも形質転換宿主細胞に相同の遺伝子に由来してもよいが、このような調節領域が、産生宿主として選択される特定の種にとって天然でない遺伝子に由来してもよいことは理解されるはずである。
異種細菌ＤＨＡＤの発現または過剰発現のための宿主であり得る酵母細胞は遺伝子操作を受け入れられる任意の酵母細胞であり、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）を含むが、これらに限定されない。適切な株としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、宿主はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
発現は、ＤＨＡＤ、例えば、表４ａ、４ｂ、５または６に記載されるＤＨＡＤ、または２００９年９月２９日に出願された関連の米国特許出願第１２／５６９，６３６号明細書（参照によって本明細書中に援用される）中のスクリーニング方法を用いて同定されるＤＨＡＤをコードする配列を含む遺伝子で宿主細胞を形質転換することによって達成される。ＤＨＡＤが発現されるためのコード領域は、当業者に良く知られているように、標的宿主細胞に対してコドン最適化され得る。酵母における遺伝子発現のための方法は当該技術分野において知られている（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照されたい）。酵母における遺伝子の発現は、通常、対象のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターおよび転写ターミネーターを必要とする。多数の酵母プロモーターは、酵母において遺伝子のための発現カセットを構築する際に使用することができ、以下の遺伝子に由来するプロモーターが含まれるが、これらに限定されない：ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、ＣＵＰ１、ＦＢＡ、ＧＰＤ、ＧＰＭ、およびＡＯＸ１。適切な転写ターミネーターには、ＦＢＡｔ、ＧＰＤｔ、ＧＰＭｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１、およびＡＤＨ１が含まれるが、これらに限定されない。
適切なプロモーター、転写ターミネーター、およびＤＨＡＤコード領域は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクター内にクローン化され、酵母細胞に形質転換され得る。これらのベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母株の両方における菌株の増殖を可能にする。一実施形態では、使用されるベクターは、選択可能なマーカー、ならびに所望の宿主における自己複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。酵母において使用されるプラスミドの例としては、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、およびｐＲＳ４２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）が挙げられ、これらは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製開始点（例えば、ｐＭＢ１）、酵母２−ミクロン複製開始点、および栄養選択のためのマーカーを含有する。これらの４つのベクターのための選択マーカーは、Ｈｉｓ３（ベクターｐＲＳ４２３）、Ｔｒｐ１（ベクターｐＲＳ４２４）、Ｌｅｕ２（ベクターｐＲＳ４２５）およびＵｒａ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。記載されるＤＨＡＤをコードするキメラ遺伝子を有する発現ベクターの構築は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における標準分子クローニング技術、あるいは酵母におけるギャップ修復組換え法のいずれかによって実施することができる。
ギャップ修復クローニングアプローチは、酵母における高効率の相同組換えを利用する。例えば、酵母ベクターＤＮＡは消化され（例えば、その複数のクローニング部位において）、その配列内に「ギャップ」が形成される。互いに、そしてベクターＤＮＡの５’および３’終端と順次重なる２１ｂｐ以上の配列を５’および３’端部の両方に含有する、対象のいくつかの挿入ＤＮＡが生成される。例えば、「遺伝子Ｘ」のための酵母発現ベクターを構築するために、酵母プロモーターおよび酵母ターミネーターが発現カセットのために選択される。プロモーターおよびターミネーターは酵母ゲノムＤＮＡから増幅され、遺伝子Ｘはそのソース生物からＰＣＲ増幅されるか、あるいは遺伝子Ｘ配列を含むクローニングベクターから得られる。直線化ベクターの５’端部とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Ｘとの間、遺伝子Ｘとターミネーター配列との間、そしてターミネーターと直線化ベクターの３’端部との間には、少なくとも２１ｂｐのオーバーラップ配列が存在する。次に、「ギャップ」ベクターおよび挿入ＤＮＡは酵母株に同時形質転換され、プラスミド上の栄養選択マーカーの相補性を可能にする適切な化合物の混合物を含有する培地にプレーティングされる。正しい挿入断片の組み合わせの存在は、選択された細胞から調製されるプラスミドＤＮＡを用いて、ＰＣＲマッピングにより確認することができる。次に、酵母（通常、低濃度）から単離されたプラスミドＤＮＡを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、例えばＴＯＰ１０に形質転換した後、ミニプレップおよび制限酵素マッピングを行い、プラスミド構築物をさらに検証することができる。最後に、構築物を配列分析によって検証することができる。
ギャップ修復技術と同様に、酵母ゲノムへの組込みも、酵母における相同組換えシステムを利用する。例えば、コード領域と、調節要素（プロモーターおよびターミネーター）および栄養要求性マーカーとを含有するカセットは、このカセットとハイブリッド形成し、挿入が所望されるゲノム領域の領域５’および３’に対して配列相同性を有する４０〜７０の塩基対を含有するプライマーを用いて、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲ増幅される。次に、ＰＣＲ産物は酵母に形質転換され、組み込まれた栄養要求性マーカーの選択を可能にする適切な化合物混合物を含有する培地にプレーティングされる。例えば、「遺伝子Ｘ」を染色体位置「Ｙ」に組み込むために、プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーター構築物がプラスミドＤＮＡ構築物からＰＣＲ増幅され、ＳＯＥ ＰＣＲまたは一般的な制限消化およびクローニングのいずれかによって、独立栄養性マーカー（ＵＲＡ３など）に結合される。プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーター−ＵＲＡ３領域を含有する全カセットは、酵母染色体における位置「Ｙ」の領域５’および３’に対する相同性を有する４０〜７０ｂｐを含有するプライマー配列によりＰＣＲ増幅される。ＰＣＲ産物は酵母に形質転換され、ウラシルが欠けた増殖培地上で選択される。形質転換体は、コロニーＰＣＲまたは染色体ＤＮＡの直接配列決定のいずれかによって検証することができる。
異種ＤＨＡＤを発現させるために使用され得る上記の材料および方法に加えて、これらの同一または類似の材料および方法を使用し、当業者に既知の修正を用いて、異種ＤＨＡＤを過剰発現させることができる。例えば、プラスミドに基づくシステムを用いて組換えポリヌクレオチドを過剰発現させる場合、高コピー数ベクター、または制御可能なコピー数を有するベクターが構築され得る。このような制御可能または誘導可能なシステムは、本明細書中、実施例１において記載されているが、他のシステムも当業者に知られており、他の高コピー数またはコピー数制御可能なベクターを構築するために使用することができる。あるいは、組込みに基づくシステムを用いて組換えポリペプチドを過剰発現させる場合、組込みベクターは、複数の組込み部位を標的にすることが必要である。多重組込みベースのシステムは、本明細書中、実施例２に記載されているが、他の多重組込みベースのシステムも当業者に知られており、組換えポリペプチドの多重組込み（例えば、ｒＤＮＡ領域への組込み）を標的とするために使用することができる。
組換え宿主細胞は、例えば、細胞タンパク質全体のパーセントによって定量化することができる。このような過剰発現は、（ａ）細胞タンパク質全体の約０．００１％よりも多い量、（ｂ）細胞タンパク質全体の約０．０１％よりも多い量、（ｃ）細胞タンパク質全体の約０．１％よりも多い量、（ｄ）細胞タンパク質全体の約０．５％よりも多い量、（ｅ）細胞タンパク質全体の約１．０％よりも多い量、（ｆ）細胞タンパク質全体の約２．０％よりも多い量、（ｇ）細胞タンパク質全体の約５％よりも多い量、（ｈ）細胞タンパク質全体の約１０％よりも多い量、および（ｉ）細胞タンパク質全体の約２０％よりも多い量、からなる群から選択される量で定量化することができる。
組換え宿主細胞において産生される異種ＤＨＡＤの比活性は、例えば、Ｕ／ｍｇで定量化することができる。異種ＤＨＡＤ比活性は、（ａ）約０．２５Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｂ）約０．３Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｃ）約０．５Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｄ）約１．０Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｅ）約１．５Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｆ）約２．０Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｇ）約３．０Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｈ）約４．０Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｉ）約５．０Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｊ）約６．０Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｋ）約７．０Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｌ）約８．０Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｍ）約９．０Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｎ）約１０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい、（ｏ）約２０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい、および（ｐ）約５０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい、からなる群から選択することができる。
また異種ＤＨＡＤ比活性は、例えば、内因性ＤＨＡＤ比活性または何か他の対照ＤＨＡＤ比活性に対するパーセント比較として定量化することもできる。「対照」ＤＨＡＤ比活性の一例は、低コピー数プラスミドまたは他の形で誘導可能または制御可能でないプラスミドを用いて組換え宿主細胞において発現された異種ＤＨＡＤからのものである。このような対照はベースラインを確立し、そこから、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを用いて組換え宿主細胞において発現されるか、あるいは以下に記載されるようにＦｅ−Ｓクラスター生合成またはＦｅ取込みおよび利用に影響を与えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同時発現される、同一の異種ＤＨＡＤの比活性が比較される。従って、対照ＤＨＡＤ比活性と比較したときの異種ＤＨＡＤの比活性の増大は、約１０％よりも大きい増大、約２０％よりも大きい増大、約３０％よりも大きい増大、約４０％よりも大きい増大、約５０％よりも大きい増大、約６０％よりも大きい増大、約７０％よりも大きい増大、約８０％よりも大きい増大、約９０％よりも大きい増大、約９５％よりも大きい増大、約９８％よりも大きい増大、および約９９％よりも大きい増大からなる群から選択される量であり得る。また異種ＤＨＡＤ比活性は、対照と比較した「倍増」によって表現することもできる。従って、比活性の増大は、対照よりも（ａ）約２倍よりも大きい増大、（ｂ）約５倍よりも大きい増大、（ｃ）約８倍よりも大きい増大、または（ｄ）約１０倍よりも大きい増大からなる群から選択することができる。
Ｆｅ−Ｓクラスター形成タンパク質ならびにＦｅ制御、利用、および恒常性
上記のように、ＤＨＡＤ酵素は機能するためにＦｅ−Ｓクラスターを必要とし、従って、これらが機能性形態で発現されるのであれば、Ｆｅ−Ｓクラスターを産生してそれをアポタンパク質に負荷する遺伝機構を有する宿主において発現されなければならない。本明細書中の他の部分に記載されるように、正常な酵母では、ミトコンドリアがＦｅ−Ｓクラスター生合成における重要な役割を果たす。正常な酵母におけるミトコンドリアからサイトゾル内のＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質へのＦｅ−Ｓクラスター前駆体の形成および移動のフラックスは、制限されると考えられる。例えば、ある点を過ぎると、サイトゾルにおける異種ＤＨＡＤのタンパク質の発現のさらなる増大は、対応するＤＨＡＤ活性の増大をもたらさない。理論によって束縛されることは望まないが、これは、上記の条件下で起こるＦｅ−Ｓクラスターに対する要求の増大を細胞が供給できないので、異種ＤＨＡＤの増大量が活性のために必須のＦｅ−Ｓクラスターによって負荷されていないためであると考えられる。本明細書において、酵母細胞は、２つの方法で（別箇にまたは同時期に）遺伝子修飾することができ、これにより、その必須のＦｅ−Ｓクラスターが負荷された、サイトゾルにおいて発現される異種ＤＨＡＤの画分の増大をもたらし得ることが実証されている。１つの方法は、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路遺伝子またはＦｅ取込みおよび利用遺伝子などの、Ｆｅ−Ｓクラスターの形成に関与する酵母遺伝子の発現を修飾することである。他方の方法は、酵母の細胞質におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成またはＦｅ取込みおよび利用に関与する異種遺伝子を発現させることである。
Ｆｅ取込みおよび利用ならびにＦｅ−Ｓクラスター生合成に関与するポリペプチドをコードする酵母遺伝子は、発現の修飾の候補である。実施形態では、修飾は、選択されたＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の機能の増大をもたらす。
一例として、Ａｆｔ１は、鉄レギュロンへの遺伝子の転写活性化因子としての役割を果たすことが分かっている（Ｋｕｍａｎｏｖｉｃｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００８．２８３，ｐ．１０２７６−１０２８６、Ｌｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｉｒｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｇｒｘ３／４ ａｎｄ Ｆｒａ２ ｆｏｒｍ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ａ ［２Ｆｅ−２Ｓ］ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｗｉｔｈ Ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ ａｎｄ Ｈｉｓｔｉｄｙｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９．４８（４０）：ｐ．９５６９−９５８１）。本明細書において例示されるように、Ａｆｔ１トランスロケーションの既知のインヒビターの欠失は、タンパク質のＦｅ−Ｓクラスター負荷の増大をもたらすので、結果として、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の比活性が増大される。従って、理論によって束縛されることは望まないが、Ｆｅレギュロンの特定の遺伝子の発現の変更は、直接的でも、インヒビターの欠失または上方制御によるものであっても、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の負荷および機能を同様に増大し得ると考えられる。例えば、酵母におけるＦｅの利用および恒常性における役割を果たすか、あるいはその一部である遺伝子（Ｆｅレギュロン遺伝子など）は、変更された発現の標的とされ得る。このような遺伝子は当該技術分野において知られており、これらの遺伝子の例は、表７に記載されている（表７のリストは、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｒｏｎ Ｒｅｇｕｌｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ａｆｔ１／Ａｆｔ２ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ｉｒｏｎ−Ｓｕｌｆｕｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００５．２８０（１１）：ｐ．１０１３５−１０１４０、Ｆｏｕｒｙ，Ｆ．ａｎｄ Ｄ．Ｔａｌｉｂｉ，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｒｏｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ａ ｇｅｎｏｍｅ ｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｙｅａｓｔ ｆｒａｔａｘｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１．２７６（１１）：ｐ．７７６２−７７６８、およびＳｈａｋｏｕｒｙ−Ｅｌｉｚｅｈ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｒｏｎ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００４．１５（３）：ｐ．１２３３−１２４３から得られる）。
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その機能と、Ｆｅ取込みおよび利用との関連とに基づいて、表７に開示される遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える候補である。Ｆｅ取込みおよび利用またはＦｅ−Ｓクラスター生合成に関連する付加的な酵母遺伝子は、表８に記載されるものを含む。
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他の宿主細胞からのＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする付加的な遺伝子が同定されており、表９に記載される遺伝子が含まれるが、これらに限
定されない。
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Ｆｅ取込みおよび代謝ならびに／またはＦｅ−Ｓクラスター生合成遺伝子（表７、８または９に記載されるものを含むがこれらに限定されない）は、潜在的に、欠失、突然変異、発現、上方制御、または下方制御されて、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させ、ＤＨＡＤなどのＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の比活性を改善することができる。さらにＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させ、ＤＨＡＤ比活性を改善するために、補助因子を添加して、Ｆｅ−Ｓクラスター制御活性を有するポリペプチドの活性を変化させることができる。
例えば、適切な量のＦｅ−Ｓクラスターをアポ酵素に提供することによって、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させる遺伝子を発現させて、ＤＨＡＤの活性を改善することができる。表７、８、もしくは９に記載される１つまたは複数の遺伝子などの任意の遺伝子、またはこれらの組み合わせは、実施例４に記載されるように、ｐＲＳ４１１プラスミドにおいてクローン化および発現させることができる。得られる構築物は、次に、ＤＨＡＤ発現ベクターｐＨＲ８１ＦＢＡｉｌｖＤ（Ｓｍ）と共に野生型ＢＹ４７４１に形質転換させることができる。対照として、対象となる遺伝子を持たないｐＲＳ４１１およびベクターｐＨＲ８１ＦＢＡｉｌｖＤ（Ｓｍ）が野生型株に形質転換される。形質転換体は、実施例４に記載されるように両方のプラスミドを維持するためにウラシルおよびメチオニンを含まないＳＤ培地を有する寒天板において選択される。形質転換からの種々の菌株の粗抽出物中のＤＨＡＤの酵素活性を測定することができる。結果は、野生型株に形質転換された対象となる遺伝子を持たない対照ｐＲＳ４１１およびベクターｐＨＲ８１ＦＢＡｉｌｖＤ（Ｓｍ）から得られる比活性と比較することができる。比活性の増大は、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるために使用可能な遺伝子を示す。
加えて、Ｆｅ−Ｓクラスターを含有する酵素またはタンパク質の改善における相加効果を提供するために、Ｆｅ−Ｓクラスター制御活性に関与する遺伝子の２つ以上において欠失を有する株を作成することができる。例えば、ＦＲＡ２およびＧＸＲ３遺伝子の両方における欠失を有する二重突然変異体は、ベクターｐＨＲ８１ＦＢＡ−ＩｌｖＤ（ｓｍ）を形質転換するために使用することができ、形質転換体からの粗抽出物中のＤＨＡＤ活性を測定することができる。
別の選択肢は、例えば、Ａｆｔ１ｐの核への移入に関与するタンパク質をコードするＰＳＥ１（配列番号７７７）遺伝子の発現を改変することである（Ｆｕｋｕｎａｋａ，ｅｔ ａｌ，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７８，ｐｐ．５０１２０−５０１２７）。この遺伝子の発現は、上記のようなベクターｐＲＳ４１１内にクローン化することによって達成することができる。
従って、本明細書には、Ｆｅ取込みおよび利用またはＦｅ−Ｓクラスター生合成遺伝子によってコードされる任意のポリペプチドの発現の改変を含む組換え宿主細胞が提供される。上記のＦｅ−Ｓクラスター生合成遺伝子のいずれか１つの少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が包含される。また、宿主細胞が上記のＦｅ取込みおよび利用またはＦｅ−Ｓクラスター生合成遺伝子のいずれか１つの内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む組換え宿主細胞も包含される。また、上記のＦｅ取込みおよび利用またはＦｅ−Ｓクラスター生合成遺伝子のいずれか１つの少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞も提供され、この宿主細胞は、上記のＦｅ取込みおよび利用またはＦｅ−Ｓクラスター生合成遺伝子のいずれか１つの内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む。
