CN102782119A - 改善需Fe-S簇蛋白质的活性 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组宿主细胞,具体地为酵母细胞,其包含二羟酸脱水酶多肽。本发明还涉及具有增加的二羟酸脱水酶比活性的重组宿主细胞,比活性的增加是所述多肽表达的增加、细胞Fe-S簇生物合成的调制、或它们的组合的结果。本发明还包括使用所述宿主细胞的方法,以及用于鉴定增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量的多肽的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2010年2月17日提交的美国专利临时申请61/305,333的权益,其全文以引用的方式并入本文。
序列表信息
本专利申请附带以电子方式提交的存于ASCII码文本文件CL4842sequencelisting.txt的序列表的内容,其全文以引用的方式并入本文。
发明背景
发明领域
本发明一般涉及微生物学和生物化学领域。具体地,本发明涉及重组宿主细胞,具体地酵母细胞,其包含二羟酸脱水酶多肽。本发明也涉及重组宿主细胞。由于增加了多肽的表达、细胞中Fe-S簇的生物合成活性的调控、或它们的组合的原因,所述宿主细胞具有增加的二羟酸脱水酶多肽比活性。本发明也包括使用所述宿主细胞的方法,以及在宿主细胞中鉴定多肽的方法,所述多肽增加了Fe-S簇的生物合成途径中的通量。
发明背景
铁-硫(Fe-S)簇作为辅因子或辅基,对这类含Fe-S簇蛋白质的正常功能是必需的。在此类含Fe-S簇蛋白质中,发现Fe-S簇有多个重要作用。当此类蛋白质在细胞中第一次合成时,他们缺乏对蛋白质正确功能所必需的Fe-S簇,被称为脱辅基蛋白质。Fe-S簇是在由参与Fe-S簇生物合成的蛋白质催化的一系列反应中形成的,并且传递给脱辅基蛋白质以形成功能的含Fe-S簇全蛋白质。
一个需要有Fe-S簇才能具备正常功能的此类蛋白质是二羟酸脱水酶(DHAD)(E.C.4.2.1.9)。DHAD催化2,3-二羟基异戊酸被转化成α-酮异戊酸,并且2,3-二羟基戊酸甲酯转化成α-酮戊酸甲酯。所述DHAD酶为天然存在的生物合成途径中的一部分,该生物合成途径产生支链氨基酸(即缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)和泛酸(维生素B5)。DHAD催化的2,3-二羟基异戊酸被转化成α-酮异戊酸也是众多异丁醇生物合成途径中的一个普通步骤,其公开于美国专利公开申请公布US20070092957A1中,以引用方式并入本文。其中公开了例如用于生产异丁醇的重组微生物工程。
高水平的DHAD酶活可期待增加来自生物合成途径的产品产量,其包括这种酶活性,包括例如增大的支链氨基酸、泛酸和异丁醇的微生物产量。异丁醇具体地用作燃料添加剂,并且其易获得性可减少对于石化燃料的需求。然而,由于所有已知的DHAD酶需要Fe-S簇以具有功能,它们必须在具有可提供这些蛋白质所需Fe-S簇的遗传机制的宿主中表达。在酵母中,线粒体在Fe-S簇生物合成中起重要作用。如果DHAD在酵母细胞在酵母胞质溶胶中有功能地表达,需要一个系统来传输必需的Fe-S前体或来自线粒体的信号并将Fe-S簇装配到胞质溶胶中的脱辅基蛋白质上。在本发明人的工作之前,酵母是否能为位于细胞质中的任何DHAD提供Fe-S簇是前所未知的(由于新生酵母DHAD位于线粒体中),更重要的是DHAD在细胞质中高水平表达时。
在某些条件下需Fe-S簇的脱辅基蛋白质合成速率可超过细胞为其合成并组装Fe-S簇的能力。在这些条件下积累的缺少簇的脱辅基蛋白质不能执行它们的正常功能。此类条件能包括1)特别大量表达需Fe-S簇的脱辅基蛋白质;2)自身Fe-S簇生物合成蛋白质表达水平高于正常;或3)宿主细胞合成Fe-S簇的能力处于减弱的状态。
发明概述
本文公开了惊人的发现:如果Fe摄入、利用、和/或Fe-S簇生物合成蛋白质中的至少一项的水平发生改变,高水平表达需Fe-S簇的脱辅基蛋白质的重组宿主细胞能够为蛋白质提供与其结合的Fe-S簇。
本文提供的是重组宿主细胞,所述重组宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸,其中所述至少一种异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或能够被调控的拷贝数的质粒。还提供了重组宿主细胞,所述重组宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸,其中所述至少一种异源性多核苷酸在重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。还提供了重组宿主细胞,所述重组宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸,其中所述宿主细胞在编码影响铁代谢或Fe-S簇生物合成的内源性基因中包含至少一种缺失、突变、和/或取代。还提供了重组宿主细胞,其包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸;和编码影响铁代谢或Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸。
在实施方案中,所述编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的异源性多核苷酸选自:表7、8和9中基因。在实施方案中,所述编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的异源性多核苷酸选自:AFT1、AFT2、CCC1、FRA2和GRX3、以及它们的组合。在实施方案中,多肽是由组成型突变的多核苷酸编码的。在实施方案中,所述组成型突变选自:AFT1 L99A、AFT1L102A、AFT1 C291F、AFT1 C293F、以及它们的组合。在实施方案中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽是由多核苷酸编码的,其包含高拷贝数的质粒或能够被调控的拷贝数的质粒。在实施方案中,所述影响Fe-S簇生物合成的多肽是由在重组宿主细胞DNA中被整合至少一次的多核苷酸编码的。在实施方案中,在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一种缺失、突变、和/或取代,选自:CCC1、FRA2和GRX3、以及它们的组合。在实施方案中,编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸选自AFT1、AFT2、它们的突变体、以及它们的组合。
在实施方案中,编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸是以多拷贝表达的。在实施方案中,所述至少一种异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或能够被调控的拷贝数的质粒。在实施方案中,所述至少一种异源性多核苷酸在重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。在实施方案中,所述Fe-S簇生物合成相比于具有内源性Fe-S簇生物合成的重组宿主细胞是增加的。
在实施方案中,所述宿主细胞为酵母宿主细胞。在实施方案中,所述酵母宿主细胞选自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)和毕赤酵母属(Pichia)。
在实施方案中,所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽在宿主细胞的胞质溶胶中表达。在实施方案中,所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽具有以<10-5的E值匹配表12的序型隐蔽马尔科夫模型的氨基酸序列,其中所述多肽还包含全部3个保守的半胱氨酸,它们对应于变异链球菌(Streptococcus mutans)DHAD酶的氨基酸序列中的位点56、129和201,所述变异链球菌DHAD酶对应于SEQ ID NO:168。在实施方案中,所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽与SEQ ID NO:168或SEQ ID NO:232具有至少约90%的氨基酸序列同一性。在实施方案中,所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有选自下列的比活性:大于对照宿主细胞的约5倍,所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸;大于对照宿主细胞的约8倍,所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸;或大于对照宿主细胞的约10倍,所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。在实施方案中,所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有选自下列的比活性:大于对照宿主细胞的约3倍,所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸;以及大于对照宿主细胞的约6倍,所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。在实施方案中,所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有选自下列的比活性:大于约0.25U/mg;大于约0.3U/mg;大于约0.5U/mg;大于约1.0U/mg;大于约1.5U/mg;大于约2.0U/mg;大于约3.0U/mg;大于约4.0U/mg;大于约5.0U/mg;大于约6.0U/mg;大于约7.0U/mg;大于约8.0U/mg;大于约9.0U/mg;大于约10.0U/mg;大于约20.0U/mg;和大于约50.0U/mg。
在实施方案中,所述重组宿主细胞产生异丁醇,并且在在实施方案中所述重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径。
本文还提供了制备产品的方法,所述方法包括:提供重组宿主细胞;并在产生所述产物的条件下,将重组宿主细胞与发酵培养基中发酵碳底物接触;其中所述产物选自支链氨基酸、泛酸、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、异丁醇、以及它们的组合。在实施方案中,所述方法还包括任选地回收所述产品。在实施方案中,所述方法还包括回收所述产品。
还提供了制备异丁醇的各种方法,所述方法包括:提供重组宿主细胞;在产生异丁醇的条件下,将重组宿主细胞与发酵培养基中发酵碳底物接触。在实施方案中,所述方法还包括任选地回收所述异丁醇。在实施方案中,所述方法还包括回收所述异丁醇。
还提供了将2,3-二羟基异戊酸转化成α-酮异戊酸的各种方法,包括:提供重组宿主细胞;使重组宿主细胞在2,3-二羟基异戊酸被转化成α-酮异戊酸的条件下生长。在实施方案中,相比于包含至少一种编码具有二羟酸脱水酶活性的异源性多核苷酸的对照重组宿主细胞,所述2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的转化的增加量选自:(a)至少约5%;(b)至少约10%;(c)至少约15%;(d)至少约20%;(e)至少约25%;(f)至少约30%;(g)至少约35%;(h)至少约40%;(i)至少约45%;(j)至少约50%;(k)至少约60%;(l)至少约70%;(m)至少约80%;(n)至少约90%;和(o)至少约95%。
还提供了增加重组宿主细胞中具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽的比活性的各种方法,包括:提供重组宿主细胞;并使重组宿主细胞在具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽以有功能的形式表达的条件下生长,有功能的形式具有大于缺乏所述异源性多肽的相同的宿主细胞的比活性。
还提供了提高宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径的通量的各种方法,所述方法包括:提供重组宿主细胞;并使重组宿主细胞在宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径的通量增加的条件下生长。
提供了包含需Fe-S簇蛋白质的重组宿主细胞;改变所述宿主细胞中影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性;并且使重组宿主细胞在增加需Fe-S簇蛋白质的活性的条件下生长。在实施方案中,所述活性增加量选自:大于约10%;大于约20%;大于约30%;大于约40%;大于约50%;大于约60%;大于约70%;大于约80%;大于约90%;和大于约95%、98%、或99%。在实施方案中,活性的增加量选自:大于约5倍;大于约8倍;大于约10倍。在实施方案中,活性的增加量选自:大于约3倍和大于约6倍。
宿主细胞中增加Fe-S簇生物合成途径中的通量的多肽的鉴定方法,包括:改变影响Fe-S簇生物合成的多肽表达或活性;测量异源性需Fe-S簇蛋白质的活性;并且比较多肽存在改变的表达或活性时测量的异源性需Fe-S簇蛋白质的活性与多肽不存在改变的表达或活性时测量的异源性需Fe-S簇蛋白质的活性,其中所述异源性需Fe-S簇蛋白质活性的增加表明Fe-S簇生物合成途径中的通量的增加。
本文提供了增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量的多肽的鉴定方法,所述方法包括:改变影响Fe-S簇生物合成的多肽表达或活性;测定具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性;并且比较多肽的表达或活性存在改变时测量的具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性与多肽的表达或活性不存在改变时测量的具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性,其中所述异源具有二羟酸脱水酶活性的多肽活性的增加表明Fe-S簇生物合成途径中的通量的增加。
在实施方案中,影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性改变包含缺失、突变、取代、表达、上调、下调、改变细胞定位、改变蛋白质的状态、和/或加入辅因子。在实施方案中,需Fe-S簇蛋白质具有二羟酸脱水酶活性,并且其中所述具有二羟酸脱水酶活性的需Fe-S簇蛋白质具有匹配表12的序型HMM的氨基酸序列,其具有<10-5的E值。其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸,它们对应于变异链球菌的氨基酸序列中的位点56、129和201,变异链球菌对应于SEQ ID NO:168。在实施方案中,所述影响Fe-S簇生物合成的多肽为选自表7、8和9中的基因。
还提供了包含至少一种编码多肽的多核苷酸的重组宿主细胞,所述多肽由本文提供的方法鉴定。在实施方案中,所述宿主细胞还包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。在实施方案中,所述编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的异源性多核苷酸以多拷贝表达。在实施方案中,所述异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒。在实施方案中,所述异源性多核苷酸在重组宿主细胞中整合至少一次。
在实施方案中,所述宿主细胞为酵母宿主细胞。在实施方案中,所述酵母宿主细胞选自:糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。在实施方案中,所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽在宿主细胞的胞质溶胶中表达。在实施方案中,所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽具有以<10-5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列。其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸,它们对应于变异链球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位点56、129和201,变异链球菌DHAD酶对应于SEQ IDNO:168。在实施方案中,所述重组宿主细胞产生的产物选自支链氨基酸、泛酸、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、异丁醇、以及它们的组合。在实施方案中,重组宿主细胞产生异丁醇。在实施方案中,所述重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径。在实施方案中,所述异丁醇生物合成途径包含由宿主细胞中异源性多核苷酸编码的至少一种多肽。在实施方案中,所述异丁醇生物合成途径包含条由宿主细胞中异源性多核苷酸编码的至少两个多肽。
在实施方案中,本发明的具有二羟酸脱水酶活性的多肽单体具有选自下列的Fe-S簇加载:(a)至少约10%;(b)至少约15%;(c)至少约20%;(d)至少约25%;(e)至少约30%;(f)至少约35%;(g)至少约40%;(h)至少约45%;(i)至少约50%;(j)至少约60%;(k)至少约70%;(l)至少约80%;(m)至少约90%;和(n)至少约95%。
附图简述
图1A描绘了用于过表达来自变异链球菌(S.mutans)的IIvD基因的载体的载体图谱。
图1B描绘了用于过表达来自变异链球菌染色体上的IlvD基因的整合载体的载体图谱。
图2描绘了用于克隆AFT1或AFT1突变体和其它受关注基因的着丝粒载体的载体图谱。
图3描绘了纯化的变异链球菌DHAD的紫外-可见吸收光谱。
图4描绘了纯化的变异链球菌DHAD的EPR光谱。
图5描绘了生物合成异丁醇的生物合成途径。
图6A描绘了维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)nif基因的示意图。
图6B描绘了附加的维涅兰德固氮菌nif基因的示意图。
图6C描绘了其中NFU作为过硫化物还原酶的公式的示意图。
图7描绘了幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)nif基因的示意图。
图8描绘了大肠杆菌(E.coli)isc基因的示意图。
图9描绘了大肠杆菌suf基因的示意图。
图10描绘了胞质溶胶的[2Fe-2S]生物合成和组装系统的示意图。
图11描绘了用于过表达来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的IIvD基因的载体的载体图谱。
表12是基于检测功能的酶计的二羟酸脱水酶的序型HMM表,检测是按照于2009年9月29日提交的美国专利公开12/569,636的描述准备的。表12是在此以电子版形式提交的,并且以引用方式并入本文。
发明详述
本文描述了一种增加与Fe-S簇一起加载的需Fe-S簇蛋白质分数的方法。也描述了重组宿主细胞,其中表达功能的需Fe-S簇的蛋白质,如DHAD酶和异源铁摄入、利用、或Fe-S簇生物合成蛋白质其中至少一种;还有重组宿主细胞,其中表达功能的DHAD酶并在涉及铁利用或Fe-S簇生物合成的天然蛋白质中的至少一种缺失、突变、和/或取代;或包含它们的组合的重组宿主细胞。此外,本发明描述了一种在宿主细胞中增加Fe-S簇生物合成途径的通量的蛋白质的鉴定方法。所述还有一种改变需Fe-S簇蛋白质活性的多肽的鉴定方法。
定义
除非另外规定,本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的意思。如发生矛盾,将以包括所述定义的本专利申请为准。此外,除非上下文另有所需,单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的,所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。
为了进一步限定本发明,本文提供了以下术语和定义。
如本文所用,术语“包含”、“包含”、“包括”、“包括”、“具有”、“具有”、“含有”或“含有”或它们的任何其它变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组。例如,包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素,而可以包括其它未明确列出的元素,或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备所固有的元素。此外,除非另外特别说明,否则“或”是指包含性的或,而不是指排他性的或。例如,以下任一项均表示满足条件A或B:A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
如本文所用,如整个说明书和权利要求中所使用的,术语“由组成”或诸如“由组成”的不同时态的变型表明包括任何列举的整数或整数组,但是无附加整数或整数组可加入到指定的方法、结构或组合物中。
如本文所用,如整个说明书和权利要求中所使用的,术语“基本上由组成”或诸如“基本上由组成”的不同时态的变型表明包括任何列举的整数或整数组,并且任选地包括未显著改变指定的方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。
此外,涉及元素或组分实例(即出现)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在为非限制性的。因此,“一个”或“一种”应被理解为包括一种或至少一种,并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代,除非有数字明显表示单数。
如本文所用,术语“发明”或“本发明”为非限制性术语,并且不旨在意指本发明的任何单独实施方案,而是涵盖如本专利申请所述的所有可能的实施方案。
如本文所用,修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下程序而发生的用数字表示的量的变化:在真实世界中用于产生浓缩物或溶液的一般测定和液体处理操作;通过这些程序中非故意的误差;通过用于产生组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异;等。术语“约”还包括由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰,权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中,术语“约”是指在报告数值10%范围内,优选地在报告数值5%范围内。
术语“异丁醇生物合成途径”是指一种由丙酮酸生成异丁醇的酶(催化)途径。
术语“兼性厌氧菌”是指能够在有氧和无氧环境中生长的微生物。
术语“碳底物”或“能发酵的碳底物”是指本发明的宿主生物体能够代谢的碳源,和尤其选自:单糖、寡糖、多糖和单碳底物或它们的混合物的碳源。
术语“Fe-S簇生物合成”是指Fe-S簇的生物合成,包括,例如,Fe-S簇的组装和加载。术语“Fe-S簇生物合成基因”、“Fe-S簇生物合成蛋白质”或“Fe-S簇生物合成途径”是指那些多核苷酸/基因和编码的多肽,其涉及Fe-S簇生物合成,包括,例如,Fe-S簇的组装和加载。
术语“铁摄入和利用”是指能够影响Fe-S簇生物合成如铁传感、摄入、利用和自稳态的过程。“铁摄入和利用基因”是指那些多核苷酸/基因和编码的多肽,其涉及铁传感、摄入、利用和自稳态。这些多核苷酸/基因中的一部分包含在“Fe Regulon”中,其在文献中已经有过描述并在后面有进一步说明。如本文所用,铁摄入和利用基因和Fe-S簇生物合成基因能够编码影响Fe-S簇生物合成的多肽。
如本文所用术语“比活性”定义为一定量蛋白质的活性单位。因此,所述比活性不是直接测定的而是通过计算得到的:用1)酶样品的活性,单位/ml除以2)该样本中的蛋白质浓度,因此所述比活性表示为单位/mg。纯的、完全活性的酶样品的比活性是这种酶的特性。蛋白质混合物的比活性是量度由感兴趣的活性酶组成的样品中的蛋白质相对分数。本发明所述多肽的比活性可选自大于约0.25U/mg;大于约0.3U/mg;大于约0.4U/mg;大于约0.5U/mg;大于约0.6U/mg;大于约0.7U/mg;大于约0.8U/mg;大于约0.9U/mg;大于约1.0U/mg;大于约1.5U/mg;大于约2.0U/mg;大于约2.5U/mg;大于约3.0U/mg;大于约3.5U/mg;大于约4.0U/mg;大于约5.5U/mg;大于约5.0U/mg;大于约6.0U/mg;大于约6.5U/mg;大于约7.0U/mg;大于约7.5U/mg;大于约8.0U/mg;大于约8.5U/mg;大于约9.0U/mg;大于约9.5U/mg;大于约10.0U/mg;大于约20.0U/mg;或大于约50.0U/mg。在一个实施方案中,本发明的多肽的比活性大于约0.25U/mg。在另一个实施方案中,所述比活性大于约1.0U/mg。在另一个实施方案中,所述比活性大于约2.0U/mg或大于约3.0U/mg。
术语“多核苷酸”旨在涵盖单个核酸以及多个核酸,和指核酸分子或核酸构建体,例如,信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸能够包含全长cDNA序列的核苷酸序列,或其片段,包括非翻译的5′和3′端序列和编码序列。所述多核苷酸能够由任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸组成,其可为非改性的RNA或DNA,或改性的RNA或DNA。例如,多核苷酸能够由单链和双链DNA构成,其为单链和双链区域的混合物;单链和双链RNA,其为单链和双链区域的混合物;包含DNA和RNA的杂合分子,其可为单链或,更典型地双链或单链和双链区域的混合物。“多核苷酸”包含了化学地、酶学地、或代谢地改性的形式。
