JP6342928B2 - Fe−Sクラスター要求タンパク質の活性の改善 - Google Patents
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Description
本出願は、参照によってその全体が援用される2010年2月17日に出願された米国仮特許出願第61/305,333号の利益を主張する。
本出願と共に出願されたASCIIテキストファイルCL4842sequencelisting.txtにおいて電子的に提出された配列表の内容は、参照によってその全体が本明細書中に援用される。
トゾルのアポタンパク質においてFe−Sクラスターを構築するためのシステムが必要とされる。本発明者らの研究よりも前は、酵母が細胞質内に位置する任意のDHADのためにFe−Sクラスターを提供し得るかどうか(天然の酵母DHADはミトコンドリア内に位置するので)、そしてはさらに重要なことには、細胞質内でいつDHADが高レベルで発現されるかはこれまで未知であった。
よってコードされる。実施形態では、前記Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、組換え宿主細胞DNA中に少なくとも1回組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされる。実施形態では、Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換は、CCC1、FRA2、およびGRX3、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。実施形態では、Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、AFT1、AFT2、これらの突然変異体、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
きい比活性、約6.0U/mgよりも大きい比活性、約7.0U/mgよりも大きい比活性、約8.0U/mgよりも大きい比活性、約9.0U/mgよりも大きい比活性、約10.0U/mgよりも大きい比活性、約20.0U/mgよりも大きい比活性、および約50.0U/mgよりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する。
ンパク質の活性が増大される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。実施形態では、前記活性の増大は、約10%よりも多い量、約20%よりも多い量、約30%よりも多い量、約40%よりも多い量、約50%よりも多い量、約60%よりも多い量、約70%よりも多い量、約80%よりも多い量、約90%よりも多い量、および約95%、98%、または99%よりも多い量からなる群から選択される量である。実施形態では、活性の増大は、約5倍よりも多い量、約8倍よりも多い量、約10倍よりも多い量からなる群から選択される量である。実施形態では、活性の増大は、約3倍よりも多い量、および約6倍よりも多い量からなる群から選択される量である。
は、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、カンジダ属(Candida)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、イサタケンキア属(Issatchenkia)、およびピキア属(Pichia)からなる群から選択される。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、10−5よりも小さいE値で表12のプロファイルHMMと一致するアミノ酸配列を有し、ここでポリペプチドはさらに、配列番号168に相当するストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)DHAD酵素のアミノ酸配列における位置56、129、および201に相当する3つの保存システイン全てを含む。実施形態では、前記組換え宿主細胞は、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、2−メチル−1−ブタノール、3−メチル−1−ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される産物を産生する。実施形態では、組換え宿主細胞はイソブタノールを産生する。実施形態では、前記組換え宿主細胞は、イソブタノール生合成経路を含む。実施形態では、前記イソブタノール生合成経路は、宿主細胞にとって異種であるポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも1つのポリペプチドを含む。実施形態では、前記イソブタノール生合成経路は、宿主細胞にとって異種であるポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも2つのポリペプチドを含む。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本出願が支配するであろう。また、文脈によって他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書において言及される全ての刊行物、特許および他の参考文献は、全ての目的のためにその全体が参照によって援用される。
オチド/遺伝子およびコード化ポリペプチドを指す。これらのポリヌクレオチド/遺伝子のいくつかは、文献において記載されており、そして以下にさらに説明される「Feレギュロン」に含有される。本明細書で使用される場合、Fe取込みおよび利用遺伝子ならびにFe−Sクラスター生合成遺伝子は、Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードすることができる。
ヌクレオチド断片は、cDNA、ゲノムDNAまたは合成DNAの1つまたは複数のセグメントから構成され得る。
タンパク質全体の約0.5%よりも多い。別の実施形態では、発現されるポリペプチドの量は、細胞タンパク質全体の約1.0%よりも多い、または細胞タンパク質全体の約2.0%よりも多い。
Packageにおける「EditSeq」機能、InforMax,Inc.(Bethesda,MD)から入手可能なVectorNTI Suiteにおける折り返し翻訳(backtranslation)機能、およびAccelrys,Inc.(San Diego,CA)から入手可能なGCG−Wisconsin Packageにおける「backtranslate」機能である。さらに、例えば、http://www.entelechon.com/bioinformatics/backtranslation.php?lang=eng(2008年4月15日訪問)における「backtranslation」機能、およびhttp://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/index.html(2002年7月9日訪問)において利用可能な「backtranseq」機能など、種々の資源がコドン最適化コード領域配列にとって公的に入手可能である。所与の頻度に基づいてコドンを割り当てるために基本的なアルゴリズムを構築することも、基本的な数学関数を用いて当業者により容易に達成され得る。
なわち非保存的アミノ酸置換の結果であってもよい。「保存的」アミノ酸置換は、関連する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含み、極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含み、正帯電(塩基性)アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含み、そして負帯電(酸性)アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。あるいは、「非保存的」アミノ酸置換は、これらのアミノ酸のいずれかの極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性における差異を選択することによって行うことができる。「挿入」または「欠失」は、組換えタンパク質により構造的または機能的に許容される変異の範囲内であり得る。可能とされる変異は、組換えDNA技術を用いて、ポリペプチド分子においてアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に行い、得られた組換え変異体を活性についてアッセイすることによって、実験的に決定することができる。
