WO2019159831A1 - 組換え宿主細胞及びｄ－ブタントリオールの新規製造方法 - Google Patents

組換え宿主細胞及びｄ－ブタントリオールの新規製造方法 Download PDF

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protein
strain
recombinant host
iron
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誠久 蓮沼
近藤　昭彦
崇弘 番場
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国立大学法人神戸大学
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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant host cell and a novel method for producing D-butanetriol.
  • the XR / XDH pathway and the XI pathway are well known as the xylose metabolism pathway of microorganisms. Using these routes, ethanol and xylitol are also produced from D-xylose.
  • Dhams / Weimberg pathway which is a xylose metabolic pathway that is completely different from the XR / XDH pathway and the XI pathway, D-xylonate, D-1,2,4-butanetriol (D-BT), 1, It has been reported that useful substances such as 4-butanediol can be produced (see Non-Patent Documents 1 to 3).
  • the above D-BT can be used not only as a raw material for various pharmaceuticals and chemical products but also becomes an energy substance D-1,2,4, -butanetriol trinitrate (D-BTTN) by nitration.
  • D-BTTN is a substance that can be used as a propellant for rockets or a substitute for nitroglycerin.
  • D-BTTN is more stable than nitroglycerin and has superior performance such as a low freezing point, low volatility, and high thermal stability (see Non-Patent Document 3).
  • D-BTTN can also be used as a raw material for pharmaceuticals such as anticancer agents and antiviral agents.
  • the D-BT is industrially produced by reducing a maleic ester using a reducing agent or a catalyst (see Non-Patent Document 4).
  • a method of producing dimethylmaleic acid by stoichiometric reduction with NaBH 4 is often used.
  • this method when 1 t of maleate is reduced, 2 to 5 t of borate is formed as a by-product, which is not suitable for mass production.
  • a reduction method using copper chromite or rubidium as a catalyst is also known.
  • harmful hexavalent chromium is released and there is a concern about an environmental load.
  • yeast S. cerevisiae
  • yeast is resistant to various stresses and is easily genetically recombined, it is considered to be a microorganism suitable for substance production using lignocellulosic biomass.
  • yeast S. cerevisiae
  • iron-sulfur (Fe-S) protein is the key to improving productivity (see Patent Documents 1 and 2).
  • the production of D-BT in yeast is currently not successful.
  • the present inventors have advanced research for the purpose of developing a method capable of efficiently producing D-BT from D-xylose using yeast (S. cerevisiae).
  • yeast S. cerevisiae
  • all substances are omitted as D-forms with the head D- omitted.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • A a poly which contains at least one heterologous polynucleotide encoding iron-sulfur protein (Fe-S protein) and (B) at least one protein which controls biosynthesis of iron-sulfur clusters A recombinant host cell overexpressed with nucleotides.
  • C at least one heterologous polynucleotide encoding another enzyme involved in the xylose metabolic pathway.
  • the recombinant host cell according to any one of [1] to [3], wherein the protein that controls biosynthesis of the iron-sulfur cluster is TYW1.
  • the other enzyme involved in the xylose metabolic pathway is at least one selected from the group consisting of xylose dehydrogenase (XylB) and 2-keto acid decarboxylase (KDC).
  • XylB xylose dehydrogenase
  • KDC 2-keto acid decarboxylase
  • a recombinant host cell according to any one of [6] The recombinant host cell according to any one of [1] to [5], wherein the host cell is a yeast cell.
  • the yeast cells may be selected from the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Pichia, Hansenula, Candida, Candida, C From the genus Kluyveromyces, Yarrowia, Isatchenkenia, Schwaniomyces, Trichosporon, Y, and Zamarenol. In at least one yeast cell selected That recombinant host cell according to [6]. [8] A method for producing D-butanetriol using the recombinant host cell according to any one of [1] to [7].
  • a method for producing D-butanetriol comprising (a) at least one heterologous polynucleotide encoding iron-sulfur protein, and at least one protein that controls biosynthesis of iron-sulfur clusters
  • a method for producing D-butanetriol which comprises the steps of: preparing a recombinant host cell overexpressing a polynucleotide encoding the gene; and (b) growing the recombinant host cell.
  • D-BT can be efficiently produced from D-xylose using yeast (S. cerevisiae).
  • FIG. 1 is a diagram showing a pathway for synthesizing butanetriol from xylose.
  • FIG. 2 is a diagram showing (A) xylose consumption, (B) xylonate production, and (C) BT production of the BD, BD-mdlC, and BD ⁇ D strains.
  • FIG. 3 is a diagram showing (A) xylose consumption, (B) xylonate production, and (C) BT production of three types of KDC (MdlC, Aro10, KivD) introduced strains.
  • FIG. 4 is a diagram showing (A) xylose consumption, (B) xylonate production, and (C) BT production of the kivD expression-enhanced strain.
  • FIG. 1 is a diagram showing a pathway for synthesizing butanetriol from xylose.
  • FIG. 2 is a diagram showing (A) xylose consumption, (B) xylonate production, and (C) BT production of
  • FIG. 5 is a diagram showing the maximum BT production amount of each recombinant host cell line.
  • FIG. 6 is a diagram showing a production procedure of the BD ⁇ D-2tkdcA-TYW1 strain and the BD ⁇ D-2tkdcA-tTYW1 strain.
  • FIG. 7 is a diagram showing the XylD activity of each recombinant host cell line.
  • FIG. 8 is a graph showing changes over time in the amount of BT produced by the BD ⁇ D-2tkdcA-TYW1 strain and the BD ⁇ D-2tkdcA-tTYW1 strain.
  • the recombinant host cell of the present invention comprises (A) at least one heterologous polynucleotide encoding an iron sulfur protein (Fe-S protein), and (B) at least one species controlling iron sulfur cluster biosynthesis. It is a cell in which a polynucleotide encoding a protein is overexpressed.
  • (C) preferably further comprises at least one heterologous polynucleotide encoding another enzyme involved in the xylose metabolic pathway.
  • the heterologous polynucleotide and the like contained in the recombinant host cell of the present invention will be described.
  • the recombinant host cell of the present invention comprises (A) at least one heterologous protein encoding iron-sulfur protein (Fe-S protein). Including polynucleotides.
  • the recombinant host cell of the present invention is used for efficient substance production, and this iron-sulfur protein functions as an enzyme necessary for substance production in the host cell. By introducing the heterogeneous iron-sulfur protein into the host cell, a metabolic pathway that is originally not provided in the host cell is activated, and a desired substance can be produced.
  • the host cell used in the present invention may be any host cell known to those skilled in the art, and includes prokaryotic cells and eukaryotic cells such as bacterial cells, fungal cells, yeast cells, mammalian cells, insect cells or plant cells.
  • Exemplary bacterial cells include Escherichia, Salmonella, Streptomyces, Pseudomonas, Staphylococcus, or any of the Bacillus species, above. Examples include Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella symphimurium, Salmonella symphimurium, and Salmonella symphimurium. Etc. It is.
  • yeast cell As the host cell used in the present invention, a yeast cell is preferable because it is resistant to various stresses and easy to recombine.
  • yeast cells include, for example, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Pichia, Hansenula, Candida, Candida, Genus Kluyveromyces, Yarrowia, Isatchenkenia, Swwanomyces, Trichosporon, Yamadam, and Zyma. Of these, Saccharomyces is more preferable, and specific examples include YPH499 strain, S288C strain, YPH500 strain, BY4741 strain, BY4742 strain, W303 strain, CEN.
  • PK BY4743, FY4, AB972, A364A, DC5, X2180-1A, D-273-10B, FL100, JK9-3d, RM11-1a, SEY6210, SEY6211, Sigma1278b Strains, SK1 strain, XJ24-24a strain, Y55 strain, YPH501 strain and the like can be used.
  • the PK strain is more preferred, and the YPH499 strain is particularly preferred.
  • iron-sulfur protein refers to a protein characterized by the presence of iron-sulfur (Fe—S) clusters containing two, three and four iron centers with variable oxidation numbers.
  • Iron-sulfur (Fe-S) clusters include 2Fe-2S clusters, 4Fe-4S clusters, 3Fe-4S clusters, etc.
  • the iron-sulfur protein (Fe-S protein) in the present invention is a protein having an iron-sulfur (Fe-S) cluster among enzymes involved in xylose metabolism in cells, such as xylonate dehydratase (XylD). Is mentioned.
  • Examples of typical XylD protein (peptide) and polynucleotides encoding the same include those shown in Tables 1 and 2 below.
  • Tables 1 and 2 below registered names of typical XylD proteins (peptides) and polynucleotides encoding the same are registered in GenomeNet. A specific sequence corresponding to each registered name is disclosed in http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?K14275+K22186+K22396+4.2.1.82+R02429.
  • the polynucleotide encoding the XylD protein (peptide) the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 is particularly preferable.
  • a protein (and a polynucleotide encoding the same) having at least 90%, preferably 95% or more identity to each specific sequence, and having XylD activity (and a polynucleotide encoding the same) Is understood to be usable in the present invention.
  • polynucleotide means both a single nucleic acid and a plurality of nucleic acids, and includes nucleic acid molecules such as mRNA, plasmid RNA, full-length cDNA and fragments thereof.
  • the polynucleotide is composed of any polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, and may be either modified or unmodified. It may be single-stranded or double-stranded, or a mixture of both.
  • the “heterologous polynucleotide” refers to a polynucleotide encoding a protein derived from a species different from the recombinant host cell of the present invention.
  • the recombinant host cell of the present invention is a yeast cell
  • examples of the heterologous polynucleotide include polynucleotides derived from bacteria such as Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. It also includes a natural coding region or a portion thereof reintroduced into the host cell in a form different from the corresponding natural gene. For example, those not in their natural location in the genome are included.
  • the purpose of introducing a heterologous polynucleotide into the recombinant host cell of the present invention is to introduce a polynucleotide encoding a protein such as an enzyme that the host cell does not originally have from a different species to metabolize a xylose metabolic pathway or the like. To make the pathway function and / or enhance.
  • the cell may be transformed with an expression vector containing the polynucleotide.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it contains the gene of the present invention in an expressible state, and a vector suitable for each host can be used.
  • the expression vector of the present invention can be prepared by constructing an expression cassette by inserting a transcription promoter upstream of the heterologous polynucleotide and optionally a terminator downstream, and inserting this cassette into the expression vector.
  • the heterologous polynucleotide can be inserted between the promoter and / or terminator in the vector without constructing an expression cassette. Good.
  • a method using a restriction enzyme, a method using topoisomerase, or the like can be used. Further, if necessary at the time of insertion, an appropriate linker may be added. Ribosome binding sequences such as an SD sequence and a Kozak sequence are known as base sequences important for translation into amino acids, and these sequences can be inserted upstream of the gene. A part of the amino acid sequence encoded by the gene may be substituted with the insertion.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited as long as it retains the gene of the present invention, and a vector suitable for each host can be used.
  • examples of the vector include plasmid DNA, bacteriophage DNA, retrotransposon DNA, artificial chromosome DNA and the like.
  • the method for introducing the expression vector into the host is not particularly limited as long as it is a method suitable for the host.
  • Examples of usable methods include electroporation, calcium ion, spheroplast, lithium acetate, calcium phosphate, and lipofection.
  • Expression of the polynucleotide in the recombinant host cell can be quantified according to methods known to those skilled in the art. For example, it can be represented by the percentage of the total cellular protein of the polypeptide encoded by the polynucleotide.
  • the recombinant host cell of the present invention is a polynucleotide encoding at least one protein that controls the biosynthesis of iron-sulfur clusters.
  • the recombinant host cell of the present invention is a polynucleotide encoding at least one protein that controls the biosynthesis of iron-sulfur clusters.
  • “Proteins that control iron-sulfur cluster biosynthesis” include proteins that control iron-sulfur cluster synthesis, proteins involved in iron-sulfur cluster transport in cells, and iron sensing, uptake, and utilization Any protein or the like may be used, and there is no particular limitation as long as it finally affects the biosynthesis of iron-sulfur clusters.
  • the polynucleotide encoding the protein that controls the sensing, uptake, and utilization of iron may be a gene contained in an iron (Fe) regulon that is a group of genes involved in iron metabolism.
  • the polynucleotide encoding TYW1 which is a protein involved in the storage of iron-sulfur (Fe-S) clusters in the cell, is used as the polynucleotide.