多核苷酸序列可意为“分离的”,其中它从天然的环境中移除出来。例如,包含在载体中的编码具有二羟酸脱水酶活性多肽或多肽片段的异源性多核苷酸,出于本发明的目的可被认为是分离的。分离的多核苷酸的另一个例子包括异源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分地或基本上)多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括此类人工合成生产的分子。DNA聚合物分离的多核苷酸片段形式可由一个或更多个cDNA、基因组DNA或合成DNA片段构成。
术语“基因”是指多核苷酸,其能够表达为特异性蛋白质,任选地包括在编码序列前面的(5′非编码序列)和后面的(3′非编码序列)调节序列。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因,包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此,嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列,或者源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。
如本文所用,“编码区”是指由翻译为氨基酸的密码子组成的核酸部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA、或TAA)不翻译为氨基酸,它可被考虑作为编码区域的一部分,但任何侧翼序列,例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、以及等等,不是编码区域的一部分。本发明的两个或更多个编码区域能存在于单种多核苷酸构建体中,例如,在单个载体上;或在独立的多种多核苷酸构建体中,例如,在独立的(不同的)载体中。此外,任何载体可包含单个编码区域,或可包含两个或更多个编码区域。此外,本发明的载体、多核苷酸、或核酸可编码异源编码区域。
术语“内源性”在用于提及多核苷酸、基因、或多肽时是指在生物体基因组中天然位置的原生的多核苷酸或基因,或是由基因组这个位置转录和翻译的原生的多肽。
术语“异源性”在用于提及多核苷酸、基因、或多肽时是指在宿主生物体中没有正常地发现的多核苷酸、基因、或多肽。“异源”也包括原生的编码区域、或它们的一部分,即以不同于对应的原生基因的一种形式重新导入源生物体,例如,不在所述生物体基因组中的原生位置上。所述异源性多核苷酸或基因可通过例如基因转移的方式导入宿主生物体。异源性基因可包括原生的编码区域,其带有重新导入所述原生宿主的非原生调节区域。“转基因”是已通过转化程序导入基因组内的基因。
术语“重组基因表达元件”是指表达一个或多个特异性蛋白质的核苷酸片段,其包括前面的调控序列(5′非编码序列)和之后的(3′终止序列)蛋白质编码序列。嵌合基因是重组基因表达元件。操纵子的编码区域可形成重组基因表达元件,一起的还有可操作地连接的启动子和终止区域。
“调控序列”是指位于编码序列上游(5′非编码序列)、内部、或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列,并且能影响相关的编码序列的转录、RNA加工或RNA稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、增强子、操纵子、阻遏子、转录终止信号、翻译引导序列、内含子、多聚腺苷酸识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的核苷酸序列。一般来讲,编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可来源于天然基因的全部、或由天然存在的不同启动子的不同元件组合而成、或甚至包含合成的核酸片段。本领域的技术人员应当理解,不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中,或在不同的发育阶段,或响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。另一方面,“诱导型启动子”在所述启动子被启动子特异的信号或分子诱导或打开时导致基因表达。还应认识到因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围,不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联,使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如,当启动子能够影响编码序列的表达(即该编码序列受到该启动子的转录控制)时,则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。
术语“表达”如本文所用是指表达和积累来源于本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA。表达也可指将mRNA翻译成多肽。这个过程包括表达的核苷酸、基因、或包括在细胞内多肽的功能存在的任何表现,没有限制,基因敲出以及瞬时表达和稳定表达。
术语“过表达”如本文所用是指表达高于相同或相关多核苷酸或基因的内源性表达。如异源性多核苷酸或基因的表达高于可比的内源性基因,或高于以非过表达多核苷酸或基因方式导入的相同的多核苷酸或基因,则这种异源性多核苷酸或基因就是过表达的。例如,多核苷酸能在宿主细胞中以低拷贝数的质粒表达,其仅存在于非常有限或少数的拷贝中,并且相同的多核苷酸能在宿主细胞中以高拷贝数的质粒或能够被调控的拷贝数的质粒过表达,其以多个拷贝形式存在。任何方式都能用于过表达多核苷酸,只要它增加多核苷酸在宿主细胞中的拷贝。除了使用高拷贝数的质粒,或能调控拷贝数质粒,多核苷酸能通过染色体上多次整合而过表达。
在重组宿主细胞中本发明的多肽的表达或过表达,能按照技术人员已知的任何数量的方法来量化,并且能以例如细胞总蛋白质百分数来表示。所述总蛋白质的百分数能大于细胞总蛋白质的约0.001%的量;大于细胞总蛋白质的约0.01%;大于细胞总蛋白质的约0.1%;大于细胞总蛋白质的约0.5%;大于细胞总蛋白质的约1.0%;大于细胞总蛋白质的约2.0%;大于细胞总蛋白质的约3%;大于细胞总蛋白质的约4.0%;大于细胞总蛋白质的约5%;大于细胞总蛋白质的约6.0%;大于细胞总蛋白质的约7.0%;大于细胞总蛋白质的约8.0%;大于细胞总蛋白质的约9.0%;大于细胞总蛋白质的约10%;或大于细胞总蛋白质的约20%。在一个实施方案中,多肽的表达量大于总细胞蛋白质的约0.5%。在另一个实施方案中,多肽的表达量大于总细胞蛋白质的约1.0%或大于总细胞蛋白质的约2.0%。
如本为所用术语“转化”指转移核酸片段到宿主生物中,获得有选择或无选择的基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
如本文所用,术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件,并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或线性或环状的单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列,其中多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中,该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起引入细胞中。
如本文所用术语“密码子简并性”是指在遗传密码中核苷酸序列允许变化的性质,这种变化不影响编码多肽中的氨基酸序列。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此,当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时,希望对基因进行设计,使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
如它是指用于转化各种宿主的基因或编码区域的核酸分子,术语“密码子优化的”是指在基因或编码区域的核酸分子中的密码子改变,反映了在没有改变DNA编码的多肽情况下宿主生物典型的密码子使用情况。此类优化包括将至少一种、或多于一种、或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一种或多种密码子。
在包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的差异使得在编码所述基因的序列中发生突变。因为每个密码子由三个核苷酸组成,并且包含DNA的核苷酸限于四个特定碱基,有64个可能的核苷酸组合,它们中的61个编码氨基酸(剩余的三个密码子编码翻译终止信号)。示出哪个密码子编码哪个氨基酸的“遗传密码”在本文表1中示出。因此,许多氨基酸由多于一种密码子编码。例如,氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四个核苷酸三联体编码,丝氨酸和精氨酸由六个核苷酸三联体编码,而色氨酸和甲硫氨酸仅由一个核苷酸三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组合发生广泛的改变,并且不改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。
表1:标准基因编码
许多生物显示在生长的肽链中使用特定密码子编码插入的特定氨基酸时的偏差。密码子偏好、或密码子偏好性、生物体间密码子使用的差异是遗传密码子的简并性造成的,在很多生物体中有很详细的记录。密码子偏好性常与信使RNA(mRNA)的翻译效率有关,这继而据信取决于特别是被翻译的密码子的特性和特定转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞中选择的优势tRNA一般是在肽合成中最频繁使用的密码子的反映。因此,可修饰基因以在给定生物中基于密码子优化进行最佳的基因表达。
如果大量基因序列可用于广泛的动物、植物和微生物物种,计算密码子使用的相关频率是可能的。密码子使用表是易得的,例如在http://www.kazusa.or.jp/codon/(2008年3月20日访问)提供的“密码子使用数据库”,并且这些表格可以在许多方面进行调整。参见Nakamura,Y.,等人.Nucl.Acids Res.28:292(2000)。从GenBank Release 128.0[2002年2月15日]中计算出的酵母密码子使用表在下表2中示出。这个表使用mRNA命名,并且因此取代了存在于DNA中的胸腺嘧啶(T),所述表使用存在于RNA中的尿嘧啶(U)。表2经过了调整,因此计算了每个氨基酸的频率,而非全部64个密码子。
表2:啤酒糖酵母基因的密码子使用表
通过利用这个表或相似的表,本领域的普通技术人员能够将所述频率应用于任何给定的多肽序列,并且产生密码子优化的编码区的核酸片段,其编码所述多肽,但是使用给定物种的最优密码子。
以最优频率随机分配以编码给定多肽序列的密码子能够通过计算每个氨基酸的密码子频率人工完成,然后将所述密码子随机分配到多肽序列。此外,多个算法和计算机软件程序是本领域的普通技术人员易得的。例如,Lasergene包中的“EditSeq”功能,购自DNAstar,Inc.,Madison,WI,VectorNTI套件的backtranslation功能,购自InforMax,Inc.,Bethesda,MD,和GCG-Wisconsin包中的“backtranslation”功能,购自Accelrys,Inc.,San Diego,CA。此外,对密码子优化的编码区序列来说,各种资源是可公开获取的,例如http://www.entelechon.com/bioinformatics/backtranslation.php?lang=eng提供的backtranslation功能(2008年4月15日访问过),和http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/index.html提供的“backtranseq”功能(2002年7月9日访问过)。构建用于基于给定频率分配密码子的基本算法也可由本领域的普通技术人员利用基本的数学功能容易地完成。
密码子优化的编码区也可通过本领域的技术人员已知的多个方法进行设计,包括软件包如“synthetic gene designer”(http://phenotype.biosci.umbc.edu/codon/sgd/index.php)。
如本文所用,术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”,并指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接组成的分子。术语“多肽”指两个或更多个氨基酸的任何单链或多链,并且不涉及特定长度的产物。因此,肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”、或其它任何用于指由两个或更多个氨基酸组成的一条链或多条链的术语,都包括在“多肽”的定义内,并且术语“多肽”可用于取代或与这些术语中任一项互换使用。一条多肽可来源于天然生物源或由重组技术产生,但不一定是由一条指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成,包括通过化学合成。
以“分离的”多肽或片段形式的变体和其衍生物拟为不在其自然环境下的多肽。不需要特别的纯化水平。例如,分离的多肽能够从它原生的或天然的环境中去除。在宿主细胞中重组产生的多种多肽和蛋白质考虑以所述发明目的进行分离,即为原生的或重组的多肽,其已通过任何适宜的技术分离、分馏、或部分或大幅纯化。
如本文所用,术语“变体”是指与本发明专门列举的多肽不同的多肽,如DHAD,其由于氨基酸插入、缺失、突变和取代、使用例如重组DNA技术如诱变而生成。判断哪个氨基酸残基可被替换、添加、或删除而不影响受关注活性的指导意见,其得出可通过比较特定多肽与同源性,例如酵母或细菌的多肽的序列,并且最小化在高同源性区(保守区)氨基酸序列变化的数量或用共有序列替换氨基酸的数量。
作为另外一种选择,编码这些相同或相似多肽的重组多核苷酸变体可以合成或通过利用遗传密码子的冗余而选出。各种密码子取代,如产生各种限制性位点的沉默变化,可引入以优化克隆到质粒表达载体或病毒表达载体。多核苷酸序列的多种突变可体现在所述多肽或添加到所述多肽的其它肽的结构域中以改变多肽中任意部分的性质。例如,突变能用于降低或消除靶蛋白质的表达,并且包括但不限于整个或部分基因的缺失、基因中DNA片段的插入(在启动子区或编码区域),因此所述蛋白质不表达或低水平表达;在编码区域引入突变即增加终止密码子或移框使得有功能的蛋白质不表达;以及在编码区域引入一个或多个突变以改变氨基酸,因此表达无功能的或较少酶活性的蛋白质。
氨基酸“取代”可为一个氨基酸替换为另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸的结果,例如,保守的氨基酸替换,或可为一个氨基酸替换为另一个具有不同结构和/或化学性质的氨基酸的结果,例如,非保守的氨基酸替换。“保守的”氨基酸取代可在参与残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性本质相似性的基础上进行。例如非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸;极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺;带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸;并且带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。作为另外一种选择,“非保守”氨基酸取代可通过选择这些氨基酸中任一项在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性本质的差异而进行。“插入”或“缺失”可在重组蛋白质结构上或功能上耐受的变型范围之内。允许的变型可通过使用重组DNA技术系统性地在氨基酸分子中制造氨基酸插入、删除、或取代并检测重组变体的活性来以实验方法确定。
氨基酸或核酸序列的“主要部分”是指部分包含多肽中足够的氨基酸序列或多核苷酸中足够的核苷酸序列的部分,可以推测地鉴定该多肽或基因,既可通过由本领域技术人员对序列手工评估,或用如BLAST的算法进行计算机自动化的序列比较和鉴定(Altschul,S.F.,等人,J.Mol.Biol.,215:403-410(1993))的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定进行。一般来讲,为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源性,需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外,对于核苷酸序列,包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外,12至15个碱基的短寡核苷酸可在聚合酶链反应中用作扩增引物,以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此,核苷酸序列的“基本部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码特定蛋白质的完整氨基酸和核苷酸序列。具有如本文报道序列的有益效果,技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知的目的。因此,本发明包括如随附的序列表中所示的完整序列,以及如上文定义的这些序列的基本部分。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如,针对DNA,腺嘌呤与胸腺嘧啶互补并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补,和针对RNA,腺嘌呤与尿嘧啶互补并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
术语“百分比同一性”如本领域已知是指通过比较多个序列测定的、两个或更多个多肽序列或两个或更多种多核苷酸序列之间的关系。本领域中“同一性”也意为多肽或多核苷酸序列之间的序列关联度,视情况而定,如由此类序列字符串的匹配来测定。“同一性”和“相似性”能通过已知方法容易地计算出来,包括但不限于那些描述见下列:1.)Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,Ed.)Oxford Universitv:NY(1988);2.)Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.,Ed.)Academic:NY(1993);3.)Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,Eds.)Humania:NJ(1994);4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.Ed.)Academic(1987);和5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.Eds.)Stockton:NY(1991)。
设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.,Madison,WI))中的MegAlignTM程序进行。序列多重比对采用“Clustal比对方法”进行,其涵盖几种算法包括所述“Clustal V比对方法”,其对应于标记为Clustal V的比对方法(描述见Higgins and Sharp,CABIOS.5:151-153(1989);Higgins,D.G.等人,Comput.Appl.Biosci.,8:189-191(1992))中,并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignTM程序中找到的比对方法。对于多重比对,默认值对应于空位罚分(GAP PENALTY)=10和空位长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)=10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE=1、空位罚分=3、窗口(WINDOW)=5和DIAGONALS SAVED=5。对于核酸,这些参数为KTUPLE=2,GAP PENALTY=5,WINDOW=4以及DIAGONALSSAVED=4。在使用Clustal V程序进行序列比对后,通过查看同一程序中的“序列距离”表格有可能获得“百分比同一性”。另外所述“ClustalW比对方法”是可用的并对应于标记为Clustal W的比对方法(描述见Higgins and Sharp,CABIOS.5:151-153(1989);Higgins,D.G.等人,Comput.Appl.Biosci.8:189-191(1992)中有所描述)和可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignTM v6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数(缺口罚分=10、缺口长度罚分=0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(%)=30、DNA转换权重(DNA Transition Weight)=0.5、蛋白质权重矩阵(Protein WeightMatrix)=Gonnet系列和DNA权重矩阵(DNA Weight Matrix)=IUB)。在使用Clustal W程序进行序列比对后,通过查看在同一程序中的“序列距离”表有可能获得“百分比同一性”。
本领域的技术人员充分理解许多水平的序列一致性对鉴定来自其它物种的多肽有用,其中此类多肽具有相同或相似功能或活性,或对描述相应的多核苷酸有用。有用的一致性百分比例子包括但不限于:55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%、或55%至100%的任何正数百分比在描述本发明时可为有用的,如55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。适宜的多核苷酸片段不仅具有上述同源性,而且典型地包含多核苷酸有至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、或至少250个核苷酸。此外,适宜的具有上述同源性的多核苷酸片段编码的多肽具有至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、或至少250个氨基酸。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于:1.)GCG程序套件(Wisconsin PackageVersion 9.0,Genetics Computer Group(GCG),Madison,WI);2.)BLASTP,BLASTN,BLASTX(Altschul等人,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990));3.)DNASTAR(DNASTAR,Inc.Madison,WI);4.)SEQUENCHER(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI);和5)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson,Comput.MethodsGenome Res.,[Proc.Int.Symp.](1994),Meeting Date 1992,111-20。编辑:Suhai、Sandor。Plenum:New York,NY)。在本专利申请案的上下文中应当理解,使用序列分析软件进行分析时,除非另外指明,否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。在此所用的“默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述:Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.的Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)(hereinafter“Maniatis”);以及Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY(1984);以及Ausubel,F.m.等人,Current Protocolsin Molecular Biology,published by Greene Publishing Assoc.andWiley-Interscience(1987)。
需Fe-S簇蛋白质的功能
包含Fe-S簇蛋白质的功能是各种不同的。对这些功能分类的更完整结果之一在下列表格中给出,其修改自Johnson,D.C.,等人,Structure,function,and formation of biological iron-sulfur clusters.Annu.Rev.Biochem.,2005.74:第247-281页。
表3:生物[Fe-S]簇 a 的功能。
a S-腺苷甲硫氨酸缩写为SAMb;乙酰-CoA,乙酰辅酶A;FNR,延胡索酸和硝酸盐还原;IRP,铁-调节蛋白质;IscR,铁-硫簇组装调节蛋白质。PRPP,磷酸核糖焦磷酸。
据信,在将Fe-S簇加载到上述类的一个或多个成员的过程中,其供应与效率的增加将具有商业和/或医学上的有益效果。在将为技术人员所赞赏的许多可能性中,给出了3个实例。1)当含Fe-S簇的酶用于发酵产品的途径中并且需要高水平表达以保持该产品途径的高通量(例如,异丁醇途径中的二羟酸脱水酶)。2)当含Fe-S簇的酶用于发酵产品的途径中并且在催化中Fe-S簇经历周转(例如,商业发酵葡萄糖为生物素过程中的生物素合成酶)。3)在疾病状态下使得对健康重要的含Fe-S簇蛋白质的正常浓度为低水平(例如,在弗里德赖希氏共济失调的情况下)。
DHAD和DHAD分析