またこれらの組換え宿主細胞は、少なくとも１つの異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質を含むこともできる。例えば、本明細書には、少なくとも１つの異種ＤＨＡＤ、およびＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が提供される。また、宿主細胞がＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む、少なくとも１つの異種ＤＨＡＤを含む組換え宿主細胞も提供される。また、少なくとも１つの異種ＤＨＡＤおよび、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞も提供され、この宿主細胞は、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む。
本発明において使用可能な宿主細胞には、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）を含むがこれらに限定されない酵母宿主細胞が含まれる。また細菌宿主細胞も、ＤＨＡＤ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド、およびＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を作製するために使用することができる。例えば、組換えＤＨＡＤ、およびＦｅ−Ｓクラスター形成タンパク質をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子発現要素を含む乳酸菌は、２００９年９月２９日に出願された米国特許出願第１２／５６９，１０３号明細書（参照によって本明細書中に援用される）の主題である。ＤＨＡＤ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドと、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドとを含む本発明の組換え宿主細胞は、２００９年９月２９日に出願された米国特許出願第１２／５６９，１０３号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されるような乳酸菌を含まない。
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、表７、８および９のＦｅ取込みおよび利用またはＦｅ−Ｓクラスター生合成経路遺伝子からなる群から選択することができる。一実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、ＡＲＮ１、ＡＲＮ２、ＡＴＸ１、ＣＣＣ２、ＣＯＴ１、ＥＮＢ１、ＦＥＴ３、ＦＥＴ５、ＦＩＴ１、ＦＩＴ２、ＦＩＴ３、ＦＲＥ１、ＦＲＥ２、ＦＲＥ３、ＦＲＥ４、ＦＲＥ５、ＦＲＥ６、ＦＴＨ１、ＦＴＲ１、ＨＭＸ１、ＳＩＴ１、ＳＭＦ３、ＴＩＳ１１、ＶＨＴ１、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＡＩＭ１、ＡＲＨ１、ＡＴＭ１、ＢＵＤ３２、ＣＡＤ１、ＣＣＣ１、ＣＦＤ１、ＣＩＡ１、ＣＭＫ１、ＣＴＨ１、ＣＴＩ６、ＣＹＣ８、ＤＡＰ１、ＤＲＥ２、ＥＲＶ１、ＥＳＡ１、ＦＥＴ４、ＦＲＡ１、ＦＲＡ２、ＧＥＦ１、ＧＧＣ１、ＧＲＸ１、ＧＲＸ２、ＧＲＸ４、ＧＲＸ５、ＨＤＡ１、ＩＢＡ５７、ＩＳＡ１、ＩＳＡ２、ＩＳＵ１、ＩＳＵ２、ＪＡＣ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ３、ＭＲＳ４、ＭＳＮ５、ＮＡＲ１、ＮＦＳ１、ＮＦＵ１、ＮＨＰ６ａ、ＮＨＰ６ｂ、ＰＳＥ１、ＳＭＦ１、ＳＮＦ１、ＳＮＦ２、ＳＮＦ３、ＳＮＦ４、ＳＳＱ１、ＴＩＭ１２、ＴＵＰ１、ＮＰ＿０１１９１１．１、ＶＰＳ４１、ＹＡＰ５、ＹＦＨ１、ＹＲＡ１、ＺＰＲ１、ｉｓｃＡｎｉｆ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｃｙｓＥ１、ｃｙｓＥ２、ｉｓｃＳ、ｉｓｃＵ、ｉｓｃＡ、ｈｓｃＢ、ｈｓｃＡ、Ｆｄｘ、ｓｕｆＳ、ｓｕｆＥ、ｃｙｓＥ３、ｓｕｆＳ２、ｉｓｃＡ２、Ｎｆｕ、ｎｆｕＡ、ｎｆｕＶ、ｎｆｕ、ｓｕｆＡ、ｓｕｆＢ、ｓｕｆＣ、ｓｕｆＤ、ｓｕｆＥ１、ｓｕｆＳ２、またはｓｕｆＥ２によってコードされる。一実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＰＳＥ１、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、またはＭＳＮ５である。一実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＰＳＥ１、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、ＭＳＮ５、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＰＳＥ１、ＦＲＡ２、ＭＳＮ５、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＰＳＥ１、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、ＭＳＮ５、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、プラスミドを含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＤＨＡＤは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＰＳＥ１、およびこれらの組み合わせと同時発現される。Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、ＡＦＴ１ Ｌ９９Ａ、ＡＦＴ１ Ｌ１０２Ａ、ＡＦＴ１ Ｃ２９１Ｆ、ＡＦＴ１ Ｃ２９３Ｆ、およびこれらの組み合わせなどの構成的突然変異体であってもよいが、これらに限定されない。Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における欠失、突然変異、および／または置換は、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、ＭＳＮ５、およびこれらの組み合わせからなる群から選択することができる。
また本発明は、組換え宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を増大させるための方法も提供し、この方法は、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性が増大される条件下で、発現または活性が変化された組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。このような方法を使用して、内因性Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質、または異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を増大させることができる。このような方法を使用して、本明細書に記載されるかあるいは本明細書に記載される方法によって同定されるＤＨＡＤの比活性を増大させることができる。Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性の増大は、約１０％よりも多い量、約１５％よりも多い量、約２０％よりも多い量、約２５％よりも多い量、約３０％よりも多い量、約３５％よりも多い量、約４０％よりも多い量、約４５％よりも多い量、約５０％よりも多い量、約５５％よりも多い量、約６０％よりも多い量、約６５％よりも多い量、約７０％よりも多い量、約７５％よりも多い量、約８０％よりも多い量、約８５％よりも多い量、約９０％よりも多い量、および約９５％よりも多い量から選択される量であり得る。活性の増大は、約３倍より大きくても、約５倍より大きくても、約８倍より大きくても、または約１０倍より大きくてもよい。実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性は、理論値の少なくとも約６０％、理論値の少なくとも約７０％、理論値の少なくとも約８０％、または理論値の少なくとも約９０％の量であり得る。
また本発明を使用して、宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させること、そして宿主細胞においてＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定することができる。一実施形態では、宿主細胞においてＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるための方法が提供され、この方法は、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質と、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与える少なくとも１つのポリペプチドか、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換のいずれか、またはこれらの両方の組み合わせとを含む組換え宿主細胞を提供するステップと、宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスが増大される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。別の実施形態では、宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法が提供され、この方法は、（ａ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、（ｂ）Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を測定するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定されるＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性と、ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定されるＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性とを比較するステップとを含み、異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性の増大は、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す。このような方法では、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質は、宿主細胞にとって内因性であっても異種性であってもよい。
Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性は、欠失、突然変異、置換、発現、上方制御、下方制御、細胞位置の変更、タンパク質の状態の変更、および／または補因子の付加、およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない当該技術分野において周知の方法によって変化させることができる。タンパク質の状態の改変には、リン酸化またはユビキチン化などの改変が含まれるが、これらに限定されない。選択されるＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質に応じて、本明細書に記載されるかあるいは当該技術分野において既知のあらゆる方法を使用して、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を測定することができる。例えば、ＤＨＡＤがＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質である場合、実施例７に記載されるアッセイを使用して、ＤＨＡＤの活性を測定し、宿主細胞のＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスの増大が存在するかどうかを決定することができる。
イソブタノールおよび他の産物
組換え宿主細胞におけるＤＨＡＤの発現は、本明細書に記載されるように、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換または２，３−ジヒドロキシメチルバレレートからα−ケトメチルバレレートへの変換のためのジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する、形質転換された組換え宿主細胞を提供する。α−ケトイソバレレートまたはα−ケトメチルバレレートを経路中間体として有する産物は、本明細書において開示される所望の異種ＤＨＡＤを有する宿主細胞において、より効果的に産生され得る。このような産物のリストには、バリン、イソロイシン、ロイシン、パントテン酸、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、およびイソブタノールが含まれるが、これらに限定されない。
例えば、酵母におけるバリンの生合成は、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（ＩＬＶ５）によるアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシ−イソバレレートへの変換ステップと、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼによる２，３−ジヒドロキシ−イソバレレートからα−ケトイソバレレート（２−ケトイソバレレートとも呼ばれる）への変換ステップと、分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ２）および分枝鎖アニモ（ａｎｉｍｏ）酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＴ１）によるα−ケトイソバレレートからバリンへの変換ステップとを含む。ロイシンの生合成は、α−ケトイソバレレートまでの同じステップと、その後の、アルファ−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＬＥＵ９、ＬＥＵ４）によるα−ケトイソバレレートからアルファ−イソプロピルマレートへの変換ステップと、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（ＬＥＵ１）によるアルファ−イソプロピルマレートからベータ−イソプロピルマレートへの換ステップと、ベータ−ＩＰＭデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）によるベータ−イソプロピルマレートからアルファ−ケトイソカプロエートへの変換ステップと、最後に、分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ２）および分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＴ１）によるアルファ−ケトイソカプロエートからロイシンへの変換ステップとを含む。細菌経路も同様であるが、異なる名称のタンパク質および遺伝子を含む。２，３−ジヒドロキシ−イソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換の増大は、特に、経路の１つまたは複数の付加的な酵素が過剰発現される場合に、これらの経路への流入を増大させるであろう。従って、バリンまたはロイシンの産生は、本明細書に開示される菌株を使用することが所望される。
パントテン酸の生合成は、ＤＨＡＤによって実施されるステップと、ケトパントイン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼおよびパントテン酸シンターゼによって実施されるステップとを含む。微生物におけるパントテン酸生合成の産生の増強のためのこれらの酵素の発現の操作は、米国特許第６，１７７，２６４号明細書に記載されている。
ＤＨＡＤのα−ケトイソバレレート産物は、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書に開示されるイソブタノール生合成経路における中間体である。開示されるイソブタノール生合成経路の図は、図５に提供される。本明細書に開示される菌株におけるイソブタノールの産生は、ＤＨＡＤ活性の増大から利益を得ることができる。本明細書に開示されるように、ＤＨＡＤ活性の増大は、宿主細胞におけるＤＨＡＤの発現によって、例えば、ＤＨＡＤの過剰発現によって、Ｆｅ−Ｓクラスター制御活性を有するポリペプチドの発現または活性の調節によって、あるいはＤＨＡＤの発現およびＦｅ−Ｓクラスター制御活性を有するポリペプチドの発現または活性の調節の両方の組み合わせによって提供される。参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書に記載されるように、例となるイソブタノール生合成経路のステップは、
− 例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒されるような、ピルベートからアセトラクテートへの変換（図５の経路ステップａを参照）と、
− 例えば、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼによって触媒されるような、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換（図５の経路ステップｂを参照）と、
− 例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）とも呼ばれるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されるような、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換（図５の経路ステップｃを参照）と、
− 例えば、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されるような、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換（図５の経路ステップｄを参照）と、
− 例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されるような、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換（図５の経路ステップｅを参照）と
を含む。
代替の経路のステップｆ、ｇ、ｈ、Ｉ、ｊ、およびｋについては、産物変換の基質、およびこれらの反応に関与する酵素は、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書に記載される。
本明細書に開示されるＤＨＡＤ以外の上記で指名された経路ステップ酵素の発現、および付加的なイソブタノール経路の発現のために使用可能な遺伝子は、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書に記載される。使用可能な付加的な遺伝子は、バイオインフォマティクスを通して、あるいは参照によって本明細書中に援用される２００９年９月２９日に出願された米国特許出願第１２／５６９，６３６号明細書に記載される種々の方法などの当該技術分野において周知の方法を用いて、相同体を単離することによって、当業者により同定され得る。適切なケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素は、米国特許出願公開第２００８０２６１２３０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９０１６３３７６号明細書、米国特許出願公開第２０１００１９７５１９号明細書、および米国特許出願第１２／８９３０７７号明細書（全て、参照によって本明細書中に援用される）に開示されている。これらにおいて開示されるＫＡＲＩの例としては、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１、およびシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５からのものが挙げられる。参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書および米国仮特許出願第６１／２９０，６３６号明細書には、適切なアルコールデヒドロゲナーゼが記載されている。
さらに、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書には、開示される生合成経路を用いるイソブタノール産生のために、キメラ遺伝子の構築、ならびに細菌および酵母の遺伝子操作が記載されている。
付加的な修飾
本明細書において提供される細胞において有用であり得る付加的な修飾の例としては、米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されるような、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減するための修飾、および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子における破壊、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する制御要素をコードする少なくとも１つの遺伝子における破壊と、米国特許出願公開第２０１００１２０１０５号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されるような、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路による炭素フラックスの増大または還元当量バランス（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ ｂａｌａｎｃｅ）を提供する宿主細胞への修飾とが挙げられる。その他の修飾としては、米国仮特許出願第６１／３８０５６３号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されるピルベート利用生合成経路におけるステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの組込みが挙げられる。適切であり得る付加的な修飾は、米国特許出願第１２／８９３０８９号明細書に記載される。さらに、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、およびホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、米国仮特許出願第６１／３５６３７９号明細書に記載されている。
産生のための増殖
本明細書に開示される組換え宿主細胞は、適切な炭素基質を含有する発酵培地中で増殖される。適切な炭素基質は、グルコースやフルクトースなどの単糖、ラクトース、マルトース、ガラクトース、もしくはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンもしくはセルロースなどの多糖類、またはこれらの混合物と、チーズ乳清透過物、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖蜜、および大麦モルトなどの再生可能な原料からの未精製混合物とを含むことができるが、これらに限定されない。その他の炭素基質としては、エタノール、ラクテート、スクシネート、またはグリセロールが挙げられる。