  • Fe-S iron-sulfur
  • By overexpressing this TYW1-encoding polynucleotide in the host cell iron uptake into the cell is promoted and iron sulfur clusters are sufficiently supplied to improve the activity of iron sulfur proteins (such as XylD). It is thought that it can be made.
  • Examples of typical TYW1 protein (peptide) and polynucleotides encoding the same include those shown in Tables 3 to 5 below and those used in Examples of the present application.
  • Tables 3 to 5 below show registered names of typical TYW1 proteins (peptides) and polynucleotides encoding the same registered in GenomeNet. A specific sequence corresponding to each registered name is disclosed in http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:4.1.3.44.
  • the polynucleotide (B) the polynucleotides of SEQ ID NOs: 2 and 3 are preferable from the viewpoint of the effect of efficiently improving BT production in a recombinant host cell.
  • a protein (and a polynucleotide encoding the same) which has at least 90%, preferably 95% or more identity to each specific sequence and which has TYW1 activity (and a polynucleotide encoding the same) Is understood to be usable in the present invention.
  • the term “overexpression” as used herein refers to expression higher than the endogenous expression of the same or related polynucleotide or gene.
  • a heterologous polynucleotide or gene has its expression higher than the expression of an equivalent endogenous gene or its expression than the expression of the same polynucleotide or gene introduced by means that do not overexpress the polynucleotide or gene. If is high, it corresponds to overexpression.
  • Any means of increasing the copy number of the polynucleotide in the host cell can be used to overexpress the polynucleotide. For example, a high copy number plasmid, a plasmid with a controllable copy number may be used, or overexpression by multiple chromosomal integrations.
  • the cell may be transformed with an expression vector containing the polynucleotide.
  • Method of introducing polynucleotide refers to the above-mentioned “Method of introducing polynucleotide”.
  • cells that are not overexpressed for comparison may not be transformed, or may be transformed with an expression vector that does not contain the polynucleotide.
  • Expression or overexpression of the polynucleotide in the recombinant host cell can be quantified according to methods known to those skilled in the art. For example, it can be represented by the percentage of the total cellular protein of the polypeptide encoded by the polynucleotide.
  • confirmation by Western blotting using an antibody capable of detecting the polypeptide encoded by the polynucleotide, or real-time PCR using a primer that specifically detects the polynucleotide can do.
  • Excessive expression by confirming that the expression level of the polypeptide encoded by the polynucleotide in the overexpressed cell is larger than that in the cell that was not overexpressed, preferably more than twice. It can be judged that it was expressed.
  • At least one heterologous polynucleotide “xylose metabolic pathway” encoding other enzymes involved in the xylose metabolic pathway means xylose to ethanol, xylitol, D-xylonate, D-1,2,4-butanetriol (D-BT), a route that produces 1,4-butanediol, and the like, for example, the XR / XDH route, the XI route, the route known as the Dahms / Weimberg route, and these routes can be used industrially Such modified routes are also included.
  • it refers to an enzymatic pathway for producing D-butanetriol from D-xylose.
  • “Another enzyme involved in the xylose metabolic pathway” refers to an enzyme that is not classified as iron-sulfur protein (Fe-S protein) among the enzymes involved in the xylose metabolic pathway.
  • Fe-S protein iron-sulfur protein
  • xylose dehydrogenase, decarboxylase, xylulose phosphorylase, xylitol dehydrogenase, xylose reductase and the like can be mentioned. Of these, in the present invention, xylose dehydrogenase and decarboxylase involved in the production of D-butanetriol from D-xylose are preferred.
  • Exemplary xylose dehydrogenase proteins (peptides) and polynucleotides encoding them include those shown in Tables 6-10 below.
  • Tables 6 to 8 below show registered names of typical xylose dehydrogenase proteins (peptides) and polynucleotides encoding the same registered in GenomeNet. The specific sequence corresponding to each registered name is http://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?ec:1.1.1.175, or http://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget ? ec: 1.1.1.179.
  • the xylose dehydrogenase protein the one encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 4 is particularly preferable (XylB) from the viewpoint of the effect of efficiently improving BT production in a recombinant host cell.
  • XylB branched 2-keto acid decarboxylase
  • KdcA 2-ketoisovalerate decarboxylase
  • Rho10 phenylpyruvate decarboxylase
  • mdlC mdlC
  • Keto acid decarboxylase (KdcA) and 2-ketoisovalerate decarboxylase (KivD etc.) are more preferable, and the polynucleotide of SEQ ID NO: 5 encodes from the viewpoint of the effect of efficiently improving BT production in a recombinant host cell.
  • Branched 2-keto acid decarboxylase (KdcA) is particularly preferred.
  • the cell is transformed with an expression vector containing the polynucleotide by a method known to those skilled in the art. be able to. For details of the method, see the section “Introduction of Polynucleotide” above.
  • xylose dehydrogenase, xylonate dehydratase, and 2-keto acid decarboxylase (KDC) are transformed into S. cerevisiae.
  • Incorporation into cerevisiae enables BT production from xylose.
  • a protein (TYW1) involved in regulation of the iron uptake amount in yeast the activity of xylonate dehydratase, which is an iron sulfur protein, can be improved, and the BT production ability can be remarkably improved.
  • the present invention also provides a method for producing D-butanetriol using the above-described recombinant host cell of the present invention.
  • the method for producing D-butanetriol of the present invention comprises (a) at least one heterologous polynucleotide encoding iron-sulfur protein, and encodes at least one protein that controls biosynthesis of iron-sulfur clusters.
  • D-butanetriol can be collected from the recombinant host cell culture obtained in step (b) above, recovered from the production system according to a conventional method, and appropriately concentrated and purified. For example, after separating and removing cells (cells) from a culture solution containing D-butanetriol, D-butanetriol is fractionated by distillation or the like.
  • the method for producing D-butanetriol of the present invention can also be referred to as a method using the above-described recombinant host cell of the present invention. That is, the above-mentioned culture solution of the recombinant host cell of the present invention can be recovered, recovered from the production system according to a conventional method, and appropriately concentrated and purified. For example, after separating and removing cells (cells) from a culture solution containing D-butanetriol, D-butanetriol is fractionated by distillation or the like.
  • BT 1,2,4-butanetriol
  • yeast S. cerevisiae
  • BT can be produced from xylose in a five step reaction.
  • xylose is converted to xylonolactone by xylose dehydrogenase.
  • Xylonolactone is converted to xylonate by xylonolactonase or spontaneous ring opening.
  • Xylonate is converted to 2-keto-3-deoxy-xylonate (KDX) by xylonate dehydratase.
  • KDX is converted to 3,4-dihydroxybutanal by 2-keto acid decarboxylase.
  • xylononolactone is not necessarily required because xylononolactone spontaneously opens and is converted to xylonate.
  • Yeast has a plurality of alcohol dehydrogenases, and it is considered that the reaction at the fifth stage can be catalyzed by any of the alcohol dehydrogenases. Therefore, first, a strain into which three kinds of genes encoding xylose dehydrogenase, xylonate dehydratase and 2-keto acid decarboxylase (KDC) were introduced was prepared.
  • KDC 2-keto acid decarboxylase
  • a YPH499 ⁇ GRE3 strain lacking GRE3 having endogenous xylose reductase activity was prepared.
  • a xylose dehydrogenase gene (xylB) and a xylonate dehydratase gene (xylD) derived from Caulobacterium crecentus were introduced to prepare a BD strain. Subsequently, E.
  • a BD-mdlC strain was prepared by introducing a KDC gene (mdlC) derived from Pseudomonas ptida, which is often used in BT production in E. coli.
  • mdlC KDC gene
  • mdlC KDC gene derived from Pseudomonas ptida
  • Nau W, Molefe MN, Frost JW Microbial Synthesis of the Energetic Material Precursor 1,2,4-Butanetriol. Journal of the American Chemical Society 2003 (Scheme 2): 12998-12999.
  • Cao Y, u , Xian M, Liu H Biotechnological production of 1,2,4-butanetriol: An efficient process to synthesize energetic material precursor from renewable biomass.
  • BT production hosts include yeast strains and S. cerevisiae. cerevisiae YPH499 [MATa ura3-52 lys2-801, ade2-101 trp1-63 his3- ⁇ 200 leu2- ⁇ 1 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)] was used.
  • yeast culture amino acids and nucleic acids are added to SD medium [6.7 g / L yeast nitrogen base without amino acids (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), 20 g / L glucose] according to the nutritional requirements of the strain.
  • YPD medium [10 g / L yeast extract, 20 g / L Bacto-peptone (Difco Laboratories), 20 g / L glucose] was used. The culture was performed at 30 ° C.
  • Yeast transformation is described in Chen et al. (Chen DC, Yang BC, Kuo TT: One-step transformation of yeast in stationary phase. Curr Genet 1992, 21: 83-84.) According to the One-step transformation method using lithium acetate. . All genes were introduced into the yeast genome by homologous recombination. S. In the cerevisiae YPH499 strain, GRE3 was replaced with a G418 (drug) resistance gene to create a GRE3-disrupted strain YPH499 ⁇ GRE3 strain.
  • the DNA fragment for GRE3 disruption was prepared using BY4741 ⁇ GRE3 genomic DNA obtained from Yeast Selection Mat-A Complete Set (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) as a template and primer dGRE3FAG-3AGAGAG-3AGGAG-3AG : SEQ ID NO: 6): and dGRE3 R (5′-CCGTGGAGTCTTCGTCAGAGTAGTG-3 ′: SEQ ID NO: 7).
  • the plasmid pTS-A-xylBD cut with EcoRV was introduced into the YPH499 ⁇ GRE3 strain to create a BD strain.
  • the plasmid PIL-mdlC was used as a template for the BD strain with primers PIL trans F (5′-ATCATCTCCGATGAAGCCTCCG-3 ′: SEQ ID NO: 8) and PIL trans R (5′-ATCACCAAAACATTGTCTGTGTG-3 ′: SEQ ID NO: 9).
  • the BD-mdlC strain was prepared by transforming a fragment containing LEU2 marker and mdlC prepared by PCR.
  • cultivated for 24 hours at 30 degreeC and 150 rpm. 10 mL of sterilized D. cells W. And then inoculated in a fermentation medium (10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 10 g / L glucose, 10 g / L xylose) so that OD600 5. The fermentation test was performed at 30 ° C. and 200 rpm. Sampling was performed every 24 h, and the culture supernatant was measured using HPLC and GC-MS.
  • Glucose and xylose concentrations in the fermentation medium were determined using high performance liquid chromatography (HPLC) equipped with an SPR-Pb column (7.8 mm ⁇ 250 mm, particle size 8 ⁇ m; Shimadzu, Kyoto, Japan) and a RID-10A detector (HPLC) ( (Shimadzu).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • SPR-Pb column 7.8 mm ⁇ 250 mm, particle size 8 ⁇ m; Shimadzu, Kyoto, Japan
  • RID-10A detector HPLC
  • GC-MS gas chromatography / mass spectrometer
  • MSTFA N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide
  • a GC-MS (GCMS-QP2010 Ultra; Shimadzu) was used with a CP-Sil 8CB column (30 m length ⁇ 0.25 mm id, film thickness of 0.25 ⁇ m; Agilent).
  • the setting of each parameter of GC-MS is as follows; the temperature of the sample vaporizing chamber was set to 230 ° C. The sample injection volume was 1 ⁇ L and the split ratio was set to 1:25. Helium was used as the carrier gas and the flow rate was set at 1.12 mL / min.
  • the column temperature was kept at 80 ° C. for 2 minutes, then heated to 330 ° C. at 15 ° C./min, and kept at 330 ° C. for 6 minutes.
  • the interface temperature and ion source temperature were set to 250 ° C. and 200 ° C., respectively.
  • Ionization Electrode impact ionization; EI
  • EI Electrode impact ionization
  • FASTT Fast Automated Scan / SIM
  • Scan mode 85-500 m / z
  • SIM Selectedion monitoring
  • Xylonate dehydratase (XylD) activity was measured by the thiobarbituric acid method (Kim S, Lee SB: Identification and characterization of Sulfolobus solfataricus D-gluconate dehydratase: a key enzyme in the non-phosphorylated Entner-Doudoroff pathway. Biochem J 2005, 387: 271-280.).
