WO2021193666A1 - 改良型鉄代謝工学による新規キシロース代謝系を介した有用物質の製造方法 - Google Patents

改良型鉄代謝工学による新規キシロース代謝系を介した有用物質の製造方法 Download PDF

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WO2021193666A1
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xylose
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誠久 蓮沼
近藤　昭彦
涼太 秀瀬
崇弘 番場
貴弘 湯川
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国立大学法人神戸大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a xylose metabolite.
  • Woody biomass contains a large amount of glucose and xylose, which are raw materials for fermentation of microorganisms, and there are many candidates for useful substances that are expected to be produced from such woody biomass using microorganisms.
  • BT 1,2,4-Butanetiol
  • 3-hydroxybutyrolactone (3-HBL) 3-hydroxybutyrolactone
  • Ethyleneglycol Glycolate
  • ⁇ -ketoglutarate AKG
  • 1,2,4-Butanetriol can be used as a raw material for various pharmaceuticals and chemical products (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
  • BTTN 1,2,4-butantrioltrinitrate
  • BTTN can be used as a rocket propellant (propellant) or as a substitute for nitroglycerin.
  • BTTN has better performance than nitroglycerin, such as stability against impact, low freezing point, low volatility, and high thermal stability (Non-Patent Document 3).
  • 3-Hydroxybutyrolactone (3-HBL) is a compound with a wide range of uses such as pharmaceuticals, solvents, and polymer raw materials, and has a market price of $ 450 per kg. Industrially, it is synthesized by reacting malic acid with ruthenium at high temperature, but there are many problems such as high-pressure reaction conditions and the use of expensive catalysts. In addition, since it is a useful compound listed by the US Department of Energy (DOE) as one of the most valuable compounds when synthesizing from biomass (Non-Patent Document 6), research on the development of manufacturing methods from biomass raw materials Is also being done. However, in spite of such a large amount of attention, it is one of the few compounds listed in the DOE report that has yet to be commercialized.
  • DOE US Department of Energy
  • 3-HBL and its precursor 3,4-hydroxybutyric acid (3,4-DHBA) are produced by condensing acetyl-CoA synthesized from glucose with Escherichia coli as a host. It is possible. In this method, the reaction pathway is very complicated, and the specificity of the enzyme constituting the reaction pathway is also low, so that the problem is that the production amount and the yield are low.
  • 3,4-DHBA production from xylose using Escherichia coli as a host Non-Patent Document 7
  • the production amount is very low (from 20 g / L xylose to 1.27 g / L 3,4-DHBA). ). There are no reports of production using yeast as a host, which has commercially excellent properties and is considered to be suitable for production from biomass.
  • Ethylene glycol is a compound currently produced in an amount of about 28 million tons as a raw material for antifreeze for automobiles and polyethylene terephthalate, which is a typical plastic (Non-Patent Document 8).
  • EG is currently produced from ethylene obtained from petroleum.
  • the problem with this method is that it is greatly affected by fluctuations in the current price of ethylene, which is a raw material.
  • biomass-based production methods have been developed, such as a method for converting bioethanol produced by microorganisms into ethylene glycol.
  • Patent Document 1 Patent Document 2, Non-Patent Document 9, Non-Patent Document 10
  • the production amount is only 14 mg / L from 20 g / L xylose (Non-Patent Document 11).
  • Glycolate is an important compound with a compound annual growth rate of 11.3% and an annual market of $ 160 million. Glycolate is used as a raw material for adhesives, metal cleaners, dye additives, skin care and hair care products, and because of its high gas barrier properties, it is used in polyglycolic acid (PLGA) and polylactic glycolic acid. It is a compound whose demand is increasing year by year as a polymer raw material (Non-Patent Document 8). In the method for producing glycolic acid by hydrolyzing chloroacetic acid or hydroxyacetone, there is concern that the purity of glycolic acid is low and the environmental load is large because by-products of carboxylic acids and alcohols are produced (Non-Patent Document 12). ..
  • Non-Patent Document 13 Several methods for producing from xylose using Escherichia coli and yeast have also been reported (Patent Document 1, Non-Patent Document 13, Non-Patent Document 14).
  • the amount of GA produced via the Dahms pathway (described later), which is a metabolic pathway for xylose, using yeast as a host in the present invention is about 1 g / L from 20 g / L of xylose, and is aimed at commercialization. Is still a low production volume (Non-Patent Document 11).
  • ⁇ -ketoglutarate is one of the important metabolites in cells and plays an important role in yeast biomass formation.
  • AKG is used as a raw material for dietary supplements and pharmaceuticals.
  • AKG is an excellent starting material that can be converted into various compounds. Specifically, it is an industrially very important compound used as a precursor for ethylene, succinic acid, itaconic acid, and adipic acid, hexamethylenediamine, ⁇ -caprolactam, and polyglutamic acid biosynthesis, which are raw materials for nylon.
  • Non-Patent Document 18 In the current AKG production process, it is produced from succinic acid and oxalic acid diester, but the problems are that cyanide is used, the yield is as low as 75%, and a large amount of by-products can be produced. Therefore, there is a strong demand for a production method using microorganisms with a low environmental load (Non-Patent Document 18).
  • woody biomass contains glucose and xylose as fermentation raw materials for microorganisms, but yeast does not have the ability to convert xylose. Therefore, studies have been conducted to introduce a xylose metabolic pathway into yeast to impart xylose conversion ability.
  • the XI pathway and the XDH pathway have been mainly introduced as this xylose metabolic pathway. These pathways convert xylulose to xylulose and then xylulose kinase to convert xylulose to xylulose pentaphosphate.
  • the converted xylulose 5-phosphate is converted to the major metabolite of yeast via the pentose phosphate pathway.
  • This conventional xylose metabolic pathway has a problem that the yield of the target product is low because it is influenced by a complicated control mechanism of the main metabolic pathway and is mediated by glycolysis (Non-Patent Document 19).
  • xylose dehydrogenase first converts xylose to xylonolactone, and lactonase converts xylose to xylonate.
  • Xylonate is converted to 2-keto-3-deoxy-xylonate (KDX) by xylonate dehydratase.
  • KDX 2-keto-3-deoxy-xylonate
  • XO xylose oxidative
  • Patent Document 3 Non-Patent Document 5, Non-Patent Document 11 and Non-Patent Document 21.
  • the production amount of useful compounds and the yield to sugar are not yet sufficiently high.
  • the accumulation of intermediate products (xylonates) in the medium which is an important issue when introducing a novel xylose assimilation pathway into yeast, has been reported. This is considered to be the main reason why the production yield of the target substance is extremely low when a novel xylose assimilation pathway is introduced into yeast.
  • an object of the present invention is to provide a novel method capable of more efficiently producing a useful substance using yeast.
  • [1] Recombinant into which a polynucleotide encoding at least one protein that controls the biosynthesis of iron-sulfur clusters is overexpressed and a polynucleotide encoding a heterologous enzyme group involved in the xylose metabolic pathway is introduced.
  • a method for producing a xylose metabolite which comprises culturing host cells in a medium containing a sulfur-containing compound.
  • [3] The method for producing a xylose metabolite according to [1] or [2], wherein the recombinant host cell is deficient in BOL2.
  • [4] The method for producing a xylose metabolite according to any one of [1] to [3], wherein the xylose metabolic pathway is the XO pathway (xylose oxidative pathway).
  • [5] The method for producing a xylose metabolite according to any one of [1] to [4], wherein the xylose metabolic pathway is the Derms pathway, the Weinberg pathway, or a modified pathway thereof.
  • the xylose metabolic pathway is the Derms pathway, and the heterologous enzymes involved in the xylose metabolic pathway are xylose dehydrogenase (XylB), xylonate dehydratase (XylD), and aldolase, [1] to [ 5] The method for producing a xylose metabolite according to any one of.
  • the xylose metabolic pathway is the Weinberg pathway, and the heterologous enzymes involved in the xylose metabolic pathway are xylose dehydrogenase (XylB), xylonate dehydratase (XylD), and 2-keto-3-deoxy-xylose.
  • the xylose metabolic pathway is a modified pathway of the Derms pathway or the Weinberg pathway, and the heterologous enzymes involved in the xylose metabolic pathway are xylose dehydrogenase (XylB), xylonate dehydratase (XylD), 2-keto.
  • the xylose metabolic pathway is a modified pathway of the Derms or Weinberg pathway, and the heterologous enzymes involved in the xylose metabolic pathway are xylose dehydrogenase (XylB), xylonate dehydratase (XylD), and aldehyde dehydrogenase (XylD).
  • ALD the method for producing a xylose metabolite according to any one of [1] to [5].
  • ALD the method for producing a xylose metabolite according to any one of [1] to [5].
  • the method for producing a xylose metabolite according to any one of [1] to [9] wherein a polynucleotide encoding a molecule that imparts oxidative stress resistance is introduced into the recombinant host cell.
  • yeast host cells are Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Pichia, Hansenula, Candida, Croquera ( Klocckera, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia, Schwanniomyces, Trichosporon, Pachosporon, and Pichisolen.
  • the method for producing a xylose metabolite according to [12] which is at least one yeast cell selected from the above.
  • the xylose metabolite is selected from the group consisting of ethylene glycol, glycolic acid, 2-ketoglutaric acid, 1,2,4-butantriol, 3,4-dihydroxybutyric acid, and 3-hydroxybutyrolactone, at least.
  • a method for producing a xylose metabolizing substance which comprises a step of culturing a host cell, wherein a polynucleotide encoding a molecule that imparts oxidative stress resistance to the recombinant host cell is introduced. Method of manufacturing substance.
  • a useful substance can be produced more efficiently using yeast.
  • FIG. 1 is a diagram showing the Weimberg Pathway among the xylose metabolic pathways.
  • FIG. 2 is a diagram showing the Dahms Pathway among the xylose metabolic pathways.
  • FIG. 3 is a diagram showing a BT / 3,4-DHBA synthetic pathway among the xylose metabolic pathways.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of comparing the accumulated amounts of intracellular sulfur-containing compounds of the BD strain and the iron metabolism-modified strain BD ⁇ BtT strain after 24 hours of culturing.
  • FIG. 5 is a diagram showing the amount of BT produced by the BT-producing strain BD ⁇ K6035 strain when iron citrate and cysteine were added.
  • FIG. 1 is a diagram showing the Weimberg Pathway among the xylose metabolic pathways.
  • FIG. 2 is a diagram showing the Dahms Pathway among the xylose metabolic pathways.
  • FIG. 3 is a diagram showing a BT / 3,4-DHBA synthetic pathway among the
  • FIG. 6 shows the production of 3,4-DHBA by the BD ⁇ K603 ⁇ ADH6-yneI strain (A) and the production of 3,4-DHBA by the BD ⁇ K603 ⁇ ADH6-yneI strain when cysteine and reduced glutathione were added (B).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of Fed-batch culture using BT-producing yeast.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of Fed-batch culture using 3,4-DHBA-producing yeast.
  • FIG. 9 is a diagram showing the effect of addition of cysteine, reduced glutathione (GSH), and oxidized glutathione (GSSG) on the production of xylose metabolites by the BD ⁇ BtT-E strain.
  • FIG. 10 is a diagram showing the effect of overexpression of YAP1 and SOD1 on the production of xylose metabolites by the BD ⁇ BtT-E strain introduced with the Derms pathway.
  • FIG. 11 is a diagram showing the effect of YAP1 and SOD1 overexpression in the production of xylose metabolites by the BD ⁇ BtT-E strain introduced with the Weinberg pathway.
  • FIG. 12 is a diagram showing the effect of addition of cysteine and reduced glutathione (GSH) on EG production by the BD ⁇ BtT-E-YAP1NLS strain.
  • FIG. 13 is a diagram showing the mechanism of iron-sulfur cluster synthesis in yeast mitochondria.
  • FIG. 14 is a diagram showing the mechanism of iron-sulfur cluster synthesis in the cytoplasm of yeast.
  • FIG. 15 is a diagram showing changes in the amount of xylonate accumulated when a gene involved in the iron-sulfur cluster synthesis mechanism is overexpressed.
  • the method for producing a xylose metabolite of the present invention comprises a group of heterologous enzymes involved in the xylose metabolic pathway, which control the biosynthesis of iron-sulfur clusters and overexpress a polynucleotide encoding at least one protein.
  • Recombinant host cells into which the encoding polynucleotide has been introduced are cultured in a medium containing a sulfur-containing compound.
  • a polynucleotide encoding a group of heterologous enzymes involved in the xylose metabolic pathway which overexpresses a polynucleotide encoding at least one protein that controls the biosynthesis of iron-sulfur clusters, was introduced.
  • the recombinant host cell can also be said to be an iron metabolism-modified cell.
  • a recombinant host into which a polynucleotide encoding at least one protein that controls the biosynthesis of iron-sulfur clusters is overexpressed and a polynucleotide encoding a heterologous enzyme group involved in the xylose metabolic pathway is introduced.
  • a method for producing a xylose metabolite which comprises a step of culturing cells, wherein a polynucleotide encoding a molecule that imparts oxidative stress resistance to the recombinant host cell is introduced. The method for producing the above is also included in the present invention.
  • the present invention is a method including a step of culturing a cell in which a polynucleotide encoding a molecule that imparts oxidative stress resistance is introduced into an iron metabolism-modified cell.
  • the present invention comprises a step of introducing a polynucleotide encoding a molecule that further imparts oxidative stress resistance and culturing the cells in a medium containing a sulfur-containing compound, which comprises the step of culturing the xylose metabolite. Is more preferable.
  • the recombinant host cell of the present invention is a group of heterologous enzymes involved in the xylose metabolic pathway in a recombinant host cell overexpressing a polynucleotide encoding at least one protein that controls the biosynthesis of iron-sulfur clusters.
  • a recombinant host cell into which a polynucleotide encoding a molecule that imparts oxidative stress resistance has been introduced is also included in the recombinant host cell in the present invention.
  • the type of host cell used in the present invention may be any of the host cells well known to those skilled in the art, and includes prokaryotic cells, eukaryotic cells such as bacterial cells, fungal cells, yeast cells, mammalian cells, insect cells or plant cells. Is done.
  • the host cell in the present invention is preferably yeast cell because it proliferates quickly, is resistant to various stresses such as low pH due to fermentation inhibitors and weak acids, and is easy to genetically recombine.
  • yeast cells include Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Pichia, Hansenula, Candida, and Klocckera. , Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia, Schwanniomyces, Trichosporon, Yamadazyma, Pachysol, etc.
  • the genus Saccharomyces is more preferable, and specifically, for example, YPH499 strain, S288C strain, YPH500 strain, BY4741 strain, BY4742 strain, W303 strain, CEN.PK strain, BY4743 strain, FY4 strain. , AB972, A364A, DC5, X2180-1A, D-273-10B, FL100, JK9-3d, RM11-1a, SEY6210, SEY6211, Sigma1278b, SK1, XJ24-24a A strain, a Y55 strain, a YPH501 strain, or the like can be used.
  • YPH499 strain, S288C strain, YPH500 strain, BY4741 strain, BY4742 strain, W303 strain, and CEN.PK strain are more preferable, and YPH499 strain is particularly preferable.
  • polynucleotide means both a single nucleic acid and a plurality of nucleic acids, and includes nucleic acid molecules such as mRNA, plasmid RNA, full-length cDNA and fragments thereof.
  • the polynucleotide is composed of any polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide and may be modified or unmodified. It may be single-stranded or double-stranded, or a mixture of both.
  • heterologous used for "heterologous enzyme” and the like means a species different from the recombinant host cell of the present invention, for example, the recombinant host cell of the present invention is a yeast cell.
  • examples of the different species include bacteria such as Escherichia coli and pyogenic bacteria. It also includes a natural coding region or a portion thereof that has been reintroduced into a host cell in a form different from the corresponding natural gene. For example, those that are not in their natural position in the genome are also included.
  • the purpose of introducing a polynucleotide encoding a heterologous enzyme group into the recombinant host cell of the present invention is to introduce a polynucleotide encoding a protein such as an enzyme that the host cell does not originally have. , Xylose metabolic pathway, and other metabolic pathways to function and / or enhance.
  • the cell may be transformed with an expression vector containing the polynucleotide.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it contains the gene of the present invention in an expressible state, and a vector suitable for each host can be used.
  • the expression vector of the present invention can be prepared by inserting a transcription promoter upstream of the heterologous polynucleotide and, in some cases, a terminator downstream to construct an expression cassette, and inserting this cassette into the expression vector.
  • a transcriptional promoter and / or terminator is already present in the expression vector, the promoter and / or terminator in the vector can be used to insert the heterologous polynucleotide in between without constructing an expression cassette. good.
  • a method using a restriction enzyme, a method using topoisomerase, or the like can be used. Further, if necessary at the time of insertion, an appropriate linker may be added.
  • ribosome-binding sequences such as SD sequence and Kozak sequence are known as important base sequences for translation into amino acids, and these sequences can be inserted upstream of the gene. Upon insertion, a part of the amino acid sequence encoded by the gene may be replaced.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited as long as it carries the gene of the present invention, and a vector suitable for each host can be used.
  • examples of the vector include plasmid DNA, bacteriophage DNA, retrotransposon DNA, artificial chromosome DNA and the like.
  • the method for introducing the expression vector into the host is not particularly limited as long as it is a method suitable for the host.
  • the methods that can be used include an electroporation method, a method using calcium ions, a spheroplast method, a lithium acetate method, a calcium phosphate method, a lipofection method and the like.
  • Expression of the polynucleotide in a recombinant host cell can be quantified according to methods known to those of skill in the art. For example, it can be represented by the percentage of total cellular protein of the polypeptide encoded by the polynucleotide.
  • iron-sulfur cluster refers to a cofactor composed of non-heme iron and an inorganic sulfur atom, and generally refers to [2Fe-2S], [4Fe-4S], and [3Fe-4S]. It is coordinated to sulfur-containing amino acid residues such as cysteine inside the protein in the form.
  • the required iron-sulfur (Fe-S) cluster differs depending on the type of iron-sulfur protein (Fe-S protein).
  • the recombinant host cell of the present invention is a cell that overexpresses a polynucleotide encoding at least one protein that controls the biosynthesis of iron-sulfur clusters.
  • Proteins that control the biosynthesis of iron-sulfur clusters include proteins that control the synthesis of iron-sulfur clusters, proteins involved in the transport of iron-sulfur clusters in cells, and control of the sensing, uptake, and utilization of iron. It may be any protein or the like, and is not particularly limited as long as it is a protein that ultimately affects the biosynthesis of iron-sulfur clusters.
  • the polynucleotide encoding a protein that controls the sensing, uptake, and utilization of iron may be a gene contained in iron (Fe) regulon, which is a group of genes involved in iron metabolism.