さらに、炭素基質は、重要な生化学的中間体への代謝的変換が実証されている二酸化炭素、またはメタノールなどの一炭素基質であってもよい。エタノールなどの二炭素基質も適切であり得る。一および二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物は、代謝活性のためにメチルアミン、グルコサミンおよび様々なアミノ酸などの多数の他の炭素含有化合物も利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母はメチルアミンからの炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３），４１５−３２，Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、様々なカンジダ種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝するであろう（Ｓｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９（１９９０））。従って、本発明において利用される炭素源は様々な種類の炭素含有基質を包含することができ、生物の選択によってのみ制限され得ることが意図される。
上記の炭素基質およびその混合物は全て本発明において適切であることが意図されるが、いくつかの実施形態では、炭素基質は、グルコース、フルクトース、およびスクロースであるか、あるいはＣ５糖を使用するように修飾された酵母細胞についてはこれらとキシロースおよび／またはアラビノースなどのＣ５糖との混合物である。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、およびこれらの混合物などの再生可能な糖源に由来し得る。グルコースおよびデキストロースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびこれらの混合物などの穀類を含むデンプンベースの原料の糖化による再生可能な穀類源に由来し得る。さらに、発酵性の糖は、例えば、参照によって本明細書中に援用される共同所有および同時係属中の米国特許出願公開第２００７００３１９１８Ａ１号明細書に記載されるような前処理および糖化プロセスにより再生可能なセルロースまたはリグノセルロース系バイオマスに由来し得る。バイオマスは任意のセルロースまたはリグノセルロース系材料を指し、セルロースと、場合によりさらに、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および／または単糖とを含む材料が含まれる。またバイオマスは、タンパク質および／または脂質などの付加的な成分も含み得る。バイオマスは単一のソースに由来してもよいし、あるいはバイオマスは２つ以上のソースに由来する混合物を含むこともでき、例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびトウモロコシ茎葉の混合物、または草および葉の混合物を含むことができる。バイオマスには、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業からのスラッジ、庭の廃棄物、木材および林業廃棄物が含まれるが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、作物残渣、例えばトウモロコシ皮、トウモロコシ茎葉、草、小麦、小麦わら、大麦、大麦わら、干し草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、大豆、穀粒の製粉から得られる成分、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、灌木および低木、野菜、果実、花、動物性肥料、並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
適切な炭素源に加えて、増殖培地には、適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液、ならびに培養物の増殖と、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質（例えば、ＤＨＡＤなど）を含む酵素経路の促進とに適した当業者に既知の他の成分が含有されなければならない。
培養条件
通常、細胞は、適切な培地中、約２０℃〜約４０℃の範囲の温度で増殖される。本発明における適切な増殖培地は、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ Ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス、または酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム、およびデキストロース（炭素／エネルギー源として）を含むブロス、またはＹＰＤ培地（ほとんどのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を増殖させるために最適な割合のペプトン、酵母抽出物、およびデキストロースのブレンド）などの一般的な市販の培地である。その他の定義された増殖培地または合成増殖培地も使用することができ、特定の微生物の増殖のための適切な培地は、微生物学または発酵科学の当業者には分かるであろう。異化産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている薬剤、例えば環状アデノシン２’：３’−一リン酸塩の使用も増殖培地中に組み込むことができる。
増殖のために適切なｐＨ範囲は、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ９．０の間である。一実施形態では、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０が初期条件として使用される。酵母の発酵のために適切なｐＨ範囲は、通常、約ｐＨ３．０〜約９．０の間である。一実施形態では、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８．０が初期条件として使用される。他の微生物の発酵のために適切なｐＨ範囲は、約ｐＨ３．０〜約ｐＨ７．５の間である。一実施形態では、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ６．５が初期条件として使用される。
増殖は、好気条件または嫌気条件下で実施することができる。一実施形態では、増殖のために嫌気条件または微好気条件が使用される。
工業的バッチおよび連続発酵
イソブタノールまたは他の産物は、バッチ発酵方法を用いて産生することができる。古典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、培地の組成は発酵の最初に設定され、発酵は人為的な変更を受けない。標準的なバッチ系の変化形は、流加系である。流加発酵プロセスも本発明において適切であり、発酵が進行するにつれて基質が徐々に添加される点以外は典型的なバッチ系を含む。流加系は、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合、および培地中の基質の量が制限されることが望ましい場合に有用である。バッチ発酵および流加発酵は一般的であり、当該技術分野においてよく知られており、その例は、Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．，ｏｒ Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７，（１９９２）（参照によって本明細書中に援用される）において見出すことができる。
イソブタノールまたは他の産物は、連続発酵法を用いて産生することもできる。連続発酵は開放系であり、定義された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、処理のために同時に等量の条件培地が除去される。連続発酵は、一般に、細胞が主に対数増殖期にあるときに、培養物を一定の高い密度に維持する。連続発酵は、細胞増殖または最終産物濃度に影響を与える１つの因子または任意の数の因子の調節を可能にする。連続発酵プロセスのための栄養物および成長因子の調節方法、ならびに産物形成速度を最大にするための技術は工業微生物学の分野でよく知られており、様々な方法が上記のＢｒｏｃｋによって詳述されている。
イソブタノールまたは他の産物の産生はバッチ、流加または連続プロセスを用いて実施可能であり、任意の既知の発酵モードが適切であり得ることが意図される。さらに、細胞は全細胞触媒として基質上に固定化可能であり、イソブタノール産生のための発酵条件にさらされることが意図される。
発酵培地からのイソブタノールの単離方法
バイオ産生されたイソブタノールは、ＡＢＥ発酵のための当該技術分野において既知の方法を用いて、発酵培地から単離することができる（例えば、Ｄｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８（１９９８），Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５（１９９２）、およびその中の参考文献を参照）。例えば、固体は、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどによって発酵培地から除去され得る。次に、イソブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、またはパーベーパレイションなどの方法を用いて発酵培地から単離され得る。
イソブタノールは水と低沸点の共沸混合物を形成するので、蒸留を用いて、混合物をその共沸組成まで分離することができる。蒸留は、共沸混合物付近の分離を得るために、別の分離方法と組み合わせて使用することができる。ブタノールを単離および精製するために蒸留と組み合わせて使用することができる方法には、デカンテーション、液液抽出、吸着、および膜ベースの技術が含まれるがこれらに限定されない。さらに、ブタノールは、共沸剤を用いた共沸蒸留を用いて単離され得る（例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｍａｌｏｎｅ，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１を参照）。
ブタノール−水混合物は不均一な共沸混合物を形成するので、イソブタノールを単離および精製するために、蒸留は、デカンテーションと組み合わせて使用され得る。この方法では、イソブタノール含有発酵ブロスは、共沸組成近くまで蒸留される。次に、共沸混合物は濃縮され、デカンテーションによって発酵培地からイソブタノールが分離される。デカントされた水相は、還流として第１の蒸留塔に戻すことができる。デカントされたイソブタノールが豊富な有機相は、第２の蒸留塔において、蒸留によりさらに精製され得る。
またイソブタノールは、蒸留と組み合わせて液液抽出を用いて発酵培地から単離することもできる。この方法では、イソブタノールは、適切な溶媒による液液抽出を用いて発酵ブロスから抽出される。次に、イソブタノール含有有機相は、ブタノールを溶媒から分離するために蒸留される。
蒸留を吸着と組み合わせて使用して、発酵培地からイソブタノールを単離することもできる。この方法では、イソブタノールを含有する発酵ブロスは共沸組成近くまで蒸留され、次に、モレキュラーシーブなどの吸着剤の使用により残存する水が除去される（Ａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ Ｂｉｏｍａｓｓ ｔｏ Ｅｔｈａｎｏｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉｌｕｔｅ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｃｏｒｎ Ｓｔｏｖｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔ ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｎｅ ２００２）。
さらに、蒸留をパーベーパレイションと組み合わせて使用して、発酵培地からイソブタノールを単離および精製することもできる。この方法では、イソブタノールを含有する発酵ブロスは共沸組成近くまで蒸留され、次に、親水性膜を通るパーベーパレイションによって残存する水が除去される（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５，１９９−２１０（２００４））。
本発明の実施形態
実施形態１（Ｅ１）． ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む。
Ｅ２． ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチは、組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている。
Ｅ３． ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞は、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む。
Ｅ４． ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドと、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞。
Ｅ５． 実施形態Ｅ３〜Ｅ４のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、表８および表９中の遺伝子からなる群から選択される。
Ｅ６． 実施形態Ｅ３〜Ｅ４のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、表７の遺伝子からなる群から選択される。
Ｅ７． 実施形態Ｅ５またはＥ６の組換え宿主細胞であって、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＰＳＥ１、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、ＭＳＮ５、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
Ｅ８． 実施形態Ｅ７の組換え宿主細胞であって、前記ポリペプチドは、構成的突然変異体であるポリヌクレオチドによってコードされる。
Ｅ９． 実施形態Ｅ８の組換え宿主細胞であって、前記構成的突然変異体は、ＡＦＴ１Ｌ９９Ａ、ＡＦＴ１Ｌ１０２Ａ、ＡＦＴ１Ｃ２９１Ｆ、ＡＦＴ１Ｃ２９３Ｆ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
Ｅ１０． 実施形態Ｅ７の組換え宿主細胞であって、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含むポリヌクレオチドによってコードされる。
Ｅ１１． 実施形態Ｅ７の組換え宿主細胞であって、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされる。
Ｅ１２． 実施形態Ｅ３の組換え宿主細胞であって、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換は、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、ＭＳＮ５、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
Ｅ１３． 実施形態Ｅ４の組換え宿主細胞であって、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＰＳＥ１、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
Ｅ１４． 実施形態Ｅ３〜Ｅ１３のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、多数コピーで発現される。
Ｅ１５． 実施形態Ｅ１４の組換え宿主細胞であって、前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む。
Ｅ１６． 実施形態Ｅ１４の組換え宿主細胞であって、前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている。
Ｅ１７． 実施形態Ｅ３〜Ｅ１６のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成は、内因性Ｆｅ−Ｓクラスター生合成を有する組換え宿主細胞と比較して増大される。
Ｅ１８． 実施形態Ｅ１〜Ｅ１７のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞は、酵母宿主細胞である。
Ｅ１９． 実施形態Ｅ１８の組換え宿主細胞であって、前記酵母宿主細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される。
Ｅ２０． 実施形態Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される。
Ｅ２１． 実施形態Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、１０−５よりも小さいＥ値で表１２のプロファイルＨＭＭと一致するアミノ酸配列を有し、ここでポリペプチドはさらに、配列番号１６８に相当するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列における位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システイン全てを含む。
Ｅ２２． 実施形態Ｅ１〜Ｅ２１のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、配列番号１６８または配列番号２３２に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
Ｅ２３． 実施形態Ｅ１〜Ｅ２２のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは：
ａ． ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約５倍よりも大きい比活性、
ｂ． ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約８倍よりも大きい比活性、および
ｃ． ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約１０倍よりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する。
Ｅ２４． 実施形態Ｅ１〜Ｅ２２のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは：
ａ．約０．２５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｂ．約０．３Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｃ．約０．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｄ．約１．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｅ．約１．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｆ．約２．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｇ．約３．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｈ．約４．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｉ．約５．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｊ．約６．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｋ．約７．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｌ．約８．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｍ．約９．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｎ．約１０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
ｏ．約２０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、および
ｐ．約５０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性
からなる群から選択される比活性を有する。
Ｅ２５． 実施形態Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、イソブタノールを産生する。
Ｅ２６． 実施形態Ｅ２５の組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、イソブタノール生合成経路を含む。
Ｅ２７． 産物を製造する方法であって、
ａ． 実施形態Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか１つの組換え宿主細胞を提供するステップと、
ｂ． 前記産物が産生される条件下、発酵培地中で（ａ）の組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
を含み、この産物は、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせらなる群から選択される。
Ｅ２８． イソブタノールを製造する方法であって、
ａ． 実施形態Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか１つの組換え宿主細胞を提供するステップと、
ｂ． イソブタノールが産生される条件下、発酵培地中で（ａ）の組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
を含む。
Ｅ２９． ２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換方法であって、
ａ． 実施形態Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか１つの組換え宿主を提供するステップと、
ｂ． ２，３−ジヒドロキシイソバレレートがα−ケトイソバレレートに変換される条件下で（ａ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップと
を含み、２，３−ジヒドロキシイソバレレートはα−ケトイソバレレートに変換される。
Ｅ３０． 組換え宿主細胞においてジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドの比活性を増大させるための方法であって、
ａ． 実施形態Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか１つの組換え宿主細胞を提供するステップと、