  • the enzyme reaction solution 400 ⁇ L; 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.1), 5 mM, MgCl 2 , 12 mM D-xylonate, 50 ⁇ L cell extract) was reacted at 30 ° C. for 10 minutes.
  • the enzymatic reaction was terminated by adding 100 ⁇ L of 2.0 M HCl. After adding 125 ⁇ L of 25 mM periodic acid solution (dissolved in 0.125 MH 2 SO 4 ) to the reaction solution (50 ⁇ L) and reacting at 20 ° C. for 20 minutes, 250 ⁇ L of 2% (w / v) sodium arsenite solution (Dissolved in 0.5M HCl) was added to terminate the reaction. Finally, 1 mL of thiobarbituric acid aqueous solution was added and reacted at 100 ° C. for 10 minutes to generate a red chromophore. In order to enhance the color intensity, an equal amount of DMSO was added to the reaction solution after cooling to room temperature.
  • BT could be produced by introducing three types of genes, xylB, xylD, and mdlC. Moreover, production of BT was confirmed even in a BD strain into which mdlC had not been introduced, suggesting that conversion from KDX to DHB was also performed by endogenous KDC. In addition, BT production was very small in the two strains BD and BD-mdlC. One possible cause is the accumulation of the intermediate product xylonate in the medium. In culture 96h, xylonate was 7.2 ⁇ 0.4 g / L and 7.6 ⁇ in BD strain and BD-mdlC, respectively. Accumulated in 0.4 g / L medium ((B) of FIG. 2).
  • the ⁇ integration is a method of introducing a target gene by homologous recombination using a ⁇ sequence, which is a repetitive sequence at the end of a retrotransposon (Ty factor) on a yeast chromosome. Since there are multiple ⁇ sequences on the chromosome, multiple copies of the target gene can be introduced by ⁇ integration (Parekh RN, Shaw MR, Wittrup KD: An integrating vector for tunable, high copy, stable integration into the dispersed Ty delta sites of Saccharomyces cerevisiae Biotechnol Prog 1996, 12: 16-21.).
  • the xylD expression-enhanced strain BD ⁇ D was created by introducing multiple copies of xylD onto the chromosome of the BD strain by the ⁇ integration method. Specifically, in order to create a multicopy-introduced strain of xylD, a plasmid p ⁇ W-xylD cut with AscI was introduced into the BD strain to create a BD ⁇ D strain.
  • the BD ⁇ D strain showed a slight decrease in the production rate of Xylonate until 48 h of culture, but no significant decrease was observed in the final amount of accumulated Xylonate ( 7.5 ⁇ 0.2 g / L) ((B) of FIG. 2).
  • the amount of BT produced by the BD ⁇ D strain in culture 96h was 41.2 ⁇ 4.4 mg / L, which was higher than that of BD-mdlC even though the KDC gene was not introduced (FIG. 2 ( C)).
  • KDC keto acid decarboxylase
  • mdlC was introduced into the BD ⁇ D strain in the same manner as described above to prepare a BD ⁇ D-mdlC strain. Further, BD ⁇ D-ARO10 strain and BD ⁇ D-kivD strain were prepared by transforming BD ⁇ D strain with pIL-ARO10 or pIL-kivD cut with EcoRV.
  • the accumulated amount of Xylonate in the culture 96h was 7.9 ⁇ 0.0, 5.8 ⁇ 0.3, 6.4 ⁇ 0.2 g / L for BD ⁇ D-mdlC, BD ⁇ D-ARO10, and BD ⁇ D-pkivd, respectively.
  • the accumulation amount was reduced as compared with BD ⁇ D (7.5 ⁇ 0.2 g / L) ((B) in FIG. 3).
  • the maximum value of BT production was 69.5 ⁇ 6.5 mg / L for BD ⁇ D-mdlC, but 105.7 ⁇ 7.8 mg / L for BD ⁇ D-ARO10, and 384.3 ⁇ 26 for BD ⁇ D-kivD.
  • kivD is the most S.D. It was suitable for BT production in C. cerevisiae, and the kivD-introduced strain showed an approximately 4.5-fold improvement in BT production compared to the mdlC-introduced strain.
  • kivD (2-ketoisovalerate decarboxylase)
  • TDH3 promoter which is stronger in expression than PGK1 in the presence of xylose
  • BD ⁇ D-tkivD was created by introducing kivD controlled by the TDH3 promoter into BD ⁇ D.
  • BD ⁇ D-tkivD another copy of kivD controlled by the TDH3 promoter was introduced into BD ⁇ D-tkivD to create BD ⁇ D-2tkivD having a total of 2 copies of kivD.
  • the BD ⁇ D strain was transformed with pIL-pTDH3-kivD cleaved with EcoRV to create a BD ⁇ D-tkivD strain.
  • a BD ⁇ D-2tkivD strain was prepared by transforming BD ⁇ D-kivD strain with pIU-pTDH3-kivD.
  • BD ⁇ D-tkivD and BD ⁇ D-2tkivD were subjected to a fermentation test using a medium containing 10 g / L glucose and 10 g / L xylose.
  • a medium containing 10 g / L glucose and 10 g / L xylose In the kivD expression-enhanced strains (BD ⁇ D-tkivD and BD ⁇ D-2tkivD), there was almost no difference in xylose consumption or Xylate production compared to BD ⁇ D-kivD in which kivD was expressed with the PGK1 promoter (Fig. 4 (A), (B)).
  • the production amounts of BD ⁇ D-tkivD and BD ⁇ D-2tkivD in fermentation 96h were 577.3 ⁇ 3.6 mg / L and 767.9 ⁇ 45.9 mg / L (FIG. 4 (C)), respectively.
  • BT production was about 1.6 times and 2.1 times that of kivD.
  • the BT yields of BD ⁇ D-tkivD and BD ⁇ D-2tkivD were 9.7% and 12.9%, respectively.
  • BD ⁇ D-tkdcA strain was prepared by transforming BD ⁇ D strain with pIL-pTDH3-kdcA cleaved with EcoRV to create a kdcA expression strain. Further, BD ⁇ D-2tkdcA strain was prepared by transforming BD ⁇ D-tkdcA strain with pIU-pTDH3-kdcA.
  • Plasmid construction All plasmids were generated using the In-fusion HD cloning Kit (Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA). C. secretus xylB and xylD were synthesized and purchased by GenScript (Piscataway, NJ, USA). L. lactis KdcA was synthesized and purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).
  • pTS-A-xylBD PCR was performed using xylB F (SEQ ID NO: 10) and xylBR (SEQ ID NO: 11) with codon-optimized xylB (GenScript) as a template to connect the TDH3 promoter and TDH3 terminator to xylB.
  • the fragment obtained by the above was connected to pATP405 (Ishii et al., 2014) cleaved with NotI-HF (New England Biolabs).
  • a pTDH3-xylB-tTDH3 fragment was prepared by PCR using the resulting plasmid as a template and primers pTDH3-xylB F (SEQ ID NO: 12) and pTDH3-xylBR (SEQ ID NO: 13).
  • a pSED1-xylD-tSAG1 fragment was prepared by PCR using the resulting plasmid as a template and primers pSED1-xylD F (SEQ ID NO: 18) and pSED1-xylD R (SEQ ID NO: 19).
  • the pSED1-xylD-tSAG1 fragment and the pTDH3-xylB-tTDH3 fragment were cleaved with NotI-HF (New England Biolabs) and XhoI (New England Biolabs), cloned into pGK402 (Ishii et al. 9).
  • A-xylBD was constructed.
  • p ⁇ W-xylD In order to connect the ADH1 promoter and terminator to xylD, pATP405 (Ishii et al., 2014) cleaved with Pmel was used as a template, and xylD 2F (SEQ ID NO: SEQ ID NO: Codon optimized) was used as a template. The fragment obtained by PCR using 20) and xylD 2R (SEQ ID NO: 21) was cloned by In-fusion.
  • PCR was performed using primers pADH1-xylD F (SEQ ID NO: 22) and pADH1-xylD R (SEQ ID NO: 23) to obtain an ADH1p-xylD-ADH1t fragment.
  • This fragment was cloned into a ⁇ integration vector p ⁇ W (Yamada et al. 2009) cleaved with SmaI to prepare a plasmid ⁇ W xylD for ⁇ integration of xylD.
  • PCR was performed using two sets of primers tdh3p F (SEQ ID NO: 24) and tdh3p R (SEQ ID NO: 25) or adh1t F (SEQ ID NO: 26) and adh1t R (SEQ ID NO: 27).
  • the TDH3 promoter and ADH1 terminator were amplified.
  • PCR was performed using primers tdh3p F (SEQ ID NO: 24) and adh1t R (SEQ ID NO: 27) to prepare a TDH3p-ADH1t fragment.
  • TDH3p-ADH1t fragment was digested with NotI-HF (New England Biolabs) and XhoI (New England Biolabs) and cloned into pGK405 (Ishii et al., 2009) and pG406 (Ishii et al. 9). tdh3p-adh1t and pIU tdh3p-adh1t were generated.
  • pIAur-TYW1 and pIAur-tTYW1 PCR were performed using pGK405 (Ishii et al., 2009) as a template, primers AUR-PGK F (SEQ ID NO: 30) and AUR-PGK R (SEQ ID NO: 31), and PGK1 Promoter and PGK1 terminator were amplified. This fragment was cloned into pAUR101 (purchased from Takara Bio) cleaved with SphI-HF (New England Biolabs) and SacI-HF (New England Biolabs) to create pGK-Aur.
  • pGK405 Ishii et al., 2009
  • primers AUR-PGK F SEQ ID NO: 30
  • AUR-PGK R SEQ ID NO: 31
  • PGK1 Promoter and PGK1 terminator were amplified. This fragment was cloned into pAUR101 (purchased from Takara Bio) cleave
  • pGK-Aur cut with SmaI TYW1 and tTYW1 obtained by PCR using cerevisiae genomic DNA as a template and primers TYW1 F (SEQ ID NO: 32), TYW1 R (SEQ ID NO: 33), TYW1 F (SEQ ID NO: 32), and tTYW1 R (SEQ ID NO: 34)
  • the fragment was cloned by In-fusion to create pIAur-TYW1 and pIAur-tTYW1.
  • the DNA fragment for GRE3 disruption was prepared by using the primer dGRE3AGTGAG-5AAG5GAG-3AGTGAG5GAG-3GAG-3GAT3GAG-3GAT3GAG-3GAT3GAG-3GAT3GAG-3GAT3GAG-3GAT3GAG-3GAT3GAG-3GAT3GAG-3GAT3GAG-3GAT3GAG-3GAT3GAG-3GAT3GAG-3GAT3GAG-3GAT5GAG-3AGT '; SEQ ID NO: 6) and dGRE3 R (5'-CCGTGGAGTCTTCGTCAGAGTAGTG-3'; SEQ ID NO: 7).
  • BY4741 ⁇ GRE3 genomic DNA used for the template is Dr. Extracted using GenTLE (yeast) high-recovery kit (Takara, Shiga, Japan).
  • Plasmid pTS-A-xylBD was digested with EcoRV-HF (New England Biolabs) and transformed into YPH499 ⁇ GRE3 strain to prepare BD strain.
  • BD ⁇ D strain The plasmid p ⁇ W-xylD was digested with AscI (New England Biolabs) and transformed into the BD strain to prepare the BD ⁇ D strain.
  • BD ⁇ D-tkdcA strain Plasmid pIL-kdcA was digested with EcoRV-HF (New England Biolabs) and transformed into BD ⁇ D strain to create BD ⁇ D-tkdcA strain.
  • BD ⁇ D-2tkdcA strain Plasmid pIU-kdcA was digested with EcoRV-HF (New England Biolabs) and transformed into BD ⁇ D strain to create BD ⁇ D-2tkdcA strain.
  • Plasmid pIAur-TYW1 was digested with BsiWI (New England Biolabs) and transformed into BD ⁇ D-2tkdcA strain to create BD ⁇ D-2tkdcA-TYW1 strain.
  • Plasmid pIAur-tTYW1 was digested with BsiWI (New England Biolabs) and transformed into BD ⁇ D-2tkdcA strain to create BD ⁇ D-2tkdcA-tTYW1 strain.
  • FIG. 8 shows the change over time in the production amount of BT.
  • XylD activity was increased by overexpressing TYW1 (0.26 U / mg total protein ⁇ 0.40 U / mg total protein).
