JPWO2019159831A1 - 組換え宿主細胞及びd−ブタントリオールの新規製造方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、酵母(S.cerevisiae)を用いて、D−キシロースからD−BTを効率的に生産できる方法を開発することを目的とする。本発明は、(A)鉄硫黄タンパク質(Fe−Sタンパク質)をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチド、及び(B)上記鉄硫黄タンパク質の生合成を制御するタンパク質をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞である。また、(C)キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。

Description

本発明は、組換え宿主細胞及びD−ブタントリオールの新規製造方法に関する。
微生物のキシロース代謝経路としては、XR/XDH経路やXI経路がよく知られている。これらの経路を利用して、D−キシロースからエタノールやキシリトールの生産も行われている。近年、上記XR/XDH経路やXI経路とは全く異なるキシロース代謝経路であるDahms/Weimberg経路を利用して、D−キシロネート、D−1,2,4−ブタントリオール(D−BT)、1,4−ブタンジオール等の有用な物質の生産ができることが報告されている(非特許文献1から3参照)。
上記D−BTは様々な医薬品や化成品の原料として利用できるだけでなく、ニトロ化することで、エネルギー物質であるD−1,2,4,−ブタントリオールトリナイトレート(D−BTTN)となる(非特許文献3参照)。このD−BTTNはロケットの推進剤(プロペラント)や、ニトログリセリンの代替品として利用できる物質である。また、D−BTTNは、ニトログリセリンより衝撃に対して安定であり、かつ凝固点が低い、揮発性が低い、熱安定性が高い等のより優れた性能を有する(非特許文献3参照)。またD−BTTNは、抗がん剤や抗ウイルス剤等の医薬品の原料としても利用出来るものである。
上記D−BTは、マレイン酸エステルを、還元剤又は触媒を用いて還元することで工業的に生産されている(非特許文献4参照)。具体的には、ジメチルマレイン酸をNaBHにより化学量論的に還元して生産する方法がよく用いられている。しかし、この方法では1tのマレイン酸エステルを還元した場合、副生成物として2〜5tのホウ酸塩ができてしまい、大量生産には向いていない。また、銅クロマイト又はルビジウムを触媒に用いた還元法も知られているが、銅クロマイトを用いる方法では有害な六価クロムが放出され環境への負荷が懸念される。一方、ルビジウムを用いる方法では2,900〜5,000psiの高圧と135℃の高温が必要であり、さらに副生成物の生成も問題となる。また、ルビジウム自体が非常に高価であることもスケールアップする際に不都合となる(非特許文献3参照)。
そのような中、バイオテクノロジーを用いた効率的なD−BTの生産方法が模索されてきた。例えば、微生物を用いたD−BTの生産経路はNiu et al.(非特許文献3参照)により報告されており、近年大腸菌を宿主とした多数の生産報告がある(非特許文献5、6参照)。
一方、酵母(S.cerevisiae)は種々のストレスに耐性があり、遺伝子組換えも容易であることから、リグノセルロース系バイオマスを原料にした物質生産に適した微生物であると考えられている。しかし現在のところ、酵母(S.cerevisiae)による上記の生産経路を利用したD−BTの生産報告はない。また、このような酵母を利用した発酵生産において、鉄硫黄(Fe−S)タンパク質の機能発現が生産性向上の鍵を握っていることが分かってきているが(特許文献1、2参照)、酵母におけるD−BTの生産において、目下のところ成功には至っていない。
国際公開公報2011−103300号 国際公開公報2014−162063号
Toivari MH, Ruohonen L, Richard P, Penttila M, Wiebe MG: Saccharomyces cerevisiae engineered to produce D-xylonate. Appl Microbiol Biotechnol 2010, 88:751-760 Toivari M, Nygard Y, Kumpula E, Vehkomaki M-L, Bencina M, Valkonen M, Maaheimo H, Andberg M, Koivula A, Ruohonen L, Penttila M, Wiebe MG: Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for bioconversion of D-xylose to D-xylonate. Metab Eng 2012, 14:427-36 Niu W, Molefe MN, Frost JW: Microbial Synthesis of the Energetic Material Precursor 1,2,4-Butanetriol. Journal of the American Chemical Society 2003(Scheme 2):12998-12999 Monteith, M.J., Schoefield, D., Bailey M: Process for the preparation of butanetriols. 1998:WO1998008793 Cao Y, Niu W, Guo J, Xian M, Liu H: Biotechnological production of 1,2,4-butanetriol: An efficient process to synthesize energetic material precursor from renewable biomass. Sci Rep 2015, 5(November):18149 Valdehuesa KNG, Liu H, Ramos KRM, Park SJ, Nisola GM, Lee WK, Chung WJ: Direct bioconversion of d-xylose to 1,2,4-butanetriol in an engineered Escherichia coli. Process Biochem 2014, 49:25-32
このような状況の中、本発明者らは、酵母(S.cerevisiae)を用いて、D−キシロースからD−BTを効率的に生産できる方法を開発することを目的として研究を進めた。なお、以降は、特に表記がない限り、各物質については全てD体として頭のD−は省略する。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、Caulobacter crescentus由来のキシロースデヒドロゲナーゼ、キシロネートデヒドラターゼ、そしてPseudomonas putida由来の2−ケト酸デカルボキシラーゼ(KDC)をS.cerevisiaeに組み込むことで、キシロースからのBT生産が可能となることを確認した。また、BT生産性を高めるために、S.cerevisiaeでのBT生産に適したKDCのスクリーニングを行った。さらに、酵母において鉄取り込み量の調節に関与するタンパクの発現を制御することで、鉄硫黄タンパク質であるキシロネートデヒドラターゼ活性を向上させ、BT生産能の著しい改善に成功した。即ち、本発明の要旨は、以下に示すとおりである。
[1](A)鉄硫黄タンパク質(Fe−Sタンパク質)をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ(B)鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも1種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた、組換え宿主細胞。
[2](C)キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチドをさらに含む、[1]に記載の組換え宿主細胞。
[3]上記鉄硫黄タンパク質が、キシロネートデヒドラターゼ(XylD)である、[1]又は[2]に記載の組換え宿主細胞。
[4]上記鉄硫黄クラスターの生合成を制御するタンパク質が、TYW1である、[1]から[3]のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
[5]上記キシロース代謝経路に関与するその他の酵素が、キシロースデヒドロゲナーゼ(XylB)、及び2−ケト酸デカルボキシラーゼ(KDC)から成る群より選択される少なくとも1種である、[2]から[4]のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