I(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,Eds.)Humania:NJ(1994)、4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,Ed.)Academic(1987)、および5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,Eds.)Stockton:NY(1991)に記載される方法を含むが、これらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。
、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%などの55%〜100%の任意の整数の百分率が本発明の記述において有用であり得る。適切なポリヌクレオチド断片は上記の相同性を有するだけでなく、通常、少なくとも50個のヌクレオチド、少なくとも100個のヌクレオチド、少なくとも150個のヌクレオチド、少なくとも200個のヌクレオチド、または少なくとも250個のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。さらに、上記の相同性を有する適切なポリヌクレオチド断片は、少なくとも50個のアミノ酸、少なくとも100個のアミノ酸、少なくとも150個のアミノ酸、少なくとも200個のアミノ酸、または少なくとも250個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
Fe−Sクラスターを含有するタンパク質の機能は様々である。これらの機能を分類するためのより完全な取り組みの1つは、Johnson,D.C.,et al.,Structure,function,and formation of biological iron−sulfur clusters.Annu.Rev.Biochem.,2005.74:p.247−281から適合された以下の表において与えられ
る。
DHADは、デヒドラターゼ(より適切にはヒドロリアーゼ)類のFe−Sクラスター要求タンパク質である。DHAD酵素をコードする遺伝子は、組換え宿主細胞においてDHAD活性の発現を提供するために使用することができる。DHADは、2,3−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換および2,3−ジヒドロキシメチルバレレートからα−ケトメチルバレレートへの変換を触媒し、E.C.4.2.1.9として分類される。組換え宿主細胞における使用に適したDHADのコード配列は、細菌、真菌、または植物源に由来することができる。使用され得るDHADは、[4Fe−4S]クラスターまたは[2Fe−2S]を有することができる。表4a、4b、5、
および6には、本発明において使用され得る典型的なDHADのコード領域およびタンパク質の配列番号が記載されている。記載された特定の配列に対して少なくとも約95%の同一性を有するタンパク質は単純化のために省略されているが、表4a、4b、5、および6に記載されるタンパク質のいずれかに対して少なくとも約95%の配列同一性を有し、DHAD活性を有するタンパク質(単純化のために省略されたものを含む)は、本明細書において開示されるように使用可能であると理解される。付加的なDHADタンパク質およびそのコード化配列は、当業者に周知であるように、公開データベースのBLAST検索によって同定することができる。通常、本明細書において提供されるものなどの既知のDHAD配列による公的に入手可能なデータベースのBLAST(上記)検索は、本発明の細胞において発現され得るDHADおよびそのコード化配列を同定するために使用される。例えば、表3のDHADタンパク質のいずれかに対して少なくとも約80〜85%のアミノ酸配列同一性、少なくとも約85〜90%、少なくとも約90〜95%、または少なくとも約98%の配列同一性を有するDHADタンパク質は、本発明の細胞において発現され得る。同一性は、GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.1、およびタンパク質重量マトリックスのGonnet250シリーズのデフォルトパラメータを用いるClustal Wアライメント法に基づく。
たDHADのアミノ酸配列に基づいてプロファイル隠れマルコフモデル(HMM)を作成した。プロファイルHMMの適用については記載されている。例えば、Krogh et
al.,J.Mol.Biol.235:1501−1531(1994)およびDurbin et al.,”Markov chains and hidden Markov models,”in Biological Sequence Analysis:Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids,Cambridge University Press(1998)を参照されたい。プロファイルHMMは、試験配列が特定の配列ファミリーに属するかどうかを決定するために使用することができる多重配列アライメントで構築された統計モデルである。同文献参照。プロファイルHMMは、まず従来の配列アライメントツールを用いて機能的に検証された配列のアライメントを作成することによって構築することができる。次に、この配列アライメントを使用して、位置特異的スコアリングシステムを使用する公的に入手可能なソフトウェアプログラム(例えば、HMMER)を用いてプロファイルHMMを構築し、入力配列の多重アライメントにおける種々のアミノ酸位置での保存の程度についての情報を得る。より具体的には、式:log__2(p_x)/(null_x)に比例する、「一致」状態(すなわち、一致状態エミッションスコア)または「挿入」状態(すなわち、挿入状態エミッションスコア)にあるアミノ酸残基のスコアが獲得される。同文献参照。この式において、項「p_x」は、プロファイルHMMによる、アライメント内の特定の位置におけるアミノ酸残基の確率であり、項「null_x」はNullモデルによる確率である。同文献参照。Nullモデルは、アミノ酸の分布から誘導されるアミノ酸のそれぞれに対するエミッション確率の予め計算されたセットを有する単純な1つの状態の確率モデルである。同文献参照。「状態」遷移スコアはログオッズパラメータとしても計算され、Log__2(t_x)に比例する。同文献参照。この式において、項「t_x」は、エミッタまたは非エミッタ状態への遷移の確率である。同文献参照。プロファイルHMMを作成するための特定の統計的分析に関するさらなる詳細は、Krogh et al.,J.Mol.Biol.235:1501−1531(1994)およびDurbin et al.,”Markov chains and hidden Markov models,”in Biological Sequence Analysis:Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids,Cambridge University Press(1998)、ならびに米国特許出願第12/569,636号明細書において入手可能である。
hburn,VA)から利用可能であるユーザーガイドに従って、HMMERソフトウェアパッケージ(プロファイルHMMの背後にある理論は、R.Durbin,S.Eddy,A.Krogh,and G.Mitchison,Biological sequence analysis:probabilistic models of proteins and nucleic acids,Cambridge University Press,1998、Krogh et al.,1994、J.Mol.Biol.235:1501−1531に記載されている)を用いて作成される。HMMERソフトウェアプログラムの出力は、入力配列を特徴付けるプロファイル隠れマルコフモデル(HMM)である。8つのDHADタンパク質に対して作成されたプロファイルHMMは、2009年9月29日に出願された米国特許出願第12/569,636号明細書において、そして表12において与えられる。
の粗抽出物は、ジニトロフェニルヒドラジンを用いる、FlintおよびEmptage(J.Biol.Chem.(1988)263(8):3558−64)によって記載されるようなDHADアッセイにおいて使用することができる。別の例では、DHAD活性は、内因性DHAD活性を持たない酵母株において、本明細書に開示される方法によって同定可能な異種DHADを発現させることによってアッセイされ得る。DHAD活性が存在する場合、酵母株は分枝鎖アミノ酸の非存在下で増殖し得る。また、DHAD活性は、より間接的な方法、例えば、DHAD活性を必要とする経路の下流産物についてアッセイすることなどによって確認することもできる。経路中間体としてα−ケトイソバレレートまたはα−ケトメチルバレレートを有する産物はどれも、DHAD活性のためのアッセイにおいて測定され得る。このような産物のリストには、バリン、イソロイシン、ロイシン、パントテン酸、2−メチル−1−ブタノール、3−メチル−1−ブタノール、およびイソブタノールが含まれるが、これらに限定されない。