DHAD为脱水酶类(更准确的为水裂合酶)的需Fe-S簇蛋白质。编码DHAD酶的基因能用于在重组宿主细胞中提供DHAD活性的表达。DHAD催化2,3-二羟基异戊酸到α-酮异戊酸以及2,3-二羟基戊酸甲酯到α-酮戊酸甲酯的转化,分类为E.C.4.2.1.9。适用于重组宿主细胞的DHAD编码序列能够来源于细菌、真菌、或植物源。可使用的DHADs可具有[4Fe-4S]簇或[2Fe-2S]簇。本发明可使用表4a、4b、5和6列出的代表DHADs的编码区和蛋白质。与某些列表的序列具有至少约95%同一性的蛋白质已因简化而略去了,但应当理解,本文所公开可使用与表4a、4b、5和6列出的任一项蛋白质具有最少约95%同一性的蛋白质,包含那些因简化而略去的。附加的DHAD蛋白质和它们的编码序列可通过BLAST搜索公共数据库来鉴定,如本领域技术人员所熟知的。通常在公开提供的数据库中BLAST(如上面所述)搜寻已知的DHAD序列,如本文中提供的那些,用于鉴定多个DHAD和它们在目前细胞中可表达的编码序列。例如,DHAD蛋白质,其具有和表3中任一项DHAD蛋白质至少约80-85%、至少约85-90%、至少约90-95%、或至少约98%的氨基酸序列序列同一性,在目前细胞中可表达。同一性基于Clustal W比对方法,所述方法采用空位罚分=10、空位长度罚分=0.1的默认参数和Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵。
表4a:代表性细菌的[2Fe-2S]DHAD蛋白质的SEQ ID NOs和编码 序列。
表4b:附加的代表性细菌[2Fe-2S]DHAD蛋白质和编码序列。
表5:代表性真菌和植物[2Fe-2S]DHAD蛋白质的SEQ ID NOs和编 码序列。
表6:代表性[4Fe-4S]DHAD蛋白质和编码序列的SEQ ID NOs。
附加的[2Fe-2S]DHAD可用于2009年9月29日提交的美国专利申请12/569,636中描述的分析方法进行鉴定,其全文以引用的方式并入本文。所述分析如下:基于八个功能不同的DHADs的氨基酸序列,准备了序型隐蔽马尔科夫模型(HMM)。已经描述了序型HMM的应用。参见例如,Krogh等人,J.Mol.Biol.235:1501-1531(1994)或Durbin等人,“Markov chains and hidden Markov models,”in Biological SequenceAnalysis:Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids,CambridgeUniversity Press(1998)。序型HMM是一种建立在多重序列比对上的统计模型,其能够用于判断测试序列是否属于某特定的序列家族。参见id.序型HMM能够建立是能通过使用常规的序列比对工具,首先生成功能验证序列的比对。下一步,使用可公开获取的软件程序(例如HMMER)将序列比对用于构建序型HMM,所述软件使用位置特异性分选系统来获取输入序列的多重比对中不同氨基酸位点保守度的信息。更具体地,获取与表达式成正比的在“匹配”状态的氨基酸残基的得分(即匹配状态发散得分),或在“插入”状态(即插入状态发散得分):Log_2(p_x)/(null_x)。参见id.在所述表达式中,术语“p_x”为在依据序型HMM比对中的特定位点上的氨基酸的概率,并且术语“null_x”为依据Null模型的概率。参见id.所述Null模型为简单的单态概率模型,具有来源于氨基酸分布每种氨基酸的一套预计算的发散概率。参见id.“态”过渡分数也计算为几率参数的对数且与Log_2(t_x)成正比。参见id.在这个表达式中,术语“t_x”为过渡到发散或非发散状态的概率。参见id.有关所述特定统计分析以生成序型HMM的更多细节在Krogh等人,J.Mol.Biol.235:1501-1531(1994)或Durbin等人,“Markov chains andhidden Markov models,”in Biological Sequence Analysis:ProbabilisticModels of Proteins and Nucleic Acids,Cambridge University Press(1998),或U.S.Patent Appl.12/569,636中进行了描述。
准备的序型隐蔽马尔科夫模型(HMM)是基于八个功能验证的DHAD的氨基酸序列计,包括来源于欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)(DNA SEQ ID NO:309;蛋白质SEQ ID NO:310)、集胞藻属(Synechocystis sp.)PCC6803(DNA SEQ ID:297;蛋白质SEQ IDNO:298)、变异链球菌(DNA SEQ ID NO:167;蛋白质SEQ ID NO:168)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(DNA SEQ ID NO:163;蛋白质(*原文可能少protein*)SEQ ID No:164)、抗重金属罗尔斯通氏菌(Ralstonia metallidurans)(DNA SEQ ID NO:345;蛋白质SEQ IDNO:346)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)(DNA SEQ IDNO:343;蛋白质SEQ ID NO:344)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(DNA SEQ ID NO:231;蛋白质SEQ ID NO:232)。此外在大肠杆菌表达并用于构建序型时,发现所述来源于约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)(DNA SEQ ID NO:229;蛋白质SEQ ID NO:230)的DHAD具有二羟酸脱水酶活性。E.coli所述HMM序型使用HMMER软件包,按照可从HMMER(Janelia Farm Research Campus,Ashburn,VA)获得的用户指南制备(HMM序型背后的理论描述于R.Durbin,S.Eddy,A.Krogh和G.Mitchison,Biological sequence analysis:probabilistic modelsof proteins and nucleic acids,Cambridge University Press,1998;Krogh等人,1994;J.Mol.Biol.235:1501-1531中)。HMMER软件程序的输出结果是特征化所输入序列的剖面隐马尔可夫模型(HMM)。为这八个所述DHAD蛋白质准备的序型HMM在2009年9月29日提交的美国申请12/569,636和表12中。
表12中的首行对每个位点报告了在“状态”(匹配状态发散得分)中每个氨基酸的概率。第二行报告了插入状态发散得分,而第三行报告了状态过渡得分。对每一位点,突出显示了最高的可能性。这些得分能转换算为“E值”(期望值),其为命中的数值或期望仅凭几率获得的序型HMM匹配值。具有以<10-5的E值匹配序型HMM的蛋白质,表明该蛋白质与用于构建序型HMM的蛋白质共有显著序列相似性,并且该蛋白质属于该序型HMM代表的家族。
任何具有以<10-5的E值匹配序型HMM的蛋白质是DHAD相关蛋白质,其包括[4Fe-4S]DHADs、[2Fe-2S]DHADs、阿拉伯糖脱水酶和磷酸葡萄糖酸脱水酶。在实施方案中,匹配序型HMM的序列将分析三个保守半胱氨酸的存在,它们对应于变异链球菌DHAD中的56、129和201位点。全部三个保守半胱氨酸的存在是含[2Fe-2S]簇蛋白质的特征。具有着三个保守半胱氨酸的蛋白质包括阿拉伯糖酸脱水酶和[2Fe-2S]DHADs。通过分析在[2Fe-2S]DHADs或阿拉伯糖酸脱水酶中存在的保守氨基酸标记,其位点对应的为变异链球菌DHAD氨基酸序列中的下列位点,可以区分[2Fe-2S]DHADs和阿拉伯糖酸脱水酶。这些氨基酸标记在[2Fe-2S]DHADs或阿拉伯糖酸脱水酶中,分别地为下列位点(出现大于90%):88位天冬酰胺与谷氨酸;113位非保守的与谷氨酸;142位精氨酸或天冬酰胺与非保守的;165位非保守的与甘氨酸;208位天冬酰胺与非保守的;454位亮氨酸与非保守的;477位苯丙氨酸或酪氨酸与非保守的;以及487位甘氨酸与非保守的。
另外,本文提供的DHAD编码区序列可用于鉴定其它天然同源性物。此类方法在本领域为人们所熟知,并且在2009年9月29日提交的美国专利申请12/569,636描述了多种可用于分离编码同源性蛋白质基因的方法,此类方法以引用方式并入本文。
在表达异源性DHAD的工程细胞中DHAD活性的存在能通过本领域已知的方法来确认。如一个实例,并如本文实施例中展示的,来自于表达细菌的DHAD的工程细胞的粗提物可用于使用二硝基苯肼的DHAD测定,其测定方法参见Flint and Emptage(J.Biol.Chem.(1988)263(8):3558-64)。在另一个实例中,DHAD的活性的测定可通过采用本文所公开的在缺乏内源性DHAD活性的酵母菌株中表达异源性DHAD来进行测定。如果DHAD活性存在,则所述酵母菌株将在不存在支链氨基酸的条件下生长。DHAD活性还可通过更多的间接方法被确认,例如通过分析在需要DHAD活性的途径中的下游产物。以α-酮异戊酸或α-酮戊酸甲酯作为途径的中间体的任何产物可用于DHAD活性测定。一个此类产物的列表包括但不限于缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、泛酸、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和异丁醇。
DHAD活性的过表达
申请人发现,在宿主细胞中异源性DHAD的表达能提供DHAD活性。DHAD的表达(其可如本文所述鉴定)能够为生物合成途径提供DHAD活性,所述途径包括2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的转化或2,3-二羟基戊酸甲酯至酮戊酸甲酯的转化。此外,所述变异链球菌[2Fe-2S]DHAD显示与2009年9月29日提交的美国专利申请12/569,636相关,以引用方式并入本文,相比于大肠杆菌[4Fe-4S]DHAD在空气中具有更高的稳定型,其被期望在异源宿主细胞中获得更好的活性。
此外,如本文所述,已发现在宿主细胞中表达时更高水平表达异源性DHAD能提供增加的DHAD活性。重组多核苷酸的高表达能以至少两个方法实现:1)通过增加包含所述重组多核苷酸的质粒拷贝数;或2)通过整合受关注基因的多个拷贝在宿主细胞染色体上。如本文为例,多拷贝异源性DHADA的表达提供了异源性DHAD比活性的增加
重组多核苷酸通常使用编码序列作为转化用嵌合基因的一部分进行克隆表达,所述嵌合基因包括可操作地连接至编码序列的启动子以及核糖体结合位点和终止控制区。所述编码区可来源于转化用的宿主细胞并结合了编码DHAD的天然基因的非原生调节序列。作为另外一种选择,所述编码区可来源于另一个宿主细胞。
用于转化多种宿主细胞的载体是常见的并在文献中有描述。载体通常包含选择性标记和在目标宿主中允许自主复制或染色体整合的序列。此外,适宜的载体可包含启动子区,其提供了转录起始控制、转录终止控制区、两者其中的编码区可插入DNA片段,为插入的编码区提供表达。这两种控制区均可来源于与转化的宿主细胞同源性的基因,但是应当理解,这种控制区也可能来源于对被选择作生产宿主的特定物种来说是非天然的基因。
能作为异源细菌DHAD表达或过表达的宿主的酵母细胞,为适宜基因操作的任何酵母细胞,其包括但不限于,酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)和毕赤酵母属(Pichia)。适合的菌株包括但不限于啤酒糖酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、光滑假丝酵母、白假丝酵母、树干毕赤酵母和解脂耶氏酵母。在一个实施方案中,所述宿主为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
用包含编码DHAD序列的基因转化宿主细胞可获得表达,例如在表4a、4b、5或6中列出的DHAD,或用与2009年9月29日提交的美国专利申请12/569,636相关的筛选方法鉴定的DHAD,以引用方式并入本文。所述用于表达DHAD的编码区可为针对靶宿主细胞密码子优化的,如本领域技术人员所熟知的。酵母基因表达方法是本领域众所周知的(参见例如Methods in Enzymology,Volume 194,Guide to Yeast Geneticsand Molecular and Cell Biology(Part A,2004,Christine Guthrie and GeraldR.Fink(Eds.),Elsevier Academic Press,San Diego,CA)。基因在酵母中的表达通常需要可操作地连接至所关注的编码区的启动子,和转录终止子。许多酵母启动子能用于构建酵母中的基因表达盒,包括但不限于来源于下列基因的启动子:CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、CUP1、FBA、GPD、GPM和AOX1。适宜的转录终止子包括但不限于FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、GAL1t、CYC1和ADH1。
适宜的启动子、转录终止子和DHAD编码区可克隆到大肠杆菌-酵母穿梭载体中并转化到酵母细胞中。这些载体允许菌株在大肠杆菌和酵母株中繁殖。在一个实施方案中,使用的载体包含一个选择性标记和允许自主复制的序列或允许整合到期望宿主染色体上的序列。酵母中使用的质粒例子为穿梭载体Examples of plasmids used in yeast are shuttlevectors pRS423、pRS424、pRS425和pRS426(美国典型培养物保藏中心,Manassas,VA),其包含大肠杆菌复制起点(例如pMB1)、酵母2-微米复制起点和营养选择的标记。这四种载体的选择标记是His3(载体pRS423)、Trp1(载体pRS424)、Leu2(载体pRS425)和Ura3(载体pRS426)。构建具有编码所述DHADs的嵌合基因的表达载体能以或者在大肠杆菌中标准分子克隆技术完成或者在酵母中间隙修复重组方法完成。
缺口修复克隆方法利用了酵母中高效的同源性重组。例如,酵母载体DNA消化后(例如在其多克隆位点)在其序列中创建一个间隙。生成了许多受关注的插入DNA,所述插入DNA在5′和3′端包含≥21bp的序列,这些序列彼此依次重叠,并且与载体DNA的5′和3′末端重叠。例如,为构建“Gene X”的酵母表达载体,表达盒选择了酵母启动子和酵母终止子。所述启动子和终止子扩增自酵母基因组DNA,而基因X通过聚合酶链反应扩增自其源生物,或者从包含基因X序列的克隆载体获得。至少21bp的重叠序列存在于在线性载体和启动子序列的5′之间、在启动子和基因X之间、基因X与终止子序列之间、以及在终止子与线性载体3′末端之间。然后,所述“有间隙的”载体和所述插入DNAs共转化到酵母菌株中并且接种到包含适宜化合物混合物的培养基上,将允许质粒上的营养选择标记互补。通过利用从选择的细胞制备的质粒DNA进行聚合酶链反应作图,能够验证正确的插入组合的存在。然后,可将从酵母分离的质粒DNA(通常浓度较低)转入大肠杆菌菌株,例如TOP10,然后通过小量抽提和限制性作图进一步验证所述质粒构建体。最后,所述构建体能通过序列分析进行验证。
与缺口修复技术类似,向酵母基因组的整合也利用了酵母中的同源性重组系统。例如,含有编码区加控制元件(启动子和终止子)和的盒,用高保真DNA聚合酶进行聚合酶链反应扩增,所用引物为与盒杂交并包含40-70个碱基对的序列,所述序列与期望插入的基因座区域的5′和3′区同源性。然后将聚合酶链反应产物转入酵母,并铺板于包含适当的化合物混合物的培养基上,所述混合物允许对所整合的营养缺陷型标记的选择。例如,为整合基因X到染色体位置Y中,所述启动子-编码区X-终止子构建体是由质粒DNA构建体聚合酶链反应扩增的,并通过SOE聚合酶链反应或一般的限制性消化和克隆接合到营养缺陷型标记(如URA3)。所述全长盒,包含启动子-编码区X-终止子-URA3区,是聚合酶链反应扩增得到的,所用引物序列为包含40-70个碱基对、与酵母染色体Y位置的5′和3′区同源性。上述聚合酶链反应产物被转入酵母,并在缺乏尿嘧啶的生长培养基上进行选择。转化体可通过克隆聚合酶链反应或通过对染色体DNA的直接测序得到验证。
除了上述材料和方法可用于表达异源性DHAD,这些相同的,或相似的材料和方法可用于过表达异源性DHAD,使用修改本领域技术人员已知的。例如,当使用基于质粒的系统来过表达所述重组多核苷酸时,可构建高拷贝数载体,或具有可调节拷贝数的载体。此类可调节或可诱导的系统如本文实施例1中所述;然而,其它系统也为本领域技术人员已知,并且可用于构建其它的高拷贝数或具有可调节拷贝数的载体。另外,当使用基于整合的系统来过表达重组多核苷酸时,需要一个靶向多重整合位点的整合载体。基于多重整合的系统如本文实施例2中所述;然而,其它基于多重整合的系统也为本领域技术人员已知,并且可用于重组多核苷酸的靶向多重整合,例如,整合到rDNA区域。
重组宿主细胞中异源性DHAD的表达能被定量,例如占细胞总蛋白质的百分比。此类过表达能被定量为选自:(a)大于细胞总蛋白质的约0.001%;(b)大于细胞总蛋白质的约0.01%;(c)大于细胞总蛋白质的约0.1%;(d)大于细胞总蛋白质的约0.5%;(e)大于细胞总蛋白质的约1.0%;(f)大于细胞总蛋白质的约2.0%;(g)大于细胞总蛋白质的约5%;(h)大于细胞总蛋白质的约10%;和(i)大于细胞总蛋白质的约20%。
重组宿主细胞中产生的异源性DHAD的比活性能够定量为,如U/mg。所述异源性DHAD比活性能选自:(a)大于约0.25U/mg;(b)大于约0.3U/mg;(c)大于约0.5U/mg;(d)大于约1.0U/mg;(e)大于约1.5U/mg;(f)大于约2.0U/mg;(g)大于约3.0U/mg;(h)大于约4.0U/mg;(i)大于约5.0U/mg;(j)大于约6.0U/mg;(k)大于约7.0U/mg;(l)大于约8.0U/mg;(m)大于约9.0U/mg;(n)大于约10.0U/mg;(o)大于约20.0U/mg;和(p)大于约50.0U/mg。
所述异源性DHAD比活性也能被定量,例如以百分比比较内源性DHAD的比活性,或比较其它对照DHAD比活性。一个对照DHAD比活性的例子为使用低拷贝数质粒,或非可诱导或可调节质粒,重组宿主细胞中表达的异源性DHAD。如以下所述,此类对照建立了基线,可据此比较在使用高拷贝数的质粒或拷贝数可调节的质粒,或质粒与编码影响Fe-S簇生物合成或铁摄入和利用的多肽的多核苷酸共表达时,在重组宿主细胞中表达相同异源性DHAD的比活性。因此,当相比于对照DHAD比活性时,异源性DHAD比活性以选自下列的量增加:大于约10%的增加;大于约20%的增加;大于约30%的增加;大于约40%的增加;大于约50%的增加;大于约60%的增加;大于约70%的增加;大于约80%的增加;大于约90%的增加;大于约95%的增加;大于约98%的增加;和大于约99%的增加。所述异源性DHAD比活性也能表达为超过对照的“倍数增加”。因此,比活性的增加能选自:比对照(a)大于约2倍高;(b)大于约5倍高;(c)大于约8倍高;或(d)大于约10倍高。
Fe-S簇形成蛋白质和铁调节、利用和自稳态
如上所述,DHAD酶发挥功能需要Fe-S簇,因此如果他们要表达为有功能的形式,它们必须在具有产生和加载Fe-S簇到脱辅基蛋白质的基因机制的宿主中表达。如本文其它地方所述,在正常酵母中,线粒体在Fe-S簇生物合成中发挥重要作用。据信,正常酵母中Fe-S簇前体的形成和从线粒体到胞质溶胶中需Fe-S簇蛋白质的运动的通量是受限的。例如,在某一点后在胞质溶胶中异源性DHAD的蛋白质表达的进一步增加并未导致DHAD活性的对应的增加。不受理论的束缚,据信这是由于增加数量的异源性DHAD没有加载其活性必需的Fe-S簇,因为细胞不能提供这些增加需求的Fe-S簇,其出现的条件如上所述。本文表明酵母细胞能以两种方式改变基因(单独地或同时地)而将导致表达在胞质溶胶中加载了其必需Fe-S簇的异源性DHAD分数的增加。一种方式是改变参与Fe-S簇形成的酵母基因的表达,如Fe-S簇生物合成途径基因或铁摄入和利用基因。另一种方式是在酵母胞质溶胶中表达参与Fe-S簇生物合成或铁摄入和利用的异源性基因。
编码参与铁摄入和利用以及Fe-S簇生物合成的多肽的酵母基因是改变表达的候选基因。在实施方案中,所述改变导致一个选择的需Fe-S簇蛋白质的功能增加。
例如,Aft1被发现对铁调节子中的基因充当转录激活因子(Kumanovics,等人.J.Biol.Chem.,2008.283,p.10276-10286;Li,H.,等人,The Yeast Iron Regulatory Proteins Grx3/4 and Fra2 formHeterodimeric Complexes Containing a [2Fe-2S]Cluster with Cysteinyland Histidyl Ligation.Biochemistry,2009.48(40):第9569-9581页。以本文为例,已知Aft1易位抑制因子的缺失导致需Fe-S簇蛋白质比活性的增加,因为这带来了蛋白质加载Fe-S簇的增加。不受理论的束缚,因此据信改变铁调节子一定基因的表达,直接地或通过缺失或上调抑制因子,将同样增加需Fe-S簇蛋白质的加载和功能。例如,在酵母中的铁利用和自稳态中起重要作用或部分作用的基因如铁调节子基因可为改变表达的靶基因。此类基因为本领域所已知,并且这些基因的例子列在表7中。(表7的列表来自Rutherford,J.C.,等人,Activation of the IronRegulon by the Yeast Aft1/Aft2 Transcription Factors Depends onMitochondrial but Not Cytosolic Iron-Sulfur Protein Biogenesis.,J.Biol.Chem.,2005.280(11):第10135-10140页;Foury,F.and D.Talibi,Mitochondrial control of iron homeostasis.A genome wide analysis of geneexpression in a yeast frataxin-deficient strain.J.Biol.Chem.,2001.276(11):第7762-7768页;或Shakoury-Elizeh,M.,等人,Transcriptionalremodeling in response to iron deprivation in Saccharomyces cerevisiae.Mol.Biol.Cell,2004.15(3):第1233-1243页。)
表7:与铁摄入和利用相关的酵母基因的例子。
基于它们的功能并联合铁摄入和利用,表7中所公开的基因编码的蛋白质是影响Fe-S簇生物合成的候选蛋白质。附加的与铁摄入和利用或Fe-S簇生物合成相关的酵母基因包括列在表8中的那些。
表8:铁摄入和利用或Fe-S簇生物合成相关的酵母基因
已经鉴定出来自其它宿主细胞的编码影响Fe-S簇生物合成的附加基因,并且包括但不限于,列在表9中的那些基因。
表9:各种细胞中直接参与Fe-S簇生物合成的基因
铁摄入和代谢和/或Fe-S簇生物合成基因,包括但不限于,那些列在表格7、8或9中的能被潜在地缺失、突变、表达、上调、或下调以增加Fe-S簇生物合成途径中的通量,并且提高Fe-S簇蛋白质如DHAD的比活性。此外,辅因子能添加以增加多肽的活性,所述多肽具有Fe-S簇调节活性以增加Fe-S簇生物合成途径中的通量并提高DHAD比活性。
例如,通过为脱辅基酶提供足够数量的Fe-S簇,增加Fe-S簇生物合成途径中的通量的基因能表达以提高DHAD的活性。任何基因,或它们的组合,如列在表格7、8或9中的一个或多个基因,能在实施例4中描述的pRS411质粒中克隆和表达。所述所得的构建体,连同DHAD表达载体pHR81 FBA ilvD(Sm),能转化到野生型BY4741中。作为对照,不含任何受关注基因的pRS411和载体pHR81 FBA ilvD(Sm)转化到野生型菌株中。如实施例4所述,所述转化子在具有无尿嘧啶和甲硫氨酸的SD培养基的琼脂平板上筛选以保持两种质粒。来自转化的不同菌株粗提物中的DHAD酶活性能够测定。所述结果能够与从对照中获得的比活性比较,所述对照为不含任何受关注基因的pRS411和载体pHR81 FBA ilvD(Sm)转化到野生型菌株中。比活性的增加表明一个基因能用来增加的Fe-S簇的生物合成途径的通量。
此外,能生成在一个或多个参与Fe-S簇调节活性的基因中缺失的菌株,在改善含Fe-S簇酶或蛋白质方面提供加性效应。例如,在FRA2和GXR3基因缺失的双突变体能够用于转化载体pHR81 FBA-IlvD(sm),并能够测定所述转化子的粗提物中的DHAD活性。
另一个可供选择的是改变基因的表达,例如,所述PSE1(SEQ IDNO:777)基因,其编码参与将Aft1p输入到核内的蛋白质(Fukunaka,等人,2003,J.Biological Chem.,vol.278,pp.50120-50127)。如上所述,这个基因的表达能够通过克隆到载体pRS411中来实现。
因此,本文提供的是重组宿主细胞,其包含任何多肽表达的改变,所述多肽由铁摄入和利用或Fe-S簇生物合成基因编码。所涵盖的为重组宿主细胞,其包含上述引用的任一项Fe-S簇生物合成基因的至少一种异源性多核苷酸。还涵盖的为重组宿主细胞,其中宿主细胞在上述引用的任一项铁摄入和利用或Fe-S簇生物合成基因中的一个内源性基因中包含至少一种缺失、突变和/或取代。还涵盖的为重组宿主细胞,其包含在上述引用的任一项铁摄入和利用或Fe-S簇生物合成基因中的至少一种异源性多核苷酸,其中宿主细胞在上述引用的任一项铁摄入和利用或Fe-S簇生物合成基因中的一个内源性基因中包含至少一种缺失、突变和/或取代。
这些重组宿主细胞还能包含至少一种异源性需Fe-S簇蛋白质。例如,本文提供的是包含至少一种异源性DHAD和至少一种异源性多核苷酸,所述多核苷酸编码影响Fe-S簇生物合成的多肽。还提供了重组宿主细胞,其包含至少一种异源性DHAD,其中所述宿主细胞在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中包含至少一种缺失、突变和/或取代。还提供了重组宿主细胞,其包含至少一种异源性DHAD和至少一种异源性多核苷酸,所述多核苷酸编码影响Fe-S簇生物合成的多肽,其中所述宿主细胞在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中包含至少一种缺失、突变和/或取代。