  • TYW1 which is a protein involved in the storage of iron-sulfur (Fe-S) clusters in cells
  • Fe-S iron-sulfur
  • Overexpression of this TYW1 encoding polynucleotide in host cells promotes the uptake of iron into cells, and sufficient supply of iron-sulfur clusters improves the activity of iron-sulfur proteins such as XylD. It is thought that it can be made to.
  • Examples of a typical TYW1 protein (peptide) and a polynucleotide encoding the same include those used in the examples of the present application.
  • the polynucleotide encoding at least one protein that controls the biosynthesis of iron-sulfur clusters is a polynucleotide encoding a TYW1 protein or a polynucleotide encoding a protein having an equivalent function, and is used in yeast. From the viewpoint of the effect of improving the activity of XylD, the polynucleotides of SEQ ID NOs: 1 and 2 are preferable.
  • a protein (and a polynucleotide encoding it) that has at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more identity to each particular sequence.
  • a protein having TYW1 activity (and the polynucleotide encoding it) is understood to be usable in the present invention.
  • YAH1, ISD11, NFS1, YFH1, ARH1, MRS3, which are involved in iron-sulfur cluster biosynthesis in mitochondria ACP1 and ISU1 are also mentioned.
  • Typical YAH1, ISD11, NFS1, YFH1, ARH1, MRS3, ACP1, and ISU1 proteins and polynucleotides encoding them include those used in the examples of the present application.
  • YAH1, ISD11, NFS1, YFH1, ARH1, MRS3, ACP1, and ISU1 are encoded as polynucleotides encoding at least one protein that controls the biosynthesis of iron-sulfur clusters overexpressed in the host cell of the present invention.
  • a polynucleotide encoding a protein having an equivalent function preferably the polynucleotides of SEQ ID NOs: 65 to 72, respectively.
  • proteins having their respective enzymatic activities are understood to be usable in the present invention.
  • At least one protein that controls the biosynthesis of iron-sulfur clusters that is overexpressed in host cells is involved in iron-sulfur cluster biosynthesis in mitochondria from the viewpoint of improving the productivity of useful substances by host cells.
  • MRS3, ACP1 and ISU1 are preferable, and ISU1 is more preferable.
  • overexpression refers to higher expression than the endogenous expression of the same or related polynucleotide or gene.
  • a heterologous polynucleotide or gene is expressed more than the expression of an equivalent endogenous gene, or more than the expression of the same polynucleotide or gene introduced by means that does not overexpress the polynucleotide or gene. If is high, it corresponds to overexpression.
  • the polynucleotide can be overexpressed using any means of increasing the copy number of the polynucleotide in the host cell. For example, a high copy number plasmid or a plasmid having a controllable number of copies may be used, or may be overexpressed by integration of a large number of chromosomes.
  • the cell may be transformed with an expression vector containing the polynucleotide.
  • Method for introducing polynucleotide refer to the section "Method for introducing polynucleotide" described above.
  • the cells to be used for comparison that are not overexpressed may not be transformed, or may be transformed with an expression vector that does not contain the polynucleotide.
  • Expression or overexpression of the polynucleotide in a recombinant host cell can be quantified according to methods known to those of skill in the art. For example, it can be represented by the percentage of total cellular protein of the polypeptide encoded by the polynucleotide.
  • confirmation by western blotting using an antibody capable of detecting the polypeptide encoded by the polynucleotide, or real-time PCR using a primer that specifically detects the polynucleotide, etc. can do.
  • the recombinant host cell of the present invention is preferably deficient in the transcriptional repressor BOL2.
  • iron metabolism is improved by deficient in the transcriptional repressor BOL2.
  • the absence of BOL2 promotes the expression of genes involved in iron metabolism whose transcription is regulated by Aft1.
  • Aft1 the expression of genes involved in iron metabolism whose transcription is regulated by Aft1.
  • a gene deletion method known to those skilled in the art can be used, and the method is not limited.
  • a mutation can be induced by using light such as ultraviolet rays or a chemical substance, and a strain lacking the target gene can be selected from the obtained mutants.
  • the gene deficiency can also be obtained, for example, by introducing a nucleotide sequence or vector containing a nucleotide sequence homologous to the target gene into a host cell to cause homologous recombination.
  • the nucleotide sequence or vector to be injected can contain a dominant selection marker.
  • the vector that can be used is not particularly limited, and a known expression vector can be used.
  • a polynucleotide encoding a group of heterologous enzymes involved in the xylose metabolic pathway has been introduced.
  • a group of heterologous enzymes involved in the xylose metabolic pathway into a host cell, a metabolic pathway originally not provided by the host cell becomes active, and a desired substance can be produced.
  • the xylose metabolic pathway and the polynucleotide encoding a group of heterologous enzymes involved in the xylose metabolic pathway will be described below.
  • the "xylose metabolic pathway” refers to xylose to ethylene glycol, glycolic acid, glyoxylic acid, pyruvic acid, 2-ketoglutaric acid, succinic acid, ethanol, xylitol, D-xylonate, D-1,2,4- A pathway for producing butanetriol (D-BT), 3,4-dihydroxybutyric acid, 1,4-butanediol, mesaconate, etc., for example, the XO pathway, the pathway known as the Dahms / Weinberg pathway, XR / XDH. It also includes routes, XI routes, routes modified to industrially use these routes, and the like.
  • it refers to an enzymatic pathway for producing ethylene glycol, glycolic acid, glyoxylic acid, pyruvic acid, 2-ketoglutaric acid, succinic acid, 3,4-dihydroxybutyric acid and the like from D-xylose.
  • the xylose metabolic pathway introduced into the host is that it can be converted into important intracellular metabolites such as 2-ketoglutaric acid, pyruvic acid, and glyoxylic acid with a small number of reactions, and glycolytic decarboxylation reaction. Since it can be converted with a sugar yield of 100% and there is no phosphorylation reaction that requires energy, the XO pathway, the Weinberg pathway (Fig. 1), and the Dahms pathway (Dahms pathway) A pathway known as FIG. 2) and a modified pathway thereof (BT synthetic pathway, 3,4-DHBA synthetic pathway, etc .; FIG. 3) are preferable.
  • xylose dehydrogenase XylB
  • xylonate dehydratase XylD
  • 2-keto-3-deoxy- enzymes involved in the Weinberg pathway. It expresses xylonate dehydratase (XylX) and 2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase (XylA, KsaD). If necessary, it is preferable to express xylonolactone lactonase (XylC).
  • xylose dehydrogenase XylB
  • xylonate dehydrogenase XylD
  • 2-keto3-deoxyxilo derived from the heterologous are used as enzymes involved in the dermus pathway.
  • Nate aldolase YagE, YjhH
  • xylose dehydrogenase XylB
  • XylD xylonate dehydratase
  • KDC 2-keto acid decarboxylase
  • ALR aldehyde reductase
  • POS5 NADH kinase
  • XylC xylonolactone lactonase
  • xylose dehydrogenase XylB
  • XylD xylonate dehydratase
  • KDC 2-keto acid decarboxylase
  • yneI aldehyde dehydrogenase
  • yqhD yqhD
  • ADH6 is preferably destroyed. If necessary, it is preferable to express xylonolactone lactonase (XylC).
  • the XylD protein (peptide) is an iron-sulfur protein (Fe-S protein), and examples of the typical XylD protein (peptide) and the polynucleotide encoding the same include those used in the examples of the present application.
  • the polynucleotide encoding the XylD protein (peptide) is a polynucleotide encoding the XylD protein (peptide) or a polynucleotide encoding a protein (peptide) having an equivalent function, and is the polynucleotide of SEQ ID NO: 3. Is particularly preferable.
  • the polynucleotide encoding the XylD protein (peptide) is a protein having at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more identity with respect to the above specific sequence. (And the polynucleotide encoding it) and the protein having XylD activity (xylonate dehydratase activity) (and the polynucleotide encoding it) is understood to be usable in the present invention.
  • xylose dehydrogenase protein examples include those used in the examples of the present application.
  • the xylose dehydrogenase protein is a polynucleotide encoding a xylose dehydrogenase protein (peptide) or a polynucleotide encoding a protein (peptide) having an equivalent function, and efficiently produces useful substances in a recombinant host cell. From the viewpoint of the effect of improving the protein, those encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 4 are particularly preferable (XylB).
  • a protein (and a polynucleotide encoding the same) having at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more identity with respect to the specific sequence. It is understood that a protein having xylose dehydrogenase activity (and a polynucleotide encoding it) can be used in the present invention.
  • XylX in the present invention is 2-keto-3-deoxy-xylonate dehydratase, and as a typical 2-keto-3-deoxy-xylonate dehydratase protein (peptide) and a polynucleotide encoding the same, the present application is carried out. Examples include those used in the examples.
  • the 2-keto-3-deoxy-xylonate dehydratase protein as XylX in the present invention has a polynucleotide encoding a 2-keto-3-deoxy-xylonate dehydratase protein (peptide) or an equivalent function.
  • polynucleotides encoding proteins (peptides) which are encoded by polynucleotides of SEQ ID NOs: 5 to 10, have the effect of efficiently improving the production of useful substances and cell proliferation in recombinant host cells. From this point of view, those encoded by the polynucleotides of SEQ ID NOs: 6, 9 and 10 are particularly preferable (XylX).
  • a protein (and a polynucleotide encoding the same) having at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more identity with respect to the specific sequence. It is understood that a protein having 2-keto-3-deoxy-xylonate dehydratase activity (and a polynucleotide encoding it) can be used in the present invention.
  • XylA and KsaD in the present invention are 2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase, and typical 2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase protein (peptide) and the polynucleotide encoding the same include those used in the examples of the present application. Can be mentioned.
  • Examples of the 2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase protein as XylA and KsaD in the present invention include those encoded by the polynucleotides of SEQ ID NOs: 11 and 12, respectively, and efficiently produce useful substances in recombinant host cells. From the viewpoint of the effect of improving the above, the one encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 12 is particularly preferable.
  • a protein (and a polynucleotide encoding it) that has at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more identity to each particular sequence.
  • 2-Ketoglutate Semialdehyde Dehydrogenase A protein having activity (and a polynucleotide encoding it) is understood to be usable in the present invention.
  • Aldolase As the aldolase protein (peptide) and the polynucleotide encoding it, the polynucleotide encoded by SEQ ID NO: 13 (YagE), sequence, from the viewpoint of the effect of efficiently improving the production of useful substances in recombinant host cells.
  • the one encoded by the polynucleotide of number 14 (yjhH) is preferred.
  • a protein (and a polynucleotide encoding it) that has at least 90%, preferably 95% or more identity to each particular sequence, and a protein that has aldolase activity (and the polynucleotide that encodes it). Is understood to be usable in the present invention.
  • KDC (KdcA) in the present invention is 2-keto acid decarboxylase, and typical 2-keto acid decarboxylase protein (peptide) and the polynucleotide encoding the same include those used in this example. Be done.
  • the KDC (KdcA) in the present invention is particularly preferably one encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 15 from the viewpoint of the effect of efficiently improving the production of useful substances in the recombinant host cell.
  • a protein (and a polynucleotide encoding it) that has at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more identity to each particular sequence.
  • a protein having 2-keto acid decarboxylase activity (and the polynucleotide encoding it) is understood to be usable in the present invention.
  • the polynucleotide encoded by SEQ ID NO: 16 as yneI (derived from E.coli) is encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 16 and the sequence as UGA2 (derived from S. cerevisiae). What is encoded by the polynucleotide of No.
  • ALD 17 is encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 18 as yqhD (derived from E.coli), and what is encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 19 as ALD2 (derived from S. cerevisiae).
  • ALD3 derived from S. cerevisiae
  • those encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 20 are preferable.
  • a protein (and a polynucleotide encoding it) having at least 90%, preferably 95% or more identity with respect to the specific sequence, and a protein having aldehyde dehydrogenase activity (and a polynucleotide encoding it). Is understood to be usable in the present invention.
  • the cell may be transformed with an expression vector containing the polynucleotide by a method known to those skilled in the art. can. See the section "Introduction of polynucleotides" above for details of the method.
  • Examples of the xylose metabolite produced by the method of the present invention include ethylene glycol, glycolic acid, glyoxylic acid, pyruvic acid, lactic acid, 2-ketoglutaric acid, succinic acid, 1,2,4-butanediol, and 3-hydroxy.
  • Butyrolactone, 3,4-dihydroxybutyric acid, 1,4-butanediol, ethanol, xylitol, D-xylonate and the like can be mentioned.
  • ethylene glycol, glycolic acid, pyruvate, 2-ketoglutaric acid, succinic acid, 1,2,4-butantriol, 3,4 -Dihydroxybutyric acid, 3-hydroxybutyrolactone, 3,4-dihydroxybutyric acid, 1,4-butanediol are preferred, ethylene glycol, glycolic acid, 2-ketoglutaric acid, 1,2,4-butantriol, 3,4-dihydroxy Butyric acid is more preferred.
  • xylose metabolite produced by the method of the present invention in addition to pyruvic acid, glyoxylic acid, and 2-ketoglutaric acid, which are metabolites of Dhams pathway and Weimberg pathway, due to the characteristics of the metabolic pathway, these compounds are used. It also includes a group of compounds derived from.
  • Examples of the sulfur-containing compound in the present invention include cysteine, ⁇ -glutamylcysteine, reduced glutathione, methionine, homocysteine, taurine, iron sulfate and the like.
  • cysteine, ⁇ -glutamylcysteine, and reduced glutathione are preferable from the viewpoint of excellent effect of improving the production efficiency of xylose metabolites from iron metabolism improving cells.
  • cysteine when cysteine is contained as a sulfur-containing compound in the culture medium of iron metabolism-improving cells, the efficiency of substance production accompanied by an oxidation reaction can be further improved.
  • the concentration of the sulfur-containing compound in the medium in the present invention needs to be appropriately adjusted depending on the type of the sulfur-containing compound, but from the viewpoint of excellent effect of improving the production efficiency of the xylose metabolite, for example, it is 1 ⁇ M to 100 mM, which is 10 ⁇ M. It is preferably ⁇ 50 mM, more preferably 50 ⁇ M to 20 mM, further preferably 100 ⁇ M to 10 mM, and particularly preferably 1 mM to 5 mM.
  • a polynucleotide encoding a molecule that imparts oxidative stress resistance to the recombinant host cell is introduced and overexpressed to improve the production efficiency of the xylose metabolite.
  • the molecule that imparts oxidative stress resistance is not particularly limited as long as it is a molecule that can impart oxidative stress resistance to cells, and examples thereof include YAP1, SOD1, CTT1, and HSP30.
  • YAP1 is one of transcription factors that respond to oxidative stress by hydrogen peroxide (H 2 0 2), subcellular localization is controlled.
  • H 2 0 2 hydrogen peroxide
  • a cysteine residue YAP1 the control mechanism of intracellular form a disulfide bond in a cell.
  • conformationally altered YAP1 is transported into the nucleus and promotes the expression of genes such as TRX2, GSH1 ( ⁇ -glutamylcysteine synthetase), GSH2 (glutathione synthetase) and TRR1 (thioredoxin reductase).
  • YAP1 is particularly preferable for the production of substances accompanied by a reduction reaction represented by the conversion of glycolaldehyde to ethylene glycol.
  • YAP1 is preferably encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 21 from the viewpoint of improving the production efficiency of xylose metabolites.
  • TRR1 thioredoxin reductase
  • Superoxide dismutase 1 is an enzyme that detoxifies superoxide, which is one of the active oxygen species, by converting it into oxygen and hydrogen peroxide.
  • SOD1 has a function as a transcription factor.
  • the activity as a transcription factor is controlled by the H 2 0 2.
  • H 2 0 2 When H 2 0 2 is present, the serine residue of SOD1 by a control mechanism in the yeast cells is phosphorylated, SOD1 that received phosphorylation moves to the nucleus.
  • SOD1 translocated into the nucleus promotes the expression of genes such as ferric reductase (FRE2, FRE3) involved in antioxidants, DNA repair, or Cu / Fe homeostasis (Nature Communications, 5 (1), 3446, 2014). ).
  • the overexpression of SOD1 is particularly preferable for the production of substances accompanied by an oxidation reaction typified by the reaction of glycolaldehyde to glycolic acid.
  • SOD1 is preferably encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 22 from the viewpoint of improving the production efficiency of xylose metabolites.
  • a protein (and a polynucleotide encoding it) that has at least 90%, preferably 95% or more identity with respect to the specific sequence, and is involved in antioxidants, DNA repair, or Cu / Fe homeostasis.
  • Proteins that have the activity of promoting the expression of genes such as Ferric reductase (FRE2, FRE3) (and the polynucleotides that encode them), or the proteins whose expression is promoted by SOD1 (and the polynucleotides that encode them) are described in this article. It is understood that it can be used in the invention.
  • CTT1 is an enzyme that detoxifies to transform the and H 2 0 2 a kind of catalase into oxygen and water.
  • Yeast has two types of catalase, and CTT1 is known to be localized in the cytoplasm.
  • the other catalase is CTA1 localized in the peroxisome.
  • CTT1 is preferably encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 23 from the viewpoint of improving the production efficiency of xylose metabolites.
  • HSP30 is a heat shock protein whose expression is induced under various environmental stress conditions (heat shock, high-concentration ethanol, weak acid, oxidative stress, glucose depletion, etc.). For example, it is known that ATP is used to negatively regulate the expression of Pma1, which releases H + extracellularly (Indian Journal of Microbiology, 51 (2), 153-158, 2011).
  • the overexpression of HSP30 is particularly preferable for the production of substances accompanied by an oxidation reaction typified by the reaction of glycolaldehyde to glycolic acid.
  • HSP30 is preferably one encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 24 from the viewpoint of improving the production efficiency of the xylose metabolite.
  • the recombinant host cells are cultured in SCD medium or the like at 25 ° C. to 40 ° C. for 15 hours to 72 hours to proliferate, and then xylose and glucose mixed sugar medium and xylose alone are used.
  • Inoculate a medium containing a carbon source (YPD medium, etc.) at a constant concentration (for example, a concentration of OD600 0.1) at 25 ° C to 40 ° C, preferably 30 ° C, 50 rpm to 800 rpm, preferably 100.
  • Incubate at 300 rpm, more preferably 150 rpm for 15 to 72 hours, preferably 20 to 48 hours, more preferably about 24 hours.
  • the fermentation medium for example, 10 g / L yeast extract, 20 g / L tryptone, 10 g / L glucose, 10 g / L xylose, etc.
  • OD600 5 for example, from 25 ° C to 40 ° C.
  • Each useful substance can be obtained by collecting the culture solution, collecting yeast from the production system according to a conventional method, and appropriately concentrating and purifying the yeast. By adding a sulfur-containing compound to the fermentation medium, the efficiency of producing a xylose metabolite can be improved.