  • the maximum production of BT increased significantly (1.15 g / L ⁇ 1.75 g / L).
  • D-BT can be efficiently produced from D-xylose using yeast (S. cerevisiae).

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Abstract

本発明は、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて、Ｄ－キシロースからＤ－ＢＴを効率的に生産できる方法を開発することを目的とする。　本発明は、（Ａ）鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ－Ｓタンパク質）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチド、及び（Ｂ）上記鉄硫黄タンパク質の生合成を制御するタンパク質をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞である。また、（Ｃ）キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。

Description

組換え宿主細胞及びＤ－ブタントリオールの新規製造方法
　本発明は、組換え宿主細胞及びＤ－ブタントリオールの新規製造方法に関する。
　微生物のキシロース代謝経路としては、ＸＲ／ＸＤＨ経路やＸＩ経路がよく知られている。これらの経路を利用して、Ｄ－キシロースからエタノールやキシリトールの生産も行われている。近年、上記ＸＲ／ＸＤＨ経路やＸＩ経路とは全く異なるキシロース代謝経路であるＤａｈｍｓ／Ｗｅｉｍｂｅｒｇ経路を利用して、Ｄ－キシロネート、Ｄ－１，２，４－ブタントリオール（Ｄ－ＢＴ）、１，４－ブタンジオール等の有用な物質の生産ができることが報告されている（非特許文献１から３参照）。
　上記Ｄ－ＢＴは様々な医薬品や化成品の原料として利用できるだけでなく、ニトロ化することで、エネルギー物質であるＤ－１，２，４，－ブタントリオールトリナイトレート（Ｄ－ＢＴＴＮ）となる（非特許文献３参照）。このＤ－ＢＴＴＮはロケットの推進剤（プロペラント）や、ニトログリセリンの代替品として利用できる物質である。また、Ｄ－ＢＴＴＮは、ニトログリセリンより衝撃に対して安定であり、かつ凝固点が低い、揮発性が低い、熱安定性が高い等のより優れた性能を有する（非特許文献３参照）。またＤ－ＢＴＴＮは、抗がん剤や抗ウイルス剤等の医薬品の原料としても利用出来るものである。
　上記Ｄ－ＢＴは、マレイン酸エステルを、還元剤又は触媒を用いて還元することで工業的に生産されている（非特許文献４参照）。具体的には、ジメチルマレイン酸をＮａＢＨ４により化学量論的に還元して生産する方法がよく用いられている。しかし、この方法では１ｔのマレイン酸エステルを還元した場合、副生成物として２～５ｔのホウ酸塩ができてしまい、大量生産には向いていない。また、銅クロマイト又はルビジウムを触媒に用いた還元法も知られているが、銅クロマイトを用いる方法では有害な六価クロムが放出され環境への負荷が懸念される。一方、ルビジウムを用いる方法では２，９００～５，０００ｐｓｉの高圧と１３５℃の高温が必要であり、さらに副生成物の生成も問題となる。また、ルビジウム自体が非常に高価であることもスケールアップする際に不都合となる（非特許文献３参照）。
　そのような中、バイオテクノロジーを用いた効率的なＤ－ＢＴの生産方法が模索されてきた。例えば、微生物を用いたＤ－ＢＴの生産経路はＮｉｕ　ｅｔ　ａｌ．（非特許文献３参照）により報告されており、近年大腸菌を宿主とした多数の生産報告がある（非特許文献５、６参照）。
　一方、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は種々のストレスに耐性があり、遺伝子組換えも容易であることから、リグノセルロース系バイオマスを原料にした物質生産に適した微生物であると考えられている。しかし現在のところ、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）による上記の生産経路を利用したＤ－ＢＴの生産報告はない。また、このような酵母を利用した発酵生産において、鉄硫黄（Ｆｅ－Ｓ）タンパク質の機能発現が生産性向上の鍵を握っていることが分かってきているが（特許文献１、２参照）、酵母におけるＤ－ＢＴの生産において、目下のところ成功には至っていない。
国際公開公報２０１１－１０３３００号 国際公開公報２０１４－１６２０６３号
Toivari MH, Ruohonen L, Richard P, Penttila M, Wiebe MG: Saccharomyces cerevisiae engineered to produce D-xylonate. Appl Microbiol Biotechnol 2010, 88:751-760 Toivari M, Nygard Y, Kumpula E, Vehkomaki M-L, Bencina M, Valkonen M, Maaheimo H, Andberg M, Koivula A, Ruohonen L, Penttila M, Wiebe MG: Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for bioconversion of D-xylose to D-xylonate. Metab Eng 2012, 14:427-36 Niu W, Molefe MN, Frost JW: Microbial Synthesis of the Energetic Material Precursor 1,2,4-Butanetriol. Journal of the American Chemical Society 2003(Scheme 2):12998-12999 Monteith, M.J., Schoefield, D., Bailey M: Process for the preparation of butanetriols. 1998:WO1998008793 Cao Y, Niu W, Guo J, Xian M, Liu H: Biotechnological production of 1,2,4-butanetriol: An efficient process to synthesize energetic material precursor from renewable biomass. Sci Rep 2015, 5(November):18149 Valdehuesa KNG, Liu H, Ramos KRM, Park SJ, Nisola GM, Lee WK, Chung WJ: Direct bioconversion of d-xylose to 1,2,4-butanetriol in an engineered Escherichia coli. Process Biochem 2014, 49:25-32
　このような状況の中、本発明者らは、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて、Ｄ－キシロースからＤ－ＢＴを効率的に生産できる方法を開発することを目的として研究を進めた。なお、以降は、特に表記がない限り、各物質については全てＤ体として頭のＤ－は省略する。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ由来のキシロースデヒドロゲナーゼ、キシロネートデヒドラターゼ、そしてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ由来の２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに組み込むことで、キシロースからのＢＴ生産が可能となることを確認した。また、ＢＴ生産性を高めるために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのＢＴ生産に適したＫＤＣのスクリーニングを行った。さらに、酵母において鉄取り込み量の調節に関与するタンパクの発現を制御することで、鉄硫黄タンパク質であるキシロネートデヒドラターゼ活性を向上させ、ＢＴ生産能の著しい改善に成功した。即ち、本発明の要旨は、以下に示すとおりである。
［１］（Ａ）鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ－Ｓタンパク質）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ（Ｂ）鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた、組換え宿主細胞。
［２］（Ｃ）キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドをさらに含む、［１］に記載の組換え宿主細胞。
［３］上記鉄硫黄タンパク質が、キシロネートデヒドラターゼ（ＸｙｌＤ）である、［１］又は［２］に記載の組換え宿主細胞。
［４］上記鉄硫黄クラスターの生合成を制御するタンパク質が、ＴＹＷ１である、［１］から［３］のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
［５］上記キシロース代謝経路に関与するその他の酵素が、キシロースデヒドロゲナーゼ（ＸｙｌＢ）、及び２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）から成る群より選択される少なくとも１種である、［２］から［４］のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
［６］上記宿主細胞が、酵母細胞である、［１］から［５］のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
［７］上記酵母細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ブレタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジタ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロッケラ属（Ｋｌｏｃｃｋｅｒａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサトケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、スワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、及びパチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）からなる群より選択される、少なくとも１種の酵母細胞である、［６］に記載の組換え宿主細胞。
［８］［１］から［７］のいずれかに記載の組換え宿主細胞を用いる、Ｄ－ブタントリオールの製造方法。
［９］Ｄ－ブタントリオールを製造する方法であって、（ａ）鉄硫黄タンパク質をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた組換え宿主細胞を調製する工程、並びに（ｂ）上記組換え宿主細胞を増殖させる工程を含むことを特徴とするＤ－ブタントリオールの製造方法。
　本発明によると、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて、Ｄ－キシロースからＤ－ＢＴを効率的に生産することができる。
図１は、キシロースからブタントリオールが合成される経路を示した図である。 図２は、ＢＤ，ＢＤ－ｍｄｌＣ，ＢＤδＤ株の（Ａ）キシロース消費量，（Ｂ）キシロネート生産量，（Ｃ）ＢＴ生産量を示す図である。 図３は、３種類のＫＤＣ（ＭｄｌＣ，Ａｒｏ１０，ＫｉｖＤ）導入株の（Ａ）キシロース消費量，（Ｂ）キシロネート生産量，（Ｃ）ＢＴ生産量を示す図である。 図４は、ｋｉｖＤ発現強化株の（Ａ）キシロース消費量，（Ｂ）キシロネート生産量，（Ｃ）ＢＴ生産量を示す図である。 図５は、各組換え宿主細胞株の最大ＢＴ生産量を示す図である。 図６は、ＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ－ＴＹＷ１株及びＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ－ｔＴＹＷ１株の作製手順を示す図である。 図７は、各組換え宿主細胞株のＸｙｌＤ活性を示す図である。 図８は、ＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ－ＴＹＷ１株及びＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ－ｔＴＹＷ１株のＢＴ生産量の経時変化を示す図である。
　以下、本発明の組換え宿主細胞、及びＤ―ブタントリオールの製造方法について詳細に説明する。なお、本明細書において、ＤＮＡやベクターの調製等の分子生物学的手法は、特に明記しない限り、当業者に公知の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。また、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。
＜組換え宿主細胞＞
　本発明の組換え宿主細胞は、（Ａ）鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ－Ｓタンパク質）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、（Ｂ）鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた細胞である。また、（Ｃ）キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。以下に本発明の組換え宿主細胞が含む、上記異種ポリヌクレオチド等について説明する。
（Ａ）鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ－Ｓタンパク質）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチド
　本発明の組換え宿主細胞は（Ａ）鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ－Ｓタンパク質）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含む。本発明の組換え宿主細胞は、効率的な物質生産のために用いられるものであり、この鉄硫黄タンパク質は、宿主細胞内での物質生産に必要な酵素として機能するものである。上記異種由来の鉄硫黄タンパク質を宿主細胞に導入することにより、元来この宿主細胞が備えていない代謝経路が働くようになり、所望の物質生産が可能となる。
　本発明に用いる宿主細胞は、当業者にとって周知の宿主細胞のいずれでもよく、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、菌類細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞が含まれる。例示的細菌細胞には、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の任意の種が含まれ、上記には、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）等が含まれる。