本出願人らは、異種DHADの発現は、宿主細胞において発現されるとDHAD活性を提供できることを見出した。本明細書に記載されるように同定され得るDHADの発現は、2,3−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換または2,3−ジヒドロキシメチルバレレートからα−ケトメチルバレレートへの変換を含む生合成経路にDHAD活性を提供することができる。さらに、S.ミュータンス(S.mutans)[2Fe−2S]DHADは、2009年9月29日に出願された関連の米国特許出願第12/569,636号明細書(参照によって本明細書中に援用される)において、大腸菌(E.coli)[4Fe−4S]DHADの空気中での感受性と比較してより高い空気中の安定性を有することが示されており、これは、異種宿主細胞においてより良い活性を得るために望ましい。
s)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、カンジダ属(Candida)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、イサタケンキア属(Issatchenkia)、およびピキア属(Pichia)を含むが、これらに限定されない。適切な株としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces
cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロミセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotolerans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、ピキア・スティピティス(Pichia stipitis)、およびヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、宿主はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces
cerevisiae)である。
上記のように、DHAD酵素は機能するためにFe−Sクラスターを必要とし、従って、これらが機能性形態で発現されるのであれば、Fe−Sクラスターを産生してそれをアポタンパク質に負荷する遺伝機構を有する宿主において発現されなければならない。本明細書中の他の部分に記載されるように、正常な酵母では、ミトコンドリアがFe−Sクラスター生合成における重要な役割を果たす。正常な酵母におけるミトコンドリアからサイトゾル内のFe−Sクラスター要求タンパク質へのFe−Sクラスター前駆体の形成および移動のフラックスは、制限されると考えられる。例えば、ある点を過ぎると、サイトゾルにおける異種DHADのタンパク質の発現のさらなる増大は、対応するDHAD活性の増大をもたらさない。理論によって束縛されることは望まないが、これは、上記の条件下で起こるFe−Sクラスターに対する要求の増大を細胞が供給できないので、異種DHA
Dの増大量が活性のために必須のFe−Sクラスターによって負荷されていないためであると考えられる。本明細書において、酵母細胞は、2つの方法で(別箇にまたは同時期に)遺伝子修飾することができ、これにより、その必須のFe−Sクラスターが負荷された、サイトゾルにおいて発現される異種DHADの画分の増大をもたらし得ることが実証されている。1つの方法は、Fe−Sクラスター生合成経路遺伝子またはFe取込みおよび利用遺伝子などの、Fe−Sクラスターの形成に関与する酵母遺伝子の発現を修飾することである。他方の方法は、酵母の細胞質におけるFe−Sクラスター生合成またはFe取込みおよび利用に関与する異種遺伝子を発現させることである。
the Yeast Aft1/Aft2 Transcription Factors Depends on Mitochondrial but Not Cytosolic Iron−Sulfur Protein Biogenesis.,J.Biol.Chem.,2005.280(11):p.10135−10140、Foury,F.and D.Talibi,Mitochondrial Control
of iron homeostasis.A genome wide analysis of gene expression in a yeast frataxin−deficient strain.J.Biol.Chem.,2001.276(11):p.7762−7768、およびShakoury−Elizeh,M.,et al.,Transcriptional remodeling in response to iron deprivation in Saccharomyces cerevisiae.Mol.Biol.Cell,2004.15(3):p.1233−1243から得られる)。
定されない。
を増大させ、DHADなどのFe−Sクラスター要求タンパク質の比活性を改善することができる。さらにFe−Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させ、DHAD比活性を改善するために、補助因子を添加して、Fe−Sクラスター制御活性を有するポリペプチドの活性を変化させることができる。
al,2003,J.Biological Chem.,vol.278,pp.50120−50127)。この遺伝子の発現は、上記のようなベクターpRS411内にクローン化することによって達成することができる。
ラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む、少なくとも1つの異種DHADを含む組換え宿主細胞も提供される。また、少なくとも1つの異種DHADおよび、Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞も提供され、この宿主細胞は、Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む。
ラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、AFT1、AFT2、PSE1、FRA2、GRX3、MSN5、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、プラスミドを含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、DHADは、AFT1、AFT2、PSE1、およびこれらの組み合わせと同時発現される。Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、AFT1 L99A、AFT1 L102A、AFT1 C291F、AFT1 C293F、およびこれらの組み合わせなどの構成的突然変異体であってもよいが、これらに限定されない。Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における欠失、突然変異、および/または置換は、FRA2、GRX3、MSN5、およびこれらの組み合わせからなる群から選択することができる。
の増大を示す。このような方法では、Fe−Sクラスター要求タンパク質は、宿主細胞にとって内因性であっても異種性であってもよい。
組換え宿主細胞におけるDHADの発現は、本明細書に記載されるように、2,3−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換または2,3−ジヒドロキシメチルバレレートからα−ケトメチルバレレートへの変換のためのジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する、形質転換された組換え宿主細胞を提供する。α−ケトイソバレレートまたはα−ケトメチルバレレートを経路中間体として有する産物は、本明細書において開示される所望の異種DHADを有する宿主細胞において、より効果的に産生され得る。このような産物のリストには、バリン、イソロイシン、ロイシン、パントテン酸、2−メチル−1−ブタノール、3−メチル−1−ブタノール、およびイソブタノールが含まれるが、これらに限定されない。
− 例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒されるような、ピルベートからアセトラクテートへの変換(図5の経路ステップaを参照)と、
− 例えば、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼによって触媒されるような、アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換(図5の経路ステップbを参照)と、