  • yeast cerevisiae YPH499 [MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1- 63 his3- ⁇ 200 leu2- ⁇ 1 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)] was used as the host of the xylose metabolic pathway-introduced strain.
  • amino acids and nucleic acids are added to SD medium [6.7 g / L yeast nitrogen base without amino acids (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), 20 g / L glucose] according to the auxotrophy of the strain.
  • SCD medium 6.7 g / L yeast nitrogen base without amino acids (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), 2 g / L synthetic complete mix, 20 g / L glucose] was used.
  • amino acids and nucleic acids were appropriately extracted from the synthetic complete mix according to the auxotrophy of the strain. Preculture was performed at 30 ° C and 200 rpm.
  • the plasmid prepared in this study was prepared using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (Takara) and Ligation high ver.2 (Takara).
  • In-Fusion the homologous sequence of the terminal 15 bases of the restriction enzyme-treated vector is added to both ends of the base sequence to be cloned by PCR, and the vector, cloning sequence, and In-Fusion enzyme are mixed and incubated at 50 ° C for 15 minutes. Created by doing.
  • Ligation was prepared by mixing a restriction enzyme-treated vector, a target gene sequence treated with a restriction enzyme corresponding to the vector, and a Ligation enzyme and incubating at 16 ° C. for 30 minutes.
  • first DNA encoding L. lactis kdcA linked to the TDH3 promoter (TDH3p) and ADH1 terminator (ADH1t) was obtained from pIL-pTDH3-kdcA (Bambaet al., 2019). Elongation was performed by PCR using -int-kdcA F and d-int-kdcA R. The elongated DNA fragment was incorporated into a p ⁇ W vector cleaved with SmaI to obtain p ⁇ W-pTDH3-kdcA.
  • a fragment of POS5 ⁇ 17 ORF was obtained by PCR using YPH499 genomic DNA as a template and prr-7-3-F and prr-7-2-R as primers.
  • the obtained POS5 ⁇ 17 ORF fragment was incorporated into a vector in which pGK405 was treated with SmaI to prepare pIL-POS5 ⁇ 17.
  • the gene that catalyzes the reaction from DHB to 3,4-DHBA was incorporated into a vector in which pIL pTDH3-tADH1 or pIU pTDH3-tADH1 was treated with SmaI.
  • Primers of prr-11-1F and prr-11-1R, prr-19-1F and prr-19-1R, prr-19-2F and prr-19-2R using YPH499 genomic DNA as a template PCR was performed using each set to obtain DNA fragments of UGA2 ORF, ALD2 ORF, and ALD3 ORF.
  • pCL-Cas9 and pCW-Cas9 use the YPH499 genomic DNA as a template and use the TEF1p for Cas9F and TEF1p for Cas9R, CYC1p for Cas9F and CYC1p for Cas9R primer sets to create the TEF1 promoter region.
  • the terminator region of CYC1 was extended respectively.
  • Cas9 ORF was extended using Cas9F and Cas9R primer sets using Cas9_Base (Nambu-Nishida et.al., Sci Rep 7,8993, 2017) as a template.
  • TEF1 promoter, Cas9 ORF, and CYC1 terminator were incorporated into pGK415 or pGK414 cleaved with XhoI and NotI to obtain pCL-Cas9 and pCW-Cas9.
  • yagE derived from E. coli with TDH3p pIL-pTDH3-tADH1 was processed with SmaI and codon-optimized yagE was incorporated to create pIL-tdh3p-yagE.
  • the DNA sequence of yagE is as shown in SEQ ID NO: 13.
  • YAP1NLS, SOD1NLS, CTT1ORF, and HSP30ORF were extended by PCR using YPH499 genomic DNA as a template.
  • prr-16-4F and prr-16-4R, prr-16-5F and prr-16-5R, prr-16-1F and prr-16-1R, prr-16- The primer sets of 2F and prr-16-2R were used, respectively.
  • prr-16-4R and prr-16-5R each contain ‘5-ccgaagaagaagcgtaaagtc-3’ (SEQ ID NO: 25).
  • PCR was performed using the primer sets of prr-MEP-1-6F and prr-MEP-1-6R to obtain fragments of TDH3p-ADH1t with the sequences of XhoI and NcoI.
  • TDH3p-ADH1t with restriction enzyme sites into a vector PCRed with the primer set of prr-MEP-1-5F and prr-MEP-1-5R using pIU pTDH3-ADH1t as a template, pIL- xTDH3p-ADH1tn was obtained.
  • pIL-xTDH3p-ADH1tn By treating pIL-xTDH3p-ADH1tn with SmaI and incorporating ksaD derived from C. glutamicum, pIL-xTDH3p-CgksaD-ADH1tn was obtained.
  • pIBG-SS Inokuma et al., Biotechnology for Biofuels, 7 (1), 8, 2014
  • SED1p And SAG1t were PCRed respectively.
  • SED1p-SAG1t was prepared by PCR using SED1p and SAG1t as templates and XhoI-SED1pF and SAG1tR primer sets. By incorporating this into pGK405 (Ishii et al., The Journal of Biochemistry, 145 (6), 701-708, 2009) processed with XhoI and NotI, pIL-sed1p-sag1t was created.
  • pIL-sed1p-BxxylX-sag1t was created by treating pIL-sed1p-sag1t with SmaI and incorporating codon-optimized B.xenovorans-derived xylX.
  • ARS208 (Reider Apel, A.et.al, Nucleic Acids Res PICas-ARS208 was prepared by incorporating two DNA fragments obtained by PCR of upstream 500 bp and downstream 500 bp fragments of 45, 496-508, 2017) with ARS208 up F and ARS 208 up R, ARS 208 down F and ARS 208 down R.
  • pIL-xTDH3p-CgksaD-ADH1tn and pIL-sed1p-BxxylX-sag1t were treated with XhoI and NcoI, XhoI and NotI.
  • Each of the obtained gene cassettes was ligated into a vector obtained by cleaving pICas-ARS208 with NcoI and NotI to obtain pICas-ARS208-tCgKsaD-sBxxylX.
  • yeast strain Yeast transformation was carried out according to the one-step transformation method using lithium acetate (Chen et al. Current Genetics, 21 (1), 83-84, 1992).
  • Table 2 shows the yeast strains used in this study.
  • the yeast strain of this study was S. cerevisiae YPH499 strain. All host strains were C. crescentus-derived xylB and xylD-introduced BD strains (Bamba et al., 2019) that catalyzed the disruption of GRE3, which converts xylose to xylitol, and the reaction from xylose to xylonate. ..
  • a BD ⁇ K6 strain was prepared by introducing kdcA derived from Lactococcus lactis into a BD strain using the ⁇ -integration method.
  • BD ⁇ K601 strain and BD ⁇ B strain were prepared by substituting the BOL2 gene of BD ⁇ K6 strain and BD strain with HIS3.
  • pIAur-tTYW1 Bamba et al., 2019 was introduced into BD ⁇ K601 and BD ⁇ B strains to prepare BD ⁇ K603 and BD ⁇ BtT strains.
  • a BD ⁇ K6035 strain was obtained by introducing pIL-POS5 ⁇ 17 in order to prepare a strain overexpressing POS5 ⁇ 17 (SEQ ID NO: 26) from which the mitochondrial localization sequence of POS5 was removed from the BD ⁇ K603 strain, which is a BT-producing strain.
  • BD ⁇ K603 ⁇ ADH6 strain was obtained by destroying ADH6 from BD ⁇ K603 strain.
  • ADH6 a DNA fragment of 500 bp upstream and downstream of ADH6 ORF was ligated.
  • BD ⁇ BtT-E strain was created by introducing pIL-tdh3p-yagE into the BD ⁇ BtT strain.
  • pIU-tdh3p-YAP1NLS-adh1t pIU-tdh3p-YAP1-adh1t
  • pIU-tdh3p-SOD1NLS-adh1t pIU-tdh3p-SOD1-adh1t
  • pIU-tdh3p-SOD1-adh1t BD ⁇ BtT-kDbX-YAP1NLS, BD ⁇ BtT-kDbX-YAP1, BD ⁇ BtT-kDbX-SOD1NLS, and BD ⁇ BtT-kDbX-SOD1 with CTT1-adh1t and pIU-tdh3p-HSP30-adh1t were constructed.
  • each primer used in this example is as shown in the sequence listing as the SEQ ID NO: shown in Table 3 below.
  • the composition of the feed solution was 10 g / L yeast extract, 20 g / L tryptone, 130 g / L glucose, and 130 g / L xylose. If necessary, a defoaming agent was added to the bioreactor. The culture conditions were controlled at 30 ° C and pH 5.5. In order to control the dissolved oxygen (DO) concentration, the air flow rate was 0.5 volume / volume / minute, and DO was automatically controlled by the stirring speed during the culture. Fermented cultures were sampled every 24 hours to measure medium and OD 600 metabolites.
  • DO dissolved oxygen
  • EG ethylene glycol
  • GA glycolic acid
  • HPLC equipped with an Aminex HPX-87H column and a refractive index detector RID-10A. It was operated at a flow rate of 0.6 mL / min and 65 ° C. using 5 mM H 2 SO 4 as the mobile phase.
  • Concentrations of BT (butantriol), 3,4-DHBA (3,4-dihydroxybutyric acid), and xylonate (xylonate) were analyzed by gas chromatography / mass spectrometer (GC-MS) (Shimadzu).
  • Trimethylsilylation for GC-MS analysis was performed according to the following procedure. That is, 100 ⁇ L of 20 mg / mL O-methylhydroxylamine hydrochloride solution dissolved in pyridine was added to the dried sample and reacted for 90 minutes (1200 rpm, 30 ° C; M-BR-022UP; Taitec, Saitama, Japan). ).
  • MSTFA N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide
  • the GC-MS (GCMS-QP2010 Ultra; Shimadzu) was equipped with a CP-Sil 8CB column (30 m length x 0.25 mm i.d., film thickness of 0.25 ⁇ m; Agilent).
  • the settings for each parameter of GC-MS are as follows. That is, the temperature of the sample vaporization chamber was set to 230 ° C.
  • the sample injection volume was 1 ⁇ L and the split ratio was set to 1:25.
  • Helium was used as the carrier gas and the flow rate was set to 1.12 mL / min.
  • the column temperature was kept at 80 ° C. for 2 minutes, then raised to 330 ° C. at 15 ° C./min, and kept warm at 330 ° C. for 6 minutes.
  • the interface temperature and the ion source temperature were set to 250 ° C and 200 ° C, respectively.
  • Ionization Electrode impact ionization; EI
  • EI Electrode impact ionization
  • Scan mode 85-500m / z
  • SIM Selected ion monitoring
  • FASTT Fast Automated Scan / SIM
  • the intracellular accumulation amounts of the sulfur-containing compounds cysteine, ⁇ -glutamylcysteine, and reduced glutathione were mainly reduced in the BD ⁇ BtT strain after the iron metabolism modification as compared with the BD strain before the iron metabolism modification. Was there. In contrast, no significant reduction in oxidized glutathione was seen. In particular, glutathione is used as an index of intracellular oxidative stress, suggesting that iron metabolism-modified yeast strains with enhanced iron uptake are exposed to excessive oxidative stress.
  • cysteine and glutathione increased the production of 3,4-DHBA to 2.43 g / L and 2.03 g / L, respectively.
  • the production of 3,4-DHBA was higher with the addition of cysteine than with the addition of glutathione.
  • cysteine and glutathione reduced the amount of xylonate accumulated. With no addition, the accumulation of xylonate was 8.58 g / L, whereas the addition of cysteine and glutathione reduced the accumulation of xylonate to 7.43 g / L and 7.80 g / L.
  • Fig. 8 shows the results of Fed-batch culture using 3,4-DHBA-producing yeast.
  • An automatic control mode of DO by stirring was used to tightly control the dissolved oxygen concentration.
  • the DO of each culture was controlled to 6.5 ppm, 4.0 ppm, 2.0 ppm, and 0.5 ppm, respectively.
  • YAP1 is a type of Yeast AP-1 like transcription factors that changes the formation of yeast in the molecule when it is subjected to oxidative stress, and expresses genes encoding proteins that reduce oxidative stress (TRX2, GSH1, etc.).
  • TRX2, GSH1, etc. promoters for oxidative stress.
  • SOD1 is Superoxide dismutase 1, an enzyme that converts superoxide to hydrogen peroxide. Tsang et al. (2014) reported that SOD1 has superoxide dismutase activity and activity as a transcription factor in yeast cells.
  • SOD1 translocates into the nucleus and functions as a transcription factor in the presence of reactive oxygen species (Reactive Oxygen Spices, ROS) such as H 2 O 2.
  • CTT1 is a catalase localized in the yeast cytoplasm and is an enzyme that converts H 2 O 2 to H 2 O.
  • HSP30 is a type of heat shock protein and is known to be involved in high temperature resistance. It is generally known that reactive oxygen species are generated by culturing yeast at high temperature, and it was selected as a candidate gene.
  • YAP1, SOD1, and CTT1 were introduced into the BD ⁇ BtT-E strain in which Dahms pathway was introduced into the iron metabolism-modified strain, respectively. Since YAP1 and SOD1 are transcription factors, those with a nuclear localization signal (Nuclear Localization Signal, NLS) added to the C-terminal were also prepared and expressed in the same manner (described as YAP1NLS and SOD1NLS).
  • NLS Nuclear Localization Signal
  • FIG. 10 shows the results of culturing each strain in which oxidative stress resistance was imparted to the BD ⁇ BtT-E strain.
  • (A) shows the accumulated amount of Xylonate
  • (B) shows the production amount of Glycolate
  • (C) shows the production amount of Ethylene glycol (EG).
  • the xylonate accumulation amount after 96 hours of the BD ⁇ BtT-E strain was 6.2 g / L
  • the xylonate accumulation amount of the strain overexpressing YAP1NLS, SOD1NLS, and HSP30 was 5.1 g / L. It decreased greatly.
  • yeast strains with decreased xylonate accumulation increased metabolite production downstream of the Dahms pathway. That is, the EG production of the BD ⁇ BtT-E strain at 48 hours of culture was 1.5 g / L, whereas that of the YAP1NLS overexpressing strain was 2.2 g / L. Furthermore, the glycolate production of the BD ⁇ BtT-E strain after 96 hours of culture was 0.6 g / L, whereas the glycolate production of the SOD1NLS overexpressing strain and the HSP30 overexpressing strain was 1.1 g / L and 1.3 g / L, respectively. It was L.
  • a BD ⁇ BtT-kDbX strain was constructed by introducing ksaD derived from C. glutamicum and xylX derived from B. xenovorans, which are genes constituting the Weimberg pathway, into the iron metabolism-modified strain BD ⁇ BtT strain. Furthermore, a strain in which YAP1 and SOD1 were introduced into the BD ⁇ BtT-kDbX strain was constructed, respectively. The results of the culture test are shown in FIG.
  • the xylonate accumulation amount of the BD ⁇ BtT-kDbX strain was 6.0 g / L
  • the Xylonate accumulation amount of the BD ⁇ BtT-kDbX-YAP1NLS strain and the BD ⁇ BtT-kDbX-SOD1NLS strain was 4.9 g / L and 5.1 g / L, respectively. there were. Since it was confirmed that the accumulation of the intermediate product xylonate was reduced by imparting oxidative stress tolerance, it was shown that the strategy of imparting stress tolerance is also effective in the Weimberg pathway.
  • FIG. 12 shows the results of culturing using the BD ⁇ BtT-E-YAP1NLS strain under the conditions of no addition, cysteine 2 mM addition, reduced glutathione 2 mM addition, and cysteine and glutathione 2 mM addition.
  • the highest EG production of 2.6 g / L was achieved at 48 hours.
  • the EG production amount was 2.5 g / L after 72 hours
  • the EG production amount was 2.7 g / L after 96 hours.
  • the present inventors have developed an iron metabolism-modified yeast by destroying BOL2 and overexpressing tTYW1 in order to enhance the activity of the iron-sulfur protein XylD.
  • the cells were cultured under the control of dissolved oxygen concentration using a bioreactor, and the following findings were obtained. That is, (i) by controlling the dissolved oxygen, it is possible to switch the oxidation (3,4-dihydroxybutyric acid) reduction reaction (1,2,4-butantriol) from the aldehyde DHB (Fig. 7). ), (Ii) By keeping the dissolved oxygen concentration low, it is possible to reduce the accumulated amount of xylonate and improve the production amount of the target product (FIG. 8).
  • Yeast has Iron-sulfur clusuter (ISC) machinery; Fig. 13) in mitochondria and Cytosolic Iron-Sulfur-Protein assembly (CIA; Fig. 14) in cytosol as an iron-sulfur cluster synthesis mechanism.
  • ISC Iron-sulfur clusuter
  • CIA Cytosolic Iron-Sulfur-Protein assembly
  • ISC Iron-sulfur clusuter
  • CIA Cytosolic Iron-Sulfur-Protein assembly
  • the plasmid required for this test was constructed as follows.
  • PCR was performed using tef1pF and tef1pR and adh1tF and adh1tR to obtain the promoter sequence of TEF1 and the terminator sequence of ADH1. These gene fragments were infused into a vector obtained by cleaving pGK406 with XhoI and NotI to obtain pIU-tef1p-adh1t.
  • PCR was performed using prr14-1-F and prr14-1-R and prr14-2-F and prr14-2-R, and the PGK1 promoter and NcoI restriction enzyme sites with the XhoI sequence were added. A fragment of the PGK1 terminator was obtained.
  • pIU-x_pgk1p-pgk1t can be obtained. Obtained.
  • Upstream 500 bp and downstream 500 bp of the gene transfer site chrX2 were obtained by PCR using chrX2 up F and chrX2 up R, chrX2 down F and chrX2 down R.
  • PICas-chrX2 was prepared by incorporating these two DNA fragments into a DNA fragment PCR using pIU-tef1p-adh1t as a template and prrMEP-1-13-F and prrMEP-1-13-R.
  • ORFs of YAH1, ISD11, NFS1, YFH1, ARH1, MRS3, ACP1 and ISU1 were obtained from the genomic DNA of YPH499 by PCR, respectively.
  • the vector obtained by cleaving pICas-chrX2 with XhoI and NcoI is cleaved with pIL x_pgk1p-ACP1-pgk1t, pIL x_pgk1p-ARH1-pgk1t, PIL x_pgk1p-MRS3-pgk1t, and PIL x_pgk1p-NFS1-pgk1t.
  • pICas-chrX2-pgk1p-NFS1, pICas-chrX2-pgk1p-MRS3, pICas-chrX2-pgk1p-ARH1 and pICas-chrX2-pgk1p-ACP1 were obtained.