　本発明に用いる宿主細胞としては、種々のストレスに耐性があり、遺伝子組換えも容易であることから、酵母細胞が好ましい。酵母細胞としては、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ブレタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジタ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロッケラ属（Ｋｌｏｃｃｋｅｒａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサトケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、スワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）等が挙げられる。これらのうち、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）であることがより好ましく、具体的には、例えばＹＰＨ４９９株、Ｓ２８８Ｃ株、ＹＰＨ５００株、ＢＹ４７４１株、ＢＹ４７４２株、Ｗ３０３株、ＣＥＮ．ＰＫ株、ＢＹ４７４３株、ＦＹ４株、ＡＢ９７２株、Ａ３６４Ａ株、ＤＣ５株、Ｘ２１８０－１Ａ株、Ｄ－２７３－１０Ｂ株、ＦＬ１００株、ＪＫ９－３ｄ株、ＲＭ１１－１ａ株、ＳＥＹ６２１０株、ＳＥＹ６２１１株、Ｓｉｇｍａ１２７８ｂ株、ＳＫ１株、ＸＪ２４－２４ａ株、Ｙ５５株、ＹＰＨ５０１株等を用いることができる。中でも、ＹＰＨ４９９株、Ｓ２８８Ｃ株、ＹＰＨ５００株、ＢＹ４７４１株、ＢＹ４７４２株、Ｗ３０３株、ＣＥＮ．ＰＫ株がさらに好ましく、ＹＰＨ４９９株が特に好ましい。
　本発明において、「鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ－Ｓタンパク質）」とは、酸化数が可変の二、三及び四鉄中心を含む鉄硫黄（Ｆｅ－Ｓ）クラスターの存在で特徴づけられるタンパク質をいう。鉄硫黄（Ｆｅ－Ｓ）クラスターには、２Ｆｅ－２Ｓクラスター、４Ｆｅ－４Ｓクラスター、３Ｆｅ－４Ｓクラスター等があり、鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ－Ｓタンパク質）の種類により要求する鉄硫黄（Ｆｅ－Ｓ）クラスターは異なる。本発明における鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ－Ｓタンパク質）は、細胞内でのキシロース代謝に関与する酵素のうちで鉄硫黄（Ｆｅ－Ｓ）クラスターを有するタンパク質であり、例えば、キシロネートデヒドラターゼ（ＸｙｌＤ）等が挙げられる。
　典型的なＸｙｌＤタンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、以下の表１～２に示すものが挙げられる。なお、下記表１～２には、典型的なＸｙｌＤタンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとして、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔに登録されているものの登録名を示している。各登録名に対応する具体的な配列は、http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?K14275+K22186+K22396+4.2.1.82+R02429に開示されている。ＸｙｌＤタンパク質（ペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１のポリヌクレオチドが特に好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、かつＸｙｌＤ活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明において「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸及び複数の核酸の両方を意味し、ｍＲＮＡ等の核酸分子、プラスミドＲＮＡ、全長のｃＤＮＡ及びその断片等を含む。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドから構成され、修飾、非修飾のどちらでもよい。一本鎖でも二本鎖でもよく、両者の混合でもよい。
　本発明において「異種ポリヌクレオチド」とは、本発明の組換え宿主細胞とは異なる種由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチドをいう。例えば、本発明の組換え宿主細胞が酵母細胞である場合、異種ポリヌクレオチドとしては、大腸菌、緑膿菌等のバクテリア由来のポリヌクレオチド等が挙げられる。また、対応する天然遺伝子とは異なる形態で宿主細胞中に再導入された天然コード領域又はその一部も含む。例えば、ゲノム中のその天然位置にはないものも含まれる。なお、本発明の組換え宿主細胞において異種ポリヌクレオチドを導入する目的は、元来その宿主細胞が有していない酵素等のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを異種から導入し、キシロース代謝経路等の代謝経路を機能させ及び／又は亢進させることである。
（ポリヌクレオチドの導入方法）
　細胞に異種ポリヌクレオチドを発現させるには、例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させればよい。発現ベクターは、本発明の遺伝子を発現可能な状態で含むものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。
　本発明の発現ベクターは、上記異種ポリヌクレオチドの上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することにより作製することができる。あるいは、発現ベクターに転写プロモーターおよび／またはターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターおよび／またはターミネーターを利用して、その間に当該異種ポリヌクレオチドを挿入すればよい。
　ベクターに上記異種ポリヌクレオチドを挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入することもできる。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。
　本発明において使用されるベクターは、本発明の遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。
　宿主への発現ベクターの導入方法は、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではない。利用可能な方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。組換え宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの発現は、当業者に公知の方法に従って定量化することができる。例えば、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの、細胞タンパク質全体のパーセントによって表すことができる。また、形質転換した細胞の細胞抽出液を用い、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出できる抗体を使用したウエスタンブロッティング、あるいは当該ポリヌクレオチドを特異的に検出するプライマーを使用したリアルタイムＰＣＲなどにより確認することができる。
（Ｂ）鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　本発明の組換え宿主細胞は、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた細胞である。「鉄硫黄クラスターの生合成を制御するタンパク質」としては、鉄硫黄クラスターの合成を制御するタンパク質、細胞内で鉄硫黄クラスターの運搬に関与しているタンパク質、鉄の感知・取り込み・利用を制御するタンパク質等のいずれであってもよく、最終的に鉄硫黄クラスターの生合成に影響を与えるタンパク質であれば特に限定されない。ここで、鉄の感知・取り込み・利用を制御するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、鉄の代謝に関与する遺伝子群である鉄（Ｆｅ）レギュロンに含まれる遺伝子であってもよい。
　（Ｂ）ポリヌクレオチドとしては組換え宿主細胞でのＢＴ産生を向上させる効果の観点から、細胞内での鉄硫黄（Ｆｅ－Ｓ）クラスターの貯蔵に関与するタンパク質であるＴＹＷ１をコードするポリヌクレオチドが好ましい。このＴＹＷ１をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において過剰発現させることにより、鉄の細胞内への取り込みが促進され、鉄硫黄クラスターが充分に供給されることにより鉄硫黄タンパク質（ＸｙｌＤなど）の活性を向上させることができると考えられる。典型的なＴＹＷ１タンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、以下の表３～５に示すもの及び本願実施例で用いたものが挙げられる。なお、下記表３～５には、典型的なＴＹＷ１タンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとして、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔに登録されているものの登録名を示している。各登録名に対応する具体的な配列は、http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:4.1.3.44に開示されている。なお、（Ｂ）ポリヌクレオチドとしては、組換え宿主細胞でのＢＴ産生を効率的に向上させる効果の観点から、配列番号２及び３のポリヌクレオチドが好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、かつＴＹＷ１活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明において「過剰発現」という用語は、本明細書で使用される場合、同一又は関連のポリヌクレオチド若しくは遺伝子の内因性発現よりも高い発現を指す。また、異種ポリヌクレオチド又は遺伝子は、同等の内因性遺伝子の発現よりもその発現が高ければ、あるいは、ポリヌクレオチド又は遺伝子を過剰発現しない手段によって導入された同じポリヌクレオチド又は遺伝子の発現よりもその発現が高ければ、過剰発現に該当する。宿主細胞においてポリヌクレオチドのコピー数を増大させる任意の手段を使用してポリヌクレオチドを過剰発現させることができる。例えば、高コピー数プラスミド、又は制御可能なコピー数を有するプラスミドを使用してもよいし、多数の染色体組込みによって過剰発現としてもよい。
　細胞にポリヌクレオチドを過剰発現させるには、例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させればよい。方法の詳細は、上述の「ポリヌクレオチドの導入方法」の項を参照されたい。なお、比較に用いる過剰発現させない細胞は、形質転換させなくてもよいし、当該ポリヌクレオチドを含まない発現ベクターで形質転換させてもよい。組換え宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの発現又は過剰発現は、当業者に公知の方法に従って定量化することができる。例えば、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの、細胞タンパク質全体のパーセントによって表すことができる。また、形質転換した細胞の細胞抽出液を用い、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出できる抗体を使用したウエスタンブロッティング、あるいは当該ポリヌクレオチドを特異的に検出するプライマーを使用したリアルタイムＰＣＲなどにより確認することができる。過剰発現させなかった細胞と比較して、過剰発現させた細胞で当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの発現量が多いこと、好ましくは２倍以上になっていることを確認すること等により、過剰発現されたと判断することができる。
（Ｃ）キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチド
　「キシロース代謝経路」とは、キシロースからエタノール、キシリトール、Ｄ－キシロネート、Ｄ－１，２，４－ブタントリオール（Ｄ－ＢＴ）、１，４－ブタンジオール等を生産する経路をいい、例えば、ＸＲ／ＸＤＨ経路、ＸＩ経路、Ｄａｈｍｓ／Ｗｅｉｍｂｅｒｇ経路として知られている経路、これらの経路を工業的に利用できるように改変した経路等も含まれる。好ましくは、Ｄ－キシロースからＤ－ブタントリオールを生産するための酵素経路を指す。
　「キシロース代謝経路に関与するその他の酵素」とは、キシロース代謝経路に関与する酵素のうちで鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ－Ｓタンパク質）に分類されない酵素を指す。例えば、キシロースデヒドロゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、キシルロースリン酸化酵素、キシリトール脱水素酵素、キシロース還元酵素等が挙げられる。これらのうち、本発明においては、Ｄ－キシロースからのＤ－ブタントリオールの生産に関与するキシロースデヒドロゲナーゼ、デカルボキシラーゼが好ましい。典型的なキシロースデヒドロゲナーゼタンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、以下の表６～１０に示すものが挙げられる。なお、下記表６～８には、典型的なキシロースデヒドロゲナーゼタンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとして、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔに登録されているものの登録名を示している。各登録名に対応する具体的な配列は、http://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?ec:1.1.1.175、又はhttp://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?ec:1.1.1.179に開示されている。
　なお、キシロースデヒドロゲナーゼタンパク質としては、組換え宿主細胞でのＢＴ産生を効率的に向上させる効果の観点から、配列番号４のポリヌクレオチドがコードするものが特に好ましい（ＸｙｌＢ）。また、デカルボキシラーゼタンパク質としては、分岐鎖２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｄｃＡ）、２－ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ等）、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ａｒｏ１０等）、ｍｄｌＣが好ましく、分岐鎖２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｄｃＡ）、２－ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ等）がより好ましく、組換え宿主細胞でのＢＴ産生を効率的に向上させる効果の観点から配列番号５のポリヌクレオチドがコードする分岐鎖２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｄｃＡ）が特に好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、かつ２－ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　なお、細胞にキシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを発現させるには、例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させる等、当業者に公知の方法により行うことができる。方法の詳細は上述の「ポリヌクレオチドの導入」の項を参照されたい。