− 例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(DHAD)とも呼ばれるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されるような、2,3−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換(図5の経路ステップcを参照)と、
− 例えば、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されるような、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換(図5の経路ステップdを参照)と、
− 例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されるような、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換(図5の経路ステップeを参照)と
を含む。
57A1号明細書には、開示される生合成経路を用いるイソブタノール産生のために、キメラ遺伝子の構築、ならびに細菌および酵母の遺伝子操作が記載されている。
本明細書において提供される細胞において有用であり得る付加的な修飾の例としては、米国特許出願公開第20090305363号明細書(参照によって本明細書中に援用される)に記載されるような、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減するための修飾、および/またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子における破壊、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する制御要素をコードする少なくとも1つの遺伝子における破壊と、米国特許出願公開第20100120105号明細書(参照によって本明細書中に援用される)に記載されるような、Entner−Doudoroff経路による炭素フラックスの増大または還元当量バランス(reducing equivalents balance)を提供する宿主細胞への修飾とが挙げられる。その他の修飾としては、米国仮特許出願第61/380563号明細書(参照によって本明細書中に援用される)に記載されるピルベート利用生合成経路におけるステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドの組込みが挙げられる。適切であり得る付加的な修飾は、米国特許出願第12/893089号明細書に記載される。さらに、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、およびホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、米国仮特許出願第61/356379号明細書に記載されている。
本明細書に開示される組換え宿主細胞は、適切な炭素基質を含有する発酵培地中で増殖される。適切な炭素基質は、グルコースやフルクトースなどの単糖、ラクトース、マルトース、ガラクトース、もしくはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンもしくはセルロースなどの多糖類、またはこれらの混合物と、チーズ乳清透過物、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖蜜、および大麦モルトなどの再生可能な原料からの未精製混合物とを含むことができるが、これらに限定されない。その他の炭素基質としては、エタノール、ラクテート、スクシネート、またはグリセロールが挙げられる。
ウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、およびこれらの混合物などの再生可能な糖源に由来し得る。グルコースおよびデキストロースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびこれらの混合物などの穀類を含むデンプンベースの原料の糖化による再生可能な穀類源に由来し得る。さらに、発酵性の糖は、例えば、参照によって本明細書中に援用される共同所有および同時係属中の米国特許出願公開第20070031918A1号明細書に記載されるような前処理および糖化プロセスにより再生可能なセルロースまたはリグノセルロース系バイオマスに由来し得る。バイオマスは任意のセルロースまたはリグノセルロース系材料を指し、セルロースと、場合によりさらに、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および/または単糖とを含む材料が含まれる。またバイオマスは、タンパク質および/または脂質などの付加的な成分も含み得る。バイオマスは単一のソースに由来してもよいし、あるいはバイオマスは2つ以上のソースに由来する混合物を含むこともでき、例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびトウモロコシ茎葉の混合物、または草および葉の混合物を含むことができる。バイオマスには、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業からのスラッジ、庭の廃棄物、木材および林業廃棄物が含まれるが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、作物残渣、例えばトウモロコシ皮、トウモロコシ茎葉、草、小麦、小麦わら、大麦、大麦わら、干し草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、大豆、穀粒の製粉から得られる成分、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、灌木および低木、野菜、果実、花、動物性肥料、並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
通常、細胞は、適切な培地中、約20℃〜約40℃の範囲の温度で増殖される。本発明における適切な増殖培地は、Luria Bertani(LB)ブロス、Sabouraud Dextrose(SD)ブロス、Yeast Medium(YM)ブロス、または酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム、およびデキストロース(炭素/エネルギー源として)を含むブロス、またはYPD培地(ほとんどのサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株を増殖させるために最適な割合のペプトン、酵母抽出物、およびデキストロースのブレンド)などの一般的な市販の培地である。その他の定義された増殖培地または合成増殖培地も使用することができ、特定の微生物の増殖のための適切な培地は、微生物学または発酵科学の当業者には分かるであろう。異化産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている薬剤、例えば環状アデノシン2’:3’−一リン酸塩の使用も増殖培地中に組み込むことができる。
イソブタノールまたは他の産物は、バッチ発酵方法を用いて産生することができる。古
典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、培地の組成は発酵の最初に設定され、発酵は人為的な変更を受けない。標準的なバッチ系の変化形は、流加系である。流加発酵プロセスも本発明において適切であり、発酵が進行するにつれて基質が徐々に添加される点以外は典型的なバッチ系を含む。流加系は、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合、および培地中の基質の量が制限されることが望ましい場合に有用である。バッチ発酵および流加発酵は一般的であり、当該技術分野においてよく知られており、その例は、Thomas D.Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,Second Edition(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA.,or Deshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227,(1992)(参照によって本明細書中に援用される)において見出すことができる。
バイオ産生されたイソブタノールは、ABE発酵のための当該技術分野において既知の方法を用いて、発酵培地から単離することができる(例えば、Durre,Appl.Microbiol.Biotechnol.49:639−648(1998),Groot et al.,Process.Biochem.27:61−75(1992)、およびその中の参考文献を参照)。例えば、固体は、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどによって発酵培地から除去され得る。次に、イソブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、またはパーベーパレイションなどの方法を用いて発酵培地から単離され得る。