  • pICas-chrX2-tef1p-YFH1, pICas-chrX2-tef1p-YAH1, pICas-chrX2-tef1p-ISU1, and pICas-chrX2-tef1p-ISD11 were obtained.
  • the constructed plasmid is shown in the table below.
  • the yeast strain used in this test was constructed by the following method.
  • the chrX2 locus was cleaved by transforming pCL-Cas9 and pGK426-chrX2 using BD ⁇ BtT-kDbX as a host.
  • a gene fragment obtained by treating the pICas series vector with NheI was introduced. The strains thus obtained are shown in the table below.
  • YAH1, ISD11, NFS1, YFH1, ARH1, MRS3, ACP1, ISU1 Eight genes (YAH1, ISD11, NFS1, YFH1, ARH1, MRS3, ACP1, ISU1) were introduced into the BD ⁇ BtT-kDbX strain as a host and cultured in YPDX medium.
  • the amount of xylonate accumulated after 96 hours of the control strain BD ⁇ BtT-kDbX strain was 6.1 g / L (Fig. 15). It was suggested that the strains overexpressing YAH1 and ISD11 consumed almost no xylose and had some adverse effect on metabolism via the Weimberg pathway. In each strain into which the other 6 genes (NFS1, YFH1, ARH1, MRS3, ACP1, ISU1) were introduced, xylose was not detected in the sample after 96 hours.
  • the culture results of these 6 strains are shown in FIG.
  • the amount of xylonate accumulated in the NFS1 and YFH1 overexpressing strains was similar to that of the control BD ⁇ BtT-kDbX strain.
  • the amount of xylonate accumulated after 96 hours was 7.6 g / L.
  • the amount of xylonate accumulated after 96 hours was 5.6 g / L, 5.4 g / L and 5.1 g / L, respectively.
  • the amount of xylonate accumulated after 48 hours of culture was reduced.
  • the present invention it is possible to efficiently produce useful substances such as metabolites obtained from xylose using yeast. This makes it possible to efficiently produce various fuels and chemicals from cellulosic biomass that does not compete with food, and in the future, it will be possible to make a major shift from the product group currently manufactured from petroleum to bio-based products. It is possible.

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Abstract

本発明は、酵母を用いてより効率よく有用物質を生産することができる新規の方法を提供することを目的とする。本発明は、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する、少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現し、キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチドが導入された組換え宿主細胞を、含硫化合物を含む培地中で培養することを特徴とする、キシロース代謝物質の製造方法である。また、上記組換え宿主細胞に酸化ストレス耐性を付与する分子をコードするポリヌクレオチドが導入されていることが好ましい。

Description

改良型鉄代謝工学による新規キシロース代謝系を介した有用物質の製造方法
　本発明は、キシロース代謝物質の製造方法に関する。
　近年、環境負荷への懸念から、化石資源から物質を生産するプロセスに代わり、木質系バイオマスから微生物を用いて有用物質を生産するプロセスが大きな注目を浴びている。木質系バイオマスには、微生物の発酵原料となるグルコースとキシロースが多く含まれており、このような木質系バイオマスから微生物を用いて生産されることが期待される有用物質候補は多数ある。例えば、1,2,4-Butanetiol(BT)、3-hydroxybutyrolactone（3-HBL）、Ethylene glycol、Glycolate、α-ketoglutarate(AKG)等が挙げられる。
　1,2,4-ブタントリオール（1,2,4-Butanetriol(BT)）は、様々な医薬品や化成品の原料として利用できる（非特許文献１、非特許文献２）。また、BTをニトロ化することで、エネルギー物質である1,2,4-ブタントリオールトリナイトレート（BTTN）となる。BTTNはロケットの推進剤（プロペランロト）や、ニトログリセリンの代替品として利用できる。しかし、BTTNはニトログリセリンより、衝撃に対して安定、凝固点が低い、揮発性が低い、熱安定性が高いなどより優れた性能を持っている（非特許文献３）。しかしながら、BTは、石油由来のマレイン酸エステルから生産されているが、高温高圧の反応条件、副生成物が多量に生成する、また高価な触媒が必要であることなど課題が多い。これらを解決するため、近年バイオマス原料に含まれるキシロースから大腸菌を宿主としたBTの生産報告例が多数あり、また発明者らによって酵母を用いたBT生産方法も開発された（非特許文献４非特許文献５）。その生産量は最大で10g/Lのキシロースから1.7g/L（収率24.5%）であり、商業化へ向けては未だ生産量は低い。
　3-ヒドロキシブチロラクトン（3-hydroxybutyrolactone（3-HBL））は、医薬品や溶剤、ポリマー原料など幅広い用途がある化合物であり、1kgあたり450ドルの市場価格を有している。工業的には、リンゴ酸を高温でルテニウムと反応させることで合成されるが、高圧の反応条件や高価な触媒の利用など問題点が多い。また、米国エネルギー省（DOE）もバイオマスから合成する際の最も価値の高い化合物の一つとして列挙している有用な化合物であるため（非特許文献６）、バイオマス原料からの製造法開発に関する研究も行われている。しかしながら、このような大きな注目を浴びている化合物にも関わらず、DOEのレポートで挙げられた化合物のうち、未だ商業化の目処が立っていない数少ない化合物の１つとなっている。微生物による発酵生産では、大腸菌を宿主にグルコースから合成されるアセチルCoAとグリコリルCoAを縮合することで、3-HBLおよびその前駆体である3,4-ヒドロキシ酪酸（3,4-DHBA）を生産可能である。この方法では、反応経路が非常に複雑であり、また反応経路を構成する酵素の特異性も低いことため、生産量や収率が低いことが課題である。また、大腸菌を宿主にキシロースからの3,4-DHBA生産報告があるが（非特許文献７）、その生産量は非常に低い（20g/Lのキシロースから1.27g/Lの3,4-DHBA）。商業的に優れた特性を持ちバイオマスからの生産に適しているとされている酵母を宿主とした生産報告例はない。
　エチレングリコール（Ethylene glycol）は、自動車用の不凍液や代表的なプラスチックであるポリエチレンテレフタラートの原料として現在約2800万トン製造されている化合物である（非特許文献８）。特に、PET需要の増大から、今後20年でその生産量は倍増すると予測されている（非特許文献８）。しかしながら、EGは現在石油から得られるエチレンを原料に生産されている。この方法では原料である現在のエチレン価格の変動に大きな影響を受けることが課題として挙げられる。また、微生物によって生産されたバイオエタノールをエチレングリコールへ変換する方法に代表される、いくつかバイオマスを原料とした生産方法も開発されている。しかしながら、これらの方法は、高温高圧の反応条件を有し、多量の副生成物が発生する。そのため、バイオマス原料に含まれる糖類から微生物を用いてEGを生産する方法が開発されている。そのため、バイオマス原料から微生物を用いた持続可能なEGの発酵生産技術の開発が求められている。大腸菌や酵母を用いたキシロースからの製造方法もいくつか報告されている（特許文献１、特許文献２、非特許文献９、非特許文献１０）。特に、酵母を宿主としてDahms pathway（後述）を介した際には、20g/Lのキシロースからわずか14 mg/Lという非常に低い生産量に留まっている（非特許文献１１）。
　グリコール酸（Glycolate）は年平均成長率が11.3%、年間1億6000万ドルの市場を有している重要な化合物である。グリコール酸（Glycolate）は、接着剤、金属洗浄剤、染料添加剤スキンケアやヘアケア製品の原料として用いられているほか、そのガスバリア性の高さからポリグリコール酸（PLGA）やポリ乳酸グリコール酸などのポリマー原料としても年々需要が高まっている化合物である（非特許文献８）。クロロ酢酸やヒドロキシアセトニトリルの加水分解によるグリコール酸の製造法では、カルボン酸類やアルコール類の副産物が生成するためグリコール酸の純度が低く、環境負荷が大きいことが懸念されている（非特許文献１２）。そのため、バイオマス原料から微生物を用いた持続可能なグリコール酸の発酵生産技術の開発が求められている。大腸菌や酵母を用いたキシロースからの製造方法もいくつか報告されている（特許文献１、非特許文献１３、非特許文献１４）。特に、本発明における酵母を宿主とし、キシロース代謝経路であるDahms pathway（後述）を介した GA生産量は20g/Lのキシロースから1g/L程度であると報告されており、商業化に向けては未だ低い生産量である（非特許文献１１）。
　α-ケトグルタル酸（α-ketoglutarate(AKG)）は、細胞内の重要な代謝物質の一つであり、酵母のバイオマス形成に重要な役割を果たす。AKGは、栄養補助食品や医薬品の原料として用いられる。バイオマスから微生物を用いた発酵生産プロセスにおいて、AKGは様々な化合物へと変換可能である優れた出発物質となる。具体的には、エチレン、コハク酸、イタコン酸、更にはナイロンの原料であるアジピン酸、ヘキサメチレンジアミン、ε-カプロラクタム、ポリグルタミン酸生合成の前駆体として用いられる産業上非常に重要な化合物である（非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）。現行のAKG生産プロセスでは、コハク酸やシュウ酸ジエステルから製造されているが、シアン化合物の使用、収率が75%と低く、また副生成物が多量にできることが課題である。そのため、微生物を用いた環境負荷の少ない製造法が強く求められている（非特許文献１８）。
　ここで、木質系バイオマスから微生物を用いて有用物質を生産するプロセスにおいては、共通する課題がある。即ち、木質系バイオマスには微生物の発酵原料としてグルコースとキシロースが含まれるが、酵母はキシロースを変換する能力を持たない。そこで、酵母にキシロース代謝経路を導入し、キシロース変換能を付与する研究が行われてきた。従来は、このキシロース代謝経路として、XI経路やXDH経路が主に導入されてきた。これらの経路は、キシロースをキシルロースに変換した後、キシルロースリン酸化酵素により、キシルロースをキシルロース５リン酸へ変換する。変換されたキシルロース５リン酸は、ペントースリン酸経路を介することで酵母の主要代謝物質へと変換される。この従来のキシロース代謝経路は、主要代謝経路の複雑な制御機構の影響を受け、また解糖系を介することから目的生産物質の収率が低いという問題があった（非特許文献１９）。
　そのような中、新規キシロース同化経路が注目されている。この新規キシロース同化経路では、まずxylose dehydrogenaseによりキシロースをキシロノラクトンへと変換し、キシロノラクトンはlactonaseによりキシロネートへと変換される。キシロネートはxylonate dehydrataseにより2-ケト-3-デオキシ-キシロネート（KDX）へと変換される。これはxylose oxidative(XO)経路と総称される代謝経路であるが、KDXより下流の代謝経路の違いにより、キシロースを５段階の反応でα-ケトグルタル酸へと変換するヴァインベルク経路（Weimberg pathway）、キシロースを４段階の反応でピルビン酸とグリコアルデヒドへと変換するダームス経路（Dahms pathway）等がある。これらの経路には、従来のXR経路やXI経路と比較して、いくつかの利点を有している。糖を変換する際にATPを必要としないこと、解糖系やペントースリン酸経路などの主要代謝経路を介することないため、少ない反応数で脱炭酸反応によって収率を低下させること無く目的物質へと変換可能であることなどが挙げられる（非特許文献１９、非特許文献２０）。そこで、これらの新規キシロース同化経路とその改変経路を酵母へ導入して有用化合物を生産する方法がいくつか報告されている（特許文献３、非特許文献５、非特許文献１１及び非特許文献２１）。しかし、これらの方法では、有用化合物の生産量や対糖収率はまだ十分高いとは言えない状況である。また、酵母へ新規キシロース同化経路を導入した際の重要な課題である、培地中への中間生成物（キシロネート）の蓄積が報告されている。これが、酵母へ新規キシロース同化経路を導入した際に目的物質の生産収率が著しく低い主な原因であると考えられている。
国際公開公報２０１４／１６２０６３号 国際公開公報２０１７／１５６１６６号 国際公開公報２０１９／１５９８３１号
Journal of Bioscience and Bioengineering, 103, Issue 5, 494-496, 2007 Macromolecules, 41, 17, 6347-6352, 2008 Journal of Molecular Modeling, 23, Article number:246, 2017 Bioresource Technology, 250, 406-412, 2017 Metabolic Engineering, 56, 17-27, 2019 Top Value Added Chemicals from Biomass, Vol.I, Results of Screening for Potential Candidates from Sugars and Synthesis Gas, DOE/GO-102004-1992, 15008859, 2004 Metabolic Engineering, 41, 39-45, 2017 Applied Microbiology and Biotechnology, vol.103, 2525-2535, 2019 Metabolic Engineering, 51, 20-31, 2018 AIChE Journal, 64(12), 4193-4200, 2018 Applied Microbiology and Biotechnology, 101(22), 8151-8163, 2017 Bioresource Technology, 268, 402-407, 2018 Metabolic Engineering, 46, 28-34, 2018 Microbial Cell Factories, 12, Article number 82, 2013 Bioresource Technology, 114, 597-602, 2012 Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 7, 476, 2020 Metabolic Engineering, 41, 82-91, 2017 Bioresource Technology, 114, 597-602, 2012 Nature Communications, 11(1), 1098, 2020 ACS Synthetic Biology, 7(1), 24-29, 2018 Metabolic Engineering, 55, 1-11, 2019
　このような状況の中、本発明は、酵母を用いてより効率よく有用物質を生産することができる新規の方法を提供することを目的とする。
　上述のとおり、新規キシロース同化経路とその改変経路を酵母へ導入し、有用化合物を生産しようとする研究が行われている。この新規キシロース同化経路の律速段階の反応は、キシロネートからKDXへの反応であることが知られている。この原因として、当該反応を触媒するキシロネートデヒドラターゼ（XylD）の酵素活性が非常に低いことが挙げられる（非特許文献１９）。XylDの活性が低いことが原因で、培地中にキシロネートが多量に蓄積することが、新規キシロース同化経路を構築する上での最も重要な課題の１つであった。酵母を宿主微生物とした場合にも、キシロネートを-ケト-3-デオキシ-キシロネート（KDX）へと変換する酵素XylDの活性が非常に低いことが、本発明者らの研究により明らかにされてきた。このXylDは鉄硫黄タンパク質であり、原核生物由来の鉄硫黄タンパク質は酵母での機能発現が非常に困難であることによると考えられる。本発明者らは、これを解決するための方法として、FRA2(BOL2)遺伝子を破壊することにより酵母内でのXylDの活性を強化し、導入したXO代謝経路を機能させて代謝物を得る方法を開発した（国際公開公報２０１４／１６２０６３号、Applied Microbiology and Biotechnology, vol.101, 8151-8163, 2017及びMetabolic Engineering, vol.55, 1-11, 2019参照）。この方法によると、改変前と比較してXylD活性を5.9倍に向上させることができた（PCT/JP2019/004582）。しかしながら、この「鉄代謝工学技術」を施した酵母株においても、多量のキシロネートが培地中に放出され、目的生産物質の収率低下の主要な原因となっていた。本研究では、この「鉄代謝工学技術」を更に発展させることで、培地中のキシロネート蓄積量の更なる減少、それに伴う目的生産物質の生産量向上を目指した。そこで、鉄代謝工学が施された鉄代謝改変株の解析およびその応用へ向けた実験を行った。その結果、鉄代謝改変株において含硫化合物であるシステイン、グルタチオン等を添加することで、XylDの反応を介するキシロース代謝経路の下流の代謝物（BT、3,4-DHBA、EG等）の生産効率を顕著に増加させることができることを見出した。また、酵母に酸化ストレス耐性を付与すること、即ち、YAP1やSOD１に核移行シグナルを付与し発現させること、又は熱ショックタンパク質HSP30を発現させること等により、キシロネート（Xylonate）の蓄積量を減少させ、且つ目的の有用物質の生産量を増加させることに成功し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］鉄硫黄クラスターの生合成を制御する、少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現し、キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチドが導入された組換え宿主細胞を、含硫化合物を含む培地中で培養することを特徴とする、キシロース代謝物質の製造方法。
［２］上記鉄硫黄クラスターの生合成を制御するタンパク質が、Tyw1、MRS3、ACP1及びISU1から成る群より選択される少なくとも１種である、［１］に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［３］上記組換え宿主細胞においてBOL2が欠損している、［１］又は［２］に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［４］上記キシロース代謝経路が、XO経路（キシロース・オキシダティブ経路；xylose oxidative pathway）である、［１］から［３］のいずれかに記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［５］上記キシロース代謝経路が、ダームス経路、ヴァインベルク経路又はこれらの改変経路である、［１］から［４］のいずれかに記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［６］上記キシロース代謝経路がダームス経路であり、上記キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群が、キシロースデヒドロゲナーゼ（XylB）、キシロネートデヒドラターゼ（XylD）、及びアルドラーゼである、［１］から［５］のいずれかに記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［７］上記キシロース代謝経路がヴァインベルク経路であり、上記キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群が、キシロースデヒドロゲナーゼ（XylB）、キシロネートデヒドラターゼ（XylD）、２－ケト－３－デオキシ－キシロネートデヒドラターゼ（XylX）及び２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（XylA）である、［１］から［５］のいずれかに記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［８］上記キシロース代謝経路がダームス経路又はヴァインベルク経路の改変経路であり、上記キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群が、キシロースデヒドロゲナーゼ（XylB）、キシロネートデヒドラターゼ（XylD）、２－ケト酸デカルボキシラーゼ（KDC）である、［１］から［５］のいずれかに記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［９］上記キシロース代謝経路がダームス経路又はヴァインベルク経路の改変経路であり、上記キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群が、キシロースデヒドロゲナーゼ（XylB）、キシロネートデヒドラターゼ（XylD）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALD）である、［１］から［５］のいずれかに記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［１０］上記組換え宿主細胞において、酸化ストレス耐性を付与する分子をコードするポリヌクレオチドが導入されている、［１］から［９］のいずれかに記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［１１］上記酸化ストレス耐性を付与する分子が、YAP1、SOD1、CTT1及びHSP30からなる群より選択される少なくとも１種である、［１０］に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［１２］上記宿主細胞が、酵母宿主細胞である、［１］から［１１］のいずれかに記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［１３］上記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ブレタノミセス属（Brettanomyces）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、カンジタ属（Candida）、クロッケラ属（Klocckera）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、ヤロウイア属（Yarrowia）、イサトケンキア属（Issatchenkia）、スワニオミセス属（Schwanniomyces）、トリコスポロン（Trichosporon）属、ヤマダジマ属（Yamadazyma）、及びパチソレン属（Pachysolen）からなる群より選択される、少なくとも１種の酵母細胞である、［１２］に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［１４］上記キシロース代謝物質が、エチレングリコール、グリコール酸、２－ケトグルタル酸、１，２，４－ブタントリオール、３，４－ジヒドロキシ酪酸、及び３－ヒドロキシブチロラクトンからなる群より選択される、少なくとも１種である、［１］から［１３］のいずれかに記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［１５］上記含硫化合物が、システイン、γ－グルタミルシステイン、及び還元型グルタチオンからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］から［１４］のいずれかに記載のキシロース代謝物質の製造方法。