ｂ． ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドを持たない同一の宿主細胞よりも大きい比活性を有する機能性形態で発現される条件下で（ａ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップと
を含む。
Ｅ３１． 宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるための方法であって、
ａ． 実施形態Ｅ３〜Ｅ２４のいずれか１つの組換え宿主細胞を提供するステップと、
ｂ． 宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスが増大される条件下で（ａ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップと
を含む。
Ｅ３２． 組換え宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を増大させる方法であって、
ａ． Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、
ｂ． 前記宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、
ｃ． Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性が増大される条件下で（ｂ）の組換え宿主細胞を増殖させるステップと、
を含む。
Ｅ３３． 実施形態Ｅ３２の方法であって、前記活性の増大は：
ａ．約１０％よりも多い量、
ｂ．約２０％よりも多い量、
ｃ．約３０％よりも多い量、
ｄ．約４０％よりも多い量、
ｅ．約５０％よりも多い量、
ｆ．約６０％よりも多い量、
ｇ．約７０％よりも多い量、
ｈ．約８０％よりも多い量、
ｉ．約９０％よりも多い量、および
ｊ．約９５％よりも多い量
からなる群から選択される量である。
Ｅ３４． 実施形態Ｅ３２の方法であって、前記活性の増大は：
ａ．約５倍よりも多い量、
ｂ．約８倍よりも多い量、
ｃ．約１０倍よりも多い量、
からなる群から選択される量である。
Ｅ３５． 宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法であって、
ａ． Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、
ｂ． 異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を測定するステップと、
ｃ． ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定される異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性と、ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定される異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性とを比較するステップと
を含み、異種Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性の増大は、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す。
Ｅ３６． 宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法であって、
ａ． Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、
ｂ． ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性を測定するステップと、
ｃ． ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性と、ステップ（ａ）のポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性とを比較するステップと
を含み、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性の増大は、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す。
Ｅ３７． 実施形態Ｅ３０〜Ｅ３６のいずれか１つの方法であって、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性の変化は、欠失、突然変異、置換、発現、上方制御、下方制御、細胞位置の変更、タンパク質の状態の変更、および／または補因子の付加を含む。
Ｅ３８． 実施形態Ｅ３２〜Ｅ３７のいずれか１つの方法であって、Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質はジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有し、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質は、１０−５よりも小さいＥ値で表１２のプロファイルＨＭＭと一致するアミノ酸配列を有し、ここでポリペプチドはさらに、配列番号１６８に相当するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列における位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システイン全てを含む。
Ｅ３９． 実施形態Ｅ３２〜Ｅ３８のいずれか１つの方法であって、前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、表７、８および９の遺伝子からなる群から選択される。
Ｅ４０． 実施形態Ｅ３５〜Ｅ３７のいずれか１つの方法によって同定されたポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
Ｅ４１． 実施形態Ｅ４０の組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞はさらに、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む。
Ｅ４２． 実施形態Ｅ４１の組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、多数コピーで発現される。
Ｅ４３． 実施形態Ｅ４１の組換え宿主細胞であって、前記異種ポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む。
Ｅ４４． 実施形態Ｅ４１の組換え宿主細胞であって、前記異種ポリヌクレオチドは、組換え宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている。
Ｅ４５． 実施形態Ｅ３５またはＥ３６の方法であって、前記宿主細胞は、酵母宿主細胞である。
Ｅ４６． 実施形態Ｅ４５の方法であって、前記酵母宿主細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される。
Ｅ４７． 実施形態Ｅ２８〜Ｅ３９のいずれか１つの方法であって、前記宿主細胞は、酵母宿主細胞である。
Ｅ４８． 実施形態Ｅ４７の方法であって、前記酵母宿主細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される。
Ｅ４９． 実施形態Ｅ４０〜Ｅ４４のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、酵母宿主細胞である。
Ｅ５０． 実施形態Ｅ４９の組換え宿主細胞であって、前記酵母宿主細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される。
Ｅ５１． 実施形態Ｅ４０〜Ｅ４４またはＥ４９〜Ｅ５０のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される。
Ｅ５２． 実施形態Ｅ４０〜Ｅ４４またはＥ４９〜Ｅ５０のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、１０−５よりも小さいＥ値で表１２のプロファイルＨＭＭと一致するアミノ酸配列を有し、ここでポリペプチドはさらに、配列番号１６８に相当するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列における位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システイン全てを含む。
Ｅ５３． 実施形態Ｅ４０〜Ｅ４４またはＥ４９〜Ｅ５０のいずれか１つの組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される産物を産生する。
Ｅ５４． 実施形態Ｅ５３の組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、イソブタノールを産生する。
Ｅ５５． 実施形態Ｅ５４の組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、イソブタノール生合成経路を含む。
略語の意味は次の通りである：「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」ミリグラムを意味し、「ｒｐｍ」は１分当たりの回転数を意味し、「ｗ／ｖ」は重量／体積を意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、そして「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学濃度を意味する。
一般的な方法
実施例において使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９によって、Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８４によって、そして，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８７によって記載されている。
細菌培養物の維持および増殖に適した材料および方法も当該技術分野において周知である。以下の実施例において使用するために適切な技術は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ ａｎｄ Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．，１９９４において、あるいは、Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９８９によって見出すことができる。細菌細胞の増殖および維持のために使用される試薬、制限酵素および材料は全て、他に指定されない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
実施例１．酵母サイトゾルにおいてプラスミドに基づく系を用いたＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からのｉｌｖＤ遺伝子によりコードされるＤＨＡＤタンパク質の過剰発現
組換えポリヌクレオチドの過剰発現は、組換えポリヌクレオチドを含むプラスミドのコピー数を増大させることによって達成することができる。酵母においてＤＨＡＤタンパク質を過剰発現させるために、誘導性ベクターを構築した。ｐＨＲ８１ベクターは、Ｕｒａ３マーカーと、欠損プロモーターを有するＬＥＵマーカーとを含有する（参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書を参照）。酵母合成ドロップアウト（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｄｒｏｐｏｕｔ）（ＳＤ、完全最小培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｍｅｄｉａ）としても知られている、Ｔｅｋｎｏｖａ）増殖培地がＳＤマイナスウラシルからＳＤマイナスロイシンに切り替えられると、ｐＨＲ８１プラスミドのコピー数が増大し、はるかにより高いレベルの組換えポリヌクレオチドの発現が得られる。ｐＨＲ８１ベクター骨格はｐＬＨ４７２ＪＥＧ４ｙ（配列番号９２１）に由来し、ｐＬＨ４７２ＪＥＧ４ｙベクターをＳｐｅＩおよびＳａｃＩＩによりを消化することによって作製した。
ＤＨＡＤタンパク質の過剰発現のために、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からのＤＨＡＤ遺伝子ｉｌｖＤ（配列番号１６７）を使用した（参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００９−０３０５３６３Ａ１号明細書を参照）。この遺伝子は、ベクターｐＲＳ４２３ＦＢＡ ｉｌｖＤＳｔｒｅｐ−ｌｕｍｉｏ中にＦＢＡプロモーターの調節下でクローン化されている（参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００９−０３０５３６３Ａ１号明細書を参照）。ＦＢＡプロモーター、ｉｌｖＤ遺伝子、およびＦＢＡターミネーターカセットを含有する領域を、ＦＢＡｐ−Ｆ（ＮｈｅＩ）およびＦＢＡｔ−Ｒ（ＳａｃＩＩ）（配列番号９１５および９１６）プライマーセットにより増幅して、ｐＨＲ８１ベクターにクローン化した。得られた発現ベクターをｐＨＲ８１ＦＢＡ−ＩｌｖＤ（Ｓｍ）と命名した（配列番号９１７、図１Ａ）。
Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤタンパク質を過剰発現させるために、発現ベクターｐＨＲ８１ＦＢＡ−ＩｌｖＤ（Ｓｍ）を野生型酵母株ＢＹ４７４１に形質転換した。ＳＤマイナスウラシルを有する寒天板において形質転換体を選択した。過剰発現のために、最初にＳＤ液体培地マイナスウラシル中、３０℃でプラスミドを含有する酵母株を増殖させた。次に、新鮮な一晩培養物（５ｍｌ）を、７５ｍｌのＳＤ培地マイナスロイシンを含有する１２５ｍｌのフラスコに移した。対照として、別の５ｍｌの新鮮な一晩培養物を、７５ｍｌのＳＤマイナスウラシルを含有するフラスコに移した。遠心分離によって回収する前に、培養物を一晩インキュベートした。実施例７に記載されるアッセイを用いて、これらのサンプル中の粗抽出物中のＤＨＡＤ活性を測定した。
ＳＤマイナスウラシル中で増殖された対照サンプルの粗抽出物中で得られたＤＨＡＤ比活性は、０．２〜０．３Ｕｍｇ−１の範囲であった。しかしながら、ＳＤ培地マイナスロイシン中で増殖された菌株から得られた平均比活性は１．６Ｕｍｇ−１であり、対照サンプルからの活性よりもはるかに高かった（約５〜８倍高い）。ＤＨＡＤはその機能のためにＦｅ−Ｓクラスターを必要とし、天然酵母Ｆｅ−Ｓクラスター生合成経路が酵母サイトゾル中で過剰発現されたＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質を受け入れられるかどうかはこれまでわかっていなかった。非誘導性の低コピー数ベクターを用いるこれまでのスクリーニング実験では、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からのＤＨＡＤは酵母サイトゾル中で組換え発現可能であり、粗抽出物中、比活性は０．１〜０．２Ｕｍｇ−１の範囲であった（参照によって本明細書中に援用される２００９年９月２９日に出願された米国特許出願第１２／５６９，６３６号明細書を参照）。従って、一実施形態では、高コピー数ベクターを用いて酵母においてＤＨＡＤなどのＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質を過剰発現させると比活性の増大が提供され、比活性は、少なくとも約５倍〜少なくとも約８倍増大される。
実施例２．染色体組込みによるＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からのｉｌｖＤ遺伝子によってコードされるＤＨＡＤタンパク質の過剰発現
酵母における遺伝子の発現を増大させるための代替の方法は、対象となる遺伝子の多数コピーを宿主細胞の染色体に組み込むことである。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からのｉｌｖＤ遺伝子（配列番号１６７）を酵母染色体に組み込むために、組込みベクターｐＺＫ−Ｄｅｌｔａ（ｓ）−Ｌｅｕ２−ＦＢＡ−ｉｌｖＤ（Ｓｍ）−ＦＢＡｔ（配列番号９１８、図１Ｂ）を構築した。組込みベクター骨格は、ｐＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に由来した。ｉｌｖＤ遺伝子が酵母デルタ配列（補体ストランドのヌクレオチド１１８〜２６７および５０６１〜５７６０）に隣接され得るように、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ｉｌｖＤ遺伝子（補体ストランドのヌクレオチド１３０６〜３０１８）を、ＦＢＡプロモーター（補体ストランドのヌクレオチド３０２６〜４０２３）の調節下で組込みベクターにクローン化した。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、２００を超える酵母デルタ配列を含有する（Ｋｉｍ Ｊ ｍ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１９９８；８：４６４−４７８）。これらのデルタ配列は、多数の組込みの標的である。また組込みベクターを、多数の組込み事象を有する形質転換株の選択のために欠損ＬＥＵ２マーカー（補体ストランドのヌクレオチド４１００〜５１９１）を含有するように操作した。
組込みのために、ＡｓｃＩおよびＡａｔＩＩ消化によりベクターＤＮＡを直線化して、ｉｌｖＤ遺伝子を含むベクターＤＮＡのデルタ配列隣接ストランドを生成し、これを次に、酵母株ＢＹ４７４１に形質転換した。ＳＤ寒天培地マイナスロイシンにおいて形質転換体を選択した。次に、ＳＤ液体培地マイナスロイシンにおいて３０℃で、これらの形質転換体を増殖させ、培養物を回収し、ＤＨＡＤ活性について分析した。粗抽出物中で得られたＤＨＡＤの比活性は、０．７〜１．２Ｕｍｇ−１の範囲であった。この比活性は、過剰発現のないｉｌｖＤ遺伝子含有プラスミドで形質転換されたＢＹ４７４１株において見出される非活性よりも約３〜６倍高かった。
実施例３．酵母欠失株におけるＤＨＡＤの比活性の改善
実施例１および２に記載される過剰発現株は高レベルの活性を有したが、発現されるＤＨＡＤタンパク質のすべてが活性とは限らなかった。例えば、過剰発現ＤＨＡＤタンパク質は細胞タンパク質全体の約５〜１０％を占め、約０．７〜１．６Ｕｍｇ−１の非活性をもたらした。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からの精製ＤＨＡＤ酵素の比活性が１００Ｕｍｇ−１であるとすると、細胞タンパク質全体の１０％でのＤＨＡＤの発現は、５〜１０Ｕｍｇ−１以上の比活性をもたらすことが期待される。１つの理論によって束縛されることを望まないが、期待される比活性と実測される比活性との間の差は、おそらく、不十分なＦｅ−Ｓクラスター負荷の結果であった。従って、過剰発現株のさらなる操作によりＦｅ−Ｓクラスター負荷を増大させることを用いて、ＤＨＡＤの比活性を増大させることができる。
比活性を改善するために、鉄代謝およびＦｅ−Ｓクラスター感知に関与する遺伝子の欠失を有する酵母株を用いて、ＤＨＡＤ比活性に対するこれらの効果を調べた。これらの菌株（ＢＹ４７４１バックグラウンド）はＯｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から購入したものであり、表１０に記載される。実施例１に記載されるように、高コピー数プラスミドｐＨＲ８１ＦＢＡ−ＩｌｖＤ（Ｓｍ）をこれらの菌株に形質転換し、増殖培地をＳＤマイナスロイシンに変えることによってＤＨＡＤ過剰発現を誘導した。培養物からの粗抽出物を調製し、ＤＨＡＤ活性についてアッセイした。結果は表１０に示される。
Figure 0005950830
驚くことに、ＦＲＡ２またはＧＲＸ３遺伝子のいずれかの欠失を有する株における粗抽出物中のＤＨＡＤ比活性は２〜３倍増大した。試験した欠失の多くはＤＨＡＤ比活性を増大させなかったので、これは予想外であった。酵母におけるサイトゾルの鉄硫黄構築（ＣＩＡ）機構は、イソプロピルマレートイソメラーゼ（Ｌｅｕ１）などのサイトゾルタンパク質のためのＦｅ−Ｓクラスターの構築に関与することが示された。これまでの結果から、このＣＩＡ機構は、Ａｆｔ１およびＧｒｘ３／Ｇｒｘ４−Ｆｒａ２ヘテロダイマーをリプレッサーとして含む鉄の感知システムから独立していることが示されている（Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８０：１０１３５−１０１４０（２００５））。
別の予想外の知見は、ＤＨＡＤ活性に対するＧｒｘ３欠失の効果である。Ｇｒｘ３およびＧｒｘ４は機能が同等であることが示された。ＧＲＸ３およびＧＲＸ４遺伝子の両方における二重突然変異は、Ｆｅレギュロンの激しい活性化をもたらしたが、Ｇｒｘ４単独の突然変異は最小の表現型を与える（Ｐｕｊｏｌ−Ｃａｒｒｉｏｎ， ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１９：４５５４−４５６４ （２００６）、Ｏｊｅｄａ， ｅｔ
ａｌ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８１：１７６６１−１７６６９（２００６））。上記の表１０に示されるように、ＧＲＸ３欠失は単独でＤＨＡＤ比活性の著しい改善をもたらす。
従って、これらの結果により、鉄の代謝に関与する遺伝子の調節は、酵母サイトゾルにおいて発現される場合にＤＨＡＤなどのＦｅ−Ｓクラスター要求タンパク質の活性を増大させることができと実証される。図１０において概説されるように、ＤＨＡＤ比活性に対するＦＲＡ２およびＧＲＸ３遺伝子の欠失の効果は、例えば、全般的制御因子Ａｆｔ１ｐによって鉄レギュロン中の遺伝子の１つまたは複数の転写を活性化することから生じ得る。どれか１つの理論によって束縛されることは望まないが、このような遺伝子の活性化は、鉄の取込みの増大および細胞質のＦｅ−Ｓクラスター生合成の増大をもたらすことができ、タンパク質のより高いＦｅ−Ｓクラスター負荷につながる（図１０）。Ｆｅ−Ｓクラスター負荷の増大の実証は実施例１１に記載される。
実施例４．ＤＨＡＤ比活性に対するＡｆｔ１ｐおよびその突然変異体の発現の効果
実施例３に記載され、図１０において概説されるように、Ｆｒａ２、Ｇｒｘ３、およびＧｒｘ４は、Ａｆｔ１ｐの機能を制御するリプレッサーである（Ｋｕｍａｎｏｖｉｃｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：１０２７６−１０２８６（２００８））。Ａｆｔ１ｐは、鉄の全般的な制御因子である。鉄の取込みおよび代謝に関与する遺伝子の活性化は、Ａｆｔ１ｐの核局在化を必要とする。Ａｆｔ１の構成的突然変異体の発現または野生型Ａｆｔ１ｐの発現の増大は、野生型株またはＡＦＴ１欠失株におけるＦｅレギュロンの活性化を導き得る（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｉｗａｉ，ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１２３１−１２３９（１９９５）、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｉｗａｉ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１８９１４−１８９１８（２００２）、Ｋａｐｌａｎ，ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０９：４５３６−４５５２（２００９））。実施例３に記載される新規の知見に基づいて、Ａｆｔ１ｐタンパク質およびその構成的突然変異体の発現は、その活性のためにＦｅ−Ｓクラスターを必要とするＤＨＡＤ酵素の活性画分を改善することが可能である。