能够用于本发明中的宿主细胞包括酵母细胞,包括但不限于糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。细菌宿主细胞也能用于生成重组宿主细胞,其包含至少一种编码具有DHAD活性的多肽的异源性多核苷酸和至少一种编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的异源性多核苷酸。例如,乳酸菌,其包含重组DHAD和至少一种编码Fe-S簇成型蛋白质的重组基因表达元件,是于2009年9月29日提交的美国专利申请12/569,103的受试菌,其以引用方式并入本文。本重组宿主细胞,其包含至少一种编码具有DHAD活性的多肽的异源性多核苷酸和至少一种编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的异源性多核苷酸,不包括于2009年9月29日提交的美国专利申请12/569,103所述的那些乳酸菌,其以引用方式并入本文。
影响Fe-S簇生物合成的多肽能选自在表7、8和9中的包含铁摄入和利用或Fe-S簇生物合成途径基因。在一个实施方案中,所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由下列基因编码:ARN1、ARN2、ATX1、CCC2、COTl、ENB1、FET3、FET5、FITl、FIT2、FIT3、FRE1、FRE2、FRE3、FRE4、FRE5、FRE6、FTH1、FTR1、HMX1、SITl、SMF3、TIS11、VHTl、AFTl、AFT2、AIM1、ARH1、ATM1、BUD32、CAD1、CCC1、CFD1、CIA1、CMK1、CTH1、CTI6、CYC8、DAP1、DRE2、ERVl、ESA1、FET4、FRA1、FRA2、GEF1、GGC1、GRX1、GRX2、GRX4、GRX5、HDA1、IBA57、ISA1、ISA2、ISUl、ISU2、JAC1、MGE1、MRS3、MRS4、MSN5、NAR1、NFS1、NFU1、NHP6a、NHP6b、PSE1、SMF1、SNF1、SNF2、SNF3、SNF4、SSQ1、TIM12、TUP1、NP_011911.1、VPS41、YAP5、YFH1、YRA1、ZPR1、iscAnif、nifU、nifS、cysE1、cysE2、iscS、iscU、iscA、hscB、hscA、Fdx、sufS、sufE、cysE3、sufS2、iscA2、Nfu、nfuA、nfuV、nfu、sufA、sufB、sufC、sufD、sufE1、sufS2、或sufE2。在一个实施方案中,所述影响Fe-S簇生物合成的多肽为AFT1、AFT2、PSE1、FRA2、GRX3或MSN5。在一个实施方案中,所述影响Fe-S簇生物合成的多肽选自AFT1、AFT2、PSE1、FRA2、GRX3、MSN5,以及它们的组合。在一个实施方案中,所述影响Fe-S簇生物合成的多肽选自AFT1、AFT2、PSE1、FRA2、MSN5、以及它们的组合。在另一个实施方案中,所述影响Fe-S簇生物合成的多肽选自AFT1、AFT2、PSE1、FRA2、GRX3、MSN5、以及它们的组合,并且所述影响Fe-S簇生物合成的多肽是由包含质粒的多核苷酸编码的。在一些实施方案中,DHAD是与AFT1、AFT2、PSE1、以及它们的组合共表达的。所述影响Fe-S簇生物合成的多肽可为组成型突变,如,但不限于,AFT1 L99A、AFT1 L102A、AFT1 C291F、AFT1 C293F、以及它们的组合。在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的缺失、突变、和/或取代能选自FRA2、GRX3、MSN5、以及它们的组合。
本发明也提供了增加重组宿主细胞中需Fe-S簇蛋白质活性的方法,所述重组宿主细胞包含需Fe-S簇蛋白质;改变宿主细胞中影响Fe-S簇生物合成的多肽表达或活性的方法;以及在需Fe-S簇蛋白质活性增加的条件下培养具有改变的表达或活性的重组宿主细胞。此类方法能被用于增加内源需Fe-S簇蛋白质的活性,或异源性需Fe-S簇蛋白质的活性。此类方法能被用于增加本文所述DHAD的比活性,或用本文提供的方法鉴定。所述需Fe-S簇蛋白质的活性的增加的量能为选自大于约10%;大于约15%;大于约20%;大于约25%;大于约30%;大于约35%;大于约40%;大于约45%;大于约50%;大于约55%;大于约60%;大于约65%;大于约70%;大于约75%;大于约80%;大于约85%;大于约90%;和大于约95%。所述活性的增加可大于约3倍、大于约5倍、大于约8倍、或大于约10倍。在实施方案中,所述需Fe-S簇蛋白质的活性能为理论数量的至少约60%、理论的至少约70%、理论的至少约80%、或理论的至少约90%。
本发明也能被用于增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径的通量,以及用于鉴定宿主细胞中增加Fe-S簇生物合成途径的通量的多肽。在一个实施方案中,提供了在宿主细胞中增加Fe-S簇生物合成途径的通量的方法,所述方法包括提供重组宿主细胞,所述重组宿主细胞包含需Fe-S簇蛋白质,以及至少一种影响Fe-S簇生物合成的多肽,在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一种缺失、突变、和/或取代,或者这两者的组合,以及在宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径的通量增加的条件下培养重组宿主细胞。在另一个实施方案中,提供了鉴定增加Fe-S簇生物合成途径的通量的多肽的方法,所述方法包括:(a)改变影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性;(b)测定需Fe-S簇蛋白质的活性;以及(c)比较在步骤(a)的多肽存在改变的表达或活性时测量的异源性需Fe-S簇蛋白质的活性与在步骤(a)的多肽不存在改变的表达或活性时测量的异源性需Fe-S簇蛋白质的活性,其中异源性需Fe-S簇蛋白质活性的增加表明在所述Fe-S簇生物合成途径中通量的增加。在此类方法中,所述需Fe-S簇蛋白质对宿主细胞可为内源的或异源的。
影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性能够通过本领域已知的方法改变,包括但不限于,缺失、突变、取代、表达、上调、下调、改变细胞的位置、改变蛋白质的状态、和/或添加辅因子,以及它们的组合。改变蛋白质的状态能包括但不限于,此类改变如磷酸化或泛素化。本文所述的任何数量的方法或本领域已知的能用于测定所述需Fe-S簇蛋白质的活性,这取决于选择的需Fe-S簇蛋白质。例如,如果DHAD是所述需Fe-S簇蛋白质,实施例7中所述检测分析法能用于测定DHAD的活性以确定在宿主细胞中所述Fe-S簇生物合成途径中通量是否增加。
异丁醇和其它产物
在重组宿主细胞中表达DHAD,如本文所述,提供了转化的、重组的宿主细胞,所述重组宿主细胞具有二羟酸脱水酶活性以转化2,3-二羟基异戊酸为α-酮异戊酸或2,3-二羟基戊酸甲酯为α-酮戊酸甲酯。以α-酮异戊酸或α-酮戊酸甲酯作为途径中间体的产物可在本文所公开的宿主细胞中以更高的效果产生,所述宿主细胞具有所述的异源性DHAD。此类产物的列表包括,但不限于,缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、泛酸、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和异丁醇。
例如,在酵母中生物合成缬氨酸包括步骤有由羟乙酸还原异构酶(ILV5)催化乙酰乳酸转化成2,3-二羟基异戊酸;由二羟酸脱水酶催化2,3-二羟基异戊酸转化成α-酮异戊酸(也被称为2-酮戊酸);以及由支链氨基酸转氨酶(BAT2)和支链氨基酸氨基转移酶(BAT1)催化α-酮异戊酸转化成缬氨酸。生物合成亮氨酸包括相同的步骤至α-酮异戊酸,接下来由异丙基苹果酸合成酶(LEU9,LEU4)催化α-酮异戊酸转化成α-异丙基苹果酸;由异丙基苹果酸异构酶(LEU1)催化α-异丙基苹果酸转化成β-异丙基苹果酸;由β-IMP脱氢酶(LEU2)催化的β-异丙基苹果酸转化α-酮异己酸;以及由支链氨基酸转氨酶(BAT2)和支链氨基酸氨基转移酶(BAT1)催化α-酮异己酸至亮氨酸的最终转化。细菌的途径与此类似,包括命名有所区别的蛋白质和基因。2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸转化的增加将增加在这些途径中的流动,尤其是如果途径中的一个或多个附加的酶过表达。因此,期待使用本文所公开的菌株生产缬氨酸或亮氨酸。
泛酸的生物合成包括通过DHAD进行的步骤,以及通过酮泛酸羟甲基转移酶和泛酸合酶进行的步骤。美国专利公开6,177,264描述了这些酶的表达工程,以增加微生物体中泛酸生物合成的产量。
所述DHAD的产物α-酮异戊酸是异丁醇生物合成途径的中间体,其公开在美国专利公开申请公布20070092957A1中,以引用方式并入本文。图5中提供了一个公开的异丁醇生物合成途径的图表。在本文公开的菌株中生产异丁醇可以获益于增加的DHAD活性。如本文所公开的,增加的DHAD活性是由宿主细胞中DHAD表达提供的,例如通过过表达DHAD、通过调节具有Fe-S簇调节活性的多肽的表达或活性、或组合过表达DHAD和调节具有Fe-S簇调节活性的多肽的表达或活性。如美国专利公开申请公布20070092957A1所述,其以引用方式并入本文,在一个实施例中异丁醇生物合成途径的步骤包括转化:
-丙酮酸向乙酰乳酸(参见图5,其中途径的步骤a),例如受乙酰乳酸合酶催化,
-乙酰乳酸向2,3-二羟基异戊酸(参见图5,其中途径的步骤b),例如受乙酰羟酸异构还原酶催化;
-2,3-二羟基异戊酸向α-酮异戊酸(参见图5,其中途径的步骤c),例如受乙酰羟酸脱水酶,也叫二羟酸脱水酶(DHAD)催化;
-α-酮异戊酸向异丁醛(参见图5,其中的途径步骤d)例如受支链α-酮酸脱羧酶催化;和
-异丁醛向异丁醇(参见图5,其中途径的步骤e),例如受支链醇脱氢酶催化。
所述底物以产生转化,以及酶参与这些反应,另外的途径的步骤f、g、h、I、j和k,如美国专利公开申请公布20070092957A1所述,其一引用方式并入本文。
本文所公开了能用于表达途径步骤酶的基因,其命名除DHAD以外的,以及那些为异丁醇途径附加的,如美国专利公开申请公布20070092957A1所述,其以引用方式并入本文。附加的基因能被本领域技术人员通过生物信息学或使用本领域熟知的方法鉴定,例如于2009年9月29日提交的美国专利申请12/569,636所述的各种方法,其以引用方式并入本文,以分离同源性物。适宜的酮醇酸还原异构酶(KARI)如美国专利申请公布Nos.20080261230A1、20090163376、20100197519和美国专利公开申请12/893077所述,全部以引用方式并入本文。本文公开的KARIs的例子为那些来自霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugmosa)PAO1和荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)PF5。美国专利申请公布2009/0269823和美国临时专利申请61/290,636,以引用方式并入本文,描述了适宜的乙醇脱氢酶。
另外如美国专利申请公布20070092957A1所述,其以引用方式并入本文,包括嵌合基因构建,以及使用公开的生物合成途径、针对异丁醇产量的细菌、酵母基因工程。
附加修改形式
在本文提供的细胞中可用的附加修改包括降低甘油-3-磷酸脱氢酶的活性的修改,和/或干扰至少一种基因,其编码具有丙酮酸脱羧酶或的多肽,或干扰至少一种基因,其编码一个控制丙酮酸脱羧酶基因表达的调节元件,如美国专利申请公布20090305363所述(以引用方式并入本文),对宿主细胞的修改通过Entner-Doudoroff途径提供增加的碳通量或降低等价平衡,如美国专利申请.公布20100120105所述(以引用方式并入本文)。其它的修改包括整合至少一种多核苷酸,其编码催化丙酮酸利用的生物合成途径中一个步骤的多肽,如美国临时申请Appl.61/380563所述(以引用方式并入本文)。可为适宜的附加的修改如美国专利申请12/893089所述。另外,宿主细胞包含异源性多核苷酸,其编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽,并且宿主细胞包含异源性多核苷酸,其编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽,如美国临时专利申请61/356379所述。
用于生产的生长
本文公开的重组宿主细胞生长于发酵培养基中,其包含适宜的碳底物。适宜的碳底物可包括但不限于,单糖如葡萄糖、果糖,寡糖如乳糖、麦芽糖、半乳糖或蔗糖,多糖如淀粉或纤维素或它们的混合物,以及来自可再生原料的未纯化混合物,如奶酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜和大麦麦芽。其它碳底物可包括乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐或甘油。
另外,碳底物也可以是已被证明可以被代谢转化成关键生化中间产物的诸如二氧化碳的一碳底物或甲醇。二碳底物如乙醇也是适宜的。除了一碳和二碳底物之外,甲基营养生物体也已知可以利用多种其它含碳化合物,例如甲胺、葡糖胺和用于代谢活动的多种氨基酸。例如,甲基营养酵母已知可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人,Microb.Growth C1 Compd.,[Int.Symp.],7th(1993),415-32,编辑:Murrell,J.Collin;Kelly,Don P.Publisher:Intercept,Andover,UK)。类似地,假丝酵母属的多种菌种将会代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人,Arch.Microbiol.153:485-489(1990))。因此,预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并将仅受限于生物体的选择。
尽管预期以上提及的所有碳底物以及它们的混合物均适用于本发明,但是在一些实施方案中,对于经过修饰以利用C5糖的酵母细胞,优选的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖,或者是它们与C5糖如木糖和/或阿拉伯糖的混合物。蔗糖可来源于可再生的糖源例如甘蔗、甜菜、木薯、甜高粱、以及它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过糖化淀粉基原料来源于可再生的谷物来源,包括谷物如玉米、小麦、裸麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物。此外,可发酵糖可来源于通过预处理和糖化步骤的可再生的纤维素的或木质纤维素的生物质,例如,在共同拥有的和共同未决的美国专利公开申请公布20070031918A1中所述,该专利以引用方式并入本文。生物质指任何纤维质的或木质纤维质的材料并包括包含纤维素的材料,并且任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖。生物质也可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源,或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物;例如,生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物,或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于:玉米粒、玉米芯、作物残余如玉米壳、玉米秸秆、玉米纤维、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆、获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥、以及它们的混合物的研磨物的组分。
除适宜的碳源外,生长培养基必需包含适宜的矿物质、盐、辅因子、缓冲液和其它成分,如本领域的技术人员所知,适宜于培养物的生长和提升酶途径,其包含需Fe-S簇蛋白质,例如DHAD。
培养条件
通常,使细胞在约20℃至约40℃的温度范围内在合适的培养基中生长。本发明中的适合的生长培养基是普通的商品化制备的培养基,例如Luria Bertani(LB)肉汤,沙氏葡萄糖肉汤(SD)肉汤,酵母培养基(YM)肉汤,或包含酵母氮源、硫酸铵和右旋糖(作为碳/能源)的肉汤,或者YPD培养基-蛋白质胨、酵母提取物和右旋糖以大多数酿酒酵母菌株生长的最适比例的一种混合物。也可以使用其它确定的或合成的生长培养基,微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于具体微生物生长的合适培养基。使用已知直接或间接地调节分解代谢物阻遏的试剂,例如,环腺苷酸2′:3′-单磷酸,也可被纳入生长培养基。
适宜生长的pH值范围为pH 5.0至约pH 9.0。在一个实施方案中,初始条件采用了约pH 6.0至约pH 8.0。适宜酵母发酵的pH值范围通常为约pH 3.0至约pH 9.0。在一个实施方案中,初始条件采用了约pH 5.0至约pH 8.0。适宜其它微生物体发酵的pH值范围为约pH 3.0至约pH7.5。在一个实施方案中,初始条件采用了约pH 4.5至约pH 6.5。
生长可在有氧或无氧条件下进行。在一个实施方案中,使用了有氧或无氧的生长条件。
工业分批发酵和连续发酵
异丁醇,或其它产物,可使用分批的发酵方法生产。经典的分批发酵是封闭系统,其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不进行人工改变。标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。补料分批发酵工艺也适用于本发明,并且包括典型的分批式系统,不同的是随着发酵进程递增地添加底物。在分解代谢阻遏往往抑制细胞的代谢作用以及在期望培养基中具有有限量的底物的情况下,补料分批式系统是有用的。分批发酵和补料分批发酵在本领域内是常用的且众所周知,并且实例可见于如下文献:Thomas D.Brock in Biotechnology:A Textbook ofIndustrial Microbiology,第二版,1989,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA.),或者Deshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227,(1992),该文献以引用方式并入本文。
异丁醇,或其它产物,也可用连续发酵方法生产。连续发酵是一种开放式系统,其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中,并同时移出等量条件培养基用于加工。连续发酵一般使培养物维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高密度。连续发酵允许调节一种因素或任意数目的因素,这些因素影响细胞生长或终产物浓度。用于调节连续发酵工艺中的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率保持最高水平的方法是工业微生物学领域众所周知的,并且多种方法已由Brock(同上)详细描述。
采用分批、分批补料或连续过程,预期异丁醇或其它产物的生产可以实行,并且任何已知的发酵模式将是合适的。另外,预期可以将细胞固定在底物上而作为完整的细胞催化剂并使其经受发酵条件以生产异丁醇。
用于从发酵培养基中分离异丁醇的方法
对于ABE发酵使用本领域已知方法,生物生产的异丁醇可从发酵培养基中分离出来(参见例如,Durre,Appl.Microbiol.Biotechnol.,49:639-648(1998),Groot等人,Process.Biochem.27:61-75(1992),以及本文参考)。例如,可通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中移除固体。然后,可使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液-液萃取、吸附、汽提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵培养基中分离异丁醇。
因为异丁醇与水形成低沸点的共沸混合物,蒸馏能够被用于分离混合物直至其共沸组成。蒸馏可与其它分离方法组合使用以便分离共沸物。可与蒸馏组合使用以便分离并纯化丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液萃取、吸附和基于膜的技术。另外,使用夹带剂的共沸蒸馏可以分离丁醇(参见例如,Doherty and Malone,Conceptual Design of DistillationSystems,McGraw Hill,New York,2001)。
丁醇-水混合物形成非均相共沸物,从而可组合使用蒸馏和滗析以分离并纯化异丁醇。在这种方法中,蒸馏包含异丁醇的发酵液使其接近共沸组合物。然后冷凝共沸混合物,并且通过滗析从发酵培养基分离异丁醇。滗析后的含水相可作为回流返回第一蒸馏塔。富含异丁醇的滗析有机相可通过在第二蒸馏塔中蒸馏进一步被纯化。
也可从发酵培养基中用液-液萃取和蒸馏分离异丁醇。在这种方法中,使用液-液萃取用合适溶剂从发酵液中萃取异丁醇。然后蒸馏包含异丁醇的有机相以从溶剂中分离丁醇。
蒸馏结合吸附也可用于从发酵培养基中分离异丁醇。在这种方法中,蒸馏包含异丁醇的发酵液使其接近共沸组成,然后使用吸附剂移除剩余的水,所述吸附剂例如分子筛(Aden等人,Lignocellulosic Biomassto Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute AcidPrehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover,ReportNREL/TP-510-32438,National Renewable Energy Laboratory,June 2002)。
此外,也可组合使用蒸馏和全蒸发以便从发酵培养基中分离并纯化异丁醇。在这种方法中,蒸馏包含异丁醇的发酵液使其接近共沸组合物,然后用全蒸发通过亲水性膜移除剩余的水(Guo等人,J.Membr.Sci.245,199-210(2004))。
所述发明的实施方案
实施方案1(E1):重组宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸,其中所述至少一种异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒。
E2:重组宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸,其中所述至少一种异源性多核苷酸在所述重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。
E3:重组宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸,其中所述宿主细胞在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中包含至少一种缺失、突变、和/或取代。
E4:重组宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸,并且编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸。
E5:实施方案E3-E4中任一项的重组宿主细胞,其中所述编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的异源性多核苷酸选自表格8和9中的基因。
E6:实施方案E3-E4中任一项的重组宿主细胞,其中所述编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的异源性多核苷酸选自表格7中的基因。
E7:实施方案E5或E6中任一项的重组宿主细胞,其中所述编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的异源性多核苷酸选自AFT1、AFT2、PSE1、FRA2、GRX3、MSN5、以及它们的组合。
E8:实施方案E7的重组宿主细胞,其中所述多肽由组成型突变体多核苷酸编码。
E9:实施方案E8的重组宿主细胞,其中所述组成型突变选自AFT1L99A、AFT1 L102A、AFT1 C291F、AFT1 C293F、以及它们的组合。
E10:实施方案E7的重组宿主细胞,其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒。
E11:实施方案E7的重组宿主细胞,其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由多核苷酸编码,所述多核苷酸在所述重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。
E12:实施方案E3的重组宿主细胞,在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一种缺失、突变、和/或取代选自FRA2、GRX3、MSN5、以及它们的组合。
E13:实施方案E4的重组宿主细胞,其中编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸选自AFT1、AFT2、PSE1、以及它们的组合。
E14:实施方案E3-E13中任一项的重组宿主细胞,其中所述编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸以多拷贝表达。
E15:实施方案E14的重组宿主细胞,其中所述至少一种异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒。
E16:实施方案E14的重组宿主细胞,其中所述至少一种异源性多核苷酸在所述重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。
E17:实施方案E3-E16中任一项的重组宿主细胞,其中相比于具有内源性Fe-S簇生物合成的重组宿主细胞所述Fe-S簇生物合成增加。