［１６］鉄硫黄クラスターの生合成を制御する、少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現し、キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチドが導入された組換え宿主細胞を培養する工程を含む、キシロース代謝物質の製造方法であって、上記組換え宿主細胞に酸化ストレス耐性を付与する分子をコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする、キシロース代謝物質の製造方法。
　本発明のキシロース代謝物質の製造方法によると、酵母を用いてより効率よく有用物質を生産することができる。
図１は、キシロース代謝経路のうちの、ヴァインベルク経路（Weimberg Pathway）を示す図である。 図２は、キシロース代謝経路のうちの、ダームス経路（Dahms Pathway）を示す図である。 図３は、キシロース代謝経路のうちの、BT/3,4-DHBA合成経路を示す図である。 図４は、培養24時間後のBD株と鉄代謝改変株BDΔBtT株の細胞内含硫化合物の蓄積量を比較した結果を示す図である。 図５は、クエン酸鉄、システイン添加時のBT生産株BDδK6035株によるBT生産量を示す図である。 図６は、BDδK603ΔADH6-yneI株による3,4-DHBA生産量を示す図（Ａ）、及びシステイン、還元型グルタチオン添加時のBDδK603ΔADH6-yneI株による3,4-DHBA生産量を示す図（Ｂ）である。 図７は、BT生産酵母を用いてFed-batch培養を行った結果を示す図である。 図８は、3,4-DHBA生産酵母を用いてFed-batch培養を行った結果を示す図である。 図９は、BDΔBtT-E株によるキシロース代謝物質生産におけるシステイン、還元型グルタチオン（GSH）、酸化型グルタチオン（GSSG）の添加の効果を示す図である。 図１０は、ダームス経路を導入したBDΔBtT-E株によるキシロース代謝物質生産おけるYAP1、SOD1過剰発現の効果を示す図である。 図１１は、ヴァインベルク経路を導入したBDΔBtT-E株によるキシロース代謝物質生産おけるYAP1、SOD1過剰発現の効果を示す図である。 図１２は、BDΔBtT-E-YAP1NLS株によるEG生産におけるシステイン、還元型グルタチオン（GSH）の添加の効果を示す図である。 図１３は、酵母のミトコンドリアにおける鉄硫黄クラスター合成機構を示す図である。 図１４は、酵母の細胞質における鉄硫黄クラスター合成機構を示す図である。 図１５は、鉄硫黄クラスター合成機構に関わる遺伝子を過剰発現させた際のキシロネート蓄積量の変化を示す図である。
　以下、本発明のキシロース代謝物質の製造方法について詳細に説明する。なお、本明細書において、DNAやベクターの調製等の分子生物学的手法は、特に明記しない限り、当業者に公知の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。また、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。
＜キシロース代謝物質の製造方法＞
　本発明のキシロース代謝物質の製造方法は、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する、少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現等させた、キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチドが導入された組換え宿主細胞を、含硫化合物を含む培地中で培養することを特徴とする。ここで、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する、少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現等させた、キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチドが導入された組換え宿主細胞は、鉄代謝改変細胞ということもできる。
　また、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する、少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現し、キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチドが導入された組換え宿主細胞を培養する工程を含む、キシロース代謝物質の製造方法であって、上記組換え宿主細胞に酸化ストレス耐性を付与する分子をコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする、キシロース代謝物質の製造方法も本発明に含まれる。即ち、本発明は、鉄代謝改変細胞に、酸化ストレス耐性を付与する分子をコードするポリヌクレオチドを導入した細胞を培養する工程を含むことを特徴とする方法であるということもできる。
　鉄硫黄クラスターの生合成を制御する、少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現し、キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチドが導入された組換え宿主細胞に、さらに酸化ストレス耐性を付与する分子をコードするポリヌクレオチドを導入し、この細胞を、含硫化合物を含む培地中で培養する工程を含むことを特徴とするキシロース代謝物質の製造方法は、本発明としてより好ましいものである。
　以下に本発明のキシロース代謝物質の製造方法をより詳細に説明する。
＜組換え宿主細胞＞
　本発明の組換え宿主細胞は、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた組換え宿主細胞において、キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチドが導入された組換え宿主細胞である。さらに、酸化ストレス耐性を付与する分子をコードするポリヌクレオチドを導入した組換え宿主細胞も、本発明における組換え宿主細胞に含まれる。
（宿主細胞）
　本発明に用いる宿主細胞の種類は、当業者にとって周知の宿主細胞のいずれでもよく、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、菌類細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞が含まれる。
　これらのうち、本発明における宿主細胞としては、増殖が早く、発酵阻害物や弱酸による低ｐＨ等の種々のストレスに耐性があり、遺伝子組換えも容易であることから、酵母細胞が好ましい。酵母細胞としては、例えば、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ブレタノミセス属（Brettanomyces）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、カンジタ属（Candida）、クロッケラ属（Klocckera）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、ヤロウイア属（Yarrowia）、イサトケンキア属（Issatchenkia）、スワニオミセス属（Schwanniomyces）、トリコスポロン（Trichosporon）属、ヤマダジマ属（Yamadazyma）、パチソレン属（Pachysolen）等が挙げられる。これらのうち、サッカロミセス属（Saccharomyces）であることがより好ましく、具体的には、例えばYPH499株、S288C株、YPH500株、BY4741株、BY4742株、W303株、CEN.PK株、BY4743株、FY4株、AB972株、A364A株、DC5株、X2180-1A株、D-273-10B株、FL100株、JK9-3d株、RM11-1a株、SEY6210株、SEY6211株、Sigma1278b株、SK1株、XJ24-24a株、Y55株、YPH501株等を用いることができる。中でも、YPH499株、S288C株、YPH500株、BY4741株、BY4742株、W303株、CEN.PK株がさらに好ましく、YPH499株が特に好ましい。
　本発明において「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸及び複数の核酸の両方を意味し、mRNA等の核酸分子、プラスミドRNA、全長のcDNA及びその断片等を含む。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドから構成され、修飾、非修飾のどちらでもよい。一本鎖でも二本鎖でもよく、両者の混合でもよい。
（異種）
　本発明において、「異種由来の酵素」等に用いられる「異種」とは、本発明の組換え宿主細胞とは異なる種であることを言い、例えば本発明の組換え宿主細胞が酵母細胞である場合、異種としては、大腸菌、緑膿菌等のバクテリア等が挙げられる。また、対応する天然遺伝子とは異なる形態で宿主細胞中に再導入された天然コード領域又はその一部も含む。例えば、ゲノム中のその天然位置にはないものも含まれる。なお、本発明の組換え宿主細胞において異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチドを導入する目的は、元来その宿主細胞が有していない酵素等のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを異種から導入し、キシロース代謝経路等の代謝経路を機能させ及び／又は亢進させることである。
（ポリヌクレオチドの導入方法）
　細胞に異種ポリヌクレオチドを発現させるには、例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させればよい。発現ベクターは、本発明の遺伝子を発現可能な状態で含むものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。
　本発明の発現ベクターは、上記異種ポリヌクレオチドの上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することにより作製することができる。あるいは、発現ベクターに転写プロモーター及び／又はターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーター及び／又はターミネーターを利用して、その間に当該異種ポリヌクレオチドを挿入すればよい。
　ベクターに上記異種ポリヌクレオチドを挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、SD配列やKozak配列等のリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入することもできる。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。
　本発明において使用されるベクターは、本発明の遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNA等が挙げられる。
　宿主への発現ベクターの導入方法は、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではない。利用可能な方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。組換え宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの発現は、当業者に公知の方法に従って定量化することができる。例えば、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの、細胞タンパク質全体のパーセントによって表すことができる。また、形質転換した細胞の細胞抽出液を用い、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出できる抗体を使用したウエスタンブロッティング、あるいは当該ポリヌクレオチドを特異的に検出するプライマーを使用したリアルタイムPCR等により確認することができる。
（鉄硫黄クラスター）
　本発明において、「鉄硫黄クラスター」とは、非ヘム鉄と無機硫黄原子からなるコファクターのことを言い、一般的には［2Fe-2S］、［4Fe-4S］、［3Fe-4S］の形でタンパク質内部のシステインなどの含硫アミノ酸残基に配位結合している。鉄硫黄タンパク質（Fe-Sタンパク質）の種類により要求する鉄硫黄（Fe-S）クラスターは異なる。
（鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチド）
　本発明の組換え宿主細胞は、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた細胞である。「鉄硫黄クラスターの生合成を制御するタンパク質」としては、鉄硫黄クラスターの合成を制御するタンパク質、細胞内で鉄硫黄クラスターの運搬に関与しているタンパク質、鉄の感知・取り込み・利用を制御するタンパク質等のいずれであってもよく、最終的に鉄硫黄クラスターの生合成に影響を与えるタンパク質であれば特に限定されない。ここで、鉄の感知・取り込み・利用を制御するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、鉄の代謝に関与する遺伝子群である鉄（Fe）レギュロンに含まれる遺伝子であってもよい。
　本発明において、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質としては、細胞内での鉄硫黄（Fe-S）クラスターの貯蔵に関与するタンパク質であるTYW1が好ましい。このTYW1をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において過剰発現させることにより、鉄の細胞内への取り込みが促進され、鉄硫黄クラスターが充分に供給されることにより鉄硫黄タンパク質であるXylD等の活性を向上させることができると考えられる。典型的なTYW1タンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、本願実施例で用いたもの等が挙げられる。なお、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、TYW1タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、酵母内でのXylDの活性向上効果の観点から、配列番号１及び２のポリヌクレオチドが好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、かつTYW1活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
　本発明において、宿主細胞に過剰発現させる、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質としては、ミトコンドリアにおける鉄硫黄クラスター生合成に関与するYAH1、ISD11、NFS1、YFH1、ARH1、MRS3、ACP1及びISU1なども挙げられる。典型的なYAH1、ISD11、NFS1、YFH1、ARH1、MRS3、ACP1、ISU1のタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、本願実施例で用いたもの等が挙げられる。なお、本発明の宿主細胞に過剰発現させる鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、YAH1、ISD11、NFS1、YFH1、ARH1、MRS3、ACP1、ISU1をコードするポリヌクレオチド、又は同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、それぞれ配列番号６５～７２のポリヌクレオチドが好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、かつそれぞれの酵素活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
　本発明において、宿主細胞に過剰発現させる、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質としては、宿主細胞による有用物質の生産性向上の観点から、ミトコンドリアにおける鉄硫黄クラスター生合成に関与する遺伝子のうち、MRS3、ACP1、ISU1が好ましく、ISU1がより好ましい。
　本発明において「過剰発現」という用語は、本明細書で使用される場合、同一又は関連のポリヌクレオチド若しくは遺伝子の内因性発現よりも高い発現を指す。また、異種ポリヌクレオチド又は遺伝子は、同等の内因性遺伝子の発現よりもその発現が高ければ、あるいは、ポリヌクレオチド又は遺伝子を過剰発現しない手段によって導入された同じポリヌクレオチド又は遺伝子の発現よりもその発現が高ければ、過剰発現に該当する。宿主細胞においてポリヌクレオチドのコピー数を増大させる任意の手段を使用してポリヌクレオチドを過剰発現させることができる。例えば、高コピー数プラスミド、又は制御可能なコピー数を有するプラスミドを使用してもよいし、多数の染色体組込みによって過剰発現としてもよい。
　細胞にポリヌクレオチドを過剰発現させるには、例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させればよい。方法の詳細は、上述の「ポリヌクレオチドの導入方法」の項を参照されたい。なお、比較に用いる過剰発現させない細胞は、形質転換させなくてもよいし、当該ポリヌクレオチドを含まない発現ベクターで形質転換させてもよい。組換え宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの発現又は過剰発現は、当業者に公知の方法に従って定量化することができる。例えば、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの、細胞タンパク質全体のパーセントによって表すことができる。また、形質転換した細胞の細胞抽出液を用い、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出できる抗体を使用したウエスタンブロッティング、あるいは当該ポリヌクレオチドを特異的に検出するプライマーを使用したリアルタイムPCR等により確認することができる。過剰発現させなかった細胞と比較して、過剰発現させた細胞で当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの発現量が多いこと、好ましくは２倍以上になっていることを確認すること等により、過剰発現されたと判断することができる。
　本発明の組換え宿主細胞は、転写抑制因子BOL2を欠損していることが好ましい。本発明の組換え宿主細胞は、転写抑制因子BOL2を欠損させることにより、鉄代謝が改善される。具体的には、BOL2の不在によりAft1によって転写が調節される鉄代謝に関わる遺伝子の発現が促進される。その結果、細胞内への鉄イオンの取り込みが促進され、鉄硫黄クラスターが充分に供給されることにより鉄硫黄タンパク質であるXylD等の活性を向上させることができると考えられる。
　宿主細胞において転写抑制因子BOL2を欠損させる方法としては、当業者に公知の遺伝子欠損方法を使用することができ、その方法は限定されるものではない。例えば、紫外線等の光又は化学物質を用いて突然変異を誘発し、得られた突然変異体から目的遺伝子が欠損した菌株を選別することができる。また、上記遺伝子欠損は、例えば、目的遺伝子と相同性があるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列又はベクターを宿主細胞に導入して相同組換え（homologous recombination）を起こさせることによっても得られる。また、上記注入されるヌクレオチド配列又はベクターには優性選別マーカーを含むことができる。使用可能なベクターは、特に限定されるものではなく公知の発現ベクターを使用することができる。
（キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチド）
　本発明の組換え宿主細胞には、キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチドが導入されている。キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群を宿主細胞に導入することにより、元来この宿主細胞が備えていない代謝経路が働くようになり、所望の物質生産が可能となる。以下に、キシロース代謝経路、キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチドについて説明する。
（キシロース代謝経路）