[6]上記宿主細胞が、酵母細胞である、[1]から[5]のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
[7]上記酵母細胞が、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ブレタノミセス属(Brettanomyces)、ピキア属(Pichia)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、カンジタ属(Candida)、クロッケラ属(Klocckera)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、イサトケンキア属(Issatchenkia)、スワニオミセス属(Schwanniomyces)、トリコスポロン(Trichosporon)属、ヤマダジマ属(Yamadazyma)、及びパチソレン属(Pachysolen)からなる群より選択される、少なくとも1種の酵母細胞である、[6]に記載の組換え宿主細胞。
[8][1]から[7]のいずれかに記載の組換え宿主細胞を用いる、D−ブタントリオールの製造方法。
[9]D−ブタントリオールを製造する方法であって、(a)鉄硫黄タンパク質をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも1種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた組換え宿主細胞を調製する工程、並びに(b)上記組換え宿主細胞を増殖させる工程を含むことを特徴とするD−ブタントリオールの製造方法。
本発明によると、酵母(S.cerevisiae)を用いて、D−キシロースからD−BTを効率的に生産することができる。
図1は、キシロースからブタントリオールが合成される経路を示した図である。 図2は、BD,BD−mdlC,BDδD株の(A)キシロース消費量,(B)キシロネート生産量,(C)BT生産量を示す図である。 図3は、3種類のKDC(MdlC,Aro10,KivD)導入株の(A)キシロース消費量,(B)キシロネート生産量,(C)BT生産量を示す図である。 図4は、kivD発現強化株の(A)キシロース消費量,(B)キシロネート生産量,(C)BT生産量を示す図である。 図5は、各組換え宿主細胞株の最大BT生産量を示す図である。 図6は、BDδD−2tkdcA−TYW1株及びBDδD−2tkdcA−tTYW1株の作製手順を示す図である。 図7は、各組換え宿主細胞株のXylD活性を示す図である。 図8は、BDδD−2tkdcA−TYW1株及びBDδD−2tkdcA−tTYW1株のBT生産量の経時変化を示す図である。
以下、本発明の組換え宿主細胞、及びD―ブタントリオールの製造方法について詳細に説明する。なお、本明細書において、DNAやベクターの調製等の分子生物学的手法は、特に明記しない限り、当業者に公知の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。また、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。
<組換え宿主細胞>
本発明の組換え宿主細胞は、(A)鉄硫黄タンパク質(Fe−Sタンパク質)をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチドを含み、(B)鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも1種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた細胞である。また、(C)キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。以下に本発明の組換え宿主細胞が含む、上記異種ポリヌクレオチド等について説明する。
(A)鉄硫黄タンパク質(Fe−Sタンパク質)をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチド
本発明の組換え宿主細胞は(A)鉄硫黄タンパク質(Fe−Sタンパク質)をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチドを含む。本発明の組換え宿主細胞は、効率的な物質生産のために用いられるものであり、この鉄硫黄タンパク質は、宿主細胞内での物質生産に必要な酵素として機能するものである。上記異種由来の鉄硫黄タンパク質を宿主細胞に導入することにより、元来この宿主細胞が備えていない代謝経路が働くようになり、所望の物質生産が可能となる。
本発明に用いる宿主細胞は、当業者にとって周知の宿主細胞のいずれでもよく、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、菌類細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞が含まれる。例示的細菌細胞には、エスケリキア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、又はバチルス(Bacillus)の任意の種が含まれ、上記には、例えば大腸菌(Escherichia coli)、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)等が含まれる。
本発明に用いる宿主細胞としては、種々のストレスに耐性があり、遺伝子組換えも容易であることから、酵母細胞が好ましい。酵母細胞としては、例えば、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ブレタノミセス属(Brettanomyces)、ピキア属(Pichia)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、カンジタ属(Candida)、クロッケラ属(Klocckera)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、イサトケンキア属(Issatchenkia)、スワニオミセス属(Schwanniomyces)、トリコスポロン(Trichosporon)属、ヤマダジマ属(Yamadazyma)、パチソレン属(Pachysolen)等が挙げられる。これらのうち、サッカロミセス属(Saccharomyces)であることがより好ましく、具体的には、例えばYPH499株、S288C株、YPH500株、BY4741株、BY4742株、W303株、CEN.PK株、BY4743株、FY4株、AB972株、A364A株、DC5株、X2180−1A株、D−273−10B株、FL100株、JK9−3d株、RM11−1a株、SEY6210株、SEY6211株、Sigma1278b株、SK1株、XJ24−24a株、Y55株、YPH501株等を用いることができる。中でも、YPH499株、S288C株、YPH500株、BY4741株、BY4742株、W303株、CEN.PK株がさらに好ましく、YPH499株が特に好ましい。
本発明において、「鉄硫黄タンパク質(Fe−Sタンパク質)」とは、酸化数が可変の二、三及び四鉄中心を含む鉄硫黄(Fe−S)クラスターの存在で特徴づけられるタンパク質をいう。鉄硫黄(Fe−S)クラスターには、2Fe−2Sクラスター、4Fe−4Sクラスター、3Fe−4Sクラスター等があり、鉄硫黄タンパク質(Fe−Sタンパク質)の種類により要求する鉄硫黄(Fe−S)クラスターは異なる。本発明における鉄硫黄タンパク質(Fe−Sタンパク質)は、細胞内でのキシロース代謝に関与する酵素のうちで鉄硫黄(Fe−S)クラスターを有するタンパク質であり、例えば、キシロネートデヒドラターゼ(XylD)等が挙げられる。
典型的なXylDタンパク質(ペプチド)及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、以下の表1〜2に示すものが挙げられる。なお、下記表1〜2には、典型的なXylDタンパク質(ペプチド)及びそれをコードするポリヌクレオチドとして、GenomeNetに登録されているものの登録名を示している。各登録名に対応する具体的な配列は、http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?K14275+K22186+K22396+4.2.1.82+R02429に開示されている。XylDタンパク質(ペプチド)をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号1のポリヌクレオチドが特に好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも90%、好ましくは95%以上の同一性を有するタンパク質(及びそれをコードするポリヌクレオチド)であり、かつXylD活性を有するタンパク質(及びそれをコードするポリヌクレオチド)は、本発明において使用可能であると理解される。