カントされた水相は、還流として第1の蒸留塔に戻すことができる。デカントされたイソブタノールが豊富な有機相は、第2の蒸留塔において、蒸留によりさらに精製され得る。
実施形態1(E1). ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む。
charomyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、カンジダ属(Candida)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、イサタケンキア属(Issatchenkia)およびピキア属(Pichia)からなる群から選択される。
a. ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約5倍よりも大きい比活性、
b. ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約8倍よりも大きい比活性、および
c. ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約10倍よりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する。
a.約0.25U/mgよりも大きい比活性、
b.約0.3U/mgよりも大きい比活性、
c.約0.5U/mgよりも大きい比活性、
d.約1.0U/mgよりも大きい比活性、
e.約1.5U/mgよりも大きい比活性、
f.約2.0U/mgよりも大きい比活性、
g.約3.0U/mgよりも大きい比活性、
h.約4.0U/mgよりも大きい比活性、
i.約5.0U/mgよりも大きい比活性、
j.約6.0U/mgよりも大きい比活性、
k.約7.0U/mgよりも大きい比活性、
l.約8.0U/mgよりも大きい比活性、
m.約9.0U/mgよりも大きい比活性、
n.約10.0U/mgよりも大きい比活性、
o.約20.0U/mgよりも大きい比活性、および
p.約50.0U/mgよりも大きい比活性
からなる群から選択される比活性を有する。
a. 実施形態E1〜E24のいずれか1つの組換え宿主細胞を提供するステップと、
b. 前記産物が産生される条件下、発酵培地中で(a)の組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
を含み、この産物は、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、2−メチル−1−ブタノール、3−メチル−1−ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせらなる群から選択される。
a. 実施形態E1〜E24のいずれか1つの組換え宿主細胞を提供するステップと、
b. イソブタノールが産生される条件下、発酵培地中で(a)の組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと
を含む。
a. 実施形態E1〜E24のいずれか1つの組換え宿主を提供するステップと、
b. 2,3−ジヒドロキシイソバレレートがα−ケトイソバレレートに変換される条件下で(a)の組換え宿主細胞を増殖させるステップと
を含み、2,3−ジヒドロキシイソバレレートはα−ケトイソバレレートに変換される。
a. 実施形態E1〜E24のいずれか1つの組換え宿主細胞を提供するステップと、
b. ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドを持たない同一の宿主細胞よりも大きい比活性を有する機能性形態で発現される条件下で(a)の組換え宿主細胞を増殖させるステップと
を含む。
a. 実施形態E3〜E24のいずれか1つの組換え宿主細胞を提供するステップと、
b. 宿主細胞におけるFe−Sクラスター生合成経路のフラックスが増大される条件下で(a)の組換え宿主細胞を増殖させるステップと
を含む。
a. Fe−Sクラスター要求タンパク質を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、
b. 前記宿主細胞におけるFe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、
c. Fe−Sクラスター要求タンパク質の活性が増大される条件下で(b)の組換え
宿主細胞を増殖させるステップと、
を含む。
a.約10%よりも多い量、
b.約20%よりも多い量、
c.約30%よりも多い量、
d.約40%よりも多い量、
e.約50%よりも多い量、
f.約60%よりも多い量、
g.約70%よりも多い量、
h.約80%よりも多い量、
i.約90%よりも多い量、および
j.約95%よりも多い量
からなる群から選択される量である。
a.約5倍よりも多い量、
b.約8倍よりも多い量、
c.約10倍よりも多い量、
からなる群から選択される量である。
a. Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、
b. 異種Fe−Sクラスター要求タンパク質の活性を測定するステップと、
c. ステップ(a)のポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定される異種Fe−Sクラスター要求タンパク質の活性と、ステップ(a)のポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定される異種Fe−Sクラスター要求タンパク質の活性とを比較するステップと
を含み、異種Fe−Sクラスター要求タンパク質の活性の増大は、前記Fe−Sクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す。
a. Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、
b. ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性を測定するステップと、
c. ステップ(a)のポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性と、ステップ(a)のポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性とを比較するステップと
を含み、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性の増大は、前記Fe−Sクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す。
または補因子の付加を含む。
実施例において使用される標準組換えDNAおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989によって、T.
J.Silhavy,M.L.Bennan,and L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1984によって、そして,Ausubel,F.M.et al.,Current
Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley−Interscience,N.Y.,1987によって記載されている。
組換えポリヌクレオチドの過剰発現は、組換えポリヌクレオチドを含むプラスミドのコピー数を増大させることによって達成することができる。酵母においてDHADタンパク質を過剰発現させるために、誘導性ベクターを構築した。pHR81ベクターは、Ura3マーカーと、欠損プロモーターを有するLEUマーカーとを含有する(参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第2007/0092957号明細書を参照)。酵母合成ドロップアウト(synthetic dropout)(SD、完全最小培地(complete minimal media)としても知られている、Teknova)増殖培地がSDマイナスウラシルからSDマイナスロイシンに切り替えられると、pHR81プラスミドのコピー数が増大し、はるかにより高いレベルの組換えポリヌクレオチドの発現が得られる。pHR81ベクター骨格はpLH472JEG4y(配列番号921)に由来し、pLH472JEG4yベクターをSpeIおよびSacIIによりを消化することによって作製した。
pHR81FBA−IlvD(Sm)と命名した(配列番号917、図1A)。