E18:实施方案E1-E17中任一项的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞为酵母宿主细胞。
E19:实施方案E18的重组宿主细胞,其中所述酵母宿主细胞选自糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
E20:实施方案E1-E19中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽在宿主细胞的胞质溶胶中表达。
E21:实施方案E1-E20中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽具有以<10-5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列,其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸,它们对应于变异链球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位点56、129和201,所述变异链球菌DHAD酶对应于SEQ ID NO:168。
E22:实施方案E1-E21中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽与SEQ ID NO:168或SEQ ID NO:232的氨基酸序列具有至少90%的同一性。
E23:实施方案E1-E22中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有比活性选自:
a.大于对照宿主细胞的约5倍,所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸;
b.大于对照宿主细胞的约8倍,所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸;以及
c.大于对照宿主细胞的约10倍,所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。
E24:实施方案E1-E22中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有比活性选自:
a.大于约0.25U/mg;
b.大于约0.3U/mg;
c.大于约0.5U/mg;
d.大于约1.0U/mg;
e.大于约1.5U/mg;
f.大于约2.0U/mg;
g.大于约3.0U/mg;
h.大于约4.0U/mg;
i.大于约5.0U/mg;
j.大于约6.0U/mg;
k.大于约7.0U/mg;
l.大于约8.0U/mg;
m.大于约9.0U/mg;
n.大于约10.0U/mg;
o.大于约20.0U/mg;和
p.大于约50.0U/mg。
E25:实施方案E1-E24中任一项的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞产生异丁醇。
E26:实施方案E25的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径。
E27:制备产物的方法包括:
a.提供实施方案E1-E24中任一项的重组宿主细胞;以及
b.在其中所述产物产生的条件下,将(a)中所述重组宿主细胞与发酵培养基中的可发酵碳底物接触;
其中所述产物选自支链氨基酸、泛酸、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、异丁醇、以及它们的组合。
E28:制备异丁醇的方法包括:
a.提供实施方案E1-E24中任一项的重组宿主细胞;
b.在其中异丁醇产生的条件下,将(a)中所述重组宿主细胞与发酵培养基中的可发酵碳底物接触。
E29:2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的转化方法包括:
a.提供实施方案E1-E24中任一项的重组宿主细胞;
b.a)中所述重组宿主细胞在2,3-二羟基异戊酸被转化成α-酮异戊酸的条件下生长,
其中2,3-二羟基异戊酸被转化成α-酮异戊酸。
E30:增加重组宿主细胞中具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽的比活性的方法包括:
a.提供实施方案E1-E24中任一项的重组宿主细胞;以及
b.(a)中所述重组宿主细胞在使得具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽以有功能的形式表达的条件下生长,所述有功能的形式具有大于缺乏所述异源性多肽的相同宿主细胞的比活性。
E31:增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量的方法包括:
a.提供实施方案E3-E24中任一项的重组宿主细胞;以及
b.(a)中所述重组宿主细胞在使得宿主细胞Fe-S簇生物合成途径中的通量增加的条件下生长。
E32:增加重组宿主细胞中需Fe-S簇蛋白质的活性的方法包括:
a.提供包含需Fe-S簇蛋白质的重组宿主细胞;
b.改变所述宿主细胞中影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性;以及
c.(b)中所述重组宿主细胞在使得需Fe-S簇蛋白质的活性增加的条件下生长。
E33:实施方案E32的方法,其中所述活性量的增加选自:
a.大于约10%;
b.大于约20%;
c.大于约30%;
d.大于约40%;
e.大于约50%;
f.大于约60%;
g.大于约70%;
h.大于约80%;
i.大于约90%;和
j.大于约95%。
E34:实施方案E32的方法,其中所述活性的增加量选自:
a.大于约5倍;
b.大于约8倍;
c.大于约10倍。
E35:增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量的多肽鉴定方法包括:
a.改变影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性;
b.测量异源性需Fe-S簇蛋白质的活性;以及
c.比较在步骤(a)的多肽存在改变的表达或活性时测量的异源性需Fe-S簇蛋白质的活性与在步骤(a)的多肽不存在改变的表达或活性时测量的异源性需Fe-S簇蛋白质的活性,
其中所述异源性需Fe-S簇蛋白质活性的增加表明Fe-S簇生物合成途径中的通量的增加。
E36:增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量的多肽鉴定方法包括:
a.改变影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性;
b.测定具有二羟酸脱水酶活性的多肽活性;以及
c.比较在步骤(a)的多肽的表达或活性存在改变时测量的具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性与在步骤(a)的多肽的表达或活性不存在改变时测量的具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性,
其中所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽活性的增加表明Fe-S簇生物合成途径中的通量的增加。
E37:实施方案E30-E36中任一项的方法,其中所述改变影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性,其包含缺失、突变、取代、表达、上调、下调、改变细胞定位、改变蛋白质的状态、和/或辅因子的添加。
E38:实施方案E32-E37中任一项的方法,其中需Fe-S簇蛋白质具有二羟酸脱水酶活性,并且其中所述具有二羟酸脱水酶活性的需Fe-S簇蛋白质具有以<10-5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列,其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸,它们对应于变异链球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位点56、129和201,所述变异链球菌DHAD酶对应于SEQ ID NO:168。
E39:实施方案E32-E38中任一项的方法,其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽选自表格7、8和9中的基因。
E40:通过实施方案E35-E37中任一项的方法鉴定重组宿主细胞,其包含至少一种编码多肽的多核苷酸。
E41:实施方案E40的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞还包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。
E42:实施方案E41的重组宿主细胞,其中所述编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸以多拷贝表达。
E43:实施方案E41的重组宿主细胞,其中所述异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒。
E44:实施方案E41的重组宿主细胞,其中所述异源性多核苷酸在所述重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。
E45:实施方案E35或E36的方法其中所述宿主细胞为酵母宿主细胞。
E46:实施方案E45的方法,其中所述酵母宿主细胞选自:糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
E47:实施方案E28-E39中任一项的方法,其中所述宿主细胞为酵母宿主细胞。
E48:实施方案E47的方法,其中所述酵母宿主细胞选自:糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
E49:实施方案E40-E44中任一项的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞为酵母宿主细胞。
E50:实施方案E49的重组宿主细胞,其中所述酵母宿主细胞选自:糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
E51:实施方案E40-E44或E49-E50中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽在宿主细胞的胞质溶胶中表达。
E52:实施方案E40-E44或E49-E50中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽具有以<10-5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列,其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸,它们对应于变异链球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位点56、129和201,变异链球菌DHAD酶对应于SEQ ID NO:168。
E53:实施方案E40-E44或E49-E50中任一项的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞产生产物选自支链氨基酸、泛酸、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、异丁醇、以及它们的组合。
E54:实施方案E53中所述重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞产生异丁醇。
E55:实施方案E54中的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径。
实施例
所用缩写的意义如下:“min”意为分钟,“h”意为小时,“sec”意为秒,“μl”意为微升,“ml”意为毫升,“L”意为升,“nm”意为纳米,“mm”意为毫米,“cm”意为厘米,“μm”意为微米,“mM”意为毫摩尔每升,“M”意为摩尔,“mmol”意为毫摩尔,“μmole”意为微摩尔,“g”意为克,“μg”意为微克,“mg”意为毫克,“rpm”意为每分钟转数,“w/v”意为重量/体积,“OD”意为光密度,以及“OD600”意为在600nm波长测定的光密度。
一般方法:
实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.的Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1989,T.J.Silhavy,M.L.Bennan和L. W.Enquist的Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,N.Y.,1984,和Ausubel,F.m.等人的,Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience,N.Y.,1987。
适合细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域内也是众所周知的。适用于下面实施例的技术可存在于以下文献中:Manual of Methodsfor General Bacteriology,Phillipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N.Costilow,Eugene W.Nester,Willis A.Wood,Noel R.Krieg和G.BriggsPhillips,编辑,American Society for Microbiology,Washington,DC.,1994,或者Thomas D.Brock in Biotechnology:A Textbook of IndustrialMicrobiology,第二版,Sinauer Associates,Inc.(Sunderland,MA)1989。使用的用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料均得自Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)、BD Diagnostic Systems(Sparks,MD)、Life Technologies(Rockville,MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis,MO),除非另外说明。
实施例1:在酵母胞质溶胶中,使用基于质粒的系统过表达DHAD 蛋白质,其由来自变异链球菌的ilvD基因编码。
重组多核苷酸的过表达能够通过增加包含所述重组多核苷酸的质粒拷贝数来实现。为在酵母中过表达DHAD蛋白质,构建了一个诱导载体。所述pHR81载体包含Ura3标记以及带有缺陷的启动子的LEU标记(参见美国专利申请公开2007/0092957,其以引用方式并入本文)。当所述酵母合成培养基(SD;也被称为完全基本培养基;Teknova)生长培养基从无尿嘧啶SD改换为无亮氨酸SD时,pHR81质粒的拷贝数增加,导致所述重组多核苷酸表达水平非常高。所述pHR81载体主链来源于pLH472 JEG4y(SEQ ID NO:921)并用SpeI和SacII消化pLH472JEG4y载体来制备。
为过表达DHAD蛋白质,使用了来自变异链球菌的DHAD基因ilvD(SEQ ID NO:167)(参见美国公布专利申请US2009-0305363A1,其以引用方式并入本文)。所述基因在载体pRS423FBA ilvD Strep-lumio的FBA启动子的控制下进行克隆(参见美国公布专利申请US2009-0305363A1,其以引用方式并入本文)。所述包含FBA启动子、ilvD基因和FBA终止子盒的区域用引物对FBAp-F(NheI)和FBAt-R(SacII)进行扩增(SEQ ID NOs:915和916)并克隆到pHR81载体中。所述所得表达载体指定为pHR81 FBA-IlvD(Sm)(SEQ ID NO:917;图1A)。
为过表达变异链球菌DHAD蛋白质,所述表达载体pHR81 FBA-IlvD(Sm)转化到野生型酵母菌株BY4741中。转化子在无尿嘧啶的SD琼脂平板上筛选。为过表达包含所述质粒的酵母菌株最初生长在30℃的无尿嘧啶SD液体培养基中。新鲜过夜培养物(5ml)转移到含75ml无亮氨酸SD培养基的125ml烧瓶里。作为对照,另外5ml新鲜过夜培养物转移到含75ml无尿嘧啶SD培养基的烧瓶里。在用离心收获之前,所述培养物孵育过夜。使用实施例7中描述的检测方法测定这些样本的粗提物中的DHAD活性。
在无尿嘧啶SD上生长的对照样本中获得的粗提物中,DHAD比活性在0.2至0.3U/mg-1的范围内。然而,在无亮氨酸SD培养基上生长的菌株中获得的平均比活性,为1.6Umg-1,比来自对照样本的活性高得多(高5-8倍)。DHAD的功能需要Fe-S簇,并且先前不知道其原生Fe-S簇生物合成途径能否调和在酵母胞质溶胶中过表达Fe-S簇。在先前使用非诱导型、低拷贝数质粒的筛选试验中,来源于变异链球菌的DHAD能在酵母胞质溶胶中重组表达,其粗提物的比活性在0.1至0.2Umg-1的范围内(参见美国专利申请12/569,636,在2009年9月29日提交,以引用方式并入本文)。因此,在一个实施方案中,过表达需Fe-S簇蛋白质,如DHAD,在酵母中使用高拷贝数载体提供了增加的比活性,其中所述比活性增加了至少约5倍至至少约8倍。
实施例2:通过染色体整合过表达DHAD蛋白质,所述DNAD蛋白 质由来自变异链球菌的ilvD基因编码。
另外一种增加酵母中基因表达的方法是在宿主细胞染色体上整合多拷贝的受关注基因。为了将来自变异链球菌的ilvD基因(SEQ IDNO:167)整合到酵母染色体上,构建了整合载体pZK-Delta(s)-Leu2-FBA-ilvD(Sm)-FBAt(SEQ ID NO:918;图1B)。所述整合载体主链来源于pSuperscript(Stratagene,La Jolla,CA)。所述变异链球菌ilvD基因(互补链的核苷酸1306-3018)克隆到所述整合载体中,处于FBA promoter(互补链的核苷酸3026-4023)控制下,以便所述ilvD基因将具有酵母Δ序列作为侧翼(互补链的核苷酸118-267和5061-5760)。酿酒酵母包含200个以上的酵母Δ序列(Kim J M等人.Genome Res.1998;8:464-478)。这些Δ序列是多重整合的靶位点。所述整合载体也设计包含缺陷的LEU2标记(互补链的核苷酸4100-5191)用于选择具有多重整合事件的转化菌株。
为了整合,所述载体DNA经AscI和AatII消化后线性化,产生Δ序列,其侧翼为包含所述ilvD基因的载体DNA链,然后所述序列转化到酵母菌株BY4741中。转化子在无亮氨酸SD琼脂培养基上选择。然后这些转化子在30℃下长在无亮氨酸SD液体培养基上,并且培养物被回收用于检测DHAD活性。在粗提物中获得的DHAD的比活性在0.7至1.2Umg-1的范围内。这样的比活性高于BY4741菌株的约3至6倍,所述BY4741菌株被包含ilvD基因的非超标达质粒转化。
实施例3:在酵母缺陷菌株中的DHAD比活性的提升
尽管在实施例1和2中描述的过表达菌株具有高水平的活力,但不是所有表达的DHAD蛋白质是有活性的。例如,过表达的DHAD蛋白质占细胞总蛋白质的大约5至10%,同时产生的比活性为约0.7至1.6Umg-1。给定的来源于变异链球菌的纯化的DHAD酶的比活性为100Umg-1,占细胞总蛋白质10%的表达的DHAD将可望产生比活性为高至5至10Umg-1。尽管不希望被理论所束缚,在期望与观察到的比活性间的差异可能是Fe-S簇加载不足的结果。因此,通过进一步操作过表达菌株增加Fe-S簇加载,能被用于增加DHAD的比活性。
为了提升比活性,在铁代谢和Fe-S簇传感的基因缺失的酵母菌株用于调查它们对DHAD比活性的效果。这些菌株(BY4741背景的)购自Open Biosystem(Huntsville,AL)并列在表10中。如实施例1所描述的,高拷贝数的质粒pHR81 FBA-IlvD(Sm)转化到这些菌株中,并且通过改变生长培养基为无亮氨酸SD诱导DHAD过表达。从培养物制备粗提物并测定DHAD的活性。结果示于表10中。
表10:参与铁代谢的基因缺失的影响。
基因 | 功能 | 比活性y(U/mg) |
野生型 | 1.69±0.02 | |
Δisu1 | Fe-S簇组装骨架蛋白质 | 1.31±0.56 |
Δfra2 | Aft1p阻遏蛋白质组分 | 3.41±0.24 |
Δsin4 | 调节蛋白质 | 1.65±0.20 |
Δmtm1 | 参与金属代谢的蛋白质 | 0.54±0.12 |
Δfra1 | 调节蛋白质 | 0.97±0.05 |
Δgrx3 | 谷氧还蛋白质 | 5.45±0.14 |
Δaft1 | 全局铁调节子 | 0.23±0.05 |
Δaft2 | Aft1p的旁系同源性物 | 1.11±0.38 |
Δmsn5 | 核蛋白质出口 | 1.59±0.10 |
Δfet3 | 亚铁摄入;多铜氧化酶 | 0.54±0.09 |
Δftr1 | 亚铁摄入;通透酶 | 0.76±0.03 |
Δccc2 | 铜转运蛋白质(for Fet3p) | 1.23±0.17 |
Δgef1 | 铜转运蛋白质/加载Fet3p | 1.70±0.10 |
Δfet4 | 低亲和性Fe(II)转运蛋白质 | 1.07±0.02 |
Δsmf1 | 低亲和性Fe(II)转运蛋白质 | 1.78±0.12 |
Δmrs3 | 线粒体铁转运蛋白质 | 1.51±0.13 |
Δmrs4 | 线粒体铁转运蛋白质 | 0.85±0.16 |
Δcth2 | 靶定mRNA结合与降解 | 1.28±0.40 |
Δcth1 | 靶定mRNA结合与降解 | 1.44±0.30 |
令人惊奇地,在具有缺失的FRA2或GRX3基因的菌株的粗提物中,DHAD比活性增加了2至3倍,这是意料不到的因为测试过的很多这种缺失不增加DHAD比活性。已被证明在酵母中胞质溶胶铁硫组装(CIA)机制负责为胞质溶胶蛋白质组装Fe-S簇,如异丙基苹果酸异构酶(Leu1)。之前的结果显示这个CIA机制独立于铁传感系统,所述铁传感系统涉及作为阻遏蛋白质的Aft1和Grx3/Grx4-Fra2的异源二聚体(Rutherford等人,J Biol Chem.280:10135-10140(2005))。
另一个意料不到的发现是Grx3中的缺失影响DHAD活性。已被证明Grx3和Grx4是功能相同的。当GRX3和GRX4基因双突变导致铁调节子大幅激活时,Grx4基因单突变赋予了最小的表型(Pujol-Carrion,等人,J Cell Sci.119:4554-4564(2006);Ojeda,等人,J Biol Chem.281:17661-17669(2006)。)。如上表10所示,仅GRX3的缺失导致DHAD比活性的显著提升。
因此,这些结果表明当在酵母胞质溶胶中表达时,参与铁代谢的调节基因能够增加需Fe-S簇蛋白质的活性,如DHAD。如图10所概述的,FRA2和GRX3基因的缺失对DHAD比活性的效应能导致,例如通过全局调节子Aft1p激活一个或多个铁调节子的转录。尽管不希望被任一项理论所束缚,激活此类基因能够导致铁摄入的增加和细胞质中Fe-S簇生物合成的增加,导致更高的蛋白质Fe-S簇加载(图10)。实施例11中描述了增加的Fe-S簇加载的展示。
实施例4:表达Aft1p及其突变体对DHAD比活性的影响。
如实施例3所描述和图10所概述,Fra2、Grx3和Grx4是调节Aft1p功能的阻遏子(Kumánovics,等人,J.Biol.Chem.283:10276-10286(2008))。Aft1p是铁的全局调节子。参与铁摄入和代谢的基因激活需要Aft1p定位在核内。Aft1组成型突变体的表达或野生型Aft1表达的增加,能导致野生型菌株中或AFT1缺失菌株中铁调节子激活(Yamaguchi-Iwai,等人,EMBO J.14:1231-1239(1995);Yamaguchi-Iwai,等人,J.Biol.Chem.277:18914-18918(2002);Kaplan,等人,Chem.Rev.109:4536-4552(2009))。基于实施例3中描述的新发现计,Aft1p蛋白质和其组成型突变体的表达可提升DHAD酶的活性分数是有可能的,所述DHAD酶的活性需要Fe-S簇。
为检查这种可能性,野生型AFT1基因及其组成型突变体用着丝粒载体pRS411克隆(Number:87538;SEQ ID NO:919)。这个载体具有在大肠杆菌中生长的氨苄青霉素选择标记和在酵母中的甲硫氨酸营养标记。所述野生型AFT1基因,包括其自身启动子和终止子,能克隆到KpnI和SacI位点之间,形成构建体pRS411-Aft1+侧翼序列(SEQID NO:920;图2)。相似的策略能够用于克隆编码Aft1组成型突变体的基因。首先检查了所述具有氨基酸L99至A和C291至F取代的Aft1组成型突变体(针对SEQ ID NO:703)。所述具有编码野生型AFT1基因或组成型突变体的基因的pRS411构建体连同表达载体pHR81 FBAIlvD(Sm),转化野生型菌株BY4741或具有AFT1、GRX3、或FRA2缺失的酵母菌株。转化子在具有无甲硫氨酸和尿嘧啶的SD培养基的琼脂平板上筛选。转化的菌株在无甲硫氨酸和亮氨酸的SD培养基中生长,在这些基因或突变体的存在下过表达所述DHAD蛋白质。测量了这些培养物的粗提物中所述DHAD的活性。
野生型Aft1p、Aft1p(C291F)和Aft1p(L99A)的表达结果显示在表11中。相比于野生型Aft1p,观察到Aft1p(C291F)在DHAD比活性上有适度的增加。在Aft1p(L99A)中观察到DHAD活性增加高很多。在表达Aft1p(L99A)的酵母中所述DHAD比活性与GRX3缺失菌株中获得的比活性相似(参见表10)。
表11:表达Aft1p及其突变体对来自变异链球菌Δaft1菌株的DHAD 活性的影响。
质粒 | 比活性(U/mg) |
pHR81-FBA-ilvD(Sm)+pRS411-Aft1 | 2.60±0.52 |
pHR81-FBA-ilvD(Sm)+pRS411-Aft1(C291L) | 3.79±0.23 |
pHR81-FBA-ilvD(Sm)+pRS411-Aft1(L99A) | 5.41±0.41 |
实施例5:在CCC1缺失菌株中胞质溶胶的DHAD比活性的增加。