Figure 2019159831
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本発明において「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸及び複数の核酸の両方を意味し、mRNA等の核酸分子、プラスミドRNA、全長のcDNA及びその断片等を含む。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドから構成され、修飾、非修飾のどちらでもよい。一本鎖でも二本鎖でもよく、両者の混合でもよい。
本発明において「異種ポリヌクレオチド」とは、本発明の組換え宿主細胞とは異なる種由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチドをいう。例えば、本発明の組換え宿主細胞が酵母細胞である場合、異種ポリヌクレオチドとしては、大腸菌、緑膿菌等のバクテリア由来のポリヌクレオチド等が挙げられる。また、対応する天然遺伝子とは異なる形態で宿主細胞中に再導入された天然コード領域又はその一部も含む。例えば、ゲノム中のその天然位置にはないものも含まれる。なお、本発明の組換え宿主細胞において異種ポリヌクレオチドを導入する目的は、元来その宿主細胞が有していない酵素等のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを異種から導入し、キシロース代謝経路等の代謝経路を機能させ及び/又は亢進させることである。
(ポリヌクレオチドの導入方法)
細胞に異種ポリヌクレオチドを発現させるには、例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させればよい。発現ベクターは、本発明の遺伝子を発現可能な状態で含むものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。
本発明の発現ベクターは、上記異種ポリヌクレオチドの上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することにより作製することができる。あるいは、発現ベクターに転写プロモーターおよび/またはターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターおよび/またはターミネーターを利用して、その間に当該異種ポリヌクレオチドを挿入すればよい。
ベクターに上記異種ポリヌクレオチドを挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、SD配列やKozak配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入することもできる。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。
本発明において使用されるベクターは、本発明の遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられる。
宿主への発現ベクターの導入方法は、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではない。利用可能な方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。組換え宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの発現は、当業者に公知の方法に従って定量化することができる。例えば、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの、細胞タンパク質全体のパーセントによって表すことができる。また、形質転換した細胞の細胞抽出液を用い、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出できる抗体を使用したウエスタンブロッティング、あるいは当該ポリヌクレオチドを特異的に検出するプライマーを使用したリアルタイムPCRなどにより確認することができる。
(B)鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも1種のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明の組換え宿主細胞は、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも1種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた細胞である。「鉄硫黄クラスターの生合成を制御するタンパク質」としては、鉄硫黄クラスターの合成を制御するタンパク質、細胞内で鉄硫黄クラスターの運搬に関与しているタンパク質、鉄の感知・取り込み・利用を制御するタンパク質等のいずれであってもよく、最終的に鉄硫黄クラスターの生合成に影響を与えるタンパク質であれば特に限定されない。ここで、鉄の感知・取り込み・利用を制御するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、鉄の代謝に関与する遺伝子群である鉄(Fe)レギュロンに含まれる遺伝子であってもよい。
(B)ポリヌクレオチドとしては組換え宿主細胞でのBT産生を向上させる効果の観点から、細胞内での鉄硫黄(Fe−S)クラスターの貯蔵に関与するタンパク質であるTYW1をコードするポリヌクレオチドが好ましい。このTYW1をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において過剰発現させることにより、鉄の細胞内への取り込みが促進され、鉄硫黄クラスターが充分に供給されることにより鉄硫黄タンパク質(XylDなど)の活性を向上させることができると考えられる。典型的なTYW1タンパク質(ペプチド)及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、以下の表3〜5に示すもの及び本願実施例で用いたものが挙げられる。なお、下記表3〜5には、典型的なTYW1タンパク質(ペプチド)及びそれをコードするポリヌクレオチドとして、GenomeNetに登録されているものの登録名を示している。各登録名に対応する具体的な配列は、http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:4.1.3.44に開示されている。なお、(B)ポリヌクレオチドとしては、組換え宿主細胞でのBT産生を効率的に向上させる効果の観点から、配列番号2及び3のポリヌクレオチドが好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも90%、好ましくは95%以上の同一性を有するタンパク質(及びそれをコードするポリヌクレオチド)であり、かつTYW1活性を有するタンパク質(及びそれをコードするポリヌクレオチド)は、本発明において使用可能であると理解される。
Figure 2019159831
Figure 2019159831
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本発明において「過剰発現」という用語は、本明細書で使用される場合、同一又は関連のポリヌクレオチド若しくは遺伝子の内因性発現よりも高い発現を指す。また、異種ポリヌクレオチド又は遺伝子は、同等の内因性遺伝子の発現よりもその発現が高ければ、あるいは、ポリヌクレオチド又は遺伝子を過剰発現しない手段によって導入された同じポリヌクレオチド又は遺伝子の発現よりもその発現が高ければ、過剰発現に該当する。宿主細胞においてポリヌクレオチドのコピー数を増大させる任意の手段を使用してポリヌクレオチドを過剰発現させることができる。例えば、高コピー数プラスミド、又は制御可能なコピー数を有するプラスミドを使用してもよいし、多数の染色体組込みによって過剰発現としてもよい。