この可能性を検討するために、野生型ＡＦＴ１遺伝子およびその構成的突然変異体を、セントロメアベクターｐＲＳ４１１を用いてクローン化した（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：８７５３８、配列番号９１９）。このベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における増殖のためのアンピシリン選択マーカーと、酵母における選択のためのメチオニン栄養マーカーとを有する。その独自のプロモーターおよびターミネーターを含む野生型ＡＦＴ１遺伝子はＫｐｎＩ部位とＳａｃＩ部位との間にクローン化することができ、その結果、構築物ｐＲＳ４１１−Ａｆｔ１＋フランキングが得られる（配列番号９２０、図２）。同様の戦略を用いて、Ａｆｔ１の構成的突然変異体をコードする遺伝子をクローン化することができる。アミノ酸Ｌ９９〜ＡおよびＣ２９１〜Ｆ（配列番号７０３に関する）における置換を有するＡｆｔ１の構成的突然変異体を最初に検討した。野生型ＡＦＴ１遺伝子または構成的突然変異体をコードする遺伝子を有するｐＲＳ４１１構築物を、発現ベクターｐＨＲ８１ＦＢＡＩｌｖＤ（Ｓｍ）と共に、野生型酵母株ＢＹ４７４１またはＡＦＴ１、ＧＲＸ３、もしくはＦＲＡ２の欠失を有する酵母株に形質転換した。ＳＤ培地マイナスメチオニンおよびウラシルを有する寒天板において、形質転換体を選択した。形質転換株をＳＤ培地マイナスメチオニンおよびロイシン中で増殖して、これらの遺伝子または突然変異体の存在下でＤＨＡＤタンパク質を過剰発現させた。これらの培養物の粗抽出物中のＤＨＡＤ活性を測定した。
野生型Ａｆｔ１ｐ、Ａｆｔ１ｐ（Ｃ２９１Ｆ）、およびＡｆｔ１ｐ（Ｌ９９Ａ）の発現の結果は、表１１に示される。Ａｆｔ１ｐ（Ｃ２９１Ｆ）では、野生型Ａｆｔ１ｐと比較して、ＤＨＡＤ比活性の中程度の増大が観察された。Ａｆｔ１ｐ（Ｌ９９Ａ）では、はるかにより高いＤＨＡＤ活性の増大が観察された。Ａｆｔ１ｐ（Ｌ９９Ａ）を発現する酵母におけるＤＨＡＤの比活性は、ＧＲＸ３欠失株において得られる比活性と類似していた（表１０を参照）。
Figure 0005950830
実施例５．ＣＣＣ１欠失株におけるサイトゾルＤＨＡＤ比活性の増大
サイトゾルＤＨＡＤタンパク質のためのＦｅ−Ｓクラスター生合成能力を増大させる正確なメカニズムは不明である。ＦＲＡ２およびＧＲＸ３欠失株（実施例３）ならびにＡｆｔ１ｐ突然変異体の発現（実施例４）による知見に基づいて、サイトゾル中のＦｅ含量の利用能を増大させると、ＤＨＡＤ比活性も改善され得る。ＣＣＣ１欠失は、サイトゾルのＦｅ含量を増大させることが示されている（Ｌｉ Ｌ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６：２９５１５−２９５１９（２００１））。この仮説を試験するために、ＢＹ４７４１のＣＣＣ１欠失株を実施例１に記載されるようなプラスミドｐＨＲ８１ＦＢＡ−ＩｌｖＤ（Ｓｍ）で形質転換した。プラスミドを有する細胞の粗抽出物をＤＨＡＤ活性についてアッセイした。表１３は実験の結果を示す。ＤＨＡＤプラスミドを有するＣＣＣ１欠失株がウラシルを欠いたＳＤ培地中で増殖される場合、ＤＨＡＤ比活性の増大は、同じプラスミドを有する野生型細胞と比較して見出された。追加のＦｅを添加すると、ＣＣＣ１欠失株においてＤＨＡＤのさらなる増大が観察された。Ｆｅの添加は、野生型細胞のＤＨＡＤ比活性に対する効果は示さなかった。ＤＨＡＤタンパク質の過剰発現を達成するために、ロイシンを欠いたＳＤ培地中で菌株を増殖させた（実施例１）。これらの条件下では、ＤＨＡＤ比活性の増大が検出された。
Figure 0005950830
実施例６．酵母において発現されるＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのＤＨＡＤの比活性の改善
実施例１〜５では、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からのＤＨＡＤ酵素を使用して、酵母において発現される場合にＤＨＡＤの比活性を増大させるための新規の方法を特定した。この実施例では、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのＤＨＡＤ酵素（配列番号９５８）の比活性を改善するために、これらの方法の適用を調査した。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのＩｌｖＤ遺伝子（配列番号９５９）を、ＦＢＡプロモーターの調節下でｐＨＲ８１ベクターにクローン化した（図１１）。得られた構築物ｐＨＲ８１ＦＢＡ−ＩｌｖＤ（Ｌｌ）−ＡＤＨｔ（図１１、配列番号９６０）を、ＦＲＡ２またはＧＲＸ３遺伝子のいずれかの欠失を有する株に形質転換した。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのＤＨＡＤに対する構成的突然変異体Ａｆｔ１ｐ（Ｌ９９Ａ）の効果を研究するために、ｐＨＲ８１ＦＢＡ−ＩｌｖＤ（Ｌｌ）−ＡＤＨｔを、ベクターｐＲＳ４１１−Ａｆｔ１（Ｌ９９Ａ）と共に、酵母宿主に同時形質転換した（実施例４を参照）。ＩｌｖＤ遺伝子を過剰発現させるために、菌株に応じてロイシンを欠くかあるいはロイシンおよびメチオニンの両方を欠いた酵母合成ドロップアウト培地において、形質転換体を増殖させた。酵素アッセイの結果は、表１４に要約される。ＦＲＡ２およびＧＲＸ３遺伝子の欠失は、酵母において発現される場合に、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのＤＨＡＤの比活性を増大させた。さらに、Ａｆｔ１構成的突然変異体Ｌ９９Ａの発現は、同様に、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのＤＨＡＤの比活性を増大させた。
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実施例７．ＤＨＡＤの比活性の決定（アッセイ法）
Ｆｅ−Ｓクラスターを必要とするタンパク質の活性の定量化は、アッセイ形式で行うことができる。タンパク質がＤＨＡＤなどの酵素である場合、活性は、通常、活性の単位に関して表現される。酵素活性の単位は、国際生化学連合の酵素委員会（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって、標準条件下、１分間当たりの１マイクロモルの基質の形質転換を触媒し得る酵素の量であると定義されている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ：Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９６１）。さらに、比活性という用語は、所与の量の酵素における活性の単位であると定義される。従って、比活性は直接測定されないが、１）酵素サンプル１ｍｌ当たりの単位（単位／ｍｌ）における活性を、２）そのサンプル中のタンパク質の濃度で割ることによって計算され、従って、比活性は単位／ｍｇで表現される。純粋で完全に活性な酵素のサンプルの比活性は、その酵素の特徴である。タンパク質の混合物のサンプルの比活性は、対象となる活性酵素から構成されるそのサンプル中のタンパク質の相対的な画分の尺度である。ＤＨＡＤ活性は、Ｆｌｉｎｔ，Ｄ．Ｈ．ａｎｄ ｍ．Ｈ．Ｅｍｐｔａｇｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３５５８−６４（１９８８）に記載されるような２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）法を用いるエンドポイントアッセイにおいて分光光度的に測定することができる。このアッセイでは、２，４−ＤＮＰＨは、２−ケトイソ吉草酸産物のケト基と反応してヒドラゾンを形成し、これを５５０ｎｍにおけるその吸光度によって検出する。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０（ＴＭ８緩衝液）を含有する。アッセイ混合物中のその最終濃度が１０ｍＭであるように、十分な２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸をアッセイ緩衝液に添加する。各アッセイにおいて、最終容積が１ｍｌであるように、酵素含有溶液および十分な基質含有緩衝液を混合する。アッセイ混合物は、通常、３７℃で３０分間インキュベートされる。
２５０μｌの１０％（Ｗ／Ｖ）トリクロロ酢酸の添加によりアッセイを停止させる。数分後に、１ＮのＨＣｌ中の２，４−ＤＮＰＨの飽和溶液５００μｌを添加する。混合物を室温で少なくとも１０分間インキュベートして、ヒドラゾンの形成を可能にする。次に、１．７５ｍｌのＮａＯＨを添加して、ヒドラゾンを可溶化し、未反応２，４−ＤＮＰＨを沈殿させる。ＮａＯＨの添加の数分後に、アッセイチューブを１０分間ソニケーター浴に入れて脱気する。次に、チューブをデスクトップ遠心分離機において最高速度で２分間遠心分離し、沈殿物を沈降させる。
次に、上澄みの吸光度を１時間以内に５５０ｎｍで読み取る。サンプルアッセイから対照アッセイを差し引いた吸光度を２６００（α−ケトイソ吉草酸標準曲線から決定される）で割って、アッセイにおける酵素活性の単位を見出す。このアッセイを本明細書に記載される実施例において使用し、ＤＨＡＤ比活性を決定した。
実施例８．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されるＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からのＤＨＡＤの精製および特徴付け
Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からのＤＨＡＤを以下のように精製して特徴付けた。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ｉｌｖＤ遺伝子を含有するｐＥＴ２８ａプラスミドを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｕｒｎｅｒ株の６リットルの培養物を増殖させ、ＩＰＴＧにより誘導した。細胞をＴＭ８緩衝液中でソニケーターにより破壊し（実施例７を参照）、粗抽出物を遠心分離して細胞片を除去してから、粗抽出物の上澄みをＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上に負荷し、ＴＭ８緩衝液中のＮａＣｌ濃度を上昇させてＤＨＡＤを溶出させることによって、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤを精製した。ＤＨＡＤを含有する画分をプールし、１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４に提供し、１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４で平衡化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷した。（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を低下させてＤＨＡＤを溶出させた。ＤＨＡＤを含有する画分をプールし、１０ｍｌ以下まで濃縮し、３５×６００ｃｍのＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（５７７ｍｌベッドボリューム）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上に負荷し、ＴＭ８緩衝液により溶出させた。ＳＤＳゲルにより判断されるように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラムから溶出されるＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤの純度は９０％以上であると評価された。
精製Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤのＵＶ−可視スペクトルは図３に示される。３００ｎｍより上のピークの数は、［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを有するタンパク質に特有である。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤを亜ジチオン酸ナトリウムにより還元し、そのＥＰＲスペクトルを種々の温度で測定した。図４は、２０°Ｋと７０°Ｋの間の温度で測定されたＥＰＲスペクトルを示す。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤのＥＰＲスペクトルは７０°Ｋまで測定可能であり、［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターを含有するタンパク質のＥＰＲスペクトルは１０°Ｋを大きく上回る温度では観察できないので、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤは［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを含有するが、［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターを含有しないことが示される。
Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて最高の比活性を有する精製Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤのバッチの正確なタンパク質含量を、定量的アミノ酸分析により決定した。活性をタンパク質含量と組み合わせることによって、このバッチの１００単位／ｍｇ比活性を得た。当該技術分野において既知の方法論を用いてＩＣＰ−ＭＳによって決定されるこのバッチの鉄含量は、ＤＨＡＤ１分子当たり２分子の鉄であった。これは、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤのこのバッチが［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターの完全補体を含有することと一致する。
実施例９．酵母粗抽出物中のＤＨＡＤの形態を細胞中の他のタンパク質からそして互いに分離して、ＤＨＡＤの存在量を測定する。
酵母細胞中のＤＨＡＤタンパク質は、２つのＦｅ−Ｓクラスター／ダイマー、１つのＦｅ−Ｓクラスター／ダイマー、およびゼロのＦｅ−Ｓクラスター／ダイマーを有するダイマーの形態で存在する。酵母粗抽出物中のＤＨＡＤタンパク質のこれらの３つの形態の濃度を測定するための方法は、Ｍｏｎｏ ＱカラムおよびＳｏｕｒｃｅ１５ＰＨＥ ＰＥ４．６／１００カラム（両カラムともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した）を用いて開発し、以下において説明する。
凍結酵母細胞を解凍し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０（ＴＭ８）中に懸濁させてから、ビーズビーティング（ｂｅａｄ ｂｅａｔｉｎｇ）によって破壊した。破壊細胞を遠心分離して、細胞片を除去し、酵母粗抽出物を生成した。
Ａ緩衝液がＴＭ８であり、Ｂ緩衝液が０．５ＭのＮａＣｌを含有するＴＭ８であるＡＫＴＡクロマトグラフシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に取り付けられた４ｍｌのＭｏｎｏ Ｑカラム上に粗抽出物を負荷した。サンプルを負荷する前に、カラムをＡ緩衝液により平衡化した。これらの条件下で、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤはＭｏｎｏ Ｑカラムに結合した。サンプルをカラム上に負荷した後、カラムを１０ｍＬのＴＭ８緩衝液で洗浄し、次に溶離液中のＮａＣｌの濃度を０．２２ＭのＮａＣｌまで上昇させた。この後、３０ｍＬで０．２２Ｍから０．３５ＭのＮａＣｌまで直線的に勾配させた。クロマトグラフィの間、カラム溶出液のＡ２１５をモニターし、１ｍＬ画分を採取した。画分をＤＨＡＤ活性についてアッセイした。Ｍｏｎｏ Ｑカラムからの画分中のＤＨＡＤの活性の合計は、粗抽出物中の活性に近かった。１ｇまでの酵母細胞ペーストを表す５ｍＬの量の粗抽出物を用いて、このカラムを用いて良好な分離が得られた。ＤＨＡＤ含有画分をプールし、ＰＨＥカラムにおけるクロマトグラフィに備えて、（ＮＨ４）２ＳＯ４中１．３５Ｍにした。
またＳｏｕｒｃｅ１５ＰＨＥ ＰＥ４．６／１００カラムは、Ａ緩衝液が１．５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有するＴＭ８であり、Ｂ緩衝液がＴＭ８であるＡＫＴＡロマトグラフシステムにも取り付けた。各ランの前に、カラムを９０％のＡで平衡化した。Ｍｏｎｏ Ｑカラムからプールし、（ＮＨ４）２ＳＯ４中１．３５Ｍにした画分をＰＨＥカラム上に負荷し、この（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度で、ＤＨＡＤはカラムに結合した。クロマトグラフィの間、カラム溶出液のＡ２１５をモニターし、１ｍＬ画分を採取した。１．３５Ｍから０Ｍまで減少する３０ｍＬの（ＮＨ４）２ＳＯ４の直線的勾配を用いてカラムを展開させると、ＤＨＡＤは３つのピークでカラムから溶出した。ＤＨＡＤピークのそれぞれの面積を積分により決定した。この溶出スキームは、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤを、Ｍｏｎｏ Ｑカラムからそれと同時に溶出される他の酵母タンパク質から分離するためのスキームと同一であることが分かった。ピークが溶出された画分において実行したＳＤＳゲルにより、酵母細胞中の可溶性タンパク質の１％で発現されたときに、これらのピーク中に存在する９０％をはるかに上回るタンパク質がＤＨＡＤであることが示された。３つのＤＨＡＤピークのそれぞれを含有する画分を別々にプールした。これらのピーク中のＤＨＡＤのＵＶ−可視吸収スペクトルならびに鉄およびスルフィド含量に基づいて、第１のピークは、２つの［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスター／ダイマーを有するＤＨＡＤを含有し、第２のピークは、１つの［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスター／ダイマーを有するＤＨＡＤを含有し、そして第３のピークは、ゼロの［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスター／ダイマーを有するＤＨＡＤを含有することが決定された。従って、その天然状態では、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素は、２つの単量体ＤＨＡＤタンパク質のダイマーとして存在すると思われる。
サンプル中に存在するＤＨＡＤの量をＰＨＥカラムからの３つのＤＨＡＤピークの面積の合計と関連付ける標準曲線は、以下のように得られた。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤを含有しない酵母細胞からの粗抽出物に種々の量の精製Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤを添加した。これらの抽出物に、上記のようなＭｏｎｏ ＱおよびＰＨＥカラムにおけるクロマトグラフィを行った。３つのＤＨＡＤピークのそれぞれの下側の面積を積分した。これらの面積の合計を、酵母粗抽出物に添加された純粋なＤＨＡＤの量に対してプロットした。プロットを用いて、以下の式を導いた：
粗抽出物サンプル中の＃μｇＤＨＡＤ＝０．５０７×（３つのＤＨＡＤピークの面積カウントの合計）。
酵母の粗抽出物中のＤＨＡＤ活性は、実施例７に記載される方法によって容易に決定することができる。酵母粗抽出物中のＤＨＡＤタンパク質の量は、この実施例で概説される手順によって決定することができる。このデータを用いて、粗抽出物中のＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤタンパク質自体の比活性を実施例１０の手順に従って計算することができる。
実施例１０．Ｆｅ−Ｓクラスターが負荷された酵母粗抽出物中のＤＨＡＤの画分を決定するための方法
精製Ｆｅ−Ｓクラスター要求タンパク質は、クラスターの完全補体を含有する場合には、特徴的な比活性を有し得る。既に述べたように、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤについては、完全補体を有する場合にこの比活性は１００単位／ｍｇである。
ダイマー当たり平均して１つのＦｅ−Ｓクラスターを有するＤＨＡＤサンプルは、２つのクラスターを有するいくつかのダイマー、１つのクラスターを有するいくつかのダイマー、およびクラスターを有さないいくつかのダイマーを含有し得る。あるいは、ダイマーへのクラスター付加が全てであるか無であり、サンプル中に平均して１つのＦｅ−Ｓクラスター／ダイマーが存在する場合、ＤＨＡＤダイマーの半分はクラスターの完全補体を有し、半分はクラスターを有さない。実施例９の結果から、ダイマー当たり１つのクラスターを有する種は単離することができるので、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤによって全ての挙動が追随されるわけではないし、全く何も追随されないわけでもないことがわかる。１つのＦｅ−Ｓクラスターを有するＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤのダイマーは、２つのＦｅ−Ｓクラスター／ダイマーを有するダイマーの１／２の活性を有することが見出され、すなわち、Ｆｅ−Ｓクラスターの完全補体の１／２を有するＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤの比活性は、５０単位／ｍｇである。これは、ダイマーの一方のモノマーにおけるＦｅ−Ｓクラスターの不在が、他方のモノマー（それがＦｅ−Ｓクラスターを含有すれば）の活性に影響を与えないことを意味する。
実施例９に記載される手順により得られる情報、およびこの実施例においてこれまで記載された情報を用いて、ＤＨＡＤサンプル中のＦｅ−Ｓクラスター負荷の程度を２つの異なる方法で決定することができる。
第１に、３つのＤＨＡＤピークの量の比を比較して、ダイマー当たり２つのクラスター、ダイマー当たり１つのクラスター、およびダイマー当たりゼロのクラスターを有する相対的な量を決定することができる。これにより、クラスター負荷の程度が与えられる。例えば、ＰＨＥカラムからのピーク１の面積が、ピーク１、ピーク２およびピーク３の面積の合計の２５％であり、ピーク２が５０％であり、ピーク３が２５％であれば、クラスターが負荷されたモノマーのパーセントは、以下の式に従って、５０％であると計算することができる：
１００＊［２＊（ピーク１の面積）＋１＊（ピーク２の面積）＋０＊（ピーク３の面積）］／［２＊（全ピーク面積］＝％Ｆｅ−Ｓクラスターを有するＤＨＡＤモノマー。
第２に、ＤＨＡＤの比活性パーセントを使用して、クラスター負荷の程度を計算することができる。実施例７に記載されるように決定された活性を、実施例９に記載されるように決定されたＤＨＡＤタンパク質の量で割ることによって、比活性を決定する。次に、比活性を１００Ｕ／ｍｇで割って、クラスターが負荷されたモノマーの画分を決定する。この画分に１００をかけて、Ｆｅ−Ｓクラスターを有するＤＨＡＤモノマーパーセントを決定する。
例えば、比活性が５０Ｕ／ｍｇであると分かれば、クラスターが負荷された画分は０．５であり、Ｆｅ−Ｓクラスターを有するＤＨＡＤモノマーパーセントは５０％である。