对于胞质溶胶的DHAD蛋白质,增加Fe-S簇生物合成能力的具体机制是未知的。基于在FRA2和GRX3缺失菌株(实施例3)以及Aft1p突变体表达的发现(实施例4),增加胞质溶胶中铁含量的可用性也可提升所述DHAD比活性。CCC1的缺失显示可增加胞质溶胶中的铁含量(Li L,等人,J Biol Chem.276:29515-29519(2001))。为测试这个假设,用实施例1中描述的质粒pHR81 FBA-IlvD(Sm)转化所述CCC1缺失菌株BY4741。检测了带有这个质粒的细胞的粗提物的DHAD活性。表13显示了这个试验的结果。当含DHAD plasmid的CCC1缺失菌株在缺乏尿嘧啶的SD培养基中生长时,发现相比于含有相同质粒的野生型细胞,DHAD比活性增加。当添加了额外铁时,观察到CCC1缺失菌株中DHAD有进一步增加。在野生型细胞中添加铁显示对DHAD比活性没有影响。为获得DHAD蛋白质的过表达,菌株在缺乏亮氨酸的SD培养基中生长(实施例1)。在这些条件下,检测到DHAD比活性的增加。
表13:表达来自变异链球菌BY4741(Δccc1)菌株的DHAD。
菌株 | 生长条件 | 无额外铁 | 100uM铁 |
野生型 | -Ura | 0.37±0.03 | 0.46±0.04 |
Δccc1 | -Ura | 0.83±0.04 | 1.24±0.03 |
野生型 | -Leu | 1.60±0.17 | 1.83±0.31 |
Δccc1 | -Leu | 2.53±0.29 | 2.7±1.07 |
实施例6:提升来自乳酸乳球菌在酵母中表达的DHAD的比活性。
实施例1-5使用来自变异链球菌的DHAD酶以鉴定在酵母中表达的DHAD比活性增加的新型方法。在这个实施例中,我们考察了这些提升来自乳酸乳球菌的DHAD酶比活性方法的应用(SEQ ID NO:958)。所述来自乳酸乳球菌(SEQ ID NO:959)的IlvD基因在FBA启动子的控制下克隆到载体pHR81中(图11)。所得构建体pHR81 FBA-IlvD(L1)-ADHt(图11;SEQ ID NO:960)转化到FRA2或GRX3基因有缺失的菌株中。为研究组成型突变体Aft1p(L99A)对来自乳酸乳球菌的DHAD的效应,pHR81 FBA-IlvD(L1)-ADHt与载体pRS411-Aft1(L99A)共转化到酵母宿主中(参见实施例4)。为过表达IlvD基因,转化子在缺乏亮氨酸或缺乏亮氨酸和甲硫氨酸的酵母合成培养基培养基中生长,其取决于菌株。酶分析法结果总结在表14。在酵母中表达时FRA2和GRX3基因中的缺失增加了来自乳酸乳球菌的DHAD的比活性。此外,Aft1组成型突变体L99A的表达类似地增加了来自乳酸乳球菌的DHAD的比活性。
表14:在酿酒酵母中过表达来自乳酸乳球菌的细菌DHAD。
菌株 | 比活性(U/mg) |
野生型 | 0.23±0.04 |
Δsft1+Ay1(L99A) | 0.95±0.31 |
Δfra2 | 0.72±0.04 |
Δgrx3 | 0.96±0.05 |
实施例7:测定DHAD的比活性。(测定方法)
需Fe-S簇蛋白质活性的定量能以检测分析形式进行。如果这个蛋白质是酶,如DHAD,其活性通常以活性单位表示。一个酶活性单位由国际生物化学联合会的酶委员会定义为在标准条件下每分钟催化1微摩尔底物转化的酶量。(International Union of Biochemistry,Report of theCommission on Enzymes,Oxford:Pergamon Press,1961)。另外,术语比活性定义为给定酶量中的酶活性单位。因此,所述比活性不是直接测定的,而是通过1)酶样品的活性,以单位/ml表示,除以2)该样本中蛋白质的浓度计算得到的,因此比活性的单位表示为单位/mg。纯的、完全活性的酶样品的比活力是这个酶的性质。蛋白质混合物样本的比活性是测量由受关注活性酶组成的样本中蛋白质的相对分数。在使用2,4-二硝基苯肼(2,4-DNPH)法的终点检测中,DHAD活性能用分光光度计测量,所述2,4-二硝基苯肼法的描述见Flint,D.H.和M.H.Emptage的J.Biol.Chem.263:3558-64(1988)。在这个检测中,2,4-DNPH与2-酮异戊酸产物的酮基反应形成腙,其可通过550nm的吸光度来检测。检测缓冲液包含50mM Tris-HC1、10mM MgCl2、pH 8.0(TM8 buffer)。足够的2,3-二羟基异戊酸加入到所述检测缓冲液中使得其在检测混合物中的终浓度为10mM。在每次检测中,含酶溶液与含足够多底物的缓冲液混合至终体积1ml。所述检测混合物通常在37℃孵育30分钟。
所述检测通过加入250μl的10%(W/V)三氯乙酸以终止反应。几分钟以后,加入500μl用1N盐酸配制的2,4-DNPH饱和溶液。所述混合物在室温下孵育至少10分钟以允许腙的形成。下一步,加入1.75ml的氢氧化钠以增溶腙,并沉淀未反应的2,4-DNPH。加入NaOH几分钟后,检测的试管放置在超声波破碎仪中10分钟以除气。所述试管然后用台式离心机以最高速2分钟以沉淀沉淀物。
1小时内读取上清液在550nm的吸光度。所述检测样本的吸光度值减去对照检测的再除以2600(由α-酮异戊酸标准曲线决定)就得到了这次检测的酶活性的单位。该检测用于本文所述的实施方案中,其中测定了DHAD的比活性。
实施例8:纯化和鉴定在大肠杆菌中表达的来自变异链球菌的 DHAD。
纯化和鉴定来自变异链球菌的DHAD如下。6升大肠杆菌Turner菌株的培养物带有pET28a质粒,其中包含变异链球菌ilvD基因,培养物生长和诱导使用了IPTG。所述变异链球菌DHAD的纯化方法为通过在TM8缓冲液中使用超声波破碎仪破碎细胞(参见实施例7),粗提物离心以去除细胞碎片,然后加载粗提物上清液到Q Sepharose(GEHealthcare)柱,并用增加NaCl浓度的TM8缓冲液洗脱DHAD。包含DHAD的部分合并,加入1M的(NH4)2SO4并加载到苯基Sepharose柱(GE Healthcare)上,用1M(NH4)2SO4平衡。所述DHAD用降低浓度的(NH4)2SO4洗脱。包含DHAD的部分合并,集中到≤10ml,加载到35×600cm Superdex-200柱(577ml柱床体积)(GE Healthcare)并用TM8缓冲液洗脱。经SDS凝胶判断,从Superdex柱洗脱的变异链球菌DHAD的纯度估计为≥90%。
纯化的变异链球菌DHAD的紫外-可见光谱如图3所示。这些高于300nm的峰是典型的含[2Fe-2S]簇的蛋白质。所述用连二亚硫酸钠还原,并且在多个温度下测定其EPR谱。图4所示EPR谱在温度20°K和70°K之间测定。所述变异链球菌DHAD的EPR谱在高达70°K时为可测量的,这表明它包含[2Fe-2S]簇并且不包含[4Fe-4S]簇,因为包含[4Fe-4S]簇的蛋白质的EPR谱在远高于10°K的温度下不能观察到。
使用Bradford蛋白质测定法,这批纯化的具有最高比活性的变异链球菌DHAD的确切蛋白质含量通过定量氨基酸分析来测定。混合所述蛋白质含量的活性得到这批的比活性为100单位/mg。使用本领域已知的方法学通过ICP-MS测定的这批的铁含量为2分子铁/DHAD。这与这批变异链球菌DHAD包含[2Fe-2S]簇的全长互补序列是一致的。
实施例9:在酵母粗提物中将DHAD的形式与细胞中其它蛋白质分 离开并从彼此来测定DHAD存在的量。
酵母细胞中存在的DHAD蛋白质以二聚体形式存在,具有两个Fe-S簇/二聚体、一个Fe-S簇/二聚体、零Fe-S簇/二聚体。在酵母粗提物中测定这三种形式DHAD蛋白质浓度的方法,是采用Mono Q柱和Source15 PHE PE 4.6/100柱(两个柱购自GE Healthcare)来开发的,并描述在下面。
冰冻的酵母细胞解冻,悬浮于50mM Tris-HC1、10mM MgCl2、pH 8.0(TM8),然后用研磨珠破碎。所述破碎细胞经离心去除细胞碎片并产生酵母粗提物。
所述粗提物加载连接在AKTA层析系统(GE Healthcare)的4mlMono Q柱上,A缓冲液为TM8,B缓冲液为含0.5M NaCl的TM8。在样品加载前,所述柱用A缓冲液平衡。在这些条件下,所述变异链球菌DHAD结合到Mono Q柱上。在所述样本加载到柱上后,所述柱用10mLTM8缓冲液洗,然后洗脱剂中的NaCl浓度增加到0.22M NaCl。接下来为30mL 0.22M至0.35M线性梯度的NaCl。在层析过程中,监测柱洗脱液的A215,并收集1mL级份。所述级份用于检测DHAD活性。从MonoQ柱流出的级份中DHAD活性的总和接近粗提物中的活性。使用这个柱获得了很好的分离,多达5mL的粗提物代表至多1g的酵母细胞糊。所述包含DHAD的级份合并配制1.35M(NH4)2SO4为在PHE柱上的层析做准备。
所述Source 15 PHE PE 4.6/100柱也连接到AKTA层析系统,其A缓冲液为包含1.5M(NH4)2SO4的TM8,和B缓冲液为TM8。在每次运行前都用90%A平衡柱。来自Mono Q柱的合并的级份配制的1.35M(NH4)2SO4加载到PHE柱上,并且在这个(NH4)2SO4浓度所述DHAD结合到柱上。在层析过程中,监测柱洗脱液的A215,并收集1mL级份。当以30mL降低的线性梯度的(NH4)2SO4、浓度为1.35M至0M冲洗柱时,所述DHAD以三个峰从柱上洗脱下来。每个DHAD峰的面积由积分测定。这个洗脱方案被认为是理想的将变异链球菌DHAD和其它酵母蛋白质分离的方法,这些蛋白质和DHAD从所述Mono Q柱上共洗脱下来。当DHAD表达的占酵母细胞中可溶性蛋白质1%时,洗脱峰级份的SDS凝胶电泳显示这些峰中存在的远超过90%的蛋白质为DHAD。包含这三个DHAD峰中的各个峰的级份单独合并。在这三个峰中基于紫外-可见吸收光谱和所述DHAD的铁与硫含量计,测定第一个峰包含DHAD带有两个[2Fe-2S]簇/二聚体;第二个峰包含DHAD带有一个[2Fe-2S]簇/二聚体;以及第三个峰包含DHAD带有0个[2Fe-2S]簇/二聚体。因此,在其原生状态,所述变异链球菌DHAD酶似乎存在由两个单体DHAD蛋白质组成的二聚体。
来自PHE柱的三个DHAD峰面积总和的样本中存在的DHAD量相关的标准曲线获得如下:各种数量的纯化的变异链球菌DHAD掺入到来自不包含变异链球菌DHAD的酵母细胞粗提物。如上所述这些提取物在Mono Q和PHE柱上进行层析。三个DHAD峰的各个峰面积整合起来。所述这些面积的总和描绘了纯DHAD掺入在酵母粗提物中的量。所述曲线图用于推导下列公式:
#μg在粗提物样本中的DHAD=0.507×(三个DHAD峰面积计数的加和)
酵母粗提物中所述DHAD活性能用实施例7中描述的方法很容易的测定。酵母粗提物中的DHAD量能以这个实施例概述的程序测定。有了这个数据,人们能根据实施例10中的程序来计算在粗提物中变异链球菌DHAD蛋白质自身的比活性。
实施例10:加载Fe-S簇的DHAD在酵母粗提物中比例的测定方法。
当纯化的需Fe-S簇蛋白质包含完全互补簇时,它将具有特征的比活性。正如前面提到的,当DHAD具有完全互补簇时变异链球菌DHAD其比活性为100units/mg。
平均每个二聚体有一个Fe-S簇的DHAD样本能包含一些有2个簇的二聚体,一些有一个簇的二聚体,以及一些没有簇的二聚体。作为另外一种选择,如果添加到二聚体的簇为全或无,并且样本中平均每个二聚体含一个Fe-S簇,则一半的DHAD二聚体将具有完全互补的簇并且另一半将没有簇。从实施例9的结果我们知道变异链球菌DHAD不遵守全或无的表现,因为一个每个二聚体一个簇的物种能为孤立的。我们已经发现含一个Fe-S簇的变异链球菌DHAD的二聚体的活性是含两个Fe-S簇的二聚体的二分之一,即具有二分之一完全互补簇的变异链球菌的比活性为50units/mg。这意味着二聚体中一个缺乏Fe-S簇的单体不影响另一个包含Fe-S簇的单体的活性。
通过实施例9中描述的程序获得的信息和到目前为止本实施方案中描述的信息,人们能有两个不同的方式测定加载到DHAD样本中Fe-S簇的度。
首先,能比较三个DHAD峰的数量比以测定其相对数量,其为每个二聚体两个簇、每个二聚体一个簇、以及每个二聚体零个簇。这给出了簇加载的度。例如,如果来自PHE柱的峰1面积为峰1、峰2、峰3面积之和的25%,峰2为50%,以及峰3为25%,加载簇的单体的百分比能按照下列公式的50%计算:
100*[2*(峰1面积)+1*(峰2面积)+0*(峰3面积)]/[2*(总峰面积)]=具有Fe-S簇的DHAD单体%。
第二,能用目前DHAD的比活性来计算加载簇的度。测定比活性是以实施例7描述测定的活性除以实施例9描述测定的DHAD蛋白质的量。然后所述比活性除以100U/mg以测定加载簇的单体的分数。这个比例乘以100以测定有Fe-S簇DHAD单体的百分数。
例如,如果比活性为50U/mg,所述加载簇的分数为0.5,并且含Fe-S簇DHAD单体的百分比为50%。
为进行此类计算,所述比活性必须基于粗提物中的DHAD蛋白质(非总蛋白质)浓度计。在其它蛋白质的存在下测定变异链球菌DHAD的浓度能用实施例9描述的方法完成。
实施例11:DHAD加载的蛋白质的比活性和推断的比例。
为测定在不同条件下生长的几个酵母菌株中加载Fe-S簇的DHAD单体的比例,使用以上所述的方法。结果示于表15中。
表15:DHAD加载的蛋白质的比活性和推断的比例。
这些结果表明在这些生长条件下,在缺乏FRA2和GRX3的菌株中加载到DHAD的Fe-S簇的水平高于包含这些基因功能拷贝的菌株的。由于Fe-S簇含量更高(Fe-S簇是活性所需的),因此更高分数的DHAD蛋白质在缺失株中以活性形式存在。
实施例12:构建酿酒酵母株PNY1505、PNY1541和PNY1542。
这个实施例的目的是构建酿酒酵母株PNY1505、PNY1541和PNY1542。这些菌株来源于PNY1503(BP1064)。PNY1503来源于CEN.PK 113-7D(CBS 8340;Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversiry Centre,Netherlands)。所述PNY1503(BP1064)的构建在美国专利申请61/368,436中描述,以引用方式并入本文,并且在后面的实施例13中。PNY1505在FRA2基因中包含一个缺失。PNY1541和PNY1542包含AFT1基因与L99A突变的整合(AFT1-L99A)在YPRCΔ15基因座。
缺失/整合是通过的同源性重组生成的,所述聚合酶链反应片段包含靶基因上游和下游同源性区以及用于转化子选择的URA3基因。所述URA3基因通过同源性重组去除以生成无痕的缺失/整合。
所述无痕的缺失/整合程序是改编自Akada等人,Yeast,23(5):399-405(2006)。每个缺失/整合所述聚合酶链反应盒是通过组合四个片段,A-B-U-C,得到的,所述整合是通过重叠聚合酶链反应或单个片段克隆完成的,并且对于缺失/整合程序,整合基因到质粒中在通过聚合酶链反应扩增整个盒之前。所述聚合酶链反应盒包含一个选择/反选标记,URA3(片段U),包括原生CEN.PK 113-7D URA3基因,连同启动子(URA3基因上游250bp)和终止子(URA3基因下游150bp)区。片段A(150bp至500bp长)和C(250bp长)对应于紧接靶基因(片段A)上游的序列和靶基因3′序列(片段C)。片段A和C用于通过同源性重组将盒整合到染色体中。片段B(500bp长)对应于紧接靶基因上游的500bp并且用于通过同源性重组,从染色体上切除URA3标记和片段C,在盒与染色体的整合时生成作为对应于片段B的直接重复序列。
使用聚合酶链反应产物ABUC盒,首先将URA3标记整合进基因组,然后通过同源性重组从基因组中切除。所述初始整合去除了基因,不包括3′序列。在切割时,基因的3′区也被去除。对于使用这个方法整合基因,将整合的基因包含在盒中片段A和B之间。
FRA2去除
所述FRA2去除(也如美国专利申请61/380,563所述,以引用方式并入本文)旨在去除编码区3′端的250个核苷酸,保留FRA2编码序列的最初113个核苷酸不动。一个阅读框终止密码子出现在去除下游7个核苷酸的位置。所述用于无痕FRA2去除的聚合酶链反应盒的四个片段的扩增,使用Phusion高保真聚合酶链反应Master Mix(New EnglandBioLabs;Ipswich,MA)和CEN.PK 113-7D基因组DNA作为模板,用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen Valencia,CA)制备。FRA2片段A的扩增使用引物oBP594(SEQ ID NO:961)和引物oBP595(SEQ ID NO:962),其包含与FRA2片段B的5′端同源性的5′尾部。FRA2片段B的扩增使用引物oBP596(SEQ ID NO:963),其包含与FRA2片段A的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP597(SEQ ID NO:964),其包含与FRA2片段U的5′端同源性的5′尾部。FRA2片段U的扩增使用引物oBP598(SEQ ID NO:965),其包含与FRA2片段B的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP599(SEQ ID NO:966),其包含与FRA2片段C的5′端同源性的5′尾部。FRA2片段C的扩增使用引物oBP600(SEQ ID NO:967),其包含与FRA2片段U的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP601(SEQ IDNO:968)。聚合酶链反应产物用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen)纯化。FRA2片段AB是通过重叠聚合酶链反应生成的,通过混合FRA2片段A和FRA2片段B并用引物oBP594(SEQ ID NO:961)和oBP597(SEQ ID NO:964)。FRA2片段UC是通过重叠聚合酶链反应生成的,通过混合FRA2片段U和FRA2片段C并用引物oBP598(SEQ ID NO:965)和oBP601(SEQ ID NO:968)进行扩增。所得聚合酶链反应产物在琼脂糖凝胶上电泳,然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化。所述FRA2 ABUC盒是通过重叠聚合酶链反应生成的,通过混合FRA2片段AB和FRA2片段UC并用引物oBP594(SEQ ID NO:961)和oBP601(SEQ ID NO:968)进行扩增。用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen)纯化聚合酶链反应产物。
制备PNY1503的感受态细胞并用FRA2 ABUC聚合酶链反应盒转化,使用Frozen-EZ Yeast Transformation II kit(Zymo Research;Orange,CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以1%的乙醇的合成完全培养基上。带有fra2敲除的转化子通过聚合酶链反应筛选,使用引物为oBP602(SEQ ID NO:969)和oBP603(SEQ ID NO:970),使用由GentraPuregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备的基因组DNA。正确的转化子生长于YPE(酵母提取物、蛋白质胨、1%乙醇)并在30℃接种到辅以1%的乙醇的,并包含5-氟-乳清酸(0.1%)的合成完全培养基上,以选择失去了URA3标记的分离物。通过聚合酶链反应确认删除和标记移除,所述聚合酶链反应具有引物oBP602(SEQ ID NO:969)和oBP603(SEQID NO:970),使用由Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备的基因组DNA。来自分离物的FRA2基因的缺乏通过聚合酶链反应阴性结果来证明,使用FRA2编码区特异性的引物,oBP605(SEQ ID NO:971)和oBP606(SEQ ID NO:972)。所述正确的分离物被选择为菌株CEN.PK113-7D MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1tpdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ::loxP fra2Δ并命名为PNY1505(BP1135)。
表16:在FRA2去除中使用的引物
YPRCΔ15 Deletion缺失和AFTl-L99A整合
所述YPRCΔ15基因座被去除并替换为AFT1-L99A,连同来自AFT1原生启动子区(800bp)和终止子区(800bp)。YPRCΔ15 deletion缺失-AFT1L99A整合的无痕盒首先克隆到质粒pUC19-URA3MCS(描述见美国专利申请61/356,379,以引用方式并入本文)。所述载体是基于pUC19的并包含来自酿酒酵母URA3基因的序列CEN.PK 113-7D,其位于多克隆位点(MCS)内。pUC19(美国典型培养物保藏中心,Manassas,VA;ATCC#37254)包含pMB1复制子和用于在大肠杆菌中复制和选择的编码β-内酰胺酶的基因。除了URA3的编码序列,为酵母在酵母中表达URA3基因还存在URA3基因上游(250bp)和下游(150bp)的序列。所述载体能用于克隆的目的,并且能用做酵母整合载体。
所述DNA涵盖了URA3编码区,连同URA3基因上游250bp和下游150bp,所述URA3编码区来自酿酒酵母CEN.PK 113-7D(CBS 8340;Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre,Netherlands)基因组DNA扩增使用引物oBP438(SEQ ID NO:1033),其包含BamHI、AscI、PmeI和FseI点,以及oBP439(SEQ ID NO:1034),其包含XbaI、PacI和NotI限制性位。基因组DNA使用Gentra PuregeneYeast/Bact kit(Qiagen)来制备。所述聚合酶链反应产物和pUC19经BamHI和XbaI消化后,用T4 DNA连接酶连接生成载体pUC19-URA3MCS。所述载体通过聚合酶链反应和测序来确认,所用引物为oBP264(SEQ ID NO:1031)和oBP265(SEQ ID NO:1032)。
YPRCΔ15片段A扩增自基因组DNA,制备如上述,所用引物为oBP622(SEQ ID NO:973),其包含KpnI限制性位点,和引物oBP623(SEQ ID NO:974),其包含与YPRCΔ15片段B的5′端同源性的5’尾部。YPRCΔ15片段B扩增自基因组DNA,所用引物为oBP624(SEQ IDNO:975),其包含与YPRCΔ15片段A的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP625(SEQ ID NO:976),其包含FseI限制性位点。聚合酶链反应产物用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen)纯化。YPRCΔ15片段A-YPRCΔ15片段B是通过重叠聚合酶链反应生成的,通过混合YPRCΔ15片段A和YPRCΔ15片段B的聚合酶链反应产物并用引物oBP622(SEQID NO:973)和oBP625(SEQ ID NO:976)扩增。所述所得聚合酶链反应产物用KpnI和FseI消化,用T4DNA连接酶连到用适宜的酶消化过的pUC19-URA3MCS的对应的位点上。YPRCΔ15片段C扩增自基因组DNA,所用引物为oBP626(SEQ ID NO:977),其包含NotI,和引物oBP627(SEQ ID NO:978),其包含PacI限制性位点。所述YPRCΔ15片段C聚合酶链反应产物用NotI和PacI消化,并且用T4 DNA连接酶连到包含YPRCΔ15片段AB的质粒的对应的位点上。AFT1-L99A,连同来自AFT1的原生启动子区(800bp)和终止子区(800bp),使用pRS411-AFT1为模板进行扩增(L99A)(如以上实施例4所述),所用引物为oBP744(SEQ ID NO:979),其包含AscI限制性位点,和引物oBP745(SEQ ID NO:980),其包含Pmel限制性位点。所述聚合酶链反应产物用AscI和PmeI消化,并用T4DNA连接酶连到包含YPRCΔ15片段ABC的质粒的对应位点上。所述整个整合盒从所得质粒扩增,所用引物为oBP622(SEQ ID NO:973)和oBP627(SEQ ID NO:978)。
制备PNY1503的感受态细胞并用YPRCΔ15去除/AFT1-L99A整合盒聚合酶链反应产物转化,使用Frozen-EZ Yeast Transformation II kit(Zymo Research)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以1%的乙醇的合成完全培养基上。转化子生长在YEP(1%乙醇)并在30℃接种到辅以1%的乙醇的,并包含5-氟-乳清酸(0.1%)的合成完全培养基上,以选择失去了URA3标记的分离物。所述YPRCΔ15的去除和AFT1L99A的整合是通过聚合酶链反应来确认,所用外部引物为oBP636(SEQ IDNO:981)和oBP637(SEQ ID NO:982)和AFT1-L99A特异性引物HY840(SEQ ID NO:983)和外部引物oBP637(SEQ ID NO:982),使用基因组DNA由Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)和菌落聚合酶链反应制备。正确的独立分离物CEN.PK 113-7D MATa ura3Δ::loxP his3Δpdc6Δ pdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1tpdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ::loxP yprcΔ15Δ::AFT1L99A被命名为菌株PNY1541和PNY1542。
表17:在YPRCΔ15去除和AFT1-L99A整合中所用的引物
实施例13:构建酿酒酵母株BP1064(PNY1503)。
所述菌株BP1064来源于CEN.PK 113-7D(CBS 8340;Centraalbureauvoor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre,Netherlands)并包含下列基因的缺失:URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6和GPD2。