細胞にポリヌクレオチドを過剰発現させるには、例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させればよい。方法の詳細は、上述の「ポリヌクレオチドの導入方法」の項を参照されたい。なお、比較に用いる過剰発現させない細胞は、形質転換させなくてもよいし、当該ポリヌクレオチドを含まない発現ベクターで形質転換させてもよい。組換え宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの発現又は過剰発現は、当業者に公知の方法に従って定量化することができる。例えば、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの、細胞タンパク質全体のパーセントによって表すことができる。また、形質転換した細胞の細胞抽出液を用い、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出できる抗体を使用したウエスタンブロッティング、あるいは当該ポリヌクレオチドを特異的に検出するプライマーを使用したリアルタイムPCRなどにより確認することができる。過剰発現させなかった細胞と比較して、過剰発現させた細胞で当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの発現量が多いこと、好ましくは2倍以上になっていることを確認すること等により、過剰発現されたと判断することができる。
(C)キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチド
「キシロース代謝経路」とは、キシロースからエタノール、キシリトール、D−キシロネート、D−1,2,4−ブタントリオール(D−BT)、1,4−ブタンジオール等を生産する経路をいい、例えば、XR/XDH経路、XI経路、Dahms/Weimberg経路として知られている経路、これらの経路を工業的に利用できるように改変した経路等も含まれる。好ましくは、D−キシロースからD−ブタントリオールを生産するための酵素経路を指す。
「キシロース代謝経路に関与するその他の酵素」とは、キシロース代謝経路に関与する酵素のうちで鉄硫黄タンパク質(Fe−Sタンパク質)に分類されない酵素を指す。例えば、キシロースデヒドロゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、キシルロースリン酸化酵素、キシリトール脱水素酵素、キシロース還元酵素等が挙げられる。これらのうち、本発明においては、D−キシロースからのD−ブタントリオールの生産に関与するキシロースデヒドロゲナーゼ、デカルボキシラーゼが好ましい。典型的なキシロースデヒドロゲナーゼタンパク質(ペプチド)及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、以下の表6〜10に示すものが挙げられる。なお、下記表6〜8には、典型的なキシロースデヒドロゲナーゼタンパク質(ペプチド)及びそれをコードするポリヌクレオチドとして、GenomeNetに登録されているものの登録名を示している。各登録名に対応する具体的な配列は、http://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?ec:1.1.1.175、又はhttp://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?ec:1.1.1.179に開示されている。
なお、キシロースデヒドロゲナーゼタンパク質としては、組換え宿主細胞でのBT産生を効率的に向上させる効果の観点から、配列番号4のポリヌクレオチドがコードするものが特に好ましい(XylB)。また、デカルボキシラーゼタンパク質としては、分岐鎖2−ケト酸デカルボキシラーゼ(KdcA)、2−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ(KivD等)、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ(Aro10等)、mdlCが好ましく、分岐鎖2−ケト酸デカルボキシラーゼ(KdcA)、2−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ(KivD等)がより好ましく、組換え宿主細胞でのBT産生を効率的に向上させる効果の観点から配列番号5のポリヌクレオチドがコードする分岐鎖2−ケト酸デカルボキシラーゼ(KdcA)が特に好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも90%、好ましくは95%以上の同一性を有するタンパク質(及びそれをコードするポリヌクレオチド)であり、かつ2−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質(及びそれをコードするポリヌクレオチド)は、本発明において使用可能であると理解される。
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なお、細胞にキシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを発現させるには、例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させる等、当業者に公知の方法により行うことができる。方法の詳細は上述の「ポリヌクレオチドの導入」の項を参照されたい。
以上説明したとおり、本発明によると、キシロースデヒドロゲナーゼ、キシロネートデヒドラターゼ、そして2−ケト酸デカルボキシラーゼ(KDC)をS.cerevisiaeに組み込むことで、キシロースからのBT生産が可能となる。さらに、酵母において鉄取り込み量の調節に関与するタンパク(TYW1)の発現を制御することで、鉄硫黄タンパク質であるキシロネートデヒドラターゼ活性を向上させ、BT生産能を著しく改善することができる。
<本発明のD−ブタントリオールの製造方法>
本発明は、上述の本発明の組換え宿主細胞を用いたD−ブタントリオールの製造方法も提供する。本発明のD−ブタントリオールの製造方法は、(a)鉄硫黄タンパク質をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも1種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた組換え宿主細胞を調製する工程、並びに(b)上記組換え宿主細胞を増殖させる工程を含むことを特徴とする。なお、鉄硫黄タンパク質をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも1種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた組換え宿主細胞を調製する方法については、各文言の意味も合わせて、上述の組換え宿主細胞の項の記載を参照されたい。
D−ブタントリオールは、上記(b)工程によって得られた組換え宿主細胞の培養液を回収し、常法に従い、製造系から回収し、適宜濃縮、精製することができる。例えば、D−ブタントリオールを含む培養液より細胞(菌体)を分離除去した後、蒸留等によりD−ブタントリオールを分別する。
また、本発明のD−ブタントリオールの製造方法は、上述の本発明の組換え宿主細胞を用いる方法ということもできる。即ち、上述の本発明の組換え宿主細胞の培養液を回収し、常法に従い、製造系から回収し、適宜濃縮、精製することができる。例えば、D−ブタントリオールを含む培養液より細胞(菌体)を分離除去した後、蒸留等によりD−ブタントリオールを分別する。
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
1.1,2,4−ブタントリオール(BT)生産酵母の作製
はじめに、酵母(S.cerevisiae)でBTを生産できることを確かめるための実験を行った。図1に示すように、BTは5段階の反応でキシロースから生産することができる。まず、キシロースはキシロースデヒドロゲナーゼによりキシロノラクトンに変換される。キシロノラクトンはキシロノラクトナーゼ又は自然に開環してキシロネートに変換される。キシロネートはキシロネートデヒドラターゼにより、2−ケト−3−デオキシ−キシロネート(KDX)に変換される。そして、KDXは2−ケト酸デカルボキシラーゼによって3,4−ジヒドロキシブタナールに変換される。最後に3,4−ジヒドロキシブタナールはアルコールデヒドロゲナーゼによってBTに変換される。これら5段階の反応の内、キシロノラクトンは自然に開環してキシロネートに変換されるため、キシロノラクトナーゼは必ずしも必要ではない。また酵母は複数のアルコールデヒドロゲナーゼを持っており、いずれかのアルコールデヒドロゲナーゼにより5段階目の反応も触媒できると考えられる。そこでまず、キシロースデヒドロゲナーゼ、キシロネートデヒドラターゼ、2−ケト酸デカルボキシラーゼ(KDC)をコードする3種類の遺伝子を導入した株を作成した。