酵母における遺伝子の発現を増大させるための代替の方法は、対象となる遺伝子の多数コピーを宿主細胞の染色体に組み込むことである。S.ミュータンス(S.mutans)からのilvD遺伝子(配列番号167)を酵母染色体に組み込むために、組込みベクターpZK−Delta(s)−Leu2−FBA−ilvD(Sm)−FBAt(配列番号918、図1B)を構築した。組込みベクター骨格は、pSuperscript(Stratagene,La Jolla,CA)に由来した。ilvD遺伝子が酵母デルタ配列(補体ストランドのヌクレオチド118〜267および5061〜5760)に隣接され得るように、S.ミュータンス(S.mutans)ilvD遺伝子(補体ストランドのヌクレオチド1306〜3018)を、FBAプロモーター(補体ストランドのヌクレオチド3026〜4023)の調節下で組込みベクターにクローン化した。S.セレビシエ(S.cerevisiae)は、200を超える酵母デルタ配列を含有する(Kim J m et al.Genome Res.1998;8:464−478)。これらのデルタ配列は、多数の組込みの標的である。また組込みベクターを、多数の組込み事象を有する形質転換株の選択のために欠損LEU2マーカー(補体ストランドのヌクレオチド4100〜5191)を含有するように操作した。
たDHADの比活性は、0.7〜1.2Umg−1の範囲であった。この比活性は、過剰発現のないilvD遺伝子含有プラスミドで形質転換されたBY4741株において見出される非活性よりも約3〜6倍高かった。
実施例1および2に記載される過剰発現株は高レベルの活性を有したが、発現されるDHADタンパク質のすべてが活性とは限らなかった。例えば、過剰発現DHADタンパク質は細胞タンパク質全体の約5〜10%を占め、約0.7〜1.6Umg−1の非活性をもたらした。S.ミュータンス(S.mutans)からの精製DHAD酵素の比活性が100Umg−1であるとすると、細胞タンパク質全体の10%でのDHADの発現は、5〜10Umg−1以上の比活性をもたらすことが期待される。1つの理論によって束縛されることを望まないが、期待される比活性と実測される比活性との間の差は、おそらく、不十分なFe−Sクラスター負荷の結果であった。従って、過剰発現株のさらなる操作によりFe−Sクラスター負荷を増大させることを用いて、DHADの比活性を増大させることができる。
al, J Biol Chem. 281:17661−17669(2006))。上記の表10に示されるように、GRX3欠失は単独でDHAD比活性の著しい改善をもたらす。
させることができと実証される。図10において概説されるように、DHAD比活性に対するFRA2およびGRX3遺伝子の欠失の効果は、例えば、全般的制御因子Aft1pによって鉄レギュロン中の遺伝子の1つまたは複数の転写を活性化することから生じ得る。どれか1つの理論によって束縛されることは望まないが、このような遺伝子の活性化は、鉄の取込みの増大および細胞質のFe−Sクラスター生合成の増大をもたらすことができ、タンパク質のより高いFe−Sクラスター負荷につながる(図10)。Fe−Sクラスター負荷の増大の実証は実施例11に記載される。
実施例3に記載され、図10において概説されるように、Fra2、Grx3、およびGrx4は、Aft1pの機能を制御するリプレッサーである(Kumanovics,et al.,J.Biol.Chem.283:10276−10286(2008))。Aft1pは、鉄の全般的な制御因子である。鉄の取込みおよび代謝に関与する遺伝子の活性化は、Aft1pの核局在化を必要とする。Aft1の構成的突然変異体の発現または野生型Aft1pの発現の増大は、野生型株またはAFT1欠失株におけるFeレギュロンの活性化を導き得る(Yamaguchi−Iwai,et al,EMBO J.14:1231−1239(1995)、Yamaguchi−Iwai,et al,J.Biol.Chem.277:18914−18918(2002)、Kaplan,et al,Chem.Rev.109:4536−4552(2009))。実施例3に記載される新規の知見に基づいて、Aft1pタンパク質およびその構成的突然変異体の発現は、その活性のためにFe−Sクラスターを必要とするDHAD酵素の活性画分を改善することが可能である。
サイトゾルDHADタンパク質のためのFe−Sクラスター生合成能力を増大させる正確なメカニズムは不明である。FRA2およびGRX3欠失株(実施例3)ならびにAft1p突然変異体の発現(実施例4)による知見に基づいて、サイトゾル中のFe含量の利用能を増大させると、DHAD比活性も改善され得る。CCC1欠失は、サイトゾルのFe含量を増大させることが示されている(Li L,et al,J Biol Chem.276:29515−29519(2001))。この仮説を試験するために、BY4741のCCC1欠失株を実施例1に記載されるようなプラスミドpHR81FBA−IlvD(Sm)で形質転換した。プラスミドを有する細胞の粗抽出物をDHAD活性についてアッセイした。表13は実験の結果を示す。DHADプラスミドを有するCCC1欠失株がウラシルを欠いたSD培地中で増殖される場合、DHAD比活性の増大は、同じプラスミドを有する野生型細胞と比較して見出された。追加のFeを添加すると、CCC1欠失株においてDHADのさらなる増大が観察された。Feの添加は、野生型細胞のDHAD比活性に対する効果は示さなかった。DHADタンパク質の過剰発現を達成するために、ロイシンを欠いたSD培地中で菌株を増殖させた(実施例1)。これらの条件下では、DHAD比活性の増大が検出された。
実施例1〜5では、S.ミュータンス(S.mutans)からのDHAD酵素を使用して、酵母において発現される場合にDHADの比活性を増大させるための新規の方法を特定した。この実施例では、L.ラクティス(L.lactis)からのDHAD酵素(配列番号958)の比活性を改善するために、これらの方法の適用を調査した。L.ラクティス(L.lactis)からのIlvD遺伝子(配列番号959)を、FBAプロモーターの調節下でpHR81ベクターにクローン化した(図11)。得られた構築物pHR81FBA−IlvD(Ll)−ADHt(図11、配列番号960)を、FRA2またはGRX3遺伝子のいずれかの欠失を有する株に形質転換した。L.ラクティス(L.lactis)からのDHADに対する構成的突然変異体Aft1p(L99A)の効果を研究するために、pHR81FBA−IlvD(Ll)−ADHtを、ベクターpRS411−Aft1(L99A)と共に、酵母宿主に同時形質転換した(実施例4を参照)
。IlvD遺伝子を過剰発現させるために、菌株に応じてロイシンを欠くかあるいはロイシンおよびメチオニンの両方を欠いた酵母合成ドロップアウト培地において、形質転換体を増殖させた。酵素アッセイの結果は、表14に要約される。FRA2およびGRX3遺伝子の欠失は、酵母において発現される場合に、L.ラクティス(L.lactis)からのDHADの比活性を増大させた。さらに、Aft1構成的突然変異体L99Aの発現は、同様に、L.ラクティス(L.lactis)からのDHADの比活性を増大させた。
Fe−Sクラスターを必要とするタンパク質の活性の定量化は、アッセイ形式で行うことができる。タンパク質がDHADなどの酵素である場合、活性は、通常、活性の単位に関して表現される。酵素活性の単位は、国際生化学連合の酵素委員会(Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry)によって、標準条件下、1分間当たりの1マイクロモルの基質の形質転換を触媒し得る酵素の量であると定義されている(International Union of Biochemistry,Report of the Commission on Enzymes,Oxford:Pergamon Press,1961)。さらに、比活性という用語は、所与の量の酵素における活性の単位であると定義される。従って、比活性は直接測定されないが、1)酵素サンプル1ml当たりの単位(単位/ml)における活性を、2)そのサンプル中のタンパク質の濃度で割ることによって計算され、従って、比活性は単位/mgで表現される。純粋で完全に活性な酵素のサンプルの比活性は、その酵素の特徴である。タンパク質の混合物のサンプルの比活性は、対象となる活性酵素から構成されるそのサンプル中のタンパク質の相対的な画分の尺度である。DHAD活性は、Flint,D.H.and m.H.Emptage,J.Biol.Chem.263:3558−64(1988)に記載されるような2,4−ジニトロフェニルヒドラジン(2,4−DNPH)法を用いるエンドポイントアッセイにおいて分光光度的に測定することができる。このアッセイでは、2,4−DNPHは、2−ケトイソ吉草酸産物のケト基と反応してヒドラゾンを形成し、これを550nmにおけるその吸光度によって検出する。アッセイ緩衝液は、50mMのTris−HC1、10mMのMgCl2、pH8.0(TM8緩衝液)を含有する。アッセイ混合物中のその最終濃度が10mMであるように、十分な2,3−ジヒドロキシイソ吉草酸をアッセイ緩衝液に添加する。各アッセイにおいて、最終容積が1mlであるように、酵素含有溶液および十分な基質含有緩衝液を混合する。アッセイ混合物は、通常、37℃で30分間インキュベートされる。