　以上説明したとおり、本発明によると、キシロースデヒドロゲナーゼ、キシロネートデヒドラターゼ、そして２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに組み込むことで、キシロースからのＢＴ生産が可能となる。さらに、酵母において鉄取り込み量の調節に関与するタンパク（ＴＹＷ１）の発現を制御することで、鉄硫黄タンパク質であるキシロネートデヒドラターゼ活性を向上させ、ＢＴ生産能を著しく改善することができる。
＜本発明のＤ－ブタントリオールの製造方法＞
　本発明は、上述の本発明の組換え宿主細胞を用いたＤ－ブタントリオールの製造方法も提供する。本発明のＤ－ブタントリオールの製造方法は、（ａ）鉄硫黄タンパク質をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた組換え宿主細胞を調製する工程、並びに（ｂ）上記組換え宿主細胞を増殖させる工程を含むことを特徴とする。なお、鉄硫黄タンパク質をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた組換え宿主細胞を調製する方法については、各文言の意味も合わせて、上述の組換え宿主細胞の項の記載を参照されたい。
　Ｄ－ブタントリオールは、上記（ｂ）工程によって得られた組換え宿主細胞の培養液を回収し、常法に従い、製造系から回収し、適宜濃縮、精製することができる。例えば、Ｄ－ブタントリオールを含む培養液より細胞（菌体）を分離除去した後、蒸留等によりＤ－ブタントリオールを分別する。
　また、本発明のＤ－ブタントリオールの製造方法は、上述の本発明の組換え宿主細胞を用いる方法ということもできる。即ち、上述の本発明の組換え宿主細胞の培養液を回収し、常法に従い、製造系から回収し、適宜濃縮、精製することができる。例えば、Ｄ－ブタントリオールを含む培養液より細胞（菌体）を分離除去した後、蒸留等によりＤ－ブタントリオールを分別する。
　以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
１．１，２，４－ブタントリオール（ＢＴ）生産酵母の作製
　はじめに、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でＢＴを生産できることを確かめるための実験を行った。図１に示すように、ＢＴは５段階の反応でキシロースから生産することができる。まず、キシロースはキシロースデヒドロゲナーゼによりキシロノラクトンに変換される。キシロノラクトンはキシロノラクトナーゼ又は自然に開環してキシロネートに変換される。キシロネートはキシロネートデヒドラターゼにより、２－ケト－３－デオキシ－キシロネート（ＫＤＸ）に変換される。そして、ＫＤＸは２－ケト酸デカルボキシラーゼによって３，４－ジヒドロキシブタナールに変換される。最後に３，４－ジヒドロキシブタナールはアルコールデヒドロゲナーゼによってＢＴに変換される。これら５段階の反応の内、キシロノラクトンは自然に開環してキシロネートに変換されるため、キシロノラクトナーゼは必ずしも必要ではない。また酵母は複数のアルコールデヒドロゲナーゼを持っており、いずれかのアルコールデヒドロゲナーゼにより５段階目の反応も触媒できると考えられる。そこでまず、キシロースデヒドロゲナーゼ、キシロネートデヒドラターゼ、２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）をコードする３種類の遺伝子を導入した株を作成した。
　酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＰＨ４９９株において、キシロースからのキシリトール生成を防ぐために、内生のキシロースレダクターゼ活性をもつＧＲＥ３を欠損させたＹＰＨ４９９ΔＧＲＥ３株を作成した。この株にＢＴ生産のためにまずは、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｒｅｃｅｎｔｕｓ由来のキシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｘｙｌＢ）とキシロネートデヒドラターゼ遺伝子（ｘｙｌＤ）を導入して、ＢＤ株を作成した。続いて、この株に、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＢＴ生産においてよく用いられているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｔｉｄａ由来のＫＤＣ遺伝子（ｍｄｌＣ）を導入することでＢＤ－ｍｄｌＣ株を作成した。（Niu W, Molefe MN, Frost JW: Microbial Synthesis of the Energetic Material Precursor 1,2,4-Butanetriol. Journal of the American Chemical Society 2003(Scheme 2):12998-12999.；Cao Y, Niu W, Guo J, Xian M, Liu H: Biotechnological production of 1,2,4-butanetriol: An efficient process to synthesize energetic material precursor from renewable biomass. Sci Rep 2015, 5(November):18149.；Valdehuesa KNG, Liu H, Ramos KRM, Park SJ, Nisola GM, Lee WK, Chung WJ: Direct bioconversion of d-xylose to 1,2,4-butanetriol in an engineered Escherichia coli. Process Biochem 2014, 49:25-32.；Zhang N, Wang J, Zhang Y, Gao H: Metabolic pathway optimization for biosynthesis of 1,2,4-butanetriol from xylose by engineered Escherichia coli. Enzyme Microb Technol 2016, 93-94:51-58.）ＢＴ生産能を評価するために、ＢＤ株及びＢＤ－ｍｄｌＣ株を用いて１０ｇ／Ｌのグルコースと１０ｇ／Ｌのキシロースを含む培地での発酵試験を行い、代謝物及び各酵素活性を測定した。具体的な実験方法を以下に説明する。
　ＢＴ生産の宿主には、酵母株、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＹＰＨ４９９［ＭＡＴａ　ｕｒａ３－５２　ｌｙｓ２－８０１　ａｄｅ２－１０１　ｔｒｐ１－　６３　ｈｉｓ３－Δ２００　ｌｅｕ２－Δ１　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）］を用いた。酵母の培養には、ＳＤ培地［６．７ｇ／Ｌ　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ），２０ｇ／Ｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ］に株の栄養要求性に合わせてアミノ酸・核酸を加えたもの、又はＹＰＤ培地［１０ｇ／Ｌ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，２０ｇ／Ｌ　Ｂａｃｔｏ－ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），２０ｇ／Ｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ］を用いた。培養は３０°Ｃで行った。
　本研究で作成したプラスミドは全て、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて作成した。簡単には、制限酵素処理したベクターの末端１５塩基の相同配列を、クローニングする塩基配列の両端にＰＣＲで付加して、ベクターとクローニング配列、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素を混合し５０℃で１５ｍｉｎインキュベートすることで作成した。この研究で使用した遺伝子のうち、Ｃ．ｃｒｅｃｅｎｔｕｓ由来のｘｙｌＢ及びｘｙｌＤ、Ｐ．Ｐｕｔｉｄａ由来のｍｄｌＣ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ由来ＫｉｖｄはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのコドンに最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，　ＮＪ，　ＵＳ）にて人工合成した。本研究で作成したプラスミドを下記表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　酵母の形質転換はＣｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（Chen DC, Yang BC, Kuo TT: One-step transformation of yeast in stationary phase. Curr Genet 1992, 21:83-84.）によって報告されている、酢酸リチウムを用いたＯｎｅ－ｓｔｅｐ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ法に従い行った。また全ての遺伝子は酵母のゲノム上に相同組替えにより導入した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＹＰＨ４９９株においてＧＲＥ３をＧ４１８（薬剤）耐性遺伝子で置換することで、ＧＲＥ３破壊株ＹＰＨ４９９ΔＧＲＥ３株を作成した。ＧＲＥ３破壊用のＤＮＡ断片の作成は、Ｙｅａｓｔ　Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　Ｍａｔ－Ａ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｓｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）より取得したＢＹ４７４１ΔＧＲＥ３のゲノムＤＮＡをテンプレートに、プライマーｄＧＲＥ３　Ｆ（５′－ＡＣＴＧＧＡＴＴＡＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧ－３′：配列番号６）：及びｄＧＲＥ３　Ｒ（５′－ＣＣＧＴＧＧＡＧＴＣＴＴＣＧＴＣＡＡＧＴＡＧＴＴＧ－３′：配列番号７）を用いて、ＰＣＲにより作成した。
　ＢＴ生産の試作株作成の為に、ＹＰＨ４９９ΔＧＲＥ３株にＥｃｏＲＶで切断したプラスミドｐＴＳ－Ａ－ｘｙｌＢＤを導入して、ＢＤ株を作成した。続いてＢＤ株に、プラスミドＰＩＬ－ｍｄｌＣをテンプレートにプライマーＰＩＬ　ｔｒａｎｓ　Ｆ（５′－ＡＴＣＡＴＣＴＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＣＣＧ－３′：配列番号８）及びＰＩＬ　ｔｒａｎｓ　Ｒ（５′－ＡＴＣＡＣＣＡＡＡＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧ－３′：配列番号９）を用いて、ＰＣＲにより作成した、ＬＥＵ２マーカー及びｍｄｌＣを含む断片を形質転換して、ＢＤ－ｍｄｌＣ株を作成した。
（発酵試験）
　発酵試験に用いる菌体は、まず５ｍＬのＳＤ培地で２４ｈ培養した（６．７ｇ／Ｌ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｄｅｔｒｏｉｔ，　ＭＩ，　ＵＳＡ）　ａｎｄ　２０　ｇ／Ｌ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ）。そして、５０ｍＬのＹＰＤ培地にＯＤ６００＝０．１となるように植菌して３０℃、１５０ｒｐｍで２４ｈ培養した。菌体を１０ｍＬの滅菌したＤ．Ｗ．で２度洗浄した後、発酵用培地（１０ｇ／Ｌ　ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，１０ｇ／Ｌ　グルコース，１０ｇ／Ｌ　キシロース）にＯＤ６００＝５となるように植菌して、全量２０ｍＬの系で、３０℃、２００ｒｐｍで発酵試験を行った。２４ｈ毎にサンプリングを行い、培養上清はＨＰＬＣ及びＧＣ－ＭＳを用いて測定した。
（代謝物測定試験）
　発酵培地中のグルコース及びキシロース濃度は、ＳＰＲ－Ｐｂカラム（７．８ｍｍ×２５０ｍｍ，ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｓｉｚｅ　８μｍ；Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）とＲＩＤ－１０Ａ検出器を装着した、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて分析した。ＨＰＬＣは８０℃で０．６ｍＬ／ｍｉｎの流速で稼働した。
　ＢＴ及びキシロネートの濃度は、ガスクロマトグラフィー／質量分析計（ＧＣ－ＭＳ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）により分析した。５μＬの培養上清に、２μＬの１０ｇ／Ｌリビトールを内部標準物質として加えて、ＣｅｎｔｒｉＶａｐ　Ｂｅｎｃｈｔｏｐ　Ｖａｃｕｕｍ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ　Ｃｉｔｙ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて乾燥させた。ＧＣ－ＭＳ分析のためのトリメチルシリル化は以下の手順で行った；乾燥させたサンプルに、ピリジンに溶解させた１００μＬの２０ｍｇ／ｍＬ　Ｏ－メチルヒドロキシルアミン塩酸塩溶液を加え９０分間反応させた（１２００ｒｐｍ，３０℃；Ｍ－ＢＲ－０２２ＵＰ；Ｔａｉｔｅｃ，Ｓａｉｔａｍａ，Ｊａｐａｎ）。そして、５０μＬのＮ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）を加えて、３０分間反応させた（１２００ｒｐｍ　ａｔ　３７℃；Ｍ－ＢＲ－０２２ＵＰ；Ｔａｉｔｅｃ）。サンプルは室温で遠心分離（３０００ｇ，５分）して上清を分析に用いた。
　ＧＣ－ＭＳ（ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０　Ｕｌｔｒａ；Ｓｈｉｍａｄｚｕ）には、ＣＰ－Ｓｉｌ　８ＣＢカラム（３０ｍ　ｌｅｎｇｔｈ×０．２５ｍｍ　ｉ．ｄ．，ｆｉｌｍ　ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ　ｏｆ０．２５μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ）を装着して用いた。ＧＣ－ＭＳの各パラメーターの設定は以下の通りである；試料気化室の温度は２３０°Ｃに設定した。サンプル注入量は１μＬでスプリット比は１：２５に設定した。ヘリウムをキャリアーガスに用いて、流量は１．１２ｍＬ／ｍｉｎに設定した。カラム温度は、８０℃で２分間保温したのちに、１５℃／ｍｉｎで３３０℃まで昇温して、３３０℃で６分間保温した。インターフェース温度及びイオン源の温度はそれぞれ、２５０℃と２００℃に設定した。イオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｉｍｐａｃｔ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ；ＥＩ）は７０ｅＶで行った。分析はＦａｓｔ　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｓｃａｎ／ＳＩＭ（ＦＡＳＴＴ）モードにより、Ｓｃａｎモード（８５－５００ｍ／ｚ）及びＳｅｌｅｃｔｅｄ　ｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＳＩＭ）モード（ｍ／ｚ　１０３，ａｎｄ　１２９　ｆｏｒ　ＢＴ，ａｎｄ　ｍ／ｚ　１０３　ｆｏｒ　ｒｉｂｉｔｏｌ）を並行して行った。