このような計算を行うために、比活性は、粗抽出物中のＤＨＡＤタンパク質の濃度（全タンパク質ではなく）に基づいていなければならない。他のタンパク質の存在下におけるＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤの濃度の決定は、実施例９に記載される方法を用いて達成することができる。
実施例１１．ＤＨＡＤ負荷タンパク質の比活性および推定画分
異なる条件下で増殖されたいくつかの酵母株においてＦｅ−Ｓクラスターが負荷されたＤＨＡＤモノマーの画分を決定するために、上記の方法を使用した。結果は表１５に示される。
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これらの結果は、これらの増殖条件下で、ＦＲＡ２およびＧＲＸ３を欠いた株におけるＤＨＡＤ中のＦｅ−Ｓクラスター負荷レベルが、これらの遺伝子の機能性コピーを含有する株よりも高いことを示す。従って、より高い画分のＤＨＡＤタンパク質は、Ｆｅ−Ｓクラスター（活性のために必要とされる）の含量がより高いので、欠失株における活性形態である。
実施例１２．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＰＮＹ１５０５、ＰＮＹ１５４１、およびＰＮＹ１５４２の構築
この実施例の目的は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＰＮＹ１５０５、ＰＮＹ１５４１、およびＰＮＹ１５４２を構築することであった。これらの株はＰＮＹ１５０３（ＢＰ１０６４）に由来した。ＰＮＹ１５０３は、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ ８３４０、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｒｙ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に由来した。ＰＮＹ１５０３（ＢＰ１０６４）の構築は、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願第６１／３６８，４３６号明細書および以下の実施例１３において記載されている。ＰＮＹ１５０５は、ＦＲＡ２遺伝子の欠失を含有する。ＰＮＹ１５４１およびＰＮＹ１５４２は、ＹＰＲＣΔ１５座位においてＬ９９Ａ突然変異（ＡＦＴ１−Ｌ９９Ａ）を有するＡＦＴ１遺伝子の組込みを含有する。
標的遺伝子の上流および下流の相同性領域および形質転換体の選択のためのＵＲＡ３遺伝子を含有するＰＣＲ断片による相同組換えによって、欠失／組込みを作製した。ＵＲＡ３遺伝子を相同組換えにより除去して、痕跡のない（ｓｃａｒｌｅｓｓ）欠失／組込みを作製した。
痕跡のない欠失／組込み手順は、Ａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，２３（５）：３９９−４０５（２００６）から適合させた。各欠失／組込みのためのＰＣＲカセットは、欠失／組込み手順のためのＰＣＲにより全カセットを増幅する前に、オーバーラップＰＣＲによって、あるいは個々の断片、および組み込むべき遺伝子をプラスミドにクローン化ことによって、４つの断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを結合することにより作成した。ＰＣＲカセットは、選択可能／対抗選択可能なマーカー、天然ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ ＵＲＡ３遺伝子からなるＵＲＡ３（断片Ｕ）を、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の上流２５０ｂｐ）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の下流１５０ｂｐ）領域と共に含有した。断片Ａ（長さ１５０ｂｐ〜５００ｂｐ）およびＣ（長さ２５０ｂｐ）は、標的遺伝子のすぐ上流の配列（断片Ａ）および標的遺伝子の３’配列（断片Ｃ）に相当した。断片ＡおよびＣは、相同組換えによるカセットの染色体への組込みのために使用した。断片Ｂ（長さ５００ｂｐ）は標的遺伝子のすぐ下流の５００ｂｐに相当し、断片Ｂに相当する配列の直接反復はカセットの染色体への組込みの際に作成されるので、ＵＲＡ３マーカーおよび断片Ｃの相同組換えによる染色体からの切除のために使用した。
ＰＣＲ産物ＡＢＵＣカセットを用いて、まずＵＲＡ３マーカーを組込み、次に相同組換えにより染色体から切除した。最初の組込みは３’配列を除く遺伝子を欠失させた。切除の際、遺伝子の３’領域も欠失させた。この方法を用いる遺伝子の組込みのために、組み込むべき遺伝子を、断片ＡとＢの間でカセットに包含させた。
ＦＲＡ２の欠失
ＦＲＡ２の欠失（参照によって本明細書中に援用される米国特許出願第６１／３８０，５６３号明細書にも記載されている）は、ＦＲＡ２コード配列の最初の１１３個のヌクレオチドはインタクトのまま、コード配列の３’端部から２５０個のヌクレオチドを欠失するように設計した。インフレームの終止コドンは欠失の７ヌクレオチド下流に存在した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製）をテンプレートとしてを用いて、痕跡のないＦＲＡ２の欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を増幅した。プライマーｏＢＰ５９４（配列番号９６１）と、ＦＲＡ２断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５９５（配列番号９６２）とを用いて、ＦＲＡ２断片Ａを増幅した。ＦＲＡ２断片Ａの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５９６（配列番号９６３）と、ＦＲＡ２断片Ｕの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５９７（配列番号９６４）とを用いて、ＦＲＡ２断片Ｂを増幅した。ＦＲＡ２断片Ｂの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５９８（配列番号９６５）と、ＦＲＡ２断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５９９（配列番号９６６）とを用いて、ＦＲＡ２断片Ｕを増幅した。ＦＲＡ２断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ６００（配列番号９６７）と、プライマーｏＢＰ６０１（配列番号９６８）とを用いて、ＦＲＡ２断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＰＣＲ産物を精製した。ＦＲＡ２断片ＡおよびＦＲＡ２断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号９６１）およびｏＢＰ５９７（配列番号９６４）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＦＲＡ２断片ＡＢを作成した。ＦＲＡ２断片ＵおよびＦＲＡ２断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５９８（配列番号９６５）およびｏＢＰ６０１（配列番号９６８）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＦＲＡ２断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＦＲＡ２断片ＡＢおよびＦＲＡ２断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号９６１）およびｏＢＰ６０１（配列番号９６８）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＦＲＡ２ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。
ＰＮＹ１５０３のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を用いて、ＦＲＡ２ＡＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、ｆｒａ２ノックアウトを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号９６９）およびｏＢＰ６０３（配列番号９７０）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（酵母抽出物、ペプトン、１％のエタノール）中で増殖させ、１％のエタノールが補充され、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号９６９）およびｏＢＰ６０３（配列番号９７０）によるＰＣＲによって確認した。分離株からのＦＲＡ２遺伝子の不在は、ＦＲＡ２の欠失コード配列、ｏＢＰ６０５（配列番号９７１）およびｏＢＰ６０６（配列番号９７２）に特異的なプライマーを用いて、ネガティブＰＣＲ結果によって実証した。正しい分離株を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤＭＡＴａ ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ ｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ ｆｒａ２Δとして選択し、ＰＮＹ１５０５（ＢＰ１１３５）と命名した。
Figure 0005950830
ＹＰＲＣΔ１５の欠失およびＡＦＴ１−Ｌ９９Ａの組込み
ＹＰＲＣΔ１５座位を欠失させ、ＡＦＴ１からの天然プロモーター領域（８００ｂｐ）およびターミネーター領域（８００ｂｐ）と共に、ＡＦＴ１−Ｌ９９Ａで置換した。ＹＰＲＣΔ１５欠失−ＡＦＴ１Ｌ９９Ａの組込みのための痕跡のないカセットを、まずプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した（参照によって本明細書中に援用される米国特許出願第６１／３５６，３７９号明細書に記載される）。ベクターはｐＵＣ１９に基づき、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）内に位置するＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤからのＵＲＡ３遺伝子の配列を含有する。ｐＵＣ１９（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ、ＡＴＣＣ＃３７２５４）は、ｐＭＢ１レプリコン、およびエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における複製および選択のためにベータ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含有する。ＵＲＡ３のコード配列に加えて、この遺伝子の上流（２５０ｂｐ）および下流（１５０ｂｐ）からの配列は、酵母におけるＵＲＡ３遺伝子の発現のために存在する。ベクターはクローニングの目的で使用することができ、酵母組込みベクターとして使用することができる。
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ８３４０、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｒｙ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）ゲノムＤＮＡからのＵＲＡ３コード領域の上流２５０ｂｐおよび下流１５０ｂｐと共に、ＵＲＡ３コード領域を包含するＤＮＡを、ＢａｍＨＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｅＩ、およびＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ４３８（配列番号１０３３）と、ＸｂａＩ、ＰａｃＩ、およびＮｏｔＩ制限部位を含有するｏＢＰ４３９（配列番号１０３４）とにより増幅した。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。ＰＣＲ産物およびｐＵＣ１９を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる消化の後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと連結させ、ベクターｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳを作成した。ベクターは、プライマーｏＢＰ２６４（配列番号１０３１）およびｏＢＰ２６５（配列番号１０３２）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。
ＫｐｎＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２２（配列番号９７３）と、ＹＰＲＣΔ１５断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ６２３（配列番号９７４）とを用いて、ＹＰＲＣΔ１５断片Ａを、上記のように調製したゲノムＤＮＡから増幅した。ＹＰＲＣΔ１５断片Ａの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ６２４（配列番号９７５）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２５（配列番号９７６）とを用いて、ＹＰＲＣΔ１５断片ＢをゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。〆ＹＰＲＣΔ１５断片ＡおよびＹＰＲＣΔ１５断片ＢのＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ６２２（配列番号９７３）およびｏＢＰ６２５（配列番号９７６）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＹＰＲＣΔ１５断片Ａ−ＹＰＲＣΔ１５断片Ｂを作成した。得られたＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＦｓｅＩにより消化し、適切な酵素による消化の後、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼと共に連結させた。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２６（配列番号９７７）と、ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２７（配列番号９７８）とを用いて、ＹＰＲＣΔ１５断片ＣをゲノムＤＮＡから増幅した。ＹＰＲＣΔ１５断片ＣのＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＰａｃＩにより消化し、ＹＰＲＣΔ１５断片ＡＢを含有するプラスミドの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼと共に連結させた。ｐＲＳ４１１−ＡＦＴ１（Ｌ９９Ａ）（上記の実施例４に記載される）をテンプレートとして用いて、ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ７４４（配列番号９７９）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ７４５（配列番号９８０）とによって、ＡＦＴ１からの天然プロモーター領域（８００ｂｐ）およびターミネーター領域（８００ｂｐ）と共にＡＦＴ１−Ｌ９９Ａを増幅した。ＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩにより消化し、ＹＰＲＣΔ１５断片ＡＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼと共に連結させた。プライマーｏＢＰ６２２（配列番号９７３）およびｏＢＰ６２７（配列番号９７８）を用いて、得られたプラスミドから組込みカセット全体を増幅した。
ＰＮＹ１５０３のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＹＰＲＣΔ１５欠失／ＡＦＴ１−Ｌ９９Ａ組込みカセットＰＣＲ産物で形質転換した。形質転換混合物を、１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングした。形質転換体をＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させ、１％のＥｔＯＨが補充され、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離を選択した。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、外側プライマーｏＢＰ６３６（配列番号９８１）およびｏＢＰ６３７（配列番号９８２）ならびにＡＦＴ１−Ｌ９９Ａ特異的プライマーＨＹ８４０（配列番号９８３）および外側プライマーｏＢＰ６３７（配列番号９８２）によるＰＣＲによってＹＰＲＣΔ１５の欠失およびＡＦＴ１Ｌ９９Ａの組込みを確認し、ＰＣＲによりクローン化した。ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤＭＡＴａ ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ ｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ ｙｐｒｃΔ１５Δ：：ＡＦＴ１Ｌ９９Ａの独立した正しい分離株を株ＰＮＹ１５４１およびＰＮＹ１５４２と命名した。
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実施例１３．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＰ１０６４（ＰＮＹ１５０３）の構築
株ＢＰ１０６４は、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ８３４０、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｒｙ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に由来し、以下の遺伝子：ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびＧＰＤ２の欠失を含有する。
標的遺伝子の上流および下流の相同性領域と、形質転換体の選択のためのＧ４１８耐性マーカーまたはＵＲＡ３遺伝子のいずれかとを含有するＰＣＲ断片による相同組換えによって、コード配列全体を完全に除去した欠失を作成した。Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて、ｌｏｘＰ部位により隣接されるＧ４１８耐性マーカーを除去した。ＵＲＡ３遺伝子を相同組換えにより除去して痕跡のない欠失を作成するか、あるいはｌｏｘＰ部位に隣接される場合には、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて除去した。
痕跡のない欠失の手順は、Ａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｙｅａｓｔ ｖ２３ ｐ３９９から適合させた。一般に、４つの断片Ａ−Ｂ−Ｕ−ＣをオーバーラップＰＣＲにより結合することによって、痕跡のない欠失のそれぞれに対してＰＣＲカセットを作った。ＰＣＲカセットは、選択可能／対抗選択可能なマーカー、天然ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ ＵＲＡ３遺伝子からなるＵＲＡ３（断片Ｕ）を、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の上流２５０ｂｐ）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の下流１５０ｂｐ）と共に含有した。断片ＡおよびＣ（それぞれ、長さ５００ｂｐ）は、標的遺伝子のすぐ上流５００ｂｐ（断片Ａ）および標的遺伝子の３’の５００ｂｐ（断片Ｃ）に相当した。断片ＡおよびＣは、相同組換えによるカセットの染色体への組込みのために使用した。断片Ｂ（長さ５００ｂｐ）は標的遺伝子のすぐ下流の５００ｂｐに相当し、断片Ｂに相当する配列の直接反復はカセットの染色体への組込みの際に作成されるので、ＵＲＡ３マーカーおよび断片Ｃの相同組換えによる染色体からの切除のために使用した。ＰＣＲ産物のＡＢＵＣカセットを用いて、まずＵＲＡ３マーカーを組込み、次に相同組換えにより染色体から切除した。最初の組込みは、３’の５００ｂｐを除く遺伝子を欠失させた。切除の際、遺伝子の３’の５００ｂｐも欠失させた。この方法を用いる遺伝子の組込みのために、組み込むべき遺伝子を、断片ＡとＢの間でＰＣＲカセットに包含させた。
ＵＲＡ３の欠失
内因性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを、ｐＬＡ５４テンプレートＤＮＡ（配列番号９８６）からＰＣＲ増幅した。ｐＬＡ５４は、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびｋａｎＭＸマーカーを含有し、ｌｏｘＰ部位によって隣接されて、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えおよびマーカーの除去を可能にする。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＢＫ５０５およびＢＫ５０６（それぞれ、配列番号９８７および９８８）を用いて行った。各プライマーのＵＲＡ３部分は、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰマーカーの組込みがＵＲＡ３コード領域の置換をもたらすように、ＵＲＡ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域に由来した。標準遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物をＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄに形質転換し、形質転換体を、Ｇ４１８（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＹＰＤにおいて３０℃で選択した。形質転換体をスクリーニングして、プライマーＬＡ４６８およびＬＡ４９２（それぞれ、配列番号９８９および９９０）を用いるＰＣＲによって正しい組込みを検証し、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸと命名した。
ＨＩＳ３の欠失