酵母(S.cerevisiae)YPH499株において、キシロースからのキシリトール生成を防ぐために、内生のキシロースレダクターゼ活性をもつGRE3を欠損させたYPH499ΔGRE3株を作成した。この株にBT生産のためにまずは、Caulobacter crecentus由来のキシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子(xylB)とキシロネートデヒドラターゼ遺伝子(xylD)を導入して、BD株を作成した。続いて、この株に、E.coliにおけるBT生産においてよく用いられているPseudomonas ptida由来のKDC遺伝子(mdlC)を導入することでBD−mdlC株を作成した。(Niu W, Molefe MN, Frost JW: Microbial Synthesis of the Energetic Material Precursor 1,2,4-Butanetriol. Journal of the American Chemical Society 2003(Scheme 2):12998-12999.;Cao Y, Niu W, Guo J, Xian M, Liu H: Biotechnological production of 1,2,4-butanetriol: An efficient process to synthesize energetic material precursor from renewable biomass. Sci Rep 2015, 5(November):18149.;Valdehuesa KNG, Liu H, Ramos KRM, Park SJ, Nisola GM, Lee WK, Chung WJ: Direct bioconversion of d-xylose to 1,2,4-butanetriol in an engineered Escherichia coli. Process Biochem 2014, 49:25-32.;Zhang N, Wang J, Zhang Y, Gao H: Metabolic pathway optimization for biosynthesis of 1,2,4-butanetriol from xylose by engineered Escherichia coli. Enzyme Microb Technol 2016, 93-94:51-58.)BT生産能を評価するために、BD株及びBD−mdlC株を用いて10g/Lのグルコースと10g/Lのキシロースを含む培地での発酵試験を行い、代謝物及び各酵素活性を測定した。具体的な実験方法を以下に説明する。
BT生産の宿主には、酵母株、S.cerevisiae YPH499[MATa ura3−52 lys2−801 ade2−101 trp1− 63 his3−Δ200 leu2−Δ1 (Stratagene,La Jolla,CA,USA)]を用いた。酵母の培養には、SD培地[6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids(Difco Laboratories,Detroit,MI,USA),20g/L glucose]に株の栄養要求性に合わせてアミノ酸・核酸を加えたもの、又はYPD培地[10g/L yeast extract,20g/L Bacto−peptone(Difco Laboratories),20g/L glucose]を用いた。培養は30°Cで行った。
本研究で作成したプラスミドは全て、In−Fusion(登録商標)HD Cloning Kit(Takara)を用いて作成した。簡単には、制限酵素処理したベクターの末端15塩基の相同配列を、クローニングする塩基配列の両端にPCRで付加して、ベクターとクローニング配列、In−Fusion酵素を混合し50℃で15minインキュベートすることで作成した。この研究で使用した遺伝子のうち、C.crecentus由来のxylB及びxylD、P.Putida由来のmdlC、L.lactis由来KivdはS.cerevisiaeのコドンに最適化したものをGenScript(Piscataway, NJ, US)にて人工合成した。本研究で作成したプラスミドを下記表9に示す。
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酵母の形質転換はChen et al.(Chen DC, Yang BC, Kuo TT: One-step transformation of yeast in stationary phase. Curr Genet 1992, 21:83-84.)によって報告されている、酢酸リチウムを用いたOne−step transformation法に従い行った。また全ての遺伝子は酵母のゲノム上に相同組替えにより導入した。S.cerevisiae YPH499株においてGRE3をG418(薬剤)耐性遺伝子で置換することで、GRE3破壊株YPH499ΔGRE3株を作成した。GRE3破壊用のDNA断片の作成は、Yeast Deletion Mat−A Complete Set(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)より取得したBY4741ΔGRE3のゲノムDNAをテンプレートに、プライマーdGRE3 F(5′−ACTGGATTAAAAGGGAGCCCAAGG−3′:配列番号6):及びdGRE3 R(5′−CCGTGGAGTCTTCGTCAAGTAGTTG−3′:配列番号7)を用いて、PCRにより作成した。
BT生産の試作株作成の為に、YPH499ΔGRE3株にEcoRVで切断したプラスミドpTS−A−xylBDを導入して、BD株を作成した。続いてBD株に、プラスミドPIL−mdlCをテンプレートにプライマーPIL trans F(5′−ATCATCTCCGATGAAGCCTCCG−3′:配列番号8)及びPIL trans R(5′−ATCACCAAACATGTTGCTGGTG−3′:配列番号9)を用いて、PCRにより作成した、LEU2マーカー及びmdlCを含む断片を形質転換して、BD−mdlC株を作成した。
(発酵試験)
発酵試験に用いる菌体は、まず5mLのSD培地で24h培養した(6.7g/L of yeast nitrogen base without amino acids(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) and 20 g/L of glucose)。そして、50mLのYPD培地にOD600=0.1となるように植菌して30℃、150rpmで24h培養した。菌体を10mLの滅菌したD.W.で2度洗浄した後、発酵用培地(10g/L tryptone,5g/L yeast extract,10g/L グルコース,10g/L キシロース)にOD600=5となるように植菌して、全量20mLの系で、30℃、200rpmで発酵試験を行った。24h毎にサンプリングを行い、培養上清はHPLC及びGC−MSを用いて測定した。
(代謝物測定試験)
発酵培地中のグルコース及びキシロース濃度は、SPR−Pbカラム(7.8mm×250mm,particle size 8μm;Shimadzu,Kyoto,Japan)とRID−10A検出器を装着した、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)(Shimadzu)を用いて分析した。HPLCは80℃で0.6mL/minの流速で稼働した。
BT及びキシロネートの濃度は、ガスクロマトグラフィー/質量分析計(GC−MS)(Shimadzu)により分析した。5μLの培養上清に、2μLの10g/Lリビトールを内部標準物質として加えて、CentriVap Benchtop Vacuum Concentrators(Labconco,Kansas City,MO,USA)を用いて乾燥させた。GC−MS分析のためのトリメチルシリル化は以下の手順で行った;乾燥させたサンプルに、ピリジンに溶解させた100μLの20mg/mL O−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩溶液を加え90分間反応させた(1200rpm,30℃;M−BR−022UP;Taitec,Saitama,Japan)。そして、50μLのN−メチル−N−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド(MSTFA)を加えて、30分間反応させた(1200rpm at 37℃;M−BR−022UP;Taitec)。サンプルは室温で遠心分離(3000g,5分)して上清を分析に用いた。