（酵素活性測定試験）
　キシロネートデヒドラターゼ（ＸｙｌＤ）活性測定は、チオバルビツール酸法により行った（Kim S, Lee SB: Identification and characterization of Sulfolobus solfataricus D-gluconate dehydratase: a key enzyme in the non-phosphorylated Entner-Doudoroff pathway. Biochem J 2005, 387:271-280.）。酵素反応溶液（４００μＬ；５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．１），５ｍＭ，ＭｇＣｌ２，１２ｍＭ　Ｄ－ｘｙｌｏｎａｔｅ，５０μＬ細胞抽出液）は３０℃で１０分間反応させた。酵素反応は１００μＬの２．０Ｍ　ＨＣｌを加えることで終結させた。反応溶液（５０μＬ）に１２５μＬの２５ｍＭ過ヨウ素酸溶液（０．１２５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４に溶解）を加え２０℃で２０分間反応させたのち、２５０μＬの２％（ｗ／ｖ）亜ヒ酸ナトリウム溶液（０．５Ｍ　ＨＣｌに溶解）を加え反応を終結した。最後に１ｍＬのチオバルビツール酸水溶液を加えて、１００℃で１０分間反応させることで、赤色の発色団を生成させた。発色強度を増強させるために、室温まで冷却したのち等量のＤＭＳＯを反応溶液に加えた。吸光度は５４９ｎｍで測定して、発色団のモル吸光係数には６．７８×１０４Ｍ－１ｃｍ－１を用いた（SKOZA L, MOHOS S: Stable Thiobarbituric Acid Chromophore with Dimethyl Sulphoxide. J Biol Chem 1976, 159:457-462.）。
（結果）
　上記試験の結果、ＢＤ株及びＢＤ－ｍｄｌＣ株において、グルコースは培養２４ｈで全て消費されていた。一方、両株においてキシロースは培養２４ｈまでに約７ｇ／Ｌが消費され、最終的に培養９６ｈで約９ｇ／Ｌが消費されていた（図２の（Ａ））。培養９６ｈにおけるＢＴの生産量は、ＢＤ株およびＢＤ－ｍｄｌＣ株で１９．３±５．４ｍｇ／Ｌと３１．６±１．９ｍｇ／Ｌであった（図２の（Ｃ））。よって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでもｘｙｌＢ、ｘｙｌＤ、ｍｄｌＣの３種類の遺伝子を導入する事でＢＴが生産できる事が確認できた。また、ｍｄｌＣを導入していないＢＤ株でもＢＴの生産が確認できたことから、内生のＫＤＣによってもＫＤＸからＤＨＢへの変換が行なわれていることが示唆された。なお、ＢＤ及びＢＤ－ｍｄｌＣの２株においてＢＴ生産量は非常に少なかった。原因の１つとして、中間生成物のキシロネートの培地中への蓄積が考えられ、培養９６ｈにおいて、ＢＤ株及びＢＤ－ｍｄｌＣにおいて、キシロネートはそれぞれ７．２±０．４ｇ／Ｌと７．６±０．４ｇ／Ｌ培地中に蓄積していた（図２の（Ｂ））。
２．δインテグレーション法によるｘｙｌＤの過剰発現
　上記のＢＤ－ｍｄｌＣの発酵試験より、中間生成物のキシロネートが培地中に多量に蓄積していることが確認された。原因としては、キシロネートからＫＤＸへの反応を触媒するＸｙｌＤの活性が低いことが考えられた。そこで、δインテグレーション法によりｘｙｌＤを染色体上に多コピー導入することで発現を強化して、ＸｙｌＤ活性の向上を試みた。なお、δインテグレーションとは、酵母染色体上のレトロトランスホポゾン（Ｔｙ因子）末端の繰り返し配列であるδ配列をターゲットに、目的遺伝子を相同組換えで導入する方法である。δ配列は染色体上に複数あるため、δインテグレーションにより目的遺伝子を多コピー導入できる（Parekh RN, Shaw MR, Wittrup KD: An integrating vector for tunable, high copy, stable integration into the dispersed Ty delta sites of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Prog 1996, 12:16-21.）。
　ＢＤ株の染色体上に、δインテグレーション法によりｘｙｌＤを多コピー導入することで、ｘｙｌＤ発現強化株ＢＤδＤを作成した。具体的には、ｘｙｌＤの多コピー導入株作成の為に、ＢＤ株にＡｓｃＩで切断したプラスミドｐδＷ－ｘｙｌＤを導入して、ＢＤδＤ株を作成した。
（結果）
　ＢＤδＤ株においてＸｙｌＤ活性が向上していることを確かめるために、上記方法に従ってＸｙｌＤの活性測定を行った。その結果、ＢＤ株及びＢＤδＤ株のＸｙｌＤ活性はそれぞれ、０．２２１±０．０１２及び０．２６９±０．０１４（Ｕ／ｍｇ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）で、ｘｙｌＤの発現強化により約１．２倍のＸｙｌＤ活性の向上が見られた。続いて、ＸｙｌＤの発現強化がＢＴ生産能に与える影響を調べるためにＢＤδＤ株を用いて、グルコース及びキシロースの混合培地で発酵試験を行った。ＢＤδＤ株はＢＤ株およびＢＤ－ｍｄｌＣ株と比べて、培養４８ｈまでを見るとＸｙｌｏｎａｔｅの生産速度はわずかに減少していたが、最終的なＸｙｌｏｎａｔｅの蓄積量に有意な減少は見られなかった（７．５±０．２ｇ／Ｌ）（図２の（Ｂ））。一方、培養９６ｈにおけるＢＤδＤ株のＢＴ生産量は４１．２±４．４ｍｇ／Ｌで、ＫＤＣ遺伝子を導入していないにも関わらずＢＤ－ｍｄｌＣより生産量が増加していた（図２の（Ｃ））。
　Ｘｙｌｏｎａｔｅの蓄積量がほとんど変化しなかった理由としては、酵母細胞内でのＸｙｌＤ活性が非常に低いことから、過剰発現により酵素を増産してもキシロネートの蓄積を解消するのに十分な活性を得られなかったことが考えられる。また、ＸｙｌＤによって、キシロネートはＫＤＸ（２－Ｋｅｔｏ－３－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｘｙｌｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）へと変換されるが、このＫＤＸ以降の代謝が弱いことが、キシロネートの代謝を停滞させている可能性がある。
３．２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）の検討（スクリーニング）
　ＫＤＸ（２－Ｋｅｔｏ－３－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｘｙｌｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）を特異的にＤＨＢ（Ｄ－３，４－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎａｌ）に変換する酵素は知られておらず、この反応が大腸菌でのＢＴ生産のボトルネックになっていると考えられている。しかしながら、これまで導入するＫＤＣ（２－ケト酸デカルボキシラーゼ；２－ｋｅｔｏａｃｉｄ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）の違いがＢＴ生産に与える影響を調べた研究はない。そこで、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＫＤＸからＤＨＢへの反応を高効率で行うＫＤＣのスクリーニングを行った。ＢＤ株やＢＤδＤ株でもＢＴが生産されていたことから、ＫＤＸに特異性のある酵母内生のＫＤＣが存在していることが考えられる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内生のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ａｒｏ１０）は広い基質特異性を持っていることから、ＫＤＸからＤＨＢへの反応を触媒している可能性があると考えた。また、過去の報告からＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ由来の２－ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）も、ｍｄｌＣに加えてＫＤＸからＤＨＢへの反応を触媒することがわかっている（Tai Y, Xiong M, Jambunathan P, Wang JJ, Wang JJ, Stapleton C, Zhang K: Engineering nonphosphorylative metabolism to generate lignocellulose-derived products. Nat Chem Biol 2016, 12:247-253.）。そこでＰ．ｐｔｉｄａ由来のｍｄｌＣに加えて、ＡＲＯ１０及びｋｉｖＤをＢＤδＤ株に導入する候補として選択した。具体的には、ＢＤδＤ株に上記と同様の方法でｍｄｌＣを導入して、ＢＤδＤ－ｍｄｌＣ株を作成した。また、ＢＤδＤ株にＥｃｏＲＶで切断したｐＩＬ－ＡＲＯ１０又はｐＩＬ－ｋｉｖＤを形質転換することで、ＢＤδＤ－ＡＲＯ１０株及びＢＤδＤ－ｋｉｖＤ株を作成した。
　ｍｄｌＣ、ＡＲＯ１０、ｋｉｖＤの３種類のＫＤＣをそれぞれ導入した株、ＢＤδＤ－ｍｄｌＣ、ＢＤδＤ－ＡＲＯ１０、ＢＤδＤ－ｋｉｖＤを用いて、１０ｇ／Ｌのグルコースと１０ｇ／Ｌのキシロースを含む培地での発酵試験を行い、ＫＤＣの違いがＢＴ生産に与える影響を調べた。３株においてキシロースの消費速度や消費量はほとんど変化が見られなかった。しかし、培養９６ｈにおけるＸｙｌｏｎａｔｅの蓄積量はＢＤδＤ－ｍｄｌＣ、ＢＤδＤ－ＡＲＯ１０、ＢＤδＤ－ｐｋｉｖｄでそれぞれ７．９±０．０，５．８±０．３，６．４±０．２ｇ／Ｌで、ＡＲＯ１０及びｋｉｖＤを導入した株ではＢＤδＤ（７．５±０．２ｇ／Ｌ）に比べて蓄積量の減少がみられた（図３の（Ｂ））。またＢＴ生産量の最大値は、ＢＤδＤ－ｍｄｌＣでは６９．５±６．５ｍｇ／Ｌであったが、ＢＤδＤ－ＡＲＯ１０では１０５．７±７．８ｍｇ／Ｌ、ＢＤδＤ－ｋｉｖＤでは３８４．３±２６．３ｍｇ／Ｌとなった（図３の（Ｃ））。よってｍｄｌＣ、ＡＲＯ１０、ｋｉｖＤの中ではｋｉｖＤが最もＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＢＴ生産に適しており、ｍｄｌＣ導入株に比べてｋｉｖＤ導入株では約４．５倍のＢＴ生産量の向上を示した。
４．ｋｉｖＤの発現強化
　上記のとおり、３種類のＫＤＣ（ｍｄｌＣ、ＡＲＯ１０、ｋｉｖＤ）導入株の発酵結果より、ＫＤＣの種類がＢＴ生産に大きく影響することが明らかとなった。上記の実験では、３種のＫＤＣは全てＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰＧＫ１プロモーターを用いて発現させていた。そこで、キシロース存在下でＰＧＫ１より強い発現強度を示すＴＤＨ３プロモーターの制御下でｋｉｖＤ（２－ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ）を発現することで、更なるＢＴ生産量の向上を試みた（Lu C, Jeffries T: Shuffling of Promoters for Multiple Genes To Optimize Xylose Fermentation in an Engineered Saccharomyces cerevisiae Strain. Appl Environ Microbiol 2007, 73:6072-6077.）。ＢＤδＤに、ＴＤＨ３プロモーターで制御されるｋｉｖＤを導入することでＢＤδＤ－ｔｋｉｖＤを作成した。更にＢＤδＤ－ｔｋｉｖＤに、ＴＤＨ３プロモーターで制御されるｋｉｖＤをもう１コピー導入することで、合計で２コピーのｋｉｖＤを持つＢＤδＤ－２ｔｋｉｖＤを作成した。具体的には、ｋｉｖＤ発現強化株作成のためにＢＤδＤ株に、ＥｃｏＲＶで切断したｐＩＬ－ｐＴＤＨ３－ｋｉｖＤを形質転換することで、ＢＤδＤ－ｔｋｉｖＤ株を作成した。さらに、ＢＤδＤ－ｋｉｖＤ株にｐＩＵ－ｐＴＤＨ３－ｋｉｖＤを形質転換することで、ＢＤδＤ－２ｔｋｉｖＤ株を作成した。
　ＢＤδＤ－ｔｋｉｖＤ及びＢＤδＤ－２ｔｋｉｖＤについて、１０ｇ／Ｌのグルコースと１０ｇ／Ｌのキシロースを含む培地を用いて発酵試験を行った。ｋｉｖＤ発現強化株（ＢＤδＤ－ｔｋｉｖＤとＢＤδＤ－２ｔｋｉｖＤ）では、ＰＧＫ１プロモーターでｋｉｖＤを発現させたＢＤδＤ－ｋｉｖＤと比べて、キシロースの消費量やＸｙｌｏｎａｔｅの生産量にはほとんど違いが見られなかった（図４の（Ａ），（Ｂ））。一方、ＢＤδＤ－ｔｋｉｖＤ及びＢＤδＤ－２ｔｋｉｖＤの発酵９６ｈにおけるＢＴ生産量は、５７７．３±３．６ｍｇ／Ｌ及び７６７．９±４５．９ｍｇ／Ｌで（図４の（Ｃ））、それぞれＢＤδＤ－ｋｉｖＤと比べて約１．６倍及び２．１倍のＢＴ生産量を示した。ＢＤδＤ－ｔｋｉｖＤ及びＢＤδＤ－２ｔｋｉｖＤのＢＴ収率はそれぞれ、９．７％及び１２．９％であった。
５．ｋｄｃＡの発現
　本実験ではｋｉｖＤに加えて、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ由来の別の２－ケト酸デカルボキシラーゼをコードするｋｄｃＡを発現することで更なるＢＴ生産量の向上を試みた。ＢＤδＤに、ＴＤＨ３プロモーターで制御されるｋｄｃＡを導入することでＢＤδＤ－ｔｋｄｃＡを作成した。更にＢＤδＤ－ｔｋｄｃＡに、ＴＤＨ３プロモーターで制御されるｋｄｃＡをもう１コピー導入することで、合計で２コピーのｋｄｃＡを持つＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡを作成した。具体的には、ｋｄｃＡ発現株作成のためにＢＤδＤ株に、ＥｃｏＲＶで切断したｐＩＬ－ｐＴＤＨ３－ｋｄｃＡを形質転換することで、ＢＤδＤ－ｔｋｄｃＡ株を作成した。さらに、ＢＤδＤ－ｔｋｄｃＡ株にｐＩＵ－ｐＴＤＨ３－ｋｄｃＡを形質転換することで、ＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ株を作成した。ＢＤδＤ－ｔｋｄｃＡ及びＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡについて、１０ｇ／Ｌのグルコースと１０ｇ／Ｌのキシロースを含む培地を用いて発酵試験を行ったところ、ｋｄｃＡ発現株（ＢＤδＤ－ｔｋｄｃＡとＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ）の発酵９６ｈにおけるＢＴ生産量は、７２２．０±１４．９ｍｇ／Ｌ及び１１５１．４±５８．５ｍｇ／Ｌであった。結果を図５に示した。
６．ＴＹＷ１過剰発現によるＸｙｌＤ活性の強化
　上記のとおり、ｋｉｖＤに加えて、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ由来の別の２－ケト酸デカルボキシラーゼをコードするｋｄｃＡを発現することで、ＢＴ生産量に増加が見られた。次に、高収率でのＢＴ産生のためにはＸｙｌＤ活性の更なる向上や、酵母細胞内で高活性なキシロネートデヒドラターゼの探索が必要と考えられた。そこで、ＥＲ表層において余剰の鉄硫黄クラスターを隔離しておく役割を果たしているＴＹＷ１というタンパクに着目し、このタンパクの発現を制御することで、ＸｙｌＤ活性やＢＴ生産量に変化がないかを検討した。具体的な実験方法を以下に説明する。
　本実験において作成した酵母細胞株の作製手順を図６に示した。なお、ＤＮＡオリゴプライマーは全てＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，　ＭＡ，　ＵＳＡ）で購入した。また、全てのＰＣＲ法には、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＮＥＯ－ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。
（プラスミドの構築）