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製）をテンプレートとして用いて、痕跡のないＨＩＳ３欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を増幅した。プライマーｏＢＰ４５２（配列番号９９１）と、ＨＩＳ３断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４５３（配列番号９９２）とを用いて、ＨＩＳ３断片Ａを増幅した。ＨＩＳ３断片Ａの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４５４（配列番号９９３）と、ＨＩＳ３断片Ｕの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４５５（配列番号９９４）とを用いて、ＨＩＳ３断片Ｂを増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４５６（配列番号９９５）と、ＨＩＳ３断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４５７（配列番号９９６）とを用いて、ＨＩＳ３断片Ｕを増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４５８（配列番号９９７）と、プライマーｏＢＰ４５９（配列番号９９８）とを用いて、ＨＩＳ３断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＨＩＳ３断片ＡおよびＨＩＳ３断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号９９１）およびｏＢＰ４５５（配列番号９９４）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＨＩＳ３断片ＡＢを作成した。ＨＩＳ３断片ＵおよびＨＩＳ３断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号９９５）およびｏＢＰ４５９（配列番号９９８）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＨＩＳ３断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＨＩＳ３断片ＡＢおよびＨＩＳ３断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号９９１）およびｏＢＰ４５９（配列番号９９８）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＨＩＳ３ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸのコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を用いて、ＨＩＳ３ＡＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、２％のグルコースが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、ｈｉｓ３ノックアウトを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ４６０（配列番号９９９）およびｏＢＰ４６１（配列番号１０００）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正しい形質転換体を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸΔｈｉｓ３：：ＵＲＡ３として選択した。
Δｕｒａ３部位からのＫａｎＭＸマーカーの除去およびΔｈｉｓ３部位からのＵＲＡ３マーカーの除去
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸΔｈｉｓ３：：ＵＲＡ３を、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号１０１１、米国仮特許出願第６１／２９０，６３９号明細書に記載される）で形質転換し、２％のグルコースが補充されたヒスチジンおよびウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングすることによって、ＫａｎＭＸマーカーを除去した。１％のガラクトースが補充されたＹＰ中、３０℃で約６時間、形質転換体を増殖させて、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＫａｎＭＸマーカーの切除を誘発させ、回収のために３０℃でＹＰＤ（２％のグルコース）プレートにプレーティングした。分離株をＹＰＤ中で一晩増殖させ、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地に３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの除去のために、５−ＦＯＡ耐性分離株をＹＰＤにおいて増殖およびプレーティングした。ＹＰＤ＋Ｇ４１８プレート、ウラシルを欠いた合成完全培地プレート、およびヒスチジンを欠いた合成完全培地プレートにおける増殖をアッセイすることによって、ＫａｎＭＸマーカー、ＵＲＡ３マーカー、およびｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの損失について分離株を検査した。Ｇ４１８に対して感受性があり、ウラシルおよびヒスチジンに対して栄養要求性である正しい分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３として選択し、ＢＰ８５７と命名した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、Δｕｒａ３のためのプライマーｏＢＰ４５０（配列番号１００１）およびｏＢＰ４５１（配列番号１００２）、ならびにΔｈｉｓ３のためのプライマーｏＢＰ４６０（配列番号９９９）およびｏＢＰ４６１（配列番号１０００）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。
ＰＤＣ６の欠失
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）およびＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製）をテンプレートとして用いて、痕跡のないＰＤＣ６欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を増幅した。プライマーｏＢＰ４４０（配列番号１００３）と、ＰＤＣ６断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４４１（配列番号１００４）とを用いて、ＰＤＣ６断片Ａを増幅した。ＰＤＣ６断片Ａの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４４２（配列番号１００５）と、ＰＤＣ６断片Ｕの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４４３（配列番号１００６）とを用いて、ＰＤＣ６断片Ｂを増幅した。ＰＤＣ６断片Ｂの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４４４（配列番号１００７）と、ＰＤＣ６断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４４５（配列番号１００８）とを用いて、ＰＤＣ６断片Ｕを増幅した。ＰＤＣ６断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４４６（配列番号１００９）と、プライマーｏＢＰ４４７（配列番号１０１０）とを用いて、ＰＤＣ６断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＰＤＣ６断片ＡおよびＰＤＣ６断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号１００３）およびｏＢＰ４４３（配列番号１００６）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ６断片ＡＢを作成した。ＰＤＣ６断片ＵおよびＰＤＣ６断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ４４４（配列番号１００７）およびｏＢＰ４４７（配列番号１０１０）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ６断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＰＤＣ６断片ＡＢおよびＰＤＣ６断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号１００３）およびｏＢＰ４４７（配列番号１０１０）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ６ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＰＤＣ６ＡＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、２％のグルコースが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、ｐｄｃ６ノックアウトを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号１０１２）およびｏＢＰ４４９（配列番号１０１３）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正しい形質転換体を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３として選択した。
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３をＹＰＤ中で一晩増殖させ、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離を選択した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号１０１２）およびｏＢＰ４４９（配列番号１０１３）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。分離株からのＰＤＣ６遺伝子の不在は、ＰＤＣ６のコード配列、ｏＢＰ５５４（配列番号１０１４）およびｏＢＰ５５５（配列番号１０１５）に特異的なプライマーを用いて、ネガティブＰＣＲ結果によって実証した。正しい分離株を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６として選択し、ＢＰ８９１と命名した。
ＰＤＣ１欠失ｉｌｖＤＳｍの組込み
ＰＤＣ１遺伝子を欠失させ、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ＃７００６１０からのｉｌｖＤコード領域で置換した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）およびＮＹＬＡ８３（米国仮特許出願第６１／２４６７０９号明細書に記載）ゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製）をテンプレートとして使用して、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組込みのためのＰＣＲカセットのためのＡ断片およびその後のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）からのｉｌｖＤコード領域を増幅した。プライマーｏＢＰ５１３（配列番号１０１６）と、ＰＤＣ１断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５１５（配列番号１０１７）とを用いて、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ（配列番号１０５３）を増幅した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）およびＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製）をテンプレートとして用いて、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組込みのためのＰＣＲカセットのＢ、Ｕ、およびＣ断片を増幅した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５１６（配列番号１０１８）と、ＰＤＣ１断片Ｕの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５１７（配列番号１０１９）とを用いて、ＰＤＣ１断片を増幅した。ＰＤＣ１断片Ｂの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５１８（配列番号１０２０）と、ＰＤＣ１断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５１９（配列番号１０２１）とを用いて、ＰＤＣ１断片Ｕを増幅した。ＰＤＣ１断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５２０（配列番号１０２２）と、プライマーｏＢＰ５２１（配列番号１０２３）とを用いて、ＰＤＣ１断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍおよびＰＤＣ１断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号１０１６）およびｏＢＰ５１７（配列番号１０１９）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−Ｂを作成した。ＰＤＣ１断片ＵおよびＰＤＣ１断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５１８（配列番号１０２０）およびｏＢＰ５２１（配列番号１０２３）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ１断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢおよびＰＤＣ１断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号１０１６）およびｏＢＰ５２１（配列番号１０２３）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ１Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣカセット（配列番号１０５４）を作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＰＤＣ１Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を２％のグルコースが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、ｐｄｃ１ノックアウトｉｌｖＤＳｍ組込みを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号１０２４）およびｏＢＰ５１２（配列番号１０２５）によるＰＣＲによってスクリーニングした。分離株からのＰＤＣ１遺伝子の不在は、ＰＤＣ１のコード配列、ｏＢＰ５５０（配列番号１０２６）およびｏＢＰ５５１（配列番号１０２７）に特異的なプライマーを用いて、ネガティブＰＣＲ結果によって実証した。正しい形質転換体を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３として選択した。
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３をＹＰＤ中で一晩増殖させ、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ＰＤＣ１の欠失、ｉｌｖＤＳｍの組込み、およびマーカーの除去は、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号１０２４）およびｏＢＰ５１２（配列番号１０２５）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。正しい分離株を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍとして選択し、ＢＰ９０７と命名した。
ＰＤＣ５欠失ｓａｄＢの組込み
ＰＤＣ５遺伝子を欠失させ、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）からのｓａｄＢコード領域で置換した。ＰＤＣ５欠失−ｓａｄＢ組込みのためのＰＣＲカセットのセグメントをまずプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。
ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳはｐＵＣ１９に基づき、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）内に位置するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＵＲＡ３遺伝子の配列を含有する。ｐＵＣ１９は、ｐＭＢ１レプリコン、およびエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における複製および選択のためにベータ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含有する。ＵＲＡ３のコード配列に加えて、この遺伝子の上流および下流からの配列は、酵母におけるＵＲＡ３遺伝子の発現のために含まれる。ベクターはクローニングの目的で使用することができ、酵母組込みベクターとして使用することができる。
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡからのＵＲＡ３コード領域の上流２５０ｂｐおよび下流１５０ｂｐと共に、ＵＲＡ３コード領域を包含するＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、ＢａｍＨＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｅＩ、およびＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ４３８（配列番号１０３３）と、ＸｂａＩ、ＰａｃＩ、およびＮｏｔＩ制限部位を含有するｏＢＰ４３９（配列番号１０３４）により増幅した。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。ＰＣＲ産物およびｐＵＣ１９（配列番号１０５６）を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる消化の後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと連結させ、ベクターｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳを作成した。ベクターは、プライマーｏＢＰ２６４（配列番号１０３１）およびｏＢＰ２６５（配列番号１０３２）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。
ｓａｄＢのコード配列およびＰＤＣ５断片ＢをｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化して、ＰＤＣ５Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣＰＣＲカセットのｓａｄＢ−ＢＵ部分を作成した。ｐＬＨ４６８−ｓａｄＢ（配列番号１０５１）をテンプレートとして用いて、ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３０（配列番号１０３５）と、ＰＤＣ５断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５３１（配列番号１０３６）とによりｓａｄＢのコード配列を増幅した。ｓａｄＢの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５３２（配列番号１０３７）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３３（配列番号１０３８）とを用いて、ＰＤＣ５断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ｓａｄＢおよびＰＤＣ５断片ＢのＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ５３０（配列番号１０３５）およびｏＢＰ５３３（配列番号１０３８）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりｓａｄＢ−ＰＤＣ５断片Ｂを作成した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩにより消化し、適切な酵素による消化の後、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼと共に連結させた。プライマーｏＢＰ５３６（配列番号１０３９）と、ＰＤＣ５断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するｏＢＰ５４６（配列番号１０４０）とを用いて、ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの増幅のために、得られたプラスミドをテンプレートとして使用した。ＰＤＣ５ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５４７（配列番号１０４１）と、プライマーｏＢＰ５３９（配列番号１０４２）とを用いて、ＰＤＣ５断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＰＤＣ５ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片ＵおよびＰＤＣ５断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５３６（配列番号１０３９）およびｏＢＰ５３９（配列番号１０４２）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ５ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。天然ＰＤＣ５コード配列のすぐ上流の５０個のヌクレオチドに対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５４２（配列番号１０４３）と、ｏＢＰ５３９（配列番号１０４２）とを用いてＰＤＣ５ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを増幅することによって、ＰＤＣ５Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣカセット（配列番号１０５５）を作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍのコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＰＤＣ５Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地（グルコースなし）において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、ｐｄｃ５ノックアウトｓａｄＢ組込みを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号１０４４）およびｏＢＰ５４１（配列番号１０４５）によるＰＣＲによってスクリーニングした。分離株からのＰＤＣ５遺伝子の不在は、ＰＤＣ５のコード配列、ｏＢＰ５５２（配列番号１０４６）およびｏＢＰ５５３（配列番号１０４７）に特異的なプライマーを用いて、ネガティブＰＣＲ結果によって実証した。正しい形質転換体を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍΔｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３として選択した。