入れて脱気する。次に、チューブをデスクトップ遠心分離機において最高速度で2分間遠心分離し、沈殿物を沈降させる。
S.ミュータンス(S.mutans)からのDHADを以下のように精製して特徴付けた。S.ミュータンス(S.mutans)ilvD遺伝子を含有するpET28aプラスミドを有する大腸菌(E.coli)Turner株の6リットルの培養物を増殖させ、IPTGにより誘導した。細胞をTM8緩衝液中でソニケーターにより破壊し(実施例7を参照)、粗抽出物を遠心分離して細胞片を除去してから、粗抽出物の上澄みをQSepharose(GE Healthcare)カラム上に負荷し、TM8緩衝液中のNaCl濃度を上昇させてDHADを溶出させることによって、S.ミュータンス(S.mutans)DHADを精製した。DHADを含有する画分をプールし、1Mの(NH4)2SO4に提供し、1Mの(NH4)2SO4で平衡化されたPhenyl−Sepharoseカラム(GE Healthcare)上に負荷した。(NH4)2SO4の濃度を低下させてDHADを溶出させた。DHADを含有する画分をプールし、10ml以下まで濃縮し、35×600cmのSuperdex−200カラム(577mlベッドボリューム)(GE Healthcare)カラム上に負荷し、TM8緩衝液により溶出させた。SDSゲルにより判断されるように、Superdexカラムから溶出されるS.ミュータンス(S.mutans)DHADの純度は90%以上であると評価された。
酵母細胞中のDHADタンパク質は、2つのFe−Sクラスター/ダイマー、1つのFe−Sクラスター/ダイマー、およびゼロのFe−Sクラスター/ダイマーを有するダイ
マーの形態で存在する。酵母粗抽出物中のDHADタンパク質のこれらの3つの形態の濃度を測定するための方法は、Mono QカラムおよびSource15PHE PE4.6/100カラム(両カラムともGE Healthcareから入手した)を用いて開発し、以下において説明する。
Qカラムからプールし、(NH4)2SO4中1.35Mにした画分をPHEカラム上に負荷し、この(NH4)2SO4濃度で、DHADはカラムに結合した。クロマトグラフィの間、カラム溶出液のA215をモニターし、1mL画分を採取した。1.35Mから0Mまで減少する30mLの(NH4)2SO4の直線的勾配を用いてカラムを展開させると、DHADは3つのピークでカラムから溶出した。DHADピークのそれぞれの面積を積分により決定した。この溶出スキームは、S.ミュータンス(S.mutans)DHADを、Mono Qカラムからそれと同時に溶出される他の酵母タンパク質から分離するためのスキームと同一であることが分かった。ピークが溶出された画分において実行したSDSゲルにより、酵母細胞中の可溶性タンパク質の1%で発現されたときに、これらのピーク中に存在する90%をはるかに上回るタンパク質がDHADであることが示された。3つのDHADピークのそれぞれを含有する画分を別々にプールした。これらのピーク中のDHADのUV−可視吸収スペクトルならびに鉄およびスルフィド含量に基づいて、第1のピークは、2つの[2Fe−2S]クラスター/ダイマーを有するDHADを含有し、第2のピークは、1つの[2Fe−2S]クラスター/ダイマーを有するDHADを含有し、そして第3のピークは、ゼロの[2Fe−2S]クラスター/ダイマーを有するDHADを含有することが決定された。従って、その天然状態では、S.ミュータンス(S.mutans)DHAD酵素は、2つの単量体DHADタンパク質のダイマーとして存在すると思われる。
QおよびPHEカラムにおけるクロマトグラフィを行った。3つのDHADピークのそれぞれの下側の面積を積分した。これらの面積の合計を、酵母粗抽出物に添加された純粋なDHADの量に対してプロットした。プロットを用いて、以下の式を導いた:
粗抽出物サンプル中の#μgDHAD=0.507×(3つのDHADピークの面積カウントの合計)。
精製Fe−Sクラスター要求タンパク質は、クラスターの完全補体を含有する場合には、特徴的な比活性を有し得る。既に述べたように、S.ミュータンス(S.mutans)DHADについては、完全補体を有する場合にこの比活性は100単位/mgである。
100*[2*(ピーク1の面積)+1*(ピーク2の面積)+0*(ピーク3の面積)]/[2*(全ピーク面積]=%Fe−Sクラスターを有するDHADモノマー。
に決定されたDHADタンパク質の量で割ることによって、比活性を決定する。次に、比活性を100U/mgで割って、クラスターが負荷されたモノマーの画分を決定する。この画分に100をかけて、Fe−Sクラスターを有するDHADモノマーパーセントを決定する。
異なる条件下で増殖されたいくつかの酵母株においてFe−Sクラスターが負荷されたDHADモノマーの画分を決定するために、上記の方法を使用した。結果は表15に示される。
この実施例の目的は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株PNY1505、PNY1541、およびPNY1542を構築することであった。これらの株はPNY1503(BP1064)に由来した。PNY1503は、CEN.PK113−7D(CBS 8340、Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversiry Centre,Netherlands)に由来した。PNY1503(BP1064)の構築は、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願第61/368,436号明細書および以下の実施例13において記載されている。PNY1505は、FRA2遺伝子の欠失を含有する。PNY1541およびPNY1542は、YPRCΔ15座位においてL99A突然変異(AFT1−L99A)を有するAFT1遺伝
子の組込みを含有する。
FRA2の欠失(参照によって本明細書中に援用される米国特許出願第61/380,563号明細書にも記載されている)は、FRA2コード配列の最初の113個のヌクレオチドはインタクトのまま、コード配列の3’端部から250個のヌクレオチドを欠失するように設計した。インフレームの終止コドンは欠失の7ヌクレオチド下流に存在した。Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New
England BioLabs、Ipswich,MA)およびCEN.PK113−7DゲノムDNA(Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen,Valencia,CA)により調製)をテンプレートとしてを用いて、痕跡のないFRA2の欠失のためのPCRカセットの4つの断片を増幅した。プライマーoBP594(配列番号961)と、FRA2断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP595(配列番号962)とを用いて、FRA2断片Aを増幅した。FRA2断片Aの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP596(配列番号963)と、FRA2断片Uの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP597(配列番号964)とを用いて、FRA2断片Bを増幅した。FRA2断片Bの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP598(配列番号965)と、FRA2断片Cの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP599(配列番号966)とを用いて、FRA2断片Uを増幅した。FRA2断片Uの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP600(配列番号967)と、プライマーoBP601(配列番号968)とを用いて、FRA2断片Cを増幅した。PCR精製キット(Qiagen)を用いてPCR産物を精製した。FRA2断片AおよびFRA2断片Bを混合し、プライマーoBP594(配列番号961)およびoBP597(配列番号96
4)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりFRA2断片ABを作成した。FRA2断片UおよびFRA2断片Cを混合し、プライマーoBP598(配列番号965)およびoBP601(配列番号968)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりFRA2断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Gel Extractionキット(Qiagen)により精製した。FRA2断片ABおよびFRA2断片UCを混合し、プライマーoBP594(配列番号961)およびoBP601(配列番号968)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりFRA2ABUCカセットを作成した。PCR産物をPCR