缺失,即完全去除整个编码序列,通过与聚合酶链反应片段同源性重组而创建,所述聚合酶链反应片段包含靶基因的上游和下游同源性区以及用于选择转化子的G418抗性标记或URA3基因。其侧翼为的G418抗性标记,用Cre重组酶去除。通过同源性重组去除所述URA3基因以创建无痕缺失,或如果侧翼为loxP位点则用Cre重组酶去除。
所述无痕缺失程序从Akada等人,2006,Yeast v23 p399中修改得到。一般来讲,每个无痕缺失的聚合酶链反应盒是通过重叠聚合酶链反应组合四个片段,A-B-U-C,得到的。所述聚合酶链反应盒包含可选的/反可选的标记,URA3(Fragment U),其包含原生CEN.PK 113-7D URA3基因,连同启动子r(URA3基因上游250bp)和终止子(URA3基因下游150bp)。片段A和C每个长500bp,它们对应于紧接靶基因(片段A)上游的500bp和靶基因3′的500bp(片段C)。片段A和C用于通过同源性重组将盒整合到染色体中。片段B(500bp长)对应于紧接靶基因下游的500bp并用于通过同源性重组,从染色体上切除URA3标记和片段C,在盒整合到染色体时生成作为对应片段B的直接重复序列使用聚合酶链反应产物ABUC盒,首先将URA3标记整合进基因组,然后通过同源性重组从基因组中切除。初始整合删除了除3′的500bp之外的基因。在切除时,也删除了所述基因3′的500bp区域。对于使用这个方法的基因整合,将要整合的基因包含在聚合酶链反应和的片段A和B之间。
URA3删除
为删除内源URA3编码区,ura3::loxP-kanMX-loxP以盒聚合酶链反应扩增自pLA54模板DNA(SEQ ID NO:986)。pLA54包含乳酸克鲁维酵母TEF1启动子和kanMX标记,并且侧翼序列为oxP位点,允许Cre重组酶参与重组并去除标记。聚合酶链反应使用Phusion DNA聚合酶和引物BK505与BK506(SEQ ID NOs:987和988,分别的)。所述每个引物的URA3部分来源于URA3启动子上游5′区,和编码区下游3′区,使得loxP-kanMX-loxP标记的整合导致marker resulted in URA3编码区的替换。使用标准基因技术将所述聚合酶链反应产物转化到CEN.PK113-7D中(Methods in Yeast Genetics,2005,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.201-202)并且转化子在30℃包含G418(100μg/ml)的YPD上选择。采用聚合酶链反应验证筛选的转化子的正确整合,所用引物为LA468和LA492(SEQ ID NOs:989和990,分别的)并命名为CEN.PK 113-7DΔura3::kanMX。
HIS3删除
用于无痕HIS3删除的聚合酶链反应盒的四个片段的扩增使用Phusion高保真聚合酶链反应Master Mix(New England BioLabs;Ipswich,MA)并以CEN.PK 113-7D基因组DNA为模板,所述基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen;Valencia,CA)制备。HIS3片段A的扩增采用引物为oBP452(SEQ ID NO:991)和引物oBP453(SEQ IDNO:992),其包含与HIS3片段B的5′端同源性的5′尾部。HIS3片段B的扩增采用引物为oBP454(SEQ ID NO:993),其包含与HIS3片段A的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP455(SEQ ID NO:994),其包含与HIS3片段U的5′端同源性的5′尾部。HIS3片段U的扩增采用引物为oBP456(SEQ ID NO:995),其包含与HIS3片段B的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP457(SEQ ID NO:996),其包含与HIS3片段C的5′端同源性的5′尾部。HIS3片段C的扩增采用引物为oBP458(SEQ ID NO:997),其包含与HIS3片段U的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP459(SEQ ID NO:998)。聚合酶链反应产物的纯化采用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen)。HIS3片段AB通过重叠聚合酶链反应生成,通过混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物oBP452(SEQ ID NO:991)和oBP455(SEQ ID NO:994)HIS3片段UC通过重叠聚合酶链反应生成,通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQ ID NO:995)和oBP459(SEQ ID NO:998)进行扩增。所得聚合酶链反应产物在琼脂糖凝胶上电泳,然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化。HIS3ABUC盒通过重叠聚合酶链反应生成,通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452(SEQ ID NO:991)和oBP459(SEQ ID NO:998)进行扩增。用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen)纯化聚合酶链反应产物。
制备CEN.PK 113-7D Δura3::kanMX的感受态细胞,并用HIS3ABUC聚合酶链反应盒转化,使用Frozen-EZ Yeast Transformation II kit(Zymo Research;Orange,CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以2%的乙醇的合成完全培养基上。具有his3敲除的转化子用聚合酶链反应进行筛选,所用引物为oBP460(SEQ ID NO:999)和oBP461(SEQ ID NO:1000),使用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bactkit(Qiagen)制备。正确的转化子选择为菌株CEN.PK 113-7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3。
从Δura3位点移除KanMX标记以及从Δhis3位点移除URA3标记
所述KanMX标记通过转化CEN.PK 113-7D Δura3::kanMXΔhis3::URA3 with pRS423::PGAL1-cre(SEQ ID NO:1011,如美国临时申请61/290,639中所述)而去除,使用Frozen-EZ Yeast Transformation II kit(Zymo Research)并在30℃接种到缺乏组氨酸和尿嘧啶辅以2%的葡萄糖的合成完全培养基上。转化子在30℃的辅以1%的半乳糖的YP上生长6个小时以诱导Cre重组酶和KanMX标记切除,并在30℃接种到YPD(2%葡萄糖)平板上以复苏。分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1%)的合成完全培养基上,以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离物生长和接种到YPD中以去除pRS423::PGAL1-cre质粒。检测分离物中KanMX标记和URA3标记的丢失,并通过在YPD+G418平板、缺乏尿嘧啶的合成完全培养基平板、以及缺乏组氨酸的合成完全培养基平板的生长检测,检测IpRS423::PGAL1-cre质粒的丢失。对G418敏感并为尿嘧啶和组氨酸营养缺陷性的正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3::loxP Δhis3并命名为BP857。所述删除和标记移除通过聚合酶链反应和测序确认,所用引物为oBP450(SEQ ID NO:1001)和oBP451(SEQ ID NO:1002)对于Δura3以及引物oBP460(SEQ ID NO:999)和oBP461(SEQ ID NO:1000)针对Δhis3,所用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。
PDC6删除
用于无痕PDC6删除的聚合酶链反应盒的四个片段的扩增使用Phusion高保真聚合酶链反应Master Mix(New England BioLabs)并以CEN.PK 113-7D基因组DNA为模板,用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。PDC6片段A的扩增所用引物为oBP440(SEQ ID NO:1003)和引物oBP441(SEQ ID NO:1004),其包含与PDC6片段B的5′端同源性的5’尾部。PDC6片段B扩增所用引物为oBP442(SEQ ID NO:1005),其包含与PDC6片段A的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP443(SEQ ID NO:1006),其包含与PDC6片段U的5′端同源性的5′尾部。PDC6片段U扩增所用引物为oBP444(SEQ ID NO:1007),其包含与PDC6片段B的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP445(SEQ ID NO:1008),其包含与PDC6片段C的5′端同源性的5′尾部。PDC6片段C扩增所用引物为oBP446(SEQ ID NO:1009),其包含与PDC6片段U的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP447(SEQ ID NO:1010)。聚合酶链反应产物纯化使用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen)。PDC6片段AB通过重叠聚合酶链反应生成,通过混合PDC6片段A和PDC6片段B并用引物oBP440(SEQ ID NO:1003)和oBP443(SEQ ID NO:1006)进行扩增。PDC6片段UC通过重叠聚合酶链反应生成,通过混合PDC6片段U和PDC6片段C并用引物oBP444(SEQ ID NO:1007)和oBP447(SEQ IDNO:1010)进行扩增。所得聚合酶链反应产物在琼脂糖凝胶上电泳,然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化。所述PDC6 ABUC盒通过重叠聚合酶链反应生成,通过混合PDC6片段AB和PDC6片段UC并用引物oBP440(SEQ ID NO:1003)和oBP447(SEQ ID NO:1010)进行扩增。用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen)纯化聚合酶链反应产物。
制备CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3的感受态细胞,并用PDC6ABUC聚合酶链反应盒转化,使用Frozen-EZ Yeast Transformation II kit(Zymo Research)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以2%的葡萄糖的合成完全培养基上。带有pdc6敲除的转化子通过聚合酶链反应进行筛选,所用引物为oBP448(SEQ ID NO:1012)和oBP449(SEQ IDNO:1013),所述基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3Δpdc6::URA3。
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6::URA3分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1%)的合成完全培养基上,以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述缺失和标记移除通过聚合酶链反应和测序确认,所用引物为oBP448(SEQ ID NO:1012)和oBP449(SEQ ID NO:1013),所述基因组DNA用Gentra PuregeneYeast/Bact kit(Qiagen)制备。来自分离物的PDC6基因的缺乏通过聚合酶链反应阴性结果来证明,所用PDC6的编码区的特异性引物为oBP554(SEQ ID NO:1014)和oBP555(SEQ ID NO:1015)。正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6并被命名为BP891。
PDC1删除-ilvDSm整合
所述PDC1基因被删除并被ilvD替换,其编码区来自变异链球菌ATCC#700610。所述A片段接着ilvD编码区,其来自变异链球菌,对于用于PDC1删除-ilvDSm整合的聚合酶链反应盒使用Phusion HighFidelity聚合酶链反应Master Mix(New England BioLabs)进行扩增并用NYLA83(如美国临时申请61/246709所述)基因组DNA作为模板,所述基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。PDC1片段A-ilvDSm(SEQ ID NO:1053)用引物oBP513(SEQ ID NO:1016)和引物oBP515(SEQ ID NO:1017)进行扩增,其包含与PDC1片段B的5′端同源性的5′尾部。所述用于PDC1删除-ilvDSm整合的聚合酶链反应盒的片段B、U和C片段,使用Phusion High Fidelity聚合酶链反应Master Mix(New England BioLabs)进行扩增,并使用CEN.PK 113-7D基因组DNA作为模板,所述基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bactkit(Qiagen)制备。PDC1片段B扩增所用引物为oBP516(SEQ ID NO:1018),其包含与PDC1片段A-ilvDSm的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP517(SEQ ID NO:1019),其包含与PDC1片段U的5′端同源性的5′尾部。PDC1片段U扩增所用引物为oBP518(SEQ ID NO:1020),其包含与PDC1片段B的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP519(SEQ ID NO:1021),其包含与PDC1片段C的5′端同源性的5′尾部。PDC1片段C扩增所用引物为oBP520(SEQ ID NO:1022),其包含与PDC1片段U的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP521(SEQ ID NO:1023)。聚合酶链反应产物用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。PDC1片段A-ilvDSm-B通过重叠聚合酶链反应生成,通过混合PDC1片段A-ilvDSm和PDC1片段B并使用引物oBP513(SEQ ID NO:1016)和oBP517(SEQ ID NO:1019)进行扩增。PDC1片段UC通过重叠聚合酶链反应生成,通过混合PDC1片段U和PDC1片段C并用引物oBP518(SEQ ID NO:1020)和oBP521(SEQ ID NO:1023)进行扩增。所得聚合酶链反应产物在琼脂糖凝胶上电泳,然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化。所述PDC1 A-ilvDSm-BUC盒(SEQ ID NO:1054)通过重叠聚合酶链反应生成,通过混合PDC1片段A-ilvDSm-B和PDC1片段UC并使用引物oBP513(SEQ ID NO:1016)和oBP521(SEQ ID NO:1023)进行扩增。用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen)纯化聚合酶链反应产物。
制备CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6的感受态细胞,并用PDC1 A-ilvDSm-BUC聚合酶链反应盒转化,使用Frozen-EZ YeastTransformation II kit(Zymo Research)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以2%的葡萄糖的合成完全培养基上。具有PDC1敲除-ilvDSm整合的转化子用聚合酶链反应进行筛选,所用引物为oBP511(SEQ IDNO:1024)和oBP512(SEQ ID NO:1025),所述基因组DNA用GentraPuregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。来自分离物的PDC1基因的缺乏通过聚合酶链反应阴性结果来证明,使用PDC1编码区特异性的引物oBP550(SEQ ID NO:1026)和oBP551(SEQ ID NO:1027)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6Δpdc1::ilvDSm-URA3。
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm-URA3过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1%)的合成完全培养基上,以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述PDC1的删除、ilvDSm的整合以及标记的移除通过聚合酶链反应和测序来确认,所用引物为oBP511(SEQ ID NO:1024)和oBP512(SEQ ID NO:1025),所述基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6Δpdc1::ilvDSm并命名为BP907。
PDC5删除sadB整合
所述PDC5基因被删除并被sadB编码区替换,所述编码区来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)。对于PDC5删除-sadB整合的聚合酶链反应盒的一个片段首先克隆到质粒pUC19-URA3MCS中。
pUC19-URA3MCS是基于pUC19的并包含处于多克隆位点(MCS)内的URA3基因,其来自酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)。pUC19包含pMBl复制子和一个编码β-内酰胺酶的基因,该基因负责在大肠杆菌中的复制与选择。除URA3的编码序列外,该基因的上游至下游序列都被包括用于在酵母中表达URA3。所述载体能用于克隆目的并能用作酵母整合载体。
所述DNA涵盖了URA3编码区,连同URA3编码区上游250bp和下游150bp,所述序列来自酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae),CEN.PK113-7D基因座DNA的扩增使用引物oBP438(SEQ ID NO:1033),其包含BamHI、AscI、PmeI和FseI,和oBP439(SEQ ID NO:1034),其包含XbaI、PacI和NotI限制性位点,使用Phusion High-Fidelity聚合酶链反应Master Mix(New England BioLabs)。基因组DNA用GentraPuregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。在使用BamHI和XbaI消化后,所述聚合酶链反应产物和pUC19(SEQ ID NO:1056)用T4DNA连接酶连接生成载体pUC19-URA3MCS。所述载体通过聚合酶链反应和测序确认,所用引物为oBP264(SEQ ID NO:1031)和oBP265(SEQ ID NO:1032)。
所述sadB编码序列和PDC5片段B克隆到pUC19-URA3MCS生成PDC5A-sadB-BUC聚合酶链反应盒的sadB-BU部分。所述sadB编码序列扩增以pLH468-sadB(SEQ ID NO:1051)作为模板,所用引物为oBP530(SEQ ID NO:1035),其包含AscI限制性位点,和引物oBP531(SEQID NO:1036),其包含与PDC5片段B的5′端同源性的5′尾部。PDC5片段B扩增所用引物为oBP532(SEQ ID NO:1037),其包含与sadB的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP533(SEQ ID NO:1038),其包含PmeI限制性位点。聚合酶链反应产物用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。sadB-PDC5片段B通过重叠聚合酶链反应生成,通过混合sadB片段U和PDC5片段B并用引物oBP530(SEQ ID NO:1035)和oBP533(SEQ ID NO:1038)进行扩增。在用合适的酶消化后,所得聚合酶链反应产物经AscI和PmeI消化用T4DNA连接酶连接到pUC19-URA3MCS对应的位点上。所得质粒用作模板以扩增sadB-片段B-片段U,所用引物为oBP536(SEQ ID NO:1039)和oBP546(SEQ IDNO:1040),其包含与PDC5片段C的5′端同源性的5′尾部。PDC5片段C扩增所用引物为oBP547(SEQ ID NO:1041),其包含与PDC5sadB-片段B-片段U的3′端同源性的5′尾部,和引物oBP539(SEQ ID NO:1042)。聚合酶链反应产物用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。PDC5sadB-片段B-片段U-片段C通过重叠聚合酶链反应生成,通过混合PDC5sadB-片段B-片段U和PDC5片段C并用引物oBP536(SEQ ID NO:1039)和oBP539(SEQ ID NO:1042)进行扩增。所得聚合酶链反应产物在琼脂糖凝胶上纯化接着使用Gel Extraction kit(Qiagen)。所述PDC5A-sadB-BUC盒(SEQ ID NO:1055)通过扩增PDC5 sadB-片段B-片段U-片段C而生成,所用引物为oBP542(SEQ IDNO:1043),其包含与原生PDC5编码序列上游50个核苷酸同源性的5′尾部,和oBP539(SEQ ID NO:1042)。用聚合酶链反应纯化试剂盒(Qiagen)纯化聚合酶链反应产物。
制备CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm的感受态细胞,并用PDC5A-sadB-BUC聚合酶链反应盒转化,所述转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation II kit(Zymo Research)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以1%的乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上。具有pdc5敲除sadB整合的转化子通过聚合酶链反应进行筛选,所用引物为oBP540(SEQ ID NO:1044)和oBP541(SEQ ID NO:1045),所述基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。来自分离物的PDC5基因的缺乏通过聚合酶链反应阴性结果来证明,使用PDC5编码区特异性的引物oBP552(SEQ ID NO:1046)和oBP553(SEQID NO:1047)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxPΔhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB-URA3。
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB-URA3过夜生长在YPD(0.1%乙醇)中并在30℃接种到合成完全培养基上,辅以乙醇(无葡萄糖)并包含包含5-氟-乳清酸(0.1%),以选择失去了URA3标记的分离物。所述PDC5删除、sadB整合以及标记去除是通过聚合酶链反应确认的,所用引物为oBP540(SEQ ID NO:1044)和oBP541(SEQ ID NO:1045),所述基因组DNA用GentraPuregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。所述正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB并命名为BP913。
GPD2删除
为删除内源的GPD2编码区,gpd2::loxP-URA3-loxP盒(SEQ ID NO:1057)进行聚合酶链反应扩增,使用loxP-URA3-loxP PCR(SEQ ID NO:1052)作为模板DNA。loxP-URA3-loxP包含来自(ATCC#77107)的URA3标记,其侧翼序列为loxP重组酶位点。聚合酶链反应使用PhusionDNA聚合酶以及引物LA512和LA513(SEQ ID NOs:1029和1030,分别的)进行。每个引物的GPD2部分来源于GPD2编码区上游5′区和编码区下游3′区,使得loxP-URA3-loxP标记的整合导致GPD2编码区的替换。所述聚合酶链反应产物转化到BP913并且转化子在缺乏尿嘧啶的辅以1%乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上筛选。筛选的转化子的正确整合通过聚合酶链反应来验证,所用引物为oBP582和AA270(SEQ IDNOs:1048和1049,分别的)。