　本発明において、「キシロース代謝経路」とは、キシロースからエチレングリコール、グリコール酸、グリオキシル酸、ピルビン酸、２－ケトグルタル酸、コハク酸、エタノール、キシリトール、Ｄ－キシロネート、Ｄ－１，２，４－ブタントリオール（Ｄ－ＢＴ）、３，４－ジヒドロキシ酪酸、１，４－ブタンジオール、メサコネート等を生産する経路をいい、例えば、XO経路、Dahms／Weinberg経路として知られている経路、XR/XDH経路、XI経路、これらの経路を工業的に利用できるように改変した経路等も含まれる。好ましくは、Ｄ－キシロースからエチレングリコール、グリコール酸、グリオキシル酸、ピルビン酸、２－ケトグルタル酸、コハク酸、３，４－ジヒドロキシ酪酸等を生産するための酵素経路を指す。
　本発明において、宿主に導入するキシロース代謝経路としては、少ない反応数で２－ケトグルタル酸やピルビン酸、グリオキシル酸等の細胞内の重要な代謝物へ変換できる点、また解糖系の脱炭酸反応を介さないことから対糖収率１００％で変換可能であり、エネルギーを必要とするリン酸化反応もない点等から、XO経路、ヴァインベルク経路（Weinberg Pathway；図１）、ダームス経路（Dahms pathway；図２）として知られている経路、これらを改変した経路（BT合成経路、3,4-DHBA合成経路等；図３）が好ましい。
（ヴァインベルク経路（Weinberg Pathway）の場合）
　本発明において、宿主細胞に異種由来のヴァインベルク経路を導入する場合には、ヴァインベルク経路に関与する酵素として、キシロースデヒドロゲナーゼ（XylB）、キシロネートデヒドラターゼ（XylD）、２－ケト－３－デオキシ－キシロネートデヒドラターゼ（XylX）及び２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（XylA、KsaD）を発現させる。必要に応じて、キシロノラクトン　ラクトナーゼ（XylC）を発現させることが好ましい。
（ダームス経路（Dahms pathway）の場合）
　本発明において、宿主細胞に異種由来のダームス経路を導入する場合には、ダームス経路に関与する酵素として、異種由来のキシロースデヒドロゲナーゼ（XylB）、キシロネートデヒドラターゼ（XylD）及び２－ケト３－デオキシキシロネートアルドラーゼ（YagE、YjhH）を発現させる。必要に応じて、キシロノラクトン　ラクトナーゼ（XylC）を発現させることが好ましい。
（ブタントリオール（BT）合成経路の場合）
　本発明において、宿主細胞に異種由来のブタントリオール合成経路を導入する場合には、キシロースデヒドロゲナーゼ（XylB）、キシロネートデヒドラターゼ（XylD）及び２－ケト酸デカルボキシラーゼ（KDC）を発現させる。必要に応じて、アルデヒドレダクターゼ（ALR）を発現させることが好ましい。また、補酵素バランスの改善のため、NADHリン酸化酵素（POS５など）を発現させることが好ましい。必要に応じて、キシロノラクトン　ラクトナーゼ（XylC）を発現させることが好ましい。
（3,4-ジヒドロキシ酪酸（3,4-DHBA）合成経路の場合）
　本発明において、宿主細胞に異種由来の３，４－DHBA合成経路を導入する場合には、キシロースデヒドロゲナーゼ（XylB）、キシロネートデヒドラターゼ（XylD）及び２－ケト酸デカルボキシラーゼ（KDC）を発現させる。さらに、DHBから3,4-DHBAへの反応を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（yneI、yqhD、ALD2、ALD3又はUGA2）を発現させる。また、ADH6は破壊することが好ましい。必要に応じて、キシロノラクトン　ラクトナーゼ（XylC）を発現させることが好ましい。
（XylD）
　XylDタンパク質（ペプチド）は鉄硫黄タンパク質（Fe-Sタンパク質）であり、典型的なXylDタンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、本願実施例で用いたもの等が挙げられる。なお、XylDタンパク質（ペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、XylDタンパク質（ペプチド）をコードするポリヌクレオチド、又は同等の機能を有するタンパク質（ペプチド）をコードするポリヌクレオチドであり、配列番号３のポリヌクレオチドが特に好ましい。XylDタンパク質（ペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、上記特定の配列に対して、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、かつXylD活性（キシロネートデヒドラターゼ活性）を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
（XylB）
　典型的なキシロースデヒドロゲナーゼタンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、本願実施例において用いたもの等が挙げられる。なお、キシロースデヒドロゲナーゼタンパク質としては、キシロースデヒドロゲナーゼタンパク質（ペプチド）をコードするポリヌクレオチド、又は同等の機能を有するタンパク質（ペプチド）をコードするポリヌクレオチドであり、組換え宿主細胞での有用物質産生を効率的に向上させる効果の観点から、配列番号４のポリヌクレオチドがコードするものが特に好ましい（XylB）。上記特定の配列に対して、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
（XylX）
　本発明におけるXylXは、２－ケト－３－デオキシ－キシロネートデヒドラターゼであり、典型的な２－ケト－３－デオキシ－キシロネートデヒドラターゼタンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、本願実施例で用いたもの等が挙げられる。
　なお、本発明におけるXylXとしての２－ケト－３－デオキシ－キシロネートデヒドラターゼタンパク質としては、２－ケト－３－デオキシ－キシロネートデヒドラターゼタンパク質（ペプチド）をコードするポリヌクレオチド、又は同等の機能を有するタンパク質（ペプチド）をコードするポリヌクレオチドであり、配列番号５～１０のポリヌクレオチドがコードするものが具体的に挙げられ、組換え宿主細胞での有用物質産生や細胞増殖を効率的に向上させる効果の観点から、配列番号６、９、１０のポリヌクレオチドがコードするものが特に好ましい（XylX）。上記特定の配列に対して、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、２－ケト－３－デオキシ－キシロネートデヒドラターゼ活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
（XylA;KsaD）
　本発明におけるXylA及びKsaDは、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、典型的な２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼタンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、本願実施例で用いたもの等が挙げられる。
　なお、本発明におけるXylA及びKsaDとしての２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼタンパク質としては、それぞれ配列番号１１、１２のポリヌクレオチドがコードするものが挙げられ、組換え宿主細胞での有用物質産生を効率的に向上させる効果の観点から、特に配列番号１２のポリヌクレオチドがコードするものが特に好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
（アルドラーゼ）
　アルドラーゼタンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、組換え宿主細胞での有用物質産生を効率的に向上させる効果の観点から、配列番号１３のポリヌクレオチドがコードするもの（YagE）、配列番号１４のポリヌクレオチドがコードするもの（yjhH）が好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、アルドラーゼ活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
（２－ケト酸デカルボキシラーゼ；KDC、KdcA）
　本発明におけるKDC（KdcA）は、２－ケト酸デカルボキシラーゼであり、典型的な２－ケト酸デカルボキシラーゼタンパク（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、本実施例で用いたものが挙げられる。
　なお、本発明におけるKDC（KdcA）としては、組換え宿主細胞での有用物質産生を効率的に向上させる効果の観点から、特に配列番号１５のポリヌクレオチドがコードするものが特に好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、２－ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
（DHBから3,4-DHBAへの反応を触媒する酵素;アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALD））
　本発明において、組換え宿主細胞にDHBから3,4-DHBAへの反応を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALD）を発現させることで、有用物質である3,4-DHBAの生産が可能となる。このような酵素の候補としては、例えば、コハク酸デヒドロゲナーゼであるyneI（E.coli由来）やUGA2（S.cerevisiae由来）、あるいはアルデヒドデヒドロゲナーゼであるyqhD（E.coli由来）、ALD2（S.cerevisiae由来）、ALD3（S.cerevisiae由来）等が挙げられる。組換え宿主細胞での3,4-DHBAの生産の効率の観点から、yneI（E.coli由来）としては配列番号１６のポリヌクレオチドがコードするものが、UGA2（S.cerevisiae由来）としては配列番号１７のポリヌクレオチドがコードするものが、yqhD（E.coli由来）としては配列番号１８のポリヌクレオチドがコードするものが、ALD2（S.cerevisiae由来）としては配列番号１９のポリヌクレオチドがコードするものが、ALD3（S.cerevisiae由来）としては配列番号２０のポリヌクレオチドがコードするものが好ましい。上記特定の配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
　なお、細胞にキシロース代謝経路に関与する酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを発現させるには、例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させる等、当業者に公知の方法により行うことができる。方法の詳細は上述の「ポリヌクレオチドの導入」の項を参照されたい。
　本発明の方法により製造されるキシロース代謝物質としては、例えば、エチレングリコール、グリコール酸、グリオキシル酸、ピルビン酸、乳酸、２－ケトグルタル酸、コハク酸、１，２，４－ブタントリオール、３－ヒドロキシブチロラクトン、３，４－ジヒドロキシ酪酸、１，４－ブタンジオール、エタノール、キシリトール、Ｄ－キシロネート等が挙げられる。これらのうち、本発明の製造方法により効率よく製造できる物質であるという観点から、エチレングリコール、グリコール酸、ピルビン酸、２－ケトグルタル酸、コハク酸、１，２，４－ブタントリオール、３，４－ジヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシブチロラクトン、３，４－ジヒドロキシ酪酸、１，４－ブタンジオールが好ましく、エチレングリコール、グリコール酸、２－ケトグルタル酸、１，２，４－ブタントリオール、３，４－ジヒドロキシ酪酸がより好ましい。また、本発明の方法により製造されるキシロース代謝物質としては、その代謝経路の特徴から、Dhams pathwayおよびWeimberg pathwayの代謝産物であるピルビン酸、グリオキシル酸、２－ケトグルタル酸に加えて、これらの化合物から誘導される化合物群も含まれる。
　以上のとおり、酵母等の宿主細胞に、鉄取り込み量の調節に関与するタンパク（TYW1）を過剰発現させ、かつキシロース代謝経路に関与する酵素群を発現させることで、キシロースからの有用物質の生産が可能となる。本発明のキシロース代謝物質の製造方法においては、このような鉄代謝改善細胞からのキシロース代謝物質の生産効率を向上させるために、このような鉄代謝改善細胞を、含硫化合物を含む培地中で培養することを特徴とする。
　本発明における含硫化合物としては、例えば、システイン、γ－グルタミルシステイン、還元型グルタチオン、メチオニン、ホモシステイン、タウリン、硫酸鉄等が挙げられる。これらのうち、鉄代謝改善細胞からのキシロース代謝物質の生産効率を向上させる効果に優れる観点から、システイン、γ－グルタミルシステイン、還元型グルタチオンが好ましい。なお、本発明のキシロース代謝物質の製造方法において、鉄代謝改善細胞の培養培地に含硫化合物としてシステインを含有させると、酸化反応を伴う物質生産の効率をより向上させることができる。また、本発明のキシロース代謝物質の製造方法において、鉄代謝改善細胞の培養培地に含硫化合物として還元型グルタチオンを含有させると、還元反応を伴う物質生産の効率をより向上させることができる。
　本発明における培地中の含硫化合物の濃度は、含硫化合物の種類によって適宜調整する必要があるが、キシロース代謝物質の生産効率を向上させる効果に優れる観点から、例えば１μＭ～１００ｍＭであり、１０μＭ～５０ｍＭであることが好ましく、５０μＭ～２０ｍＭであることがより好ましく、１００μＭ～１０ｍＭであることがさらに好ましく、１ｍＭ～５ｍＭであることが特に好ましい。
　本発明のキシロース代謝物質の製造方法においては、上記組換え宿主細胞に酸化ストレス耐性を付与する分子をコードするポリヌクレオチドを導入し、過剰発現させることで、キシロース代謝物質の生産効率を向上させることができる。このような酸化ストレス耐性を付与する分子としては、細胞に酸化ストレス耐性を付与できる分子であれば特に限定されないが、例えば、YAP1、SOD1、CTT1、HSP30等が挙げられる。
　YAP1は、酸化ストレスに応答する転写因子の一つであり、過酸化水素（H202）によって、細胞内の局在が制御されている。H202が存在すると、細胞内の制御機構によってYAP1のシステイン残基が細胞内でジスルフィド結合を形成する。ジスルフィド結合の形成により、コンフォーメーション変化を起こしたYAP1は核内に輸送され、TRX2、GSH1（γ-グルタミルシステインシンテターゼ）、GSH2（グルタチオンシンテターゼ）およびTRR1（チオレドキシンレダクターゼ）などの遺伝子の発現を促進する（Microbial Cell, 6(6), 267-285, 2019）。なお、YAP1の過剰発現は、特にグリコアルデヒドからエチレングリコールへの変換に代表される還元反応を伴う物質生産により好ましい。本発明において、YAP1は、キシロース代謝物質の生産効率を向上させる観点から、配列番号２１のポリヌクレオチドがコードするものが好ましい。上記特定の配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、TRX2、GSH1（γ-グルタミルシステインシンテターゼ）、GSH2（グルタチオンシンテターゼ）およびTRR1（チオレドキシンレダクターゼ）などの遺伝子の発現を促進する活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）、あるいはYAP1によって発現が促進されるタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
　Superoxide dismutase 1（SOD1）は、活性酸素種の一つであるスーパーオキシドを酸素と過酸化水素へと変換することで無毒化する酵素である。また、近年、SOD1には転写因子としての機能を有していることも明らかにされている。この転写因子としての活性は、H202によって制御されている。H202が存在すると、酵母細胞内の制御機構によりSOD1のセリン残基がリン酸化され、リン酸化を受けたSOD1は核内に移行する。核内に移行したSOD1は、抗酸化やDNA修復、あるいはCu/Feの恒常性に関わるFerric reductase（FRE2、FRE3）などの遺伝子の発現を促進する（Nature Communications, 5(1), 3446, 2014）。なお、SOD1の過剰発現は、特にグリコアルデヒドからグリコール酸への反応に代表される酸化反応を伴う物質生産により好ましい。本発明において、SOD1は、キシロース代謝物質の生産効率を向上させる観点から、配列番号２２のポリヌクレオチドがコードするものが好ましい。上記特定の配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、抗酸化やDNA修復、あるいはCu/Feの恒常性に関わるFerric reductase（FRE2、FRE3）などの遺伝子の発現を促進する活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）、あるいはSOD1によって発現が促進されるタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
　CTT1は、カタラーゼの一種でありH202を酸素と水に変換することで無毒化する酵素である。酵母は２種類のカタラーゼを有しており、CTT1は細胞質に局在することが知られている。もう一方のカタラーゼは、ペルオキシソームに局在するCTA1である。本発明において、CTT1は、キシロース代謝物質の生産効率を向上させる観点から、配列番号２３のポリヌクレオチドがコードするものが好ましい。上記特定の配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、カタラーゼ活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
　HSP30は、熱ショックタンパク質であり、様々な環境ストレス条件下でその発現が誘導される（熱ショック、高濃度エタノール、弱酸、酸化ストレス、グルコースの枯渇など）。例えば、ATPを利用してH+を細胞外に放出するPma1の発現を負に制御することが知られている（Indian Journal of Microbiology, 51(2), 153-158, 2011）。なお、HSP30の過剰発現は、特にグリコアルデヒドからグリコール酸への反応に代表される酸化反応を伴う物質生産により好ましい。本発明において、HSP30は、キシロース代謝物質の生産効率を向上させる観点から、配列番号２４のポリヌクレオチドがコードするものが好ましい。上記特定の配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、上記と同様の活性（例えば、ATPを利用してH+を細胞外に放出するPma1の発現を負に制御する等）を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
　上記組換え宿主細胞に酸化ストレス耐性を付与する分子をコードするポリヌクレオチドを導入した細胞を、含硫化合物を含む培地中で培養することにより、さらにキシロース代謝物質の生産効率を向上させることができる。
　本発明の製造方法においては、上記組換え宿主細胞を、SCD培地等を用いて25℃から40℃、15時間から72時間培養して増殖させた後、キシロース及びグルコース混合糖培地、キシロース単一炭素源を含む培地等(YPD培地等)に一定の濃度(例えばOD600=0.1となる濃度)で植菌して、25℃から40℃、好ましくは30℃で、50rpmから800rpm、好ましくは100から300rpm、より好ましくは150rpmの条件で、15時間から72時間、好ましくは20時間から48時間、より好ましくは24時間程度培養する。その後、発酵用培地(例えば、10g/L yeast extract, 20g/L tryptone, 10g/L glucose, 10g/L xylose等)に例えばOD600=5となるように植菌して、25℃から40℃、好ましくは30℃にて、50rpmから800rpm、好ましくは100から300rpm、より好ましくは150rpmの条件で15時間から72時間培養を行う。培養液を回収し、常法に従い、製造系から酵母を回収し、適宜濃縮、精製することにより各有用物質を取得することができる。なお、上記発酵用培地に、含硫化合物を添加することで、キシロース代謝物質の製造効率を向上させることができる。
　以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
１．実験手法
　以下に、本実施例における具体的な実験手法を項目に分けて説明する
（１）使用菌体及び培地
　プラスミドの増幅には全て、Escherichia coli NovaBlue （Merck Millipore, Darmstadt, Germany）を用いた。NovaBlueは、100μg/mLアンピシリンを含むLuria-Bertani培地（5g/L yeast extract, 10g/L tryptone, 及び10g/L NaCl）で培養した。キシロース代謝経路導入株の宿主には、S. cerevisiae YPH499 [MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1- 63 his3-Δ200 leu2-Δ1（Stratagene, La Jolla, CA, USA）]を用いた。酵母株の培養には、SD培地[6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids （Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）, 20g/L glucose]に株の栄養要求性に合わせてアミノ酸・核酸を加えたもの、又はSCD培地[6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids （Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）, 2g/L synthetic complete mix, 20g/L glucose]を用いた。酵母の形質転換の際には、synthetic complete mixから株の栄養要求性に合わせて適切にアミノ酸・核酸を抜いたものを用いた。前培養は30°C、200rpmで行った。
（２）プラスミドの作成