　全てのプラスミドは、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ　ＵＳＡ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて作成した。Ｃ．ｃｒｅｃｅｎｔｕｓ　ｘｙｌＢとｘｙｌＤはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）で合成を行い購入した。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ　ＫｄｃＡはＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で合成を行い購入した。
ｐＴＳ－Ａ－ｘｙｌＢＤの構築
　ｘｙｌＢにＴＤＨ３プロモーターとＴＤＨ３ターミネーターをつなぐために、コドン最適化したｘｙｌＢ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をテンプレートにプライマーｘｙｌＢ　Ｆ（配列番号１０）とｘｙｌＢ　Ｒ（配列番号１１）を用いてＰＣＲにより得られた断片を、ＮｏｔＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断したｐＡＴＰ４０５（Ｉｓｈｉｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１４）に接続した。できたプラスミドをテンプレートにプライマーｐＴＤＨ３－ｘｙｌＢ　Ｆ（配列番号１２）とｐＴＤＨ３－ｘｙｌＢ　Ｒ（配列番号１３）を用いてＰＣＲにより、ｐＴＤＨ３－ｘｙｌＢ－ｔＴＤＨ３断片を作成した。
　ｘｙｌＤにＳＥＤ１　プロモーターとＳＡＧ１　ターミネーターをつなぐために、プラスミドｐＩＢＧ－ＳＳ（Ｉｎｏｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１４）をテンプレートにプライマーＳＥＤ１ｐ－ＳＡＧ１ｔ　Ｆ（配列番号１４），　ＳＥＤ１ｐ－ＳＡＧ１ｔ　Ｒ（配列番号１５）を用いてＰＣＲにより得られた断片と、コドン最適化したｘｙｌＤ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をテンプレートにプライマーｘｙｌＤ　Ｆ（配列番号１６）　とｘｙｌＤ　Ｒ（配列番号１７）を用いてＰＣＲにより得られた断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎで結合した。できたプラスミドをテンプレートにプライマーｐＳＥＤ１－ｘｙｌＤ　Ｆ（配列番号１８）とｐＳＥＤ１－ｘｙｌＤ　Ｒ（配列番号１９）を用いてＰＣＲにより、ｐＳＥＤ１－ｘｙｌＤ－ｔＳＡＧ１断片を作成した。ｐＳＥＤ１－ｘｙｌＤ－ｔＳＡＧ１断片とｐＴＤＨ３－ｘｙｌＢ－ｔＴＤＨ３断片を、ＮｏｔＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）とＸｈｏＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断したｐＧＫ４０２　（Ｉｓｈｉｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００９）にクローニングすることで、ｐＴＳ－Ａ－ｘｙｌＢＤを構築した。
ｐδＷ－ｘｙｌＤの構築
　ｘｙｌＤに、ＡＤＨ１プロモーターとターミネーターを接続するために、ＰｍｅＩで切断したｐＡＴＰ４０５　（Ｉｓｈｉｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１４）に、コドン最適化したｘｙｌＤ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をテンプレートにプライマーｘｙｌＤ　２Ｆ（配列番号２０）とｘｙｌＤ　２Ｒ（配列番号２１）を用いてＰＣＲにより得られた断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎによりクローニングした。できたプラスミドをテンプレートにプライマーｐＡＤＨ１－ｘｙｌＤ　Ｆ（配列番号２２）とｐＡＤＨ１－ｘｙｌＤ　Ｒ（配列番号２３）を用いてＰＣＲを行い、ＡＤＨ１ｐ－ｘｙｌＤ－ＡＤＨ１ｔ断片を得た。この断片をＳｍａＩで切断したδインテグレーション用ベクターｐδＷ（Ｙａｍａｄａ　ｅｔ　ａｌ．２００９）にクローニングして、ｘｙｌＤのδインテグレーション用プラスミドｐδＷ　ｘｙｌＤを作成した。
ｐＩＬ－ｋｄｃＡ及びｐＩＵ－ｋｄｃＡの構築
　Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡをテンプレートに、２セットのプライマーｔｄｈ３ｐ　Ｆ（配列番号２４）とｔｄｈ３ｐ　Ｒ（配列番号２５）またａｄｈ１ｔ　Ｆ（配列番号２６）とａｄｈ１ｔ　Ｒ（配列番号２７）を用いてＰＣＲを行い、ＴＤＨ３　プロモーターとＡＤＨ１ターミネーターを増幅した。これら２つのＰＣＲ断片をテンプレートに、プライマーｔｄｈ３ｐ　Ｆ（配列番号２４）とａｄｈ１ｔ　Ｒ（配列番号２７）を用いてＰＣＲを行いＴＤＨ３ｐ－ＡＤＨ１ｔ断片を作成した。ＴＤＨ３ｐ－ＡＤＨ１ｔ断片を、ＮｏｔＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）とＸｈｏＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断したｐＧＫ４０５（Ｉｓｈｉｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００９）　およびｐＧＫ４０６（Ｉｓｈｉｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００９）にクローニングすることで、ｐＩＬ　ｔｄｈ３ｐ－ａｄｈ１ｔ　とｐＩＵ　ｔｄｈ３ｐ－ａｄｈ１ｔを作成した。ｋｄｃＡに、ＴＤＨ３プロモーターとＡＤＨ１ターミネーターを接続するために、ＳｍａＩで切断したｐＩＬ　ｔｄｈ３ｐ－ａｄｈ１ｔ　とｐＩＵ　ｔｄｈ３ｐ－ａｄｈ１ｔに、コドン最適化したｋｄｃＡ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をテンプレートにプライマーｔｄｈ３　ｋｄｃＡ　Ｆ（配列番号２８）とｔｄｈ３　ｋｄｃＡ　Ｒ（配列番号２９）を用いてＰＣＲにより得られた断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎによりクローニングすることで、ｐＩＬ－ｋｄｃＡおよびｐＩＵ－ｋｄｃＡを作成した。
ｐＩＡｕｒ－ＴＹＷ１とｐＩＡｕｒ－ｔＴＹＷ１の構築
　ｐＧＫ４０５（Ｉｓｈｉｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００９）をテンプレートに、プライマーＡＵＲ－ＰＧＫ　Ｆ（配列番号３０）とＡＵＲ－ＰＧＫ　Ｒ（配列番号３１）を用いてＰＣＲを行い、ＰＧＫ１プロモーターとＰＧＫ１　ターミネーターを増幅した。この断片を、ＳｐｈＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）とＳａｃＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断したｐＡＵＲ１０１（タカラバイオから購入）にクローニングすることで、ｐＧＫ－Ａｕｒを作成した。ＴＹＷ１及びｔＴＹＷ１にＰＧＫ１プロモーターとＰＧＫ１ターミネーターを接続するために、ＳｍａＩで切断したｐＧＫ－Ａｕｒに、Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡをテンプレートにプライマーＴＹＷ１　Ｆ（配列番号３２）とＴＹＷ１　Ｒ（配列番号３３）及びＴＹＷ１　Ｆ（配列番号３２）とｔＴＹＷ１　Ｒ（配列番号３４）を用いてＰＣＲにより得られたＴＹＷ１およびｔＴＹＷ１断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎによりクローニングすることで、ｐＩＡｕｒ－ＴＹＷ１およびｐＩＡｕｒ－ｔＴＹＷ１を作成した。
（形質転換）
　酵母の形質転換はＣｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）によって報告されている、酢酸リチウムを法に従い行った。
ＹＰＨ４９９ΔＧＲＥ３株の作成
　まずＳ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＹＰＨ４９９株においてＧＲＥ３をＧ４１８（薬剤）耐性遺伝子で置換することで、ＧＲＥ３破壊株ＹＰＨ４９９ΔＧＲＥ３株を作成した。ＧＲＥ３破壊用のＤＮＡ断片の作成は、Ｙｅａｓｔ　Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　Ｍａｔ－Ａ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｓｅｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　Ｗａｌｔｈａｍ，　ＭＡ，　ＵＳＡ）より取得したＢＹ４７４１ΔＧＲＥ３株のゲノムＤＮＡをテンプレートに、プライマーｄＧＲＥ３　Ｆ　（５′－　ＡＣＴＧＧＡＴＴＡＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧ－３′；配列番号６）及びｄＧＲＥ３　Ｒ　（５′－　ＣＣＧＴＧＧＡＧＴＣＴＴＣＧＴＣＡＡＧＴＡＧＴＴＧ－３′；配列番号７）を用いてＰＣＲにより作成した。テンプレートに用いたＢＹ４７４１ΔＧＲＥ３のゲノムＤＮＡは、Ｄｒ．　ＧｅｎＴＬＥ　（ｙｅａｓｔ）　ｈｉｇｈ－ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｋｉｔ　（Ｔａｋａｒａ，　Ｓｈｉｇａ，　Ｊａｐａｎ）を用いて抽出した。
ＢＤ株の作成
　プラスミドｐＴＳ－Ａ－ｘｙｌＢＤをＥｃｏＲＶ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して、ＹＰＨ４９９ΔＧＲＥ３株に形質転換することでＢＤ株を作成した。
ＢＤδＤ株の作成
　プラスミドｐδＷ－ｘｙｌＤをＡｓｃＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して、ＢＤ株に形質転換することでＢＤδＤ株を作成した。
ＢＤδＤ－ｔｋｄｃＡ株の作成
　プラスミドｐＩＬ－ｋｄｃＡをＥｃｏＲＶ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して、ＢＤδＤ株に形質転換することでＢＤδＤ－ｔｋｄｃＡ株を作成した。
ＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ株の作成
　プラスミドｐＩＵ－ｋｄｃＡをＥｃｏＲＶ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して、ＢＤδＤ株に形質転換することでＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ株を作成した。
ＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ－ＴＹＷ１株の作成
　プラスミドｐＩＡｕｒ－ＴＹＷ１をＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して、ＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ株に形質転換することでＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ－ＴＹＷ１株を作成した。
ＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ－ｔＴＹＷ１株の作成
　プラスミドｐＩＡｕｒ－ｔＴＹＷ１をＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して、ＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ株に形質転換することでＢＤδＤ－２ｔｋｄｃＡ－ｔＴＹＷ１株を作成した。
　発酵試験、培養液の分析（ＢＴの定量）、ＸｙｌＤの活性測定は、上述の方法により行った。各株のＸｙｌＤ活性を図７に示す。また、ＢＴの生産量の経時変化を図８に示す。作成した株においてはＴＹＷ１を過剰発現することで、ＸｙｌＤ活性が高くなった（０．２６Ｕ／ｍｇ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ→０．４０Ｕ／ｍｇ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）。また、ＢＴ最大生産量も顕著に増加した（１．１５ｇ／Ｌ→１．７５ｇ／Ｌ）。
　本発明によると、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて、Ｄ－キシロースからＤ－ＢＴを効率的に生産することができる。

Claims (9)

  1. 　（Ａ）鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ－Ｓタンパク質）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ
    　（Ｂ）鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた、組換え宿主細胞。
  2. 　（Ｃ）キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
  3. 　上記鉄硫黄タンパク質が、キシロネートデヒドラターゼ（ＸｙｌＤ）である、請求項１又は２に記載の組換え宿主細胞。
  4. 　上記鉄硫黄クラスターの生合成を制御するタンパク質が、Ｔｙｗ１である、請求項１から３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
  5. 　上記キシロース代謝経路に関与するその他の酵素が、キシロースデヒドロゲナーゼ（ＸｙｌＢ）、２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）から成る群より選択される少なくとも１種である、請求項１から４のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
  6. 　上記宿主細胞が、酵母宿主細胞である、請求項１から５のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
  7. 　上記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ブレタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジタ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロッケラ属（Ｋｌｏｃｃｋｅｒａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサトケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、スワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、及びパチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）からなる群より選択される、少なくとも１種の酵母細胞である、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
  8. 　請求項１から７のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞を用いる、Ｄ－ブタントリオールの製造方法。
  9. 　Ｄ－ブタントリオールの製造方法であって、
    （ａ）鉄硫黄タンパク質をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた組換え宿主細胞を調製する工程、並びに
    （ｂ）上記組換え宿主細胞を増殖させる工程
    を含むことを特徴とするＤ－ブタントリオールの製造方法。
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