Purificationキット(Qiagen)により精製した。
Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen)により調製されたゲノムDNAを用いて、プライマーoBP602(配列番号969)およびoBP603(配列番号970)によるPCRによって確認した。分離株からのFRA2遺伝子の不在は、FRA2の欠失コード配列、oBP605(配列番号971)およびoBP606(配列番号972)に特異的なプライマーを用いて、ネガティブPCR結果によって実証した。正しい分離株を株CEN.PK113−7DMATa ura3Δ::loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]−DHAD|ilvD_Sm−PDC1t pdc5Δ::P[PDC5]−ADH|sadB_Ax−PDC5t gpd2Δ::loxP fra2Δとして選択し、PNY1505(BP1135)と命名した。
YPRCΔ15座位を欠失させ、AFT1からの天然プロモーター領域(800bp)およびターミネーター領域(800bp)と共に、AFT1−L99Aで置換した。YPRCΔ15欠失−AFT1L99Aの組込みのための痕跡のないカセットを、まずプラスミドpUC19−URA3MCSにクローン化した(参照によって本明細書中に援用される米国特許出願第61/356,379号明細書に記載される)。ベクターはpUC19に基づき、マルチクローニング部位(MCS)内に位置するS.セレビシエ(S.cerevisiae)CEN.PK113−7DからのURA3遺伝子の配列を含有する。pUC19(American Type Culture Collection,Manassas,VA、ATCC#37254)は、pMB1レプリコン、およびエシェリキア・コリ(Escherichia coli)における複製および選択のためにベータ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含有する。URA3のコード配列に加えて、この遺伝子の上流(250bp)および下流(150bp)からの配列は、酵母におけるURA3遺伝子の発現のために存在する。ベクターはクローニングの目的で使用することができ、酵母組込みベクターとして使用することができる。
Centre,Netherlands)ゲノムDNAからのURA3コード領域の上流250bpおよび下流150bpと共に、URA3コード領域を包含するDNAを、BamHI、AscI、PmeI、およびFseI制限部位を含有するプライマーoBP438(配列番号1033)と、XbaI、PacI、およびNotI制限部位を含有するoBP439(配列番号1034)とにより増幅した。Gentra Puregene
Yeast/Bactキット(Qiagen)を用いてゲノムDNAを調製した。PCR産物およびpUC19を、BamHIおよびXbaIによる消化の後、T4DNAリガーゼと連結させ、ベクターpUC19−URA3MCSを作成した。ベクターは、プライマーoBP264(配列番号1031)およびoBP265(配列番号1032)によるPCRおよび配列決定によって確認した。
bp)と共にAFT1−L99Aを増幅した。PCR産物をAscIおよびPmeIにより消化し、YPRCΔ15断片ABCを含有するプラスミドの対応する部位にT4DNAリガーゼと共に連結させた。プライマーoBP622(配列番号973)およびoBP627(配列番号978)を用いて、得られたプラスミドから組込みカセット全体を増幅した。
株BP1064は、CEN.PK113−7D(CBS8340、Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversiry Centre,Netherlands)に由来し、以下の遺伝子:URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6、およびGPD2の欠失を含有する。
内因性URA3コード領域を欠失させるために、ura3::loxP−kanMX−loxPカセットを、pLA54テンプレートDNA(配列番号986)からPCR増幅した。pLA54は、K.ラクティス(K.lactis)TEF1プロモーターおよびkanMXマーカーを含有し、loxP部位によって隣接されて、Creリコンビナーゼによる組換えおよびマーカーの除去を可能にする。PCRは、Phusion DNAポリメラーゼならびにプライマーBK505およびBK506(それぞれ、配列番号987および988)を用いて行った。各プライマーのURA3部分は、loxP−kanMX−loxPマーカーの組込みがURA3コード領域の置換をもたらすように、URA3プロモーターの上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域に由来した。標準遺伝子技術(Methods in Yeast Genetics,2005,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.201−202)を用いて、PCR産物をCEN.PK113−7Dに形質転換し、形質転換体を、G418(100μg/ml)を含有するYPDにおいて30℃で選択した。形質転換体をスクリーニングして、プライマーLA468およびLA492(それぞれ、配列番号989および990)を用いるPCRによって正しい組込みを検証し、CEN.PK113−7DΔura3::kanMXと命名した。
Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs,Ipswich,MA)およびCEN.PK113−7DゲノムDNA(Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen,Valencia,CA)により調製)をテンプレートとして用いて、痕跡のないHIS3欠失のためのPCRカセットの4つの断片を増幅した。プライマーoBP452(配列番号991)と、HIS3断片Bの5’端部に対する相同性を有する5
’尾部を含有するプライマーoBP453(配列番号992)とを用いて、HIS3断片Aを増幅した。HIS3断片Aの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP454(配列番号993)と、HIS3断片Uの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP455(配列番号994)とを用いて、HIS3断片Bを増幅した。HIS3断片Bの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP456(配列番号995)と、HIS3断片Cの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP457(配列番号996)とを用いて、HIS3断片Uを増幅した。HIS3断片Uの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP458(配列番号997)と、プライマーoBP459(配列番号998)とを用いて、HIS3断片Cを増幅した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。HIS3断片AおよびHIS3断片Bを混合し、プライマーoBP452(配列番号991)およびoBP455(配列番号994)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりHIS3断片ABを作成した。HIS3断片UおよびHIS3断片Cを混合し、プライマーoBP456(配列番号995)およびoBP459(配列番号998)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりHIS3断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Gel Extractionキット(Qiagen)により精製した。HIS3断片ABおよびHIS3断片UCを混合し、プライマーoBP452(配列番号991)およびoBP459(配列番号998)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりHIS3ABUCカセットを作成した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。
Frozen−EZ Yeast Transformation IIキット(Zymo Research)を用いて、CEN.PK113−7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3を、pRS423::PGAL1−cre