　本研究で作成したプラスミドは、In-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit（Takara）、Ligation high ver.2(Takara)を用いて作成した。In-Fusionでは、制限酵素処理したベクターの末端15塩基の相同配列を、クローニングする塩基配列の両端にPCRで付加して、ベクターとクローニング配列、In-Fusion酵素を混合し50℃で15分インキュベートすることで作成した。Ligationでは、制限酵素処理したベクター、ベクターに対応する制限酵素で処理した目的の遺伝子配列、Ligation酵素を混合し16℃、30分インキュベートすることで作成した。この研究で使用した遺伝子は全て、S. cerevisiaeのコドンに最適化したものをGeneArt(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)にて人工合成した。本研究で作成したプラスミドを表１に示す。下記表中、「Yamada et al. 2010」はApplied Microbiology and Biotechnology, 85(5), 1491-1498, 2010であり、「Bamba et al. 2019」はMetabolic engineering, vol.56, p.17-27, 2019である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　pδW-pTDH3-kdcAを構築するために、まずTDH3プロモーター（TDH3p）およびADH1ターミネーター（ADH1t）に連結されたL.lactis kdcAをコードするDNAをpIL-pTDH3-kdcA（Bambaet al.,2019）からd-int-kdcA Fとd-int-kdcA Rを用いてPCRにより伸長した。伸長したDNA断片を、SmaIで切断したpδWベクターに組み込むことで、pδW-pTDH3-kdcAを得た。
　YPH499 ゲノムDNAをテンプレートとして、prr-7-3-Fおよびprr-7-2-Rをプライマーとして用いてPCRすることで、POS5Δ17 ORFの断片を得た。得られたPOS5Δ17 ORFの断片を、pGK405をSmaIで処理したベクターに組み込むことで、pIL-POS5Δ17を作成した。
　DHBから3,4-DHBAへの反応を触媒する遺伝子は、pIL pTDH3-tADH1またはpIU pTDH3-tADH1をSmaIで処理したベクターに組み込んだ。YPH499 ゲノム DNAをテンプレートとし、prr-11-1 Fとprr-11-1 R、prr-19-1 Fとprr-19-1 R、prr-19-2 Fとprr-19-2 Rのプライマーセットを用いてそれぞれPCRを行い、UGA2 ORF、ALD2 ORF、ALD3 ORFのDNA断片を得た。
　pCL-Cas9およびpCW-Cas9を作成するため、YPH499 ゲノムDNAをテンプレートとし、TEF1p for Cas9 FとTEF1p for Cas9 R、CYC1p for Cas9 FとCYC1p for Cas9 Rのプライマーセットを用いて、TEF1のプロモーター領域とCYC1のターミネーター領域をそれぞれ伸長した。また、Cas9_Base（Nambu-Nishida et.al., Sci Rep 7,8993,2017）をテンプレートとし、Cas9 FとCas9 Rのプライマーセットを用いてCas9 ORFを伸長した。TEF1プロモーター、Cas9 ORF、CYC1ターミネーターを、pGK415またはpGK414をXhoIとNotIで切断したものに組み込み、pCL-Cas9およびpCW-Cas9を得た。
　E.coli由来のyagEをTDH3pと連結するため、pIL-pTDH3-tADH1をSmaIで処理し、コドン最適化したyagEを組み込むことで、pIL-tdh3p-yagEを作成した。なお、上記yagEのDNA配列は、配列番号１３で示すとおりである。
　酸化ストレス耐性付与のため、YPH499 ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、YAP1NLS、SOD1NLS、CTT1 ORF、HSP30 ORFをPCRにて伸長した。PCRには、prr-16-4 Fとprr-16-4 R、prr-16-5 Fとprr-16-5 R、prr-16-1 Fとprr-16-1 R、prr-16-2 Fとprr-16-2 Rのプライマーセットをそれぞれ用いた。核移行シグナルを付与するために、prr-16-4 Rとprr-16-5 Rにはそれぞれ ‘5- ccgaagaagaagcgtaaagtc -3’（配列番号２５）が含まれている。YAP1NLSとSOD1NLSの核移行シグナルを除くため、YPH499 ゲノムDNAをテンプレートにprr-16-4 Fとprr-20-1 R、prr-16-5 Fとprr-20-2 Rのプライマーセットを用いてPCRを行なった。得られたDNA断片をpIU-pTDH3-tADH1をSmaIで切断したものにそれぞれ組み込みことで、目的のplamidを得た。
　pIU pTDH3-ADH1tをテンプレートとしてprr-MEP-1-6 Fとprr-MEP-1-6 Rのプライマーセットを用いてPCRし、XhoIとNcoIの配列を付与したTDH3p-ADH1tの断片を得た。pIU pTDH3-ADH1t をテンプレートとしてprr-MEP-1-5 Fとprr-MEP-1-5 RのプライマーセットでPCRしたベクターに、制限酵素サイトが付与されたTDH3p-ADH1tを組み込むことで、pIL-xTDH3p-ADH1tnを得た。pIL-xTDH3p-ADH1tnをSmaIで処理し、C.glutamicum由来ksaDを組み込むことで、pIL-xTDH3p-CgksaD-ADH1tnを得た。pIBG-SS (Inokuma et al., Biotechnology for Biofuels, 7(1), 8, 2014) をテンプレートとして、XhoI-SED1p FとXhoI-SED1p R、またはSAG1t FとSAG1t Rのプライマーセットを使用し、SED1pとSAG1tをそれぞれPCRした。SED1pとSAG1tをテンプレートとして、XhoI-SED1p FとSAG1t Rのプライマーセットを用いてPCRすることで、SED1p-SAG1tを作成した。これを、XhoIとNotIで処理したpGK405(Ishii et al.,The Journal of Biochemistry, 145(6), 701-708, 2009)に組み込むことでpIL-sed1p-sag1tを作成した。pIL-sed1p-sag1tをSmaIで処理し、コドン最適化したB.xenovorans由来のxylXを組み込むことで、pIL-sed1p-BxxylX-sag1tを作成した。pIU-tdh3p-adh1tをテンプレートとし、prrMEP-1-13-FとprrMEP-1-13-Rのプライマーセットを用いてPCRしたＤＮＡ断片に、ARS208（Reider Apel, A.et.al, Nucleic Acids Res 45, 496-508,2017）の上流500bpおよび下流500bp断片をARS208 up FおよびARS208 up R、ARS208 down FおよびARS208 down RでPCRした２つのＤＮＡ断片を組み込むことで、pICas-ARS208を作成した。pIL-xTDH3p-CgksaD-ADH1tnとpIL-sed1p-BxxylX-sag1tをXhoIとNcoI、XhoIとNotIで処理した。得られたそれぞれの遺伝子カセットを、pICas-ARS208をNcoIとNotIで切断したベクターにLigationすることで、pICas-ARS208-tCgKsaD-sBxxylXを得た。
（３）酵母株の作成
　酵母の形質転換は、酢酸リチウムを用いたOne-step transformation法に従い行った(Chen et al. Current Genetics, 21(1), 83-84, 1992)。本研究で使用した酵母株を表２に示す。本研究の酵母株としてはS.cerevisiae YPH499株を用いた。キシロースをキシリトールに変換するGRE3の破壊、およびキシロースからキシロネートまでの反応を触媒するC.crescentus由来のxylBおよびxylDが導入されたBD株 (Bamba et al., 2019)を全てのホスト株として使用した。BT生産株を構築するために、BD株にδ-integration法を用いてLactococcus lactis由来のkdcAを導入したBDδK6株を作成した。BDδK6株およびBD株のBOL2遺伝子をHIS3で置換することにより、BDδK601株およびBDΔB株を作成した。tTYW1過剰発現株を作成するために、pIAur-tTYW1 (Bamba et al., 2019)をBDδK601株とBDΔB株に導入し、BDδK603株およびBDΔBtT株を作成した。BT生産株であるBDδK603株にPOS5のミトコンドリア局在配列を取り除いたPOS5Δ17（配列番号２６）を過剰発現した株を作成するために、pIL-POS5Δ17を導入することでBDδK6035株を得た。
　BT生産株であるBDδK603を宿主に3,4-DHBA生産株を構築するために、BDδK603株からADH6を破壊することでBDδK603ΔADH6株を得た。ADH6の破壊には、ADH6 ORFの上流および下流500bpのＤＮＡ断片を連結したもの使用した。BDδK603δADH6株にpIL-tdh3p-yneI-adt1t、pIL-tdh3p-UGA2-adt1t、pIU-tdh3p-yqhD-adt1t、pIU-tdh3p-ALD2-adt1t、pIU-tdh3p-ALD3-adt1tを導入することで、BDδK603ΔADH6-yneI株、BDδK603ΔADH6-UGA2株、BDδK603ΔADH6-yqhD株、BDδK603ΔADH6-ALD2株、BDδK603δADH6-ALD3株をそれぞれ作成した。
　鉄代謝の改変されたBDΔBtT株を宿主にダームス経路（Dahms pathway）を導入するために、BDΔBtT株にpIL-tdh3p-yagEを導入することでBDΔBtT-E株を作成した。このBDΔBtT-E株に酸化ストレス耐性を付与するため、pIU-tdh3p-YAP1NLS-adh1t、pIU-tdh3p-YAP1-adh1t、pIU-tdh3p-SOD1NLS-adh1t、pIU-tdh3p-SOD1-adh1t、pIU-tdh3p-CTT1-adh1t、pIU-tdh3p-HSP30-adh1tを導入したBDΔBtT-E-YAP1NLS、BDΔBtT-E-YAP1、BDΔBtT-E-SOD1NLS、BDΔBtT-E-SOD1、BDΔBtT-E-CTT1、BDΔBtT-E-HSP30株をそれぞれ構築した。
　鉄代謝の改変されたBDΔBtT-Cas9株を宿主にWeimberg pathwayを導入するために、pICas-ARS208-tdh3p-ksaD-sed1p-BxxylXをNheIで処理した断片をgRNA発現plasmidであるpGK426-ARS208と共に形質転換することで、BDΔBtT-kDbX株を作成した。このBDΔBtT-kDbX株に酸化ストレス耐性を付与するため、pIU-tdh3p-YAP1NLS-adh1t、pIU-tdh3p-YAP1-adh1t、pIU-tdh3p-SOD1NLS-adh1t、pIU-tdh3p-SOD1-adh1t、pIU-tdh3p-CTT1-adh1t、pIU-tdh3p-HSP30-adh1tを導入したBDΔBtT-kDbX-YAP1NLS、BDΔBtT-kDbX-YAP1、BDΔBtT-kDbX-SOD1NLS、BDΔBtT-kDbX-SOD1をそれぞれ構築した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本実施例において用いた各プライマーの配列は、下記表３に示した配列番号として、配列表に記載したとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（４）発酵試験
　発酵試験に用いる菌体は、まず5mLのSCD培地で24時間培養した。そして、50mLのYPD培地にOD600=0.1となるように植菌して30℃、150rpmで24時間培養した。菌体を10mLの滅菌したD.W.で2度洗浄した後、発酵用培地（10g/L yeast extract, 20g/L tryptone, 10g/L glucose, 10g/L xylose）にOD600=5となるように植菌して、全量20mLの系で、30℃、200rpmで発酵試験を行った。24時間毎にサンプリングを行い、培養上清はHPLC及びGC-MSを用いて測定した。システインおよび還元型グルタチオンの添加は、200mMのストック溶液を、20mLの発酵用培地に終濃度2mMとなるよう添加した。酸化型グルタチオンは、100mMのストック溶液を、20mLの発酵用培地に終濃度1mMとなるよう添加した。
　Fed-batch培養のために、まず酵母細胞をSCD培地で一晩増殖させた。培養液を400mL YPD培地に接種し、24時間で30℃、150rpmで培養を行った。培養液を3000rpm、5分間の遠心分離により菌体を回収し、蒸留水で2回洗浄した。Ｆｅｄ-ｂａｔｃｈ発酵は、1.0Lバイオリアクター（ABLE Biott、東京、日本）の初期容量を0.5 Lで行った。培養開始点での1.0Lバイオリアクターの培地には、10g/L yeast extract, 20g/L tryptoneが含まれていました。初期OD=10となるように菌体を培地に植菌し、発酵開始時点から2時間ごとに1.0 mlのフィード溶液を自動的に添加した。フィード溶液の組成は、10g/L yeast extract, 20g/L tryptone、130 g/Lのグルコース、および130 g/Lのキシロースであった。必要に応じて、バイオリアクターに消泡剤を添加した。培養条件は30°C、pH 5.5で制御しました。溶存酸素（DO）濃度を制御するために、空気流量は 0.5 volume/volume/minute で行い、培養中は攪拌速度によってDOを自動的に制御しました。発酵培養物を24時間ごとにサンプリングして、培地およびOD600の代謝物を測定しました。
（５）代謝物測定
　発酵培地中のグルコースおよびキシロース濃度は、SPR-Pbカラム（7.8 mm ×250 mm, particle size 8 μm; Shimadzu, Kyoto, Japan）とRID-10A 検出器を装着した、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）（Shimadzu）を用いて分析した。移動相に水を用いて流速0.6mL/min、80℃で稼働した。
　EG（エチレングリコール）およびGA（グリコール酸）の濃度は、Aminex HPX-87Hカラムと屈折率検出器RID-10Aを装着したHPLCを用いて分析した。移動相に5mM H2SO4を用いて流速0.6mL/min、65℃で稼働した。BT（ブタントリオール）、3,4-DHBA（3,4-ジヒドロキシ酪酸）、xylonate（キシロネート）の濃度はガスクロマトグラフィー/質量分析計（GC-MS）（Shimadzu）により分析した。5μLの培養上清に、2μLの10g/Lリビトールを内部標準物質として加えて、CentriVap Benchtop Vacuum Concentrators (Labconco, Kansas City, MO, USA)を用いて乾燥させた。GC-MS分析のためのトリメチルシリル化は以下の手順で行った。即ち、乾燥させたサンプルに、ピリジンに溶解させた100μLの20mg/mL O-メチルヒドロキシルアミン塩酸塩溶液を加え90分間反応させた（1200rpm, 30℃; M-BR-022UP; Taitec, Saitama, Japan）。そして、50μLの N-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（MSTFA）を加えて、30分間反応させた（1200rpm at 37℃; M-BR-022UP;Taitec）。サンプルは室温で遠心分離（3000g, 5分）して上清を分析に用いた。
　GC-MS(GCMS-QP2010 Ultra; Shimadzu)には、CP-Sil 8CB カラム(30m length×0.25mm i.d., film thickness of 0.25μm; Agilent)を装着して用いた。GC-MSの各パラメーターの設定は以下の通りである。即ち、試料気化室の温度は230℃に設定した。サンプル注入量は1μLでスプリット比は1:25に設定した。ヘリウムをキャリアーガスに用いて、流量は1.12mL/minに設定した。カラム温度は、80℃で2分間保温したのちに、15℃/minで330℃まで昇温して、330℃で6分間保温した。インターフェース温度およびイオン源の温度はそれぞれ、250℃と200℃に設定した。イオン化（Electron impact ionization; EI）は70eVで行った。分析はFast Automated Scan/SIM(FASTT)モードにより、Scanモード（85-500m/z）及びSelected ion monitoring(SIM)モード(BT; m/z 103,129,リビトール;m/z 103)を並行して行った。
２．酵母の鉄代謝改変が細胞内代謝物の蓄積量に与える影響の検討
　鉄代謝改変前の株であるCaulobacter crescentus由来のＸｙｌＢとＸｙｌＤが導入されたＢＤ株に対してBOL2の破壊とtTYW1の過剰発現を行うことで、鉄代謝改変株であるBDΔBtT株を構築した。鉄代謝改変による酵母の鉄取り込みの促進が、細胞内代謝物にどのような影響を及ぼしているか調査することとした。BD株とBDΔBtT株を、グルコースとキシロースを含む培地で培養し、２４時間後の菌体の細胞内代謝物を測定した。その結果を図４に示す。
　図４に示すとおり、鉄代謝改変前のBD株と比較して鉄代謝改変後のBDΔBtT株では主に含硫化合物であるシステイン、γ－グルタミルシステイン、還元型グルタチオンの細胞内蓄積量が減少していた。それに対して、酸化型グルタチオンの優位な減少は見られなかった。特にグルタチオンは細胞内の酸化ストレスの指標として用いられるため、鉄取り込みの強化された鉄代謝改変酵母株は過剰の酸化ストレスに曝露されていることが示唆された。
３．酵母の鉄代謝改変株からの有用物質生産における、培地へのクエン酸鉄、システイン、グルタチオンの添加効果の検討
（１）キシロネート及びBT（ブタントリオール）生産
　鉄代謝の改変されたBT生産株BDδK6035株を用いて、クエン酸鉄またはシステインをグルコースとキシロースを含む培地に添加し、培養試験を行なった結果を図５に示す。添加なしの条件では、xylonate蓄積量とBT生産量はそれぞれ7.5 g/Lと2.2 g/Lであった。クエン酸鉄の添加では、BT生産量の優位な増加は確認されなかった。システイン添加時には、中間生成物であるxylonateの蓄積量が7.5 g/Lから6.6 g/Lと大幅に減少した。そして、Xylonateの蓄積量減少に伴って10 g/LのキシロースからのBT生産量は大幅に増加し、システインを2mM添加した際に最も多い3.3g/LのBTを生産した。
（２）3,4-DHBA（3,4-ジヒドロキシ酪酸）生産
　目的生産物を3,4-DHBAに変更しても、システインなどの含硫化合物の添加が生産量増加に寄与するのかを確認することとした。BDδK603株からBT生産を防ぐため、酵母細胞内でDHBからBTへの反応を触媒していると考えられるADH6を破壊したBDδK603ΔADH6株を作成した。BTの生産を防ぐことが可能になったかを確認するため、培養試験を行ったところ、ADH6が破壊されたBDδK603ΔADH6株ではBTを生産しなかった。BDδK603ΔADH6株に対して、酵母でDHBから3,4-DHBAへの反応を触媒すると考えられる遺伝子を発現させることとした。その候補遺伝子として、E.coli由来のyneI、yqhD、S.cerevisiae由来のALD2、ALD3、UGA2を選択した。TDH3プロモーターの制御下でそれぞれの候補遺伝子を発現させた株をそれぞれ構築し、10 g/Lのグルコースと10 g/Lのキシロースを含む培地で培養試験を行なった。図６-Ａに示す通り、yneIを発現させたBDδK603ΔADH6-yneI株で最も高い1.6g/Lの3,4-DHBAを生産した。その他、yqhD、UGA2、ALD2、ALD3を発現させた株の3,4-DHBA生産量はそれぞれ、0.53 g/L、0.33 g/L、1.13 g/L、0.80 g/Lであった。このBDδK603ΔADH6-yneI株を用いて、システインと還元型のグルタチオンを添加し培養した結果を図６－Ｂに示す。システインとグルタチオンの添加により、3,4-DHBAの生産量はそれぞれ増大し、2.43 g/Lと2.03 g/Lであった。グルタチオンを添加した場合と比較して、システインの添加の方が3,4-DHBAの生産量は高かった。また、システインとグルタチオンの添加により、キシロネートの蓄積量が減少した。添加なしでは、8.58 g/Lのキシロネート蓄積量であったのに対し、システインとグルタチオンの添加により、7.43 g/Lと7.80 g/Lへとキシロネートの蓄積量が減少した。
　更なる3,4-DHBA生産量増大のため、BT生産酵母株であるBDδK6035と3,4-DHBA生産酵母株であるBDδK6035ΔADH6-yneIを用いて、1.0 LのバイオリアクターでのFed-batch培養を行った。本発明では、溶存酸素濃度を制御することにした。活性酸素種（スーパーオキシドやＨ２０２など）は通気や攪拌によって培地へ溶け込んだ酸素によって発生し、酵母細胞内への酸化ストレスを引き起こすためである。すなわち、鉄代謝改変株の培養時に溶存酸素を制御することで、鉄代謝改変酵母が受ける酸化ストレスを軽減することが可能ではないかと考えた。まず、BT生産酵母を用いてFed-batch培養を行った結果を、図７に示す。攪拌速度を200 rpmで一定に制御し、DOを低く保った場合にはBTの生産のみが確認された。一方、攪拌速度を400 rpmで一定に制御し、DOを高く保った場合には、BTと3,4-DHBAの生産が確認された。興味深いことに、BT生産酵母は、三角フラスコでの通気量が限られた条件での培養試験ではBTのみを生産する。以上のことから、攪拌速度によって溶存酸素濃度（Dissolved Oxygen, DO）を制御することにより、アルデヒドであるDHBからアルコールへの還元反応によるBT生産と、アルデヒドからカルボン酸への酸化反応による3,4-DHBA生産を制御可能であることがわかった。
　次に、3,4-DHBA生産酵母を用いてFed-batch培養を行った結果を、図８に示す。溶存酸素濃度を厳密に制御するために、攪拌によるDOの自動制御モードを使用した。各培養のDOを、それぞれ6.5 ppm、4.0 ppm、2.0 ppm、0.5 ppmに制御した。その時の3,4-DHBAの生産量は、DO=0.5の条件で最大であり、192時間で7.08 g/Lの3,4-DHBAを生産した。これは、これまで報告された中で最も高い3,4-DHBAの生産量である。また、キシロネートの蓄積量は、DO=0.5 ppmで最も低く、192時間で7.30 g/Lであった。DOを低く保つことで、キシロネートの蓄積量を低く抑えることが可能であり、目的生産物質の生産量を増大させることが可能であった。
（３）BDΔBtT-E株を用いた試験
　図６－Ｂのシステイン添加の実験結果が、使用した株や目的生産物に依存した効果でないことを確かめるため、鉄代謝改変株にDahms pathwayを導入するためにE. coli由来のyagEを導入したBDΔBtT-E株を用いて同様の実験を行なった。その結果を図９に示す。Xylonate蓄積量は、添加なしの場合には6.2g/Lであったのに対し、還元型グルタチオンを添加した時にキシロネート蓄積量は最も減少し、９６時間時点で5.9g/Lであった。添加なしの場合には、BDΔBtT-E株のethylene glycol生産量は1.5g/Lであった。それに対して、システインまたは還元型グルタチオンを添加した場合には、ethylene glycol生産量は増大し、それぞれ48時間後2.1g/Lと2.4g/Lであった。以上の結果から、ダームス経路（Dahms pathway）を導入した鉄代謝改変株においても、システインや還元型グルタチオンの添加により、中間生成物であるXylonateの蓄積量を減少させることが可能であり、また目的物質の生産量を増大させる効果を確認した。
４．酵母の鉄代謝改変株からの有用物質生産における、酸化ストレス耐性付与の効果の検討
（１）ダームス経路を構成する遺伝子を導入した鉄代謝改変株