GC−MS(GCMS−QP2010 Ultra;Shimadzu)には、CP−Sil 8CBカラム(30m length×0.25mm i.d.,film thickness of0.25μm;Agilent)を装着して用いた。GC−MSの各パラメーターの設定は以下の通りである;試料気化室の温度は230°Cに設定した。サンプル注入量は1μLでスプリット比は1:25に設定した。ヘリウムをキャリアーガスに用いて、流量は1.12mL/minに設定した。カラム温度は、80℃で2分間保温したのちに、15℃/minで330℃まで昇温して、330℃で6分間保温した。インターフェース温度及びイオン源の温度はそれぞれ、250℃と200℃に設定した。イオン化(Electron impact ionization;EI)は70eVで行った。分析はFast Automated Scan/SIM(FASTT)モードにより、Scanモード(85−500m/z)及びSelected ion monitoring(SIM)モード(m/z 103,and 129 for BT,and m/z 103 for ribitol)を並行して行った。
(酵素活性測定試験)
キシロネートデヒドラターゼ(XylD)活性測定は、チオバルビツール酸法により行った(Kim S, Lee SB: Identification and characterization of Sulfolobus solfataricus D-gluconate dehydratase: a key enzyme in the non-phosphorylated Entner-Doudoroff pathway. Biochem J 2005, 387:271-280.)。酵素反応溶液(400μL;50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.1),5mM,MgCl,12mM D−xylonate,50μL細胞抽出液)は30℃で10分間反応させた。酵素反応は100μLの2.0M HClを加えることで終結させた。反応溶液(50μL)に125μLの25mM過ヨウ素酸溶液(0.125M HSOに溶解)を加え20℃で20分間反応させたのち、250μLの2%(w/v)亜ヒ酸ナトリウム溶液(0.5M HClに溶解)を加え反応を終結した。最後に1mLのチオバルビツール酸水溶液を加えて、100℃で10分間反応させることで、赤色の発色団を生成させた。発色強度を増強させるために、室温まで冷却したのち等量のDMSOを反応溶液に加えた。吸光度は549nmで測定して、発色団のモル吸光係数には6.78×10−1cm−1を用いた(SKOZA L, MOHOS S: Stable Thiobarbituric Acid Chromophore with Dimethyl Sulphoxide. J Biol Chem 1976, 159:457-462.)。
(結果)
上記試験の結果、BD株及びBD−mdlC株において、グルコースは培養24hで全て消費されていた。一方、両株においてキシロースは培養24hまでに約7g/Lが消費され、最終的に培養96hで約9g/Lが消費されていた(図2の(A))。培養96hにおけるBTの生産量は、BD株およびBD−mdlC株で19.3±5.4mg/Lと31.6±1.9mg/Lであった(図2の(C))。よって、S.cerevisiaeでもxylB、xylD、mdlCの3種類の遺伝子を導入する事でBTが生産できる事が確認できた。また、mdlCを導入していないBD株でもBTの生産が確認できたことから、内生のKDCによってもKDXからDHBへの変換が行なわれていることが示唆された。なお、BD及びBD−mdlCの2株においてBT生産量は非常に少なかった。原因の1つとして、中間生成物のキシロネートの培地中への蓄積が考えられ、培養96hにおいて、BD株及びBD−mdlCにおいて、キシロネートはそれぞれ7.2±0.4g/Lと7.6±0.4g/L培地中に蓄積していた(図2の(B))。
2.δインテグレーション法によるxylDの過剰発現
上記のBD−mdlCの発酵試験より、中間生成物のキシロネートが培地中に多量に蓄積していることが確認された。原因としては、キシロネートからKDXへの反応を触媒するXylDの活性が低いことが考えられた。そこで、δインテグレーション法によりxylDを染色体上に多コピー導入することで発現を強化して、XylD活性の向上を試みた。なお、δインテグレーションとは、酵母染色体上のレトロトランスホポゾン(Ty因子)末端の繰り返し配列であるδ配列をターゲットに、目的遺伝子を相同組換えで導入する方法である。δ配列は染色体上に複数あるため、δインテグレーションにより目的遺伝子を多コピー導入できる(Parekh RN, Shaw MR, Wittrup KD: An integrating vector for tunable, high copy, stable integration into the dispersed Ty delta sites of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Prog 1996, 12:16-21.)。
BD株の染色体上に、δインテグレーション法によりxylDを多コピー導入することで、xylD発現強化株BDδDを作成した。具体的には、xylDの多コピー導入株作成の為に、BD株にAscIで切断したプラスミドpδW−xylDを導入して、BDδD株を作成した。
(結果)
BDδD株においてXylD活性が向上していることを確かめるために、上記方法に従ってXylDの活性測定を行った。その結果、BD株及びBDδD株のXylD活性はそれぞれ、0.221±0.012及び0.269±0.014(U/mg total protein)で、xylDの発現強化により約1.2倍のXylD活性の向上が見られた。続いて、XylDの発現強化がBT生産能に与える影響を調べるためにBDδD株を用いて、グルコース及びキシロースの混合培地で発酵試験を行った。BDδD株はBD株およびBD−mdlC株と比べて、培養48hまでを見るとXylonateの生産速度はわずかに減少していたが、最終的なXylonateの蓄積量に有意な減少は見られなかった(7.5±0.2g/L)(図2の(B))。一方、培養96hにおけるBDδD株のBT生産量は41.2±4.4mg/Lで、KDC遺伝子を導入していないにも関わらずBD−mdlCより生産量が増加していた(図2の(C))。
Xylonateの蓄積量がほとんど変化しなかった理由としては、酵母細胞内でのXylD活性が非常に低いことから、過剰発現により酵素を増産してもキシロネートの蓄積を解消するのに十分な活性を得られなかったことが考えられる。また、XylDによって、キシロネートはKDX(2−Keto−3−deoxy−D−xylonic acid)へと変換されるが、このKDX以降の代謝が弱いことが、キシロネートの代謝を停滞させている可能性がある。
3.2−ケト酸デカルボキシラーゼ(KDC)の検討(スクリーニング)
KDX(2−Keto−3−deoxy−D−xylonic acid)を特異的にDHB(D−3,4−Dihydroxybutanal)に変換する酵素は知られておらず、この反応が大腸菌でのBT生産のボトルネックになっていると考えられている。しかしながら、これまで導入するKDC(2−ケト酸デカルボキシラーゼ;2−ketoacid decarboxylase)の違いがBT生産に与える影響を調べた研究はない。そこで、S.cerevisiaeにおいてKDXからDHBへの反応を高効率で行うKDCのスクリーニングを行った。BD株やBDδD株でもBTが生産されていたことから、KDXに特異性のある酵母内生のKDCが存在していることが考えられる。S.cerevisiae内生のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ(Aro10)は広い基質特異性を持っていることから、KDXからDHBへの反応を触媒している可能性があると考えた。また、過去の報告からLactococcus lactis由来の2−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ(KivD)も、mdlCに加えてKDXからDHBへの反応を触媒することがわかっている(Tai Y, Xiong M, Jambunathan P, Wang JJ, Wang JJ, Stapleton C, Zhang K: Engineering nonphosphorylative metabolism to generate lignocellulose-derived products. Nat Chem Biol 2016, 12:247-253.)。そこでP.ptida由来のmdlCに加えて、ARO10及びkivDをBDδD株に導入する候補として選択した。具体的には、BDδD株に上記と同様の方法でmdlCを導入して、BDδD−mdlC株を作成した。また、BDδD株にEcoRVで切断したpIL−ARO10又はpIL−kivDを形質転換することで、BDδD−ARO10株及びBDδD−kivD株を作成した。