所述URA3标记的循环是通过转化pRS423::PGAL1-cre(SEQ ID NO:1011)并在30℃接种到缺乏组氨酸,辅以1%的乙醇的合成完全培养基上。在辅以1%的乙醇的,并包含5-氟-乳清酸(0.1%)的合成完全培养基上,转化子是有条斑纹状的,并且在30℃孵育以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离物生长在YPE(1%乙醇)上以移除pRS423::PGAL1-cre质粒。通过聚合酶链反应确认删除和标记移除,所述聚合酶链反应具有引物oBP582(SEQ ID NO:1048)和oBP591(SEQ ID NO:1050)。所述正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB Δgpd2::loxP并命名为BP1064。
实施例14:摇瓶实验以测定23-二羟基异戊酸的积累和异丁醇产量。
这个实施例的目的是为了显示异丁醇途径中间体2,3-二羟基异戊酸(DHIV)的积累的效应,并显示在产异丁醇菌株的异丁醇产量,所述菌株包含整合拷贝的AFT1-L99A基因或相比于亲本菌株的FRA2缺失。菌株由异丁醇途径质粒pYZ090(SEQ ID NO:984;如美国专利申请61/368,436所述,以引用方式并入本文)和pLH468(SEQ ID NO:985;如美国专利申请61/246,844所述,以引用方式并入本文)转化。这些质粒也简要描述如下。
pYZ090(SEQ ID NO:984)被构建以包含一个嵌合基因,其具有来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)alsS基因(nt位点457-2172)编码区,所述alsS基因表达起始于酵母CUP1启动子(nt 2-449)并接CYC1终止子(nt 2181-2430);以及一个嵌合基因,其具有来自乳酸乳球菌的ilvC基因(nt 3634-4656),所述KARI的表达起始于酵母ILV5启动子(2433-3626)并接ILV5终止子(nt 4682-5304)。
pLH468(SEQ ID NO:985)构建了包括:嵌合基因,其具有来自变异链球菌的ilvD基因的编码区(nt位点3313-4849),所述表达DHAD的编码区从来自于酿酒酵母FBA1启动子(nt 2109-3105)接着FBA1终止子(nt 4858-5857);嵌合基因,其具有密码子优化的马肝乙醇脱氢酶的编码区(nt 6286-7413),所述表达ADH的编码区从酿酒酵母GPM1启动子(nt 7425-8181)接着ADH1终止子(nt 5962-6277);以及嵌合基因,其具有来自乳酸乳球菌的密码子优化的kivD基因编码区(nt 9249-10895),所述表达KivD基因的编码区从TDH3启动子(nt10896-11918)接着TDH3终止子(nt 8237-9235)。
PNY1503(亲本菌株)的转化子定名为PNY1504。PNY1505(fra2缺失菌株)的转化子定名为PNY1506。PNY1541和PNY1542(AFT1-L99A整合菌株)的转化子定名为PNY1543和PNY1544为PNY1541的,以及PNY1545和PNY1546为PNY1542的。
菌株生长于合成培养基中(酵母氮源-无氨基酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和Yeast Synthetic Drop-Out Media Supplement无尿嘧啶和组氨酸(Clontech,Mountain View,CA))辅以100mM MES pH5.5、0.2%葡萄糖和0.2%乙醇。过夜培养物生长在125mL的通气Erlenmeye烧瓶中的15mL培养基里,温度为30℃,New Brunswick Scientific I24摇床转速为225RPM。125mL紧密封口的Erlenmeyer烧瓶中,18ml培养基接种了过夜培养物至OD600值为0.5,并且在30℃下生长6小时,NewBrunswick Scientific I24摇床转速为225RPM。6个小时后,葡萄糖添加到2.5%,酵母提取物添加到5g/L,以及蛋白质胨添加到10g/L(时间0小时)。24和48小时后,培养物上清液(收集采用了Spin-X离心管过滤单位,Costar Cat.No.8169)用HPLC(方法描述见美国专利申请公开US 2007/0092957,以引用方式并入本文)和LC/MS液质联用进行分析。葡萄糖和异丁醇浓度用HPLC测定。DHIV的分离和定量采用了LC/MS液质联用,所用仪器为Waters(Milford,MA)AcquityTQD系统,层析柱为Atlantis T3(#186003539部分)。柱温维持在30℃并且流速为0.5mL/分钟。所述A流动相为0.1%甲酸水0.溶液,以及B流动相为0.1%甲酸乙腈溶液。每次运行包括99%A 1分钟、线性梯度超过一分钟到25%B、接着99%A 1分钟。使用Waters ACQ_TQD(s/n QBA688)质谱检测器,监测m/z=133(负ESI)、锥孔电压32.5V时的柱流出物峰值。DHIV通常在1.2分钟出现。获得了基线分离并且以由1M含水原液配置的标准溶液的分析作为参考将DHIV的峰面积转换为有基准的μM DHIV浓度。
表18显示了DHIV摩尔产量(DHIV摩尔数/消耗的葡萄糖摩尔数)和AFTl-L99A菌株的异丁醇滴度(PNY1543、PNY1544、PNY1545和PNY1546)以及FRA2缺失菌株(PNY1506)与亲本菌株背景(PNY1504)在24小时和48小时的对比。AFT1-L99A表达或FRA2缺失都导致DHIV的积累减少大约50%。
表18:DHIV摩尔产量和异丁醇滴度。
数据为两个独立烧瓶的平均值,对于PNY1504和,PNY1506,以及菌株AFT1-L99A的两个独立转化子(PNY1543-PNY1544和PNY1545-PNY1546)。
前述特定实施方案的描述将充分地揭示本发明的一般本质,使得其他人员能够在不背离本发明的一般概念的情况下,无需进行过度实验地应用本领域内的技术知识,容易地修改和/或改变此类特定实施方案的多个应用。因此,此类改变和修改形式旨在基于本文提供的教导和指导,在所述公开的等同实施方案的目的和范围内。应当了解本文的用语或术语的目的是描述并不是限制,因此本说明书的用语或术语是按照本是描述和没有限制的目的,这样,本规范的术语或用语是由本领域技术人员按照教导和指导来解释的。
Claims (61)
1.重组宿主细胞,包含:
(a)编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸;和
(b)(i)在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一种缺失、突变、和/或取代;和/或
(ii)编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸。
2.权利要求1的重组宿主细胞,其中所述编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸:
(a)包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒;或
(b)在所述重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。
3.重组宿主细胞,包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸,其中所述至少一种异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒。
4.重组宿主细胞,包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸,其中所述至少一种异源性多核苷酸在所述重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。
5.权利要求1或2的重组宿主细胞,其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由选自表8和9中基因的基因编码。
6.权利要求1或2的重组宿主细胞,其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由选自表7中基因的基因编码。
7.权利要求5或6的重组宿主细胞,其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由选自AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、CCC1、以及它们的组合的基因编码。
8.权利要求7的重组宿主细胞,其中所述多肽由组成型突变体多核苷酸编码。
9.权利要求8的重组宿主细胞,其中所述组成型突变体选自AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F、AFT1C293F、以及它们的组合。
10.权利要求1或2的重组宿主细胞,其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽为AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、或CCC1。
11.权利要求1或2的重组宿主细胞,其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽为AFT1、AFT2、FRA2、或CCC1。
12.权利要求1或2的重组宿主细胞,其中在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一种缺失、突变、和/或取代选自FRA2、GRX3、CCC1、以及它们的组合。
13.权利要求1或2的重组宿主细胞,其中编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸选自AFT1、AFT2、以及它们的组合。
14.权利要求1的重组宿主细胞,其中所述编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸以多拷贝表达。
15.权利要求14的重组宿主细胞,其中所述至少一种异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒。
16.权利要求14的重组宿主细胞,其中所述至少一种异源性多核苷酸在所述重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。
17.权利要求1、2、或5-16中任一项的重组宿主细胞,其中相比于具有内源性Fe-S簇生物合成的重组宿主细胞,所述Fe-S簇生物合成增加。
18.权利要求1-17中任一项的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞为酵母宿主细胞。
19.权利要求18的重组宿主细胞,其中所述酵母宿主细胞选自糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
20.权利要求1-19中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽在宿主细胞的胞质溶胶中表达。
21.权利要求1-20中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽具有以<10-5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列,其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸,它们对应于变异链球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位点56、129和201,所述变异链球菌DHAD酶对应于SEQ ID NO:168。
22.权利要求1-21中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽具有氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ IDNO:168或SEQ ID NO:232具有至少约90%的同一性。
23.权利要求1-22中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有选自下列的比活性:
(a)大于对照宿主细胞的约5倍,所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸;
(b)大于对照宿主细胞的约8倍,所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸;和
(c)大于对照宿主细胞的约10倍,所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。
24.权利要求1-22中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有选自下列的比活性:
(a)大于约0.25U/mg;
(b)大于约0.3U/mg;
(c)大于约0.5U/mg;
(d)大于约1.0U/mg;
(e)大于约1.5U/mg;
(f)大于约2.0U/mg;
(g)大于约3.0U/mg;
(h)大于约4.0U/mg;
(i)大于约5.0U/mg;
(j)大于约6.0U/mg;
(k)大于约7.0U/mg;
(l)大于约8.0U/mg;
(m)大于约9.0U/mg;
(n)大于约10.0U/mg;
(o)大于约20.0U/mg;和
(p)大于约50.0U/mg。
25.权利要求1-24中任一项的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞产生异丁醇。
26.权利要求25的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径。
27.制备产物的方法,包括:
(a)提供权利要求1-24中任一项的重组宿主细胞;
(b)在产生所述产物的条件下,使(a)的重组宿主细胞与发酵培养基中的可发酵碳底物接触;
其中所述产物选自支链氨基酸、泛酸、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、异丁醇、以及它们的组合。
28.制备异丁醇的方法,包括:
(a)提供权利要求1-24中任一项的重组宿主细胞;
(b)在产生异丁醇的条件下,使(a)的重组宿主细胞与发酵培养基中的可发酵碳底物接触。
29.用于将2,3-二羟基异戊酸转化成α-酮异戊酸的方法,包括:
(a)提供权利要求1-24中任一项的重组宿主;以及
(b)使(a)的重组宿主细胞在2,3-二羟基异戊酸被转化成α-酮异戊酸的条件下生长,
其中2,3-二羟基异戊酸被转化成α-酮异戊酸。
30.用于增加重组宿主细胞中的具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽的比活性的方法,包括:
(a)提供权利要求1-24中任一项的重组宿主细胞;以及
(b)使(a)的重组宿主细胞在具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽以有功能的形式表达的条件下生长,所述有功能的形式具有大于缺乏所述异源性多肽的相同宿主细胞的比活性。
31.用于增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量的方法,包括:
(a)提供权利要求3-24中任一项的重组宿主细胞;以及
(b)使(a)的重组宿主细胞在所述宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量增加的条件下生长。
32.增加重组宿主细胞中的需Fe-S簇蛋白质的活性的方法,包括:
(a)提供包含需Fe-S簇蛋白质的重组宿主细胞;
(b)改变所述宿主细胞中影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性;以及
(c)使(b)的重组宿主细胞在需Fe-S簇蛋白质的活性增加的条件下生长。
33.权利要求32的方法,其中所述活性的增加量选自:
(a)大于约10%;
(b)大于约20%;
(c)大于约30%;
(d)大于约40%;
(e)大于约50%;
(f)大于约60%;
(g)大于约70%;
(h)大于约80%;
(i)大于约90%;和
(j)大于约95%。
34.权利要求32的方法,其中所述活性的增加量选自:
(a)大于约5倍;
(b)大于约8倍;和
(c)大于约10倍。
35.增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量的多肽的鉴定方法,包括:
(a)改变影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性;
(b)测量异源性需Fe-S簇蛋白质的活性;以及
(c)比较在步骤(a)的多肽存在改变的表达或活性时测量的异源性需Fe-S簇蛋白质的活性与在步骤(a)的多肽不存在改变的表达或活性时测量的异源性需Fe-S簇蛋白质的活性,
其中所述异源性需Fe-S簇蛋白质活性的增加表明所述Fe-S簇生物合成途径中的通量的增加。
36.增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量的多肽的鉴定方法,包括:
(a)改变影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性;
(b)测量具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性;以及
(c)比较在步骤(a)的多肽的表达或活性存在改变时测量的具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性与在步骤(a)的多肽的表达或活性不存在改变时测量的具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性,
其中具有二羟酸脱水酶活性的多肽活性的增加表明所述Fe-S簇生物合成途径中的通量的增加。
37.权利要求30-36中任一项的方法,其中影响Fe-S簇生物合成的多肽的所述表达或活性改变包括缺失、突变、取代、表达、上调、下调、改变细胞定位、改变蛋白质的状态、和/或加入辅因子。
38.权利要求32-37中任一项的方法,其中所述需Fe-S簇蛋白质具有二羟酸脱水酶活性,并且其中所述具有二羟酸脱水酶活性的需Fe-S簇蛋白质具有以<10-5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列,其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸,它们对应于变异链球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位点56、129和201,所述变异链球菌DHAD酶对应于SEQ ID NO:168。
39.权利要求32-38中任一项的方法,其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由选自AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、CCC1、以及它们的组合的基因编码。
40.重组宿主细胞,包含至少一种多核苷酸,所述多核苷酸编码由权利要求35-37中任一项的方法鉴定的多肽。
41.权利要求40的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞还包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。
42.权利要求41的重组宿主细胞,其中所述编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的异源性多核苷酸以多拷贝表达。
43.权利要求41的重组宿主细胞,其中所述异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒。
44.权利要求41的重组宿主细胞,其中所述异源性多核苷酸在重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。
45.权利要求35或36的方法,其中所述宿主细胞为酵母宿主细胞。
46.权利要求45的方法,其中所述酵母宿主细胞选自糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
47.权利要求28-39中任一项的方法,其中所述宿主细胞为酵母宿主细胞。
48.权利要求47的方法,其中所述酵母宿主细胞选自糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
49.权利要求40-44中任一项的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞为酵母宿主细胞。
50.权利要求49的重组宿主细胞,其中所述酵母宿主细胞选自糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
51.权利要求40-44或49-50中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽在宿主细胞的胞质溶胶中表达。
52.权利要求40-44或49-50中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽具有以<10-5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列,其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸,它们对应于变异链球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位点56、129和201,所述变异链球菌DHAD酶对应于SEQ ID NO:168。
53.权利要求40-44或49-50中任一项的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞产生选自支链氨基酸、泛酸、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、异丁醇、以及它们的组合的产物。
54.权利要求53的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞产生异丁醇。
55.权利要求54的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径。
56.权利要求1-22中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有选自下列的比活性:
(a)大于对照宿主细胞的约3倍,所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸;和
(b)大于对照宿主细胞的约6倍,所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。
57.权利要求32的方法,其中所述活性的增加量选自:
(a)大于约3倍;和
(b)大于约6倍。
58.权利要求1-22、40-44、或49-50中任一项的重组宿主细胞,其中所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽的单体具有选自下列的Fe-S簇加载:
(a)至少约10%;
(b)至少约15%;
(c)至少约20%;
(d)至少约25%;
(e)至少约30%;
(f)至少约35%;
(g)至少约40%;
(h)至少约45%;
(i)至少约50%;
(j)至少约60%;
(k)至少约70%;
(l)至少约80%;
(m)至少约90%;和
(n)至少约95%。
59.权利要求29的方法,其中相比于包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸的对照宿主细胞,所述2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的转化的增加量选自:
(a)至少约5%;
(b)至少约10%;
(c)至少约15%;
(d)至少约20%;
(e)至少约25%;
(f)至少约30%;
(g)至少约35%;
(h)至少约40%;
(i)至少约45%;
(j)至少约50%;
(k)至少约60%;
(l)至少约70%;
(m)至少约80%;
(n)至少约90%;和
(o)至少约95%。
60.权利要求1、2、或5-26中任一项的重组宿主细胞,其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由下列基因编码:ARN1、ARN2、ATX1、CCC2、COT1、ENB1、FET3、FET5、FIT1、FIT2、FIT3、FRE1、FRE2、FRE3、FRE4、FRE5、FRE6、FTH1、FTR1、HMX1、SIT1、SMF3、TIS11、VHT1、AFT1、AFT2、AIM1、ARH1、ATM1、BUD32、CAD1、CCC1、CFD1、CIA1、CMK1、CTH1、CTI6、CYC8、DAP1、DRE2、ERV1、ESA1、FET4、FRA1、FRA2、GEF1、GGC1、GRX1、GRX2、GRX4、GRX5、HDA1、IBA57、ISA1、ISA2、ISU1、ISU2、JAC1、MGE1、MRS3、MRS4、MSN5、NAR1、NFS1、NFU1、NHP6a、NHP6b、PSE1、SMF1、SNF1、SNF2、SNF3、SNF4、SSQ1、TIM12、TUP1、NP 011911.1、VPS41、YAP5、YFH1、YRA1、ZPR1、iscAnif、nifU、nifS、cysE1、cysE2、iscS、iscU、iscA、hscB、hscA、Fdx、sufS、sufE、cysE3、sufS2、iscA2、Nfu、nfuA、nfuV、nfu、sufA、sufB、sufC、sufD、sufE1、sufS2、或sufE2。
61.测量具有二羟酸脱水酶活性的多肽形式的浓度的方法,包括:
(a)使用第一层析程序从粗提物中分离含所述多肽的级份;
(b)使用第二层析程序从(a)中分离包含所述多肽的一种形式的级份;以及
(c)测量(b)中获得的所述多肽的所述形式的浓度。
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