　鉄代謝改変株では含硫化合物の細胞内蓄積量が減少しており、不足していたシステインやグルタチオンを培地中へ添加することで中間生成物であるXylonateの蓄積量の減少とそれに伴う下流の代謝物（BT、3,4-DHBA、EG）生産量の増加を確認した。特に、還元型グルタチオン（GSH）は細胞内の酸化ストレスの代表的な指標であるため、鉄取り込み能が強化された鉄代謝改変株では、酸化ストレスを過剰に受けているのではないかと推察された。そのため、鉄代謝改変株に対して酸化ストレス耐性を付与することで、xylonateの蓄積量減少とそれに伴って代謝物生産量が増加するのではないかと考えた。
　本発明者らは、酵母に酸化ストレス耐性を付与する手法として、YAP1、SOD1、CTT1、HSP30を選択した。YAP1は、Yeast AP-1 like transcription factorsの一種であり、酵母が酸化ストレスを受けると分子内でコンフォーメーション変化を起こし、酸化ストレスを低減するタンパク質をコードする遺伝子（TRX2、GSH1など）の発現を促進する。SOD1はSuperoxide dismutase 1であり、スーパーオキシドを過酸化水素に変換する酵素である。Tsang et al. (2014) では、SOD1はSuperoxide dismutase活性を有し、酵母細胞内で転写因子としての活性を有していることが報告されている。つまり、SOD1は、H2O2などの活性酸素種（Reactive Oxygen Spices、ROS）が存在すると、核内に移行し転写因子として機能する。CTT1は、酵母細胞質に局在するカタラーゼであり、H2O2をH2Oへと変換する酵素である。HSP30は、heat shock proteinの一種であり、高温耐性に関わることが知られている。酵母を高温で培養することで活性酸素種が発生することが一般的に知られており、候補遺伝子として選択した。
　鉄代謝改変株にDahms pathwayが導入されたBDΔBtT-E株に、それぞれYAP1、SOD1、CTT1導入した株を作成した。YAP1とSOD1は転写因子であるため、C末端に核移行シグナル（Nuclear Localization Signal, NLS）を付与したものも作成し同様に発現させた（YAP1NLS、SOD1NLSと記載）。
　BDΔBtT-E株に酸化ストレス耐性を付与したそれぞれの株を培養した結果を図１０に示す。図６の（A）はXylonate 蓄積量、（B）はGlycolate 生産量、（C）はEthylene glycol (EG) 生産量を示している。図１０に示すとおり、BDΔBtT-E株の96時間後のxylonate蓄積量が6.2 g/Lであったのに対し、YAP1NLS、SOD1NLS、HSP30を過剰発現させた株ではxylonate蓄積量は5.1 g/Lと大きく減少した。また、xylonate蓄積量が減少したこれらの酵母株では、Dahms pathway下流の代謝物生産量が増加した。即ち、培養48時間におけるBDΔBtT-E株のEG生産量は1.5g/Lであったのに対し、YAP1NLS過剰発現株では2.2g/Lであった。さらに、培養96時間後におけるBDΔBtT-E株のglycolate生産量は0.6 g/Lであったのに対し、SOD1NLS過剰発現株ならびにHSP30過剰発現株のGlycolate生産量はそれぞれ1.1g/Lと1.3g/Lであった。NLSを付与しなかったYAP1やSOD1の過剰発現株では、xylonateの蓄積量や代謝物生産量に有意な変化は見られなかった。またCTT1過剰発現株では、培養96時間後のxylonateの蓄積量は5.9g/Lであり、わずかな蓄積量の減少が見られた。それに伴い、EG生産量も増加し、培養96時間後で1.7g/Lであった。
（２）ヴァインベルク経路を構成する遺伝子を導入した鉄代謝改変株
　次に、鉄代謝改変株に酸化ストレス耐性を付与する戦略が、他のキシロース代謝経路にも応用可能かを検証した。鉄代謝改変株BDΔBtT株にWeimberg pathwayを構成する遺伝子であるC.glutamicum由来のksaDとB.xenovorans由来のxylXを導入したBDΔBtT-kDbX株を構築した。更に、BDΔBtT-kDbX株に対してYAP1とSOD１を導入した株をそれぞれ構築した。培養試験を行った結果を図１１に示す。BDΔBtT-kDbX株のxylonate蓄積量が6.0 g/Lであったのに対し、BDΔBtT-kDbX-YAP1NLS株、BDΔBtT-kDbX-SOD1NLS株のXylonateの蓄積量はそれぞれ4.9g/L、5.1g/Lであった。酸化ストレス耐性付与によって中間生成物xylonateの蓄積量減少を確認したことから、Weimberg pathwayにおいてもストレス耐性付与の戦略は有効であることが示された。
５．酸化ストレス耐性を付与した酵母の鉄代謝改変株からの有用物質生産における、培地へのシステイン、グルタチオンの添加効果の検討
　最後に、グルタチオンやシステインの培地中への添加と酸化ストレス耐性付与を組み合わせることとした。BDΔBtT-E-YAP1NLS株を用いて、添加なし、システイン2mM添加、還元型グルタチオン2mM添加、システインおよびグルタチオン2mM添加の条件で培養した結果を図１２に示す。BDΔBtT-E-YAP1NLS株に還元型のグルタチオンを添加した条件で、48時間時点で最も高い2.6g/LのEG生産を達成した。また、システインを添加した条件では72時間後に2.5 g/LのEG生産量を示し、システインとグルタチオンを添加した条件では96時間後に2.7g/LのEG生産量を示した。
　以上、本発明者らは、鉄硫黄タンパク質XylDの活性強化のため、BOL2の破壊とtTYW1の過剰発現を行うことで鉄代謝改変酵母を開発していた。本研究では、まず鉄取り込み能が強化された鉄代謝改変株の細胞内代謝物の蓄積量を測定することで、鉄代謝が改変された酵母株では含硫化合物の蓄積量が減少することを明らかにした（図４）。そして、鉄代謝改変株に不足していた含硫化合物であるシステインやグルタチオンを添加することで、酵母での新規キシロース代謝経路構築の際の大きな課題であったキシロネートの蓄積量減少、および導入された新規キシロース代謝経路に基づく下流の代謝物生産量（BT（図５）、3,4-DHBA（図６））が増加した。クエン酸鉄の添加により、代謝物の生産量に変化がなかったことから、鉄の取り込み能が強化され鉄の存在量は十分であることが示唆された（図５）。また、鉄代謝改変株にDahm pathwayを導入した株に対して、システインまたはグルタチオンを添加した場合においても、目的生産物質（EG）の生産量向上を確認した（図９）。本発明は、対象の物質や経路に依存しない広範に適応可能な技術である。鉄代謝改変酵母や鉄硫黄タンパク質への酸化ストレスを緩和するために、バイオリアクターを用いた溶存酸素濃度の制御下で培養したところ、以下の知見を得た。すなわち、（i）溶存酸素を制御することにより、アルデヒドであるDHBからの酸化（3,4-ジヒドロキシ酪酸）還元反応（1,2,4-ブタントリオール）の切り替えが可能であること（図７）、（ii）溶存酸素濃度を低く保つことにより、キシロネートの蓄積量を減少させ、且つ目的生産物質の生産量を向上させることが可能であること（図８）、である。これらの実験結果から、筆者らは更なる鉄代謝工学手法の開発を目論み、鉄代謝改変株に酸化ストレス耐性を付与する戦略を得た。その結果、特に、YAP1やSOD１に核移行シグナルを付与したもの、あるいは熱ショックタンパク質HSP30を発現させることで、Xylonateの蓄積量減少、および目的物質（EG、GA）の生産量増加を確認した（図１０）。すなわち、鉄代謝工学の新たな手法として、酸化ストレス耐性の付与が有効であることを示した。驚くべきことに、熱ショックタンパク質であるHSP30の過剰発現によっても、Xylonateの蓄積量減少と下流の代謝物生産量増加を確認した。過去に、高温耐性を獲得した株では酸化ストレスに関わる遺伝子の発現が上昇することが報告されている（Bioresource Technology, 245, 1447-1454, 2017）。よって、本発明における「ストレス耐性の付与」は、酸化ストレスなどに代表される酵母が培養時に受け得る種々のストレス耐性全般に適用可能であることが示された。また、鉄代謝改変酵母にストレス耐性を付与する手法は、Dahms pathwayが導入された酵母のみならず、Weimberg pathwayが導入された酵母においても、キシロネートの蓄積量減少に寄与した（図１１）。即ち、この手法も、導入された新規キシロース代謝経路に依存せず広範に適応可能であることが示された。加えて、このストレス応答性の遺伝子の発現と含硫化合物の培地への添加には相乗効果が確認された（図１２）。以上から、鉄代謝が改変された酵母に種々のストレス耐性（例えば、酸化ストレス耐性、高温ストレス耐性）を付与することで、これまで酵母で構築が困難であった新規キシロース代謝経路を、より機能的に構築することが可能になった。ここに、酵母への酸化ストレス耐性や高温ストレス耐性を付与する手法により、酵母の新規の鉄代謝工学手法の開発の成功したことを報告する。
６．酵母の鉄代謝改変株からの有用物質生産における、鉄硫黄クラスター合成機構に関与する遺伝子の過剰発現の効果の検討
　上記試験結果から、酸化ストレス耐性に関わる遺伝子（YAP1、SOD1）をWeimberg pathway（ヴァインベルク経路）に代表される新規キシロース同化経路が導入された酵母に導入することで、下流の代謝物生産量の増加及び主要な中間生成物であるキシロネートの蓄積量を減少させることに成功した。これらの酸化ストレスに関わる転写因子は、酵母の鉄硫黄クラスター合成機構に関与していることが示唆されているが、具体的な相関関係が示された例は存在しない。また、これら酵母の鉄硫黄クラスター生合成に関わる遺伝子を過剰発現することにより、酵母に発現された鉄硫黄タンパク質（XylDなど）の活性強化、あるいはそれに伴う中間生成物の蓄積量減少が示された例も存在しない。そこで、酵母の鉄硫黄クラスター合成機構に関わる遺伝子を過剰発現することで、中間生成物であるキシロネートの蓄積量が減少するか否かを評価することとした。
　酵母は、鉄硫黄クラスター合成機構として、ミトコンドリアにIron-sulfur clusuter (ISC) machinery；図１３）, サイトソルにCytosolic Iron-Sulfur-Protein assembly（CIA；図１４）をそれぞれ有している。また、CIAに関わる遺伝子であるCFD1、CIA2を過剰発現させても、鉄硫黄タンパク質XylDの活性は変化しなかったとの報告がある。よって、本研究では、酵母が有する鉄硫黄クラスター合成機構の中でも、ISC machineryに着目し、主要な酵素をコードする８つの遺伝子をそれぞれ過剰発現することで、中間生成物であるキシロネート蓄積量の減少を目指した。
　本試験に必要なプラスミドの構築は以下のように行った。
　YPH499のゲノムDNAをテンプレートに、tef1p Fとtef1p Rおよびadh1t Fとadh1t Rを用いてPCRを行い、TEF1のプロモータ配列及びADH1のターミネータ配列を得た。これらの遺伝子断片を、pGK406をXhoIとNotIで切断したベクターにInfusionすることで、pIU-tef1p-adh1tを得た。
　YPH499のゲノムDNAをテンプレートに、prr14-1-Fとprr14-1-Rおよびprr14-2-Fとprr14-2-Rを用いてPCRし、XhoI配列を付与したPGK1プロモータとNcoIの制限酵素サイトが付与されたPGK1ターミネータの断片を得た。pIU pTDH3-ADH1t をテンプレートにprr-MEP-1-5 Fとprr-MEP-1-5 R でPCRして得られたベクターにPGK1プロモータとADH1ターミネータを導入することで、pIU-x_pgk1p-pgk1tを得た。
　遺伝子導入サイトchrX2の上流500bpおよび下流500bpをchrX2 up FおよびchrX2 up R、chrX2 down FおよびchrX2 down Rを用いてPCRによって獲得した。この２つのDNA断片を、pIU-tef1p-adh1tをテンプレートにprrMEP-1-13-FとprrMEP-1-13-Rを用いてPCRしたDNA断片に組み込むことで、pICas-chrX2を作成した。
　ISC machineryを構成する遺伝子を過剰発現するために、YPH499のゲノムDNAからそれぞれPCRによって、YAH1、ISD11、NFS1、YFH1、ARH1、MRS3、ACP1、ISU1のORFを得た。それぞれのORFをpIU-tef1p-adh1tおよびpIL-x_pgk1p-pgk1tをSmaIで消化したベクターにInfusionすることで、pIU tef1p-ISD11-adh1t、pIU tef1p-ISU1-adh1t、pIU tef1p-YAH1-adht、pIU tef1p-YFH1-adh1t、pIL x_pgk1p-ACP1-pgk1t、pIL x_pgk1p-ARH1-pgk1t、PIL x_pgk1p-MRS3-pgk1t、PIL x_pgk1p-NFS1-pgk1tを得た。
　pICas-chrX2をXhoIとNcoIで切断して得たベクターに、pIL x_pgk1p-ACP1-pgk1t、pIL x_pgk1p-ARH1-pgk1t、PIL x_pgk1p-MRS3-pgk1t、PIL x_pgk1p-NFS1-pgk1tをXhoIとNcoIで切断することで得た遺伝子カセットとLigationすることで、pICas-chrX2-pgk1p-NFS1、pICas-chrX2-pgk1p-MRS3、pICas-chrX2-pgk1p-ARH1、pICas-chrX2-pgk1p-ACP1を得た。
　pICas-chrX2をXhoIとNotIで切断して得たベクターに、pIU tef1p-ISD11-adh1t、pIU tef1p-ISU1-adh1t、pIU tef1p-YAH1-adht、pIU tef1p-YFH1-adh1tをXhoIとNotIで切断することで得た遺伝子カセットとLigationすることで、pICas-chrX2-tef1p-YFH1、pICas-chrX2-tef1p-YAH1、pICas-chrX2-tef1p-ISU1、pICas-chrX2-tef1p-ISD11を得た。構築したプラスミドを以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本試験で用いた酵母株は以下の方法により構築した。
　BDΔBtT-kDbXを宿主に、pCL-Cas9およびpGK426-chrX2を形質転換することで、chrX2の遺伝子座を切断した。切断された遺伝子座を修復するために、pICasシリーズのベクターをNheIで処理することで得られる遺伝子断片を導入した。このようにして得られた株を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記試験において用いた各プライマーの配列は、下記表６に示した配列番号として、配列表に記載したとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　BDΔBtT-kDbX株を宿主に８つの遺伝子（YAH1、ISD11、NFS1、YFH1、ARH1、MRS3、ACP1、ISU1）をそれぞれ導入し、YPDX培地で培養した。コントロール株であるBDΔBtT-kDbX株の９６時間後のキシロネート蓄積量は6.1g/Lであった（図１５）。YAH1およびISD11を過剰発現した株では、キシロースをほとんど消費しておらず、Weimberg pathwayを介した代謝に何らかの悪影響を与えることが示唆された。その他６つの遺伝子（NFS1、YFH1、ARH1、MRS3、ACP1、ISU1）を導入したそれぞれの株は、９６時間後のサンプルにキシロースは検出されなかった。それら６つの株の培養結果を図１５に示す。NFS1およびYFH1の過剰発現株のキシロネート蓄積量は、コントロールであるBDΔBtT-kDbX株と同等であった。また、ARH1過剰発現株では、96時間後のキシロネート蓄積量が7.6g/Lであった。一方、MRS3、ACP1、ISU1過剰発現株では96時間後のキシロネート蓄積量が、それぞれ5.6g/L、5.4g/L、5.1g/Lであった。コントロール株と比較して、培養４８時間以降のキシロネート蓄積量が減少した。
　以上から、酵母の鉄硫黄クラスター合成機構に関わる遺伝子を過剰発現することで、新規キシロース同化経路構築における主要な中間生成物キシロネートの蓄積量を減少させることに成功した。ISC machineryやCIAの改変と、酸化ストレス耐性の付与とを組み合わせることで、更なるキシロネート蓄積量の減少と、下流の目的物質の生産量増大が期待される。
　本発明によると、酵母を用いてキシロースから得られる代謝物質のような有用物質を効率よく生産することができる。これにより、食料と競合しないセルロース系バイオマスから多様な燃料や化学品を高効率に作り出すことも可能となり、将来的には現在石油から製造している製品群をバイオベース製品に大転換することを可能とするものである。

Claims (16)

  1. 　鉄硫黄クラスターの生合成を制御する、少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現し、キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチドが導入された組換え宿主細胞を、含硫化合物を含む培地中で培養することを特徴とする、キシロース代謝物質の製造方法。
  2. 　上記鉄硫黄クラスターの生合成を制御するタンパク質が、Tyw1、MRS3、ACP1及びISU1から成る群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  3. 　上記組換え宿主細胞においてBOL2が欠損している、請求項１又は２に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  4. 　上記キシロース代謝経路が、XO経路（キシロース・オキシダティブ経路；xylose oxidative pathway）である、請求項１から３のいずれかに１項に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  5. 　上記キシロース代謝経路が、ダームス経路、ヴァインベルク経路又はこれらの改変経路である、請求項１から４のいずれか１項に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  6. 　上記キシロース代謝経路がダームス経路であり、上記キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群が、キシロースデヒドロゲナーゼ（XylB）、キシロネートデヒドラターゼ（XylD）、及びアルドラーゼである、請求項１から５のいずれか１項に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  7. 　上記キシロース代謝経路がヴァインベルク経路であり、上記キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群が、キシロースデヒドロゲナーゼ（XylB）、キシロネートデヒドラターゼ（XylD）、２－ケト－３－デオキシ－キシロネートデヒドラターゼ（XylX）及び２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（XylA）である、請求項１から５のいずれか１項に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  8. 　上記キシロース代謝経路がダームス経路又はヴァインベルク経路の改変経路であり、上記キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群が、キシロースデヒドロゲナーゼ（XylB）、キシロネートデヒドラターゼ（XylD）、２－ケト酸デカルボキシラーゼ（KDC）である、請求項１から５のいずれか１項に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  9. 　上記キシロース代謝経路がダームス経路又はヴァインベルク経路の改変経路であり、上記キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群が、キシロースデヒドロゲナーゼ（XylB）、キシロネートデヒドラターゼ（XylD）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALD）である、請求項１から５のいずれか１項に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  10. 　上記組換え宿主細胞において、酸化ストレス耐性を付与する分子をコードするポリヌクレオチドが導入されている、請求項１から９のいずれか１項に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  11. 　上記酸化ストレス耐性を付与する分子が、YAP1、SOD1、CTT1及びHSP30からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１０に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  12. 　上記宿主細胞が、酵母宿主細胞である、請求項１から１１のいずれか１項に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  13. 　上記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ブレタノミセス属（Brettanomyces）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、カンジタ属（Candida）、クロッケラ属（Klocckera）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、ヤロウイア属（Yarrowia）、イサトケンキア属（Issatchenkia）、スワニオミセス属（Schwanniomyces）、トリコスポロン（Trichosporon）属、ヤマダジマ属（Yamadazyma）、及びパチソレン属（Pachysolen）からなる群より選択される、少なくとも１種の酵母細胞である、請求項１２に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  14. 　上記キシロース代謝物質が、エチレングリコール、グリコール酸、２－ケトグルタル酸、１，２，４－ブタントリオール、３，４－ジヒドロキシ酪酸、及び３－ヒドロキシブチロラクトンからなる群より選択される、少なくとも１種である、請求項１から１３のいずれか１項に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  15. 　上記含硫化合物が、システイン、γ－グルタミルシステイン、及び還元型グルタチオンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から１４のいずれか１項に記載のキシロース代謝物質の製造方法。
  16. 　鉄硫黄クラスターの生合成を制御する、少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現し、キシロース代謝経路に関与する異種由来の酵素群をコードするポリヌクレオチドが導入された組換え宿主細胞を培養する工程を含む、キシロース代謝物質の製造方法であって、上記組換え宿主細胞に酸化ストレス耐性を付与する分子をコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする、キシロース代謝物質の製造方法。
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