mdlC、ARO10、kivDの3種類のKDCをそれぞれ導入した株、BDδD−mdlC、BDδD−ARO10、BDδD−kivDを用いて、10g/Lのグルコースと10g/Lのキシロースを含む培地での発酵試験を行い、KDCの違いがBT生産に与える影響を調べた。3株においてキシロースの消費速度や消費量はほとんど変化が見られなかった。しかし、培養96hにおけるXylonateの蓄積量はBDδD−mdlC、BDδD−ARO10、BDδD−pkivdでそれぞれ7.9±0.0,5.8±0.3,6.4±0.2g/Lで、ARO10及びkivDを導入した株ではBDδD(7.5±0.2g/L)に比べて蓄積量の減少がみられた(図3の(B))。またBT生産量の最大値は、BDδD−mdlCでは69.5±6.5mg/Lであったが、BDδD−ARO10では105.7±7.8mg/L、BDδD−kivDでは384.3±26.3mg/Lとなった(図3の(C))。よってmdlC、ARO10、kivDの中ではkivDが最もS.cerevisiaeにおけるBT生産に適しており、mdlC導入株に比べてkivD導入株では約4.5倍のBT生産量の向上を示した。
4.kivDの発現強化
上記のとおり、3種類のKDC(mdlC、ARO10、kivD)導入株の発酵結果より、KDCの種類がBT生産に大きく影響することが明らかとなった。上記の実験では、3種のKDCは全てS.cerevisiae由来のPGK1プロモーターを用いて発現させていた。そこで、キシロース存在下でPGK1より強い発現強度を示すTDH3プロモーターの制御下でkivD(2−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ)を発現することで、更なるBT生産量の向上を試みた(Lu C, Jeffries T: Shuffling of Promoters for Multiple Genes To Optimize Xylose Fermentation in an Engineered Saccharomyces cerevisiae Strain. Appl Environ Microbiol 2007, 73:6072-6077.)。BDδDに、TDH3プロモーターで制御されるkivDを導入することでBDδD−tkivDを作成した。更にBDδD−tkivDに、TDH3プロモーターで制御されるkivDをもう1コピー導入することで、合計で2コピーのkivDを持つBDδD−2tkivDを作成した。具体的には、kivD発現強化株作成のためにBDδD株に、EcoRVで切断したpIL−pTDH3−kivDを形質転換することで、BDδD−tkivD株を作成した。さらに、BDδD−kivD株にpIU−pTDH3−kivDを形質転換することで、BDδD−2tkivD株を作成した。
BDδD−tkivD及びBDδD−2tkivDについて、10g/Lのグルコースと10g/Lのキシロースを含む培地を用いて発酵試験を行った。kivD発現強化株(BDδD−tkivDとBDδD−2tkivD)では、PGK1プロモーターでkivDを発現させたBDδD−kivDと比べて、キシロースの消費量やXylonateの生産量にはほとんど違いが見られなかった(図4の(A),(B))。一方、BDδD−tkivD及びBDδD−2tkivDの発酵96hにおけるBT生産量は、577.3±3.6mg/L及び767.9±45.9mg/Lで(図4の(C))、それぞれBDδD−kivDと比べて約1.6倍及び2.1倍のBT生産量を示した。BDδD−tkivD及びBDδD−2tkivDのBT収率はそれぞれ、9.7%及び12.9%であった。
5.kdcAの発現
本実験ではkivDに加えて、L.lactis由来の別の2−ケト酸デカルボキシラーゼをコードするkdcAを発現することで更なるBT生産量の向上を試みた。BDδDに、TDH3プロモーターで制御されるkdcAを導入することでBDδD−tkdcAを作成した。更にBDδD−tkdcAに、TDH3プロモーターで制御されるkdcAをもう1コピー導入することで、合計で2コピーのkdcAを持つBDδD−2tkdcAを作成した。具体的には、kdcA発現株作成のためにBDδD株に、EcoRVで切断したpIL−pTDH3−kdcAを形質転換することで、BDδD−tkdcA株を作成した。さらに、BDδD−tkdcA株にpIU−pTDH3−kdcAを形質転換することで、BDδD−2tkdcA株を作成した。BDδD−tkdcA及びBDδD−2tkdcAについて、10g/Lのグルコースと10g/Lのキシロースを含む培地を用いて発酵試験を行ったところ、kdcA発現株(BDδD−tkdcAとBDδD−2tkdcA)の発酵96hにおけるBT生産量は、722.0±14.9mg/L及び1151.4±58.5mg/Lであった。結果を図5に示した。
6.TYW1過剰発現によるXylD活性の強化
上記のとおり、kivDに加えて、L.lactis由来の別の2−ケト酸デカルボキシラーゼをコードするkdcAを発現することで、BT生産量に増加が見られた。次に、高収率でのBT産生のためにはXylD活性の更なる向上や、酵母細胞内で高活性なキシロネートデヒドラターゼの探索が必要と考えられた。そこで、ER表層において余剰の鉄硫黄クラスターを隔離しておく役割を果たしているTYW1というタンパクに着目し、このタンパクの発現を制御することで、XylD活性やBT生産量に変化がないかを検討した。具体的な実験方法を以下に説明する。
本実験において作成した酵母細胞株の作製手順を図6に示した。なお、DNAオリゴプライマーは全てThermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)で購入した。また、全てのPCR法には、KOD−Plus−NEO−DNAポリメラーゼ(TOYOBO)を用いた。
(プラスミドの構築)
全てのプラスミドは、In−fusion HD cloning Kit(Takara Bio USA,Mountain View,CA,USA)を用いて作成した。C.crecentus xylBとxylDはGenScript(Piscataway,NJ,USA)で合成を行い購入した。L.lactis KdcAはThermo Fisher Scientific(Waltham,MA,USA)で合成を行い購入した。
pTS−A−xylBDの構築
xylBにTDH3プロモーターとTDH3ターミネーターをつなぐために、コドン最適化したxylB(GenScript)をテンプレートにプライマーxylB F(配列番号10)とxylB R(配列番号11)を用いてPCRにより得られた断片を、NotI−HF(New England Biolabs)で切断したpATP405(Ishii et al., 2014)に接続した。できたプラスミドをテンプレートにプライマーpTDH3−xylB F(配列番号12)とpTDH3−xylB R(配列番号13)を用いてPCRにより、pTDH3−xylB−tTDH3断片を作成した。
xylDにSED1 プロモーターとSAG1 ターミネーターをつなぐために、プラスミドpIBG−SS(Inokuma et al., 2014)をテンプレートにプライマーSED1p−SAG1t F(配列番号14), SED1p−SAG1t R(配列番号15)を用いてPCRにより得られた断片と、コドン最適化したxylD(GenScript)をテンプレートにプライマーxylD F(配列番号16) とxylD R(配列番号17)を用いてPCRにより得られた断片をIn−fusionで結合した。できたプラスミドをテンプレートにプライマーpSED1−xylD F(配列番号18)とpSED1−xylD R(配列番号19)を用いてPCRにより、pSED1−xylD−tSAG1断片を作成した。pSED1−xylD−tSAG1断片とpTDH3−xylB−tTDH3断片を、NotI−HF(New England Biolabs)とXhoI(New England Biolabs)で切断したpGK402 (Ishii et al., 2009)にクローニングすることで、pTS−A−xylBDを構築した。
pδW−xylDの構築
xylDに、ADH1プロモーターとターミネーターを接続するために、PmeIで切断したpATP405 (Ishii et al., 2014)に、コドン最適化したxylD(GenScript)をテンプレートにプライマーxylD 2F(配列番号20)とxylD 2R(配列番号21)を用いてPCRにより得られた断片をIn−fusionによりクローニングした。できたプラスミドをテンプレートにプライマーpADH1−xylD F(配列番号22)とpADH1−xylD R(配列番号23)を用いてPCRを行い、ADH1p−xylD−ADH1t断片を得た。この断片をSmaIで切断したδインテグレーション用ベクターpδW(Yamada et al.2009)にクローニングして、xylDのδインテグレーション用プラスミドpδW xylDを作成した。
pIL−kdcA及びpIU−kdcAの構築