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍΔｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３をＹＰＥ（１％のエタノール）中で一晩増殖させ、エタノールが補充され、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地（グルコースなし）において３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離を選択した。ＰＤＣ５の欠失、ｓａｄＢの組込み、およびマーカーの除去は、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号１０４４）およびｏＢＰ５４１（配列番号１０４５）によるＰＣＲによって確認した。正しい分離株を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍΔｐｄｃ５：：ｓａｄＢとして選択し、ＢＰ９１３と命名した。
ＧＰＤ２の欠失
内因性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるために、ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰＰＣＲ（配列番号１０５２）をテンプレートＤＮＡとして用いて、ｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセット（配列番号１０５７）をＰＣＲ増幅した。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰは、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位に隣接される（ＡＴＣＣ♯７７１０７）からのＵＲＡ３マーカーを含有する。Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＬＡ５１２およびＬＡ５１３（それぞれ、配列番号１０２９および１０３０）を用いてＰＣＲを行った。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰマーカーの組込みがＧＰＤ２コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのＧＰＤ２部分は、ＧＰＤ２コード領域の上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域に由来した。ＰＣＲ産物をＢＰ９１３に形質転換し、形質転換体を１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地（グルコースなし）において選択した。形質転換体をスクリーニングして、プライマーｏＢＰ５８２およびＡＡ２７０（それぞれ、配列番号１０４８および１０４９）を用いるＰＣＲによって正しい組込みを検証した。
ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号１０１１）による形質転換と、１％のエタノールが補充され、ヒスチジンを欠いた合成完全培地における３０℃でのプレーティングとによって、ＵＲＡ３マーカーを再利用した。形質転換体を１％のエタノールが補充され、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地上に画線し、３０℃でインキュベートして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドを除去するために５−ＦＯＡ耐性分離株をＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させた。欠失およびマーカー除去は、プライマーｏＢＰ５８２（配列番号１０４８）およびｏＢＰ５９１（配列番号１０５０）によるＰＣＲによって確認した。正しい分離株を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍΔｐｄｃ５：：ｓａｄＢΔｇｐｄ２：：ｌｏｘＰとして選択し、ＢＰ１０６４と命名した。
実施例１４．２，３−ジヒドロキシイソバレレートの蓄積およびイソブタノールの産生を測定するための振とうフラスコ実験
この実施例の目的は、イソブタノール経路中間体２，３−ジヒドロキシイソバレレート（ＤＨＩＶ）の蓄積に対する効果を示し、ＡＦＴ１−Ｌ９９Ａ遺伝子の組込みコピーまたはＦＲＡ２欠失を有するイソブタノロゲン（ｉｓｏｂｕｔａｎｏｌｏｇｅｎ）株におけるイソブタノール産生を親株と比較して示すことであった。イソブタノール経路プラスミドｐＹＺ０９０（配列番号９８４、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願第６１／３６８，４３６号明細書に記載）およびｐＬＨ４６８（配列番号９８５、参照によって本明細書中に援用される米国仮特許出願第６１／２４６，８４４号明細書に記載）で菌株を形質転換した。またこれらのプラスミドは、以下のように、簡単に説明される。
ＡＬＳの発現のために酵母ＣＵＰ１プロモーター（ｎｔ２−４４９）から発現され、その後にＣＹＣ１ターミネーター（ｎｔ２１８１−２４３０）が続くバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのａｌｓＳ遺伝子（ｎｔ位置４５７−２１７２）のコード領域を有するキメラ遺伝子と、ＫＡＲＩの発現のために酵母ＩＬＶ５プロモーター（２４３３−３６２６）から発現され、その後にＩＬＶ５ターミネーター（ｎｔ４６８２−５３０４）が続くラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ｎｔ３６３４−４６５６）からのｉｌｖＣ遺伝子のコード領域を有するキメラ遺伝子とを含有するように、ｐＹＺ０９０（配列番号９８４）を構築した。
ＤＨＡＤの発現のためにＦＢＡ１ターミネーター（ｎｔ４８５８−５８５７）が後に続くＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＢＡ１プロモーター（ｎｔ２１０９−３１０５）によって発現されたストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（ｎｔ位置３３１３−４８４９）からのｉｌｖＤ遺伝子のコード領域を有するキメラ遺伝子と、ＡＤＨの発現のためにＡＤＨ１ターミネーター（ｎｔ５９６２−６２７７）が後に続くＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＭ１プロモーター（ｎｔ７４２５−８１８１）から発現されたコドン最適化ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（ｎｔ６２８６−７４１３）のコード領域を有するキメラ遺伝子と、ＫｉｖＤの発現のためにＴＤＨ３ターミネーター（ｎｔ８２３７−９２３５）が後に続くＴＤＨ３プロモーター（ｎｔ１０８９６−１１９１８）から発現されたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ｎｔ９２４９−１０８９５）からのコドン最適化ｋｉｖＤ遺伝子のコード領域を有するキメラ遺伝子とを含有するように、ｐＬＨ４６８（配列番号９８５）を構築した。
ＰＮＹ１５０３（親株）の形質転換体をＰＮＹ１５０４と命名した。ＰＮＹ１５０５（ｆｒａ２欠失株）の形質転換体をＰＮＹ１５０６と命名した。ＰＮＹ１５４１およびＰＮＹ１５４２（ＡＦＴ１−Ｌ９９Ａ組込み株）の形質転換体を、ＰＮＹ１５４１に対してはＰＮＹ１５４３およびＰＮＹ１５４４、そしてＰＮＹ１５４２に対してはＰＮＹ１５４５およびＰＮＹ１５４６と命名した。
１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）、０．２％のグルコース、および０．２％のエタノールが補充された合成培地（アミノ酸を含まないＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ならびにウラシルおよびヒスチジンを含まないＹｅａｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））中で菌株を増殖させた。Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉ２４シェーカーにおいて３０℃、２２５ＲＰＭで、１２５ｍＬの通気孔付（ｖｅｎｔｅｄ）三角フラスコ内の１５ｍＬの培地中で一晩培養物を増殖させた。１２５ｍＬの固くフタをした三角フラスコ中の１８ｍｌの培地を一晩培養物と共に、ＯＤ６００が０．５になるまでインキュベートし、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉ２４シェーカーにおいて、３０℃、２２５ＲＰＭで６時間増殖させた。６時間後、グルコースを２．５％まで添加し、酵母抽出物を５ｇ／Ｌまで添加し、ペプトンを１０ｇ／Ｌまで添加した（タイム０時間）。２４時間および４８時間後に、ＨＰＬＣ（参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書に記載される方法）およびＬＣ／ＭＳによって、培養物の上澄み（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルターユニット、Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．８１６９を用いて採取）を分析した。グルコースおよびイソブタノールの濃度は、ＨＰＬＣにより決定した。Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３（パーツ＃１８６００３５３９）カラムを用いるＷａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）ＡｃｑｕｉｔｙＴＱＤシステムにおけるＬＣ／ＭＳによってＤＨＩＶを分離および定量した。カラムは３０℃で保持し、流速は０．５ｍＬ／分であった。Ａ移動相は水中０．１％のギ酸であり、Ｂ移動相はアセトニトリル中０．１％のギ酸であった。各ランは、９９％のＡで１分間、２５％のＢまで１分間にわたる直線的な勾配の後、９９％のＡで１分間からなった。Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱ＿ＴＱＤ（ｓ／ｎ ＱＢＡ６８８）質量分析検出器により、コーン電圧３２．５Ｖで、ｍ／ｚ＝１３３（負のＥＳＩ）におけるピークについてカラムの溶出をモニターした。ＤＨＩＶは、通常、１．２分で出現した。ベースラインの分離を得て、１Ｍ水溶液ストックから作った標準溶液の分析を参照してＤＨＩＶのピーク面積をＤＨＩＶ濃度μＭに変換した。
表１８は、２４時間および４８時間における、親株バックグラウンド（ＰＮＹ１５０４）と比較したＡＦＴ１−Ｌ９９Ａ株（ＰＮＹ１５４３、ＰＮＹ１５４４、ＰＮＹ１５４５、およびＰＮＹ１５４６）、ならびにＦＲＡ２欠失株（ＰＮＹ１５０６）のＤＨＩＶのモル収量（消費されたグルコース１モル当たりのＤＨＩＶのモル数）およびイソブタノール力価を示す。ＡＦＴ１−Ｌ９９Ａの発現またはＦＲＡ２の欠失はいずれも、ＤＨＩＶの蓄積の約５０％の低下をもたらした。
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データは、ＰＮＹ１５０４およびＰＮＹ１５０６については２つの独立したフラスコの平均である。ＡＦＴ１−Ｌ９９Ａ株（ＰＮＹ１５４３−ＰＮＹ１５４４およびＰＮＹ１５４５−ＰＮＹ１５４６）については２つの独立した形質転換体の平均である。
特定の実施形態の上記の説明は本発明の一般的性質をとても十分に明らかにし得るので、他者は、当該技術分野の技能の範囲内の知識を適用することによって、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、過度の実験を行わなくてもこのような特定の実施形態を容易に変更することができ、および／または種々の用途に適合させることができる。従って、本明細書において提示される教示およびガイダンスに基づいて、このような適合および変更は、開示される実施形態の等価物の意味および範囲内に含まれることが意図される。本明細書中の表現または用語は説明のためのものであって限定ではないので、本明細書の用語または表現は教示およびガイダンスを考慮して当業者により解釈されるべきであると理解されるはずである。
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Claims (21)

  1. （ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（DHAD）活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド、ここで当該DHAD活性を有するポリペプチドは［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを含む；ならびに
    （ｂ）（ｉ）ＦＲＡ２、ＧＲＸ３またはＣＣＣ１をコードする内因性遺伝子の少なくとも１つの欠失；および／または
    （ii）構成的突然変異体ＡＦＴ１（Ｃ２９１Ｆ）またはＡＦＴ（Ｌ９９Ａ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド；
    を含む組換え酵母宿主細胞。
  2. ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、
    （ａ）高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含むか；または
    （ｂ）組換え酵母宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている；
    請求項１に記載の組換え酵母宿主細胞。
  3. ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが多コピーで発現される、請求項１に記載の組換え酵母宿主細胞。
  4. 前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む、請求項３に記載の組換え酵母宿主細胞。
  5. 前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、組換え酵母宿主細胞ＤＮＡ中に少なくとも１回組み込まれている、請求項３に記載の組換え酵母宿主細胞。
  6. 前記Ｆｅ−Ｓクラスター生合成が、内因性Ｆｅ−Ｓクラスター生合成を有する組換え宿
    主細胞と比較して増大された、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  7. 前記組換え酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え酵母宿主細胞。
  8. ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、前記宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  9. ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、１０-5よりも小さいＥ値で表１２のプロファイルＨＭＭとマッチするアミノ酸配列を有し、ポリペプチドがさらに、配列番号１６８に相当するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列における位置５６、１２９、および２０１に相当する３つの保存システイン全てを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  10. ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、配列番号１６８または配列番号２３２に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  11. ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、
    （ａ）約０．２５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｂ）約０．３Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｃ）約０．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｄ）約１．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｅ）約１．５Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｆ）約２．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｇ）約３．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｈ）約４．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｉ）約５．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｊ）約６．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｋ）約７．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｌ）約８．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｍ）約９．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｎ）約１０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、
    （ｏ）約２０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性、および
    （ｐ）約５０．０Ｕ／ｍｇよりも大きい比活性
    からなる群から選択される比活性を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  12. 前記組換え宿主細胞がイソブタノールを産生する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  13. 前記組換え酵母宿主細胞がイソブタノール生合成経路を含む、請求項１２に記載の組換え酵母宿主細胞。
  14. 生産物を製造する方法であって、
    （ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞を備えるステップと、
    （ｂ）上記生産物が産生される条件下、発酵培地中で（ａ）の組換え酵母宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
    を含み、該生産物が、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記方法。
  15. （ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞を備えるステップと、
    （ｂ）イソブタノールが産生される条件下、発酵培地中で（ａ）の組換え酵母宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
    を含む、イソブタノールの製造方法。
  16. ２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換方法であって、
    （ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞を備えるステップと、
    （ｂ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートがα−ケトイソバレレートに変換される条件下で（ａ）の組換え酵母宿主細胞を増殖させるステップと
    を含み、２，３−ジヒドロキシイソバレレートがα−ケトイソバレレートへ変換される、上記方法。
  17. 組換え酵母宿主細胞においてジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドの比活性を増大させるための方法であって、
    （ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞を備えるステップと、
    （ｂ）上記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドが、該異種ポリペプチドを持たない同一の宿主細胞よりも大きい比活性を有する機能性形態で発現される条件下で（ａ）の組換え酵母宿主細胞を増殖させるステップと
    を含む、上記方法。
  18. 宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスを増大させるための方法であって、
    （ａ）請求項３〜１１のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞を備えるステップと、
    （ｂ）該宿主細胞におけるＦｅ−Ｓクラスター生合成経路のフラックスが増大される条件下で（ａ）の組換え酵母宿主細胞を増殖させるステップと
    を含む、上記方法。
  19. 前記組換え酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドのモノマーが、
    （ａ）少なくとも約１０％、
    （ｂ）少なくとも約１５％、
    （ｃ）少なくとも約２０％、
    （ｄ）少なくとも約２５％、
    （ｅ）少なくとも約３０％、
    （ｆ）少なくとも約３５％、
    （ｇ）少なくとも約４０％、
    （ｈ）少なくとも約４５％、
    （ｉ）少なくとも約５０％、
    （ｊ）少なくとも約６０％、
    （ｋ）少なくとも約７０％、
    （ｌ）少なくとも約８０％、
    （ｍ）少なくとも約９０％、および
    （ｎ）少なくとも約９５％
    からなる群から選択されるＦｅ−Ｓクラスター負荷を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  21. ２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの前記変換が、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含有する対照宿主細胞と比較して、
    （ａ）少なくとも約５％、
    （ｂ）少なくとも約１０％、
    （ｃ）少なくとも約１５％、
    （ｄ）少なくとも約２０％、
    （ｅ）少なくとも約２５％、
    （ｆ）少なくとも約３０％、
    （ｇ）少なくとも約３５％、
    （ｈ）少なくとも約４０％、
    （ｉ）少なくとも約４５％、
    （ｊ）少なくとも約５０％、
    （ｋ）少なくとも約６０％、
    （ｌ）少なくとも約７０％、
    （ｍ）少なくとも約８０％、
    （ｎ）少なくとも約９０％、および
    （ｏ）少なくとも約９５％
    からなる群から選択される量で増大される、請求項１６に記載の方法。
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