S. cerevisiaeのゲノムDNAをテンプレートに、2セットのプライマーtdh3p F(配列番号24)とtdh3p R(配列番号25)またadh1t F(配列番号26)とadh1t R(配列番号27)を用いてPCRを行い、TDH3 プロモーターとADH1ターミネーターを増幅した。これら2つのPCR断片をテンプレートに、プライマーtdh3p F(配列番号24)とadh1t R(配列番号27)を用いてPCRを行いTDH3p−ADH1t断片を作成した。TDH3p−ADH1t断片を、NotI−HF(New England Biolabs)とXhoI(New England Biolabs)で切断したpGK405(Ishii et al., 2009) およびpGK406(Ishii et al., 2009)にクローニングすることで、pIL tdh3p−adh1t とpIU tdh3p−adh1tを作成した。kdcAに、TDH3プロモーターとADH1ターミネーターを接続するために、SmaIで切断したpIL tdh3p−adh1t とpIU tdh3p−adh1tに、コドン最適化したkdcA(Thermo Fisher Scientific)をテンプレートにプライマーtdh3 kdcA F(配列番号28)とtdh3 kdcA R(配列番号29)を用いてPCRにより得られた断片をIn−fusionによりクローニングすることで、pIL−kdcAおよびpIU−kdcAを作成した。
pIAur−TYW1とpIAur−tTYW1の構築
pGK405(Ishii et al., 2009)をテンプレートに、プライマーAUR−PGK F(配列番号30)とAUR−PGK R(配列番号31)を用いてPCRを行い、PGK1プロモーターとPGK1 ターミネーターを増幅した。この断片を、SphI−HF(New England Biolabs)とSacI−HF(New England Biolabs)で切断したpAUR101(タカラバイオから購入)にクローニングすることで、pGK−Aurを作成した。TYW1及びtTYW1にPGK1プロモーターとPGK1ターミネーターを接続するために、SmaIで切断したpGK−Aurに、S. cerevisiaeのゲノムDNAをテンプレートにプライマーTYW1 F(配列番号32)とTYW1 R(配列番号33)及びTYW1 F(配列番号32)とtTYW1 R(配列番号34)を用いてPCRにより得られたTYW1およびtTYW1断片をIn−fusionによりクローニングすることで、pIAur−TYW1およびpIAur−tTYW1を作成した。
(形質転換)
酵母の形質転換はChen et al.(1992)によって報告されている、酢酸リチウムを法に従い行った。
YPH499ΔGRE3株の作成
まずS. cerevisiae YPH499株においてGRE3をG418(薬剤)耐性遺伝子で置換することで、GRE3破壊株YPH499ΔGRE3株を作成した。GRE3破壊用のDNA断片の作成は、Yeast Deletion Mat−A Complete Set (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)より取得したBY4741ΔGRE3株のゲノムDNAをテンプレートに、プライマーdGRE3 F (5′− ACTGGATTAAAAGGGAGCCCAAGG−3′;配列番号6)及びdGRE3 R (5′− CCGTGGAGTCTTCGTCAAGTAGTTG−3′;配列番号7)を用いてPCRにより作成した。テンプレートに用いたBY4741ΔGRE3のゲノムDNAは、Dr. GenTLE (yeast) high−recovery kit (Takara, Shiga, Japan)を用いて抽出した。
BD株の作成
プラスミドpTS−A−xylBDをEcoRV−HF(New England Biolabs)で切断して、YPH499ΔGRE3株に形質転換することでBD株を作成した。
BDδD株の作成
プラスミドpδW−xylDをAscI(New England Biolabs)で切断して、BD株に形質転換することでBDδD株を作成した。
BDδD−tkdcA株の作成
プラスミドpIL−kdcAをEcoRV−HF(New England Biolabs)で切断して、BDδD株に形質転換することでBDδD−tkdcA株を作成した。
BDδD−2tkdcA株の作成
プラスミドpIU−kdcAをEcoRV−HF(New England Biolabs)で切断して、BDδD株に形質転換することでBDδD−2tkdcA株を作成した。
BDδD−2tkdcA−TYW1株の作成
プラスミドpIAur−TYW1をBsiWI(New England Biolabs)で切断して、BDδD−2tkdcA株に形質転換することでBDδD−2tkdcA−TYW1株を作成した。
BDδD−2tkdcA−tTYW1株の作成
プラスミドpIAur−tTYW1をBsiWI(New England Biolabs)で切断して、BDδD−2tkdcA株に形質転換することでBDδD−2tkdcA−tTYW1株を作成した。
発酵試験、培養液の分析(BTの定量)、XylDの活性測定は、上述の方法により行った。各株のXylD活性を図7に示す。また、BTの生産量の経時変化を図8に示す。作成した株においてはTYW1を過剰発現することで、XylD活性が高くなった(0.26U/mg total protein→0.40U/mg total protein)。また、BT最大生産量も顕著に増加した(1.15g/L→1.75g/L)。
本発明によると、酵母(S.cerevisiae)を用いて、D−キシロースからD−BTを効率的に生産することができる。

Claims (9)

  1. (A)鉄硫黄タンパク質(Fe−Sタンパク質)をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ
    (B)鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも1種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた、組換え宿主細胞。
  2. (C)キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1に記載の組換え宿主細胞。
  3. 上記鉄硫黄タンパク質が、キシロネートデヒドラターゼ(XylD)である、請求項1又は2に記載の組換え宿主細胞。
  4. 上記鉄硫黄クラスターの生合成を制御するタンパク質が、Tyw1である、請求項1から3のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞。
  5. 上記キシロース代謝経路に関与するその他の酵素が、キシロースデヒドロゲナーゼ(XylB)、2−ケト酸デカルボキシラーゼ(KDC)から成る群より選択される少なくとも1種である、請求項1から4のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞。
  6. 上記宿主細胞が、酵母宿主細胞である、請求項1から5のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞。
  7. 上記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ブレタノミセス属(Brettanomyces)、ピキア属(Pichia)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、カンジタ属(Candida)、クロッケラ属(Klocckera)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、イサトケンキア属(Issatchenkia)、スワニオミセス属(Schwanniomyces)、トリコスポロン(Trichosporon)属、ヤマダジマ属(Yamadazyma)、及びパチソレン属(Pachysolen)からなる群より選択される、少なくとも1種の酵母細胞である、請求項6に記載の組換え宿主細胞。
  8. 請求項1から7のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞を用いる、D−ブタントリオールの製造方法。
  9. D−ブタントリオールの製造方法であって、
    (a)鉄硫黄タンパク質をコードする少なくとも1種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも1種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた組換え宿主細胞を調製する工程、並びに
    (b)上記組換え宿主細胞を増殖させる工程
    を含むことを特徴とするD−ブタントリオールの製造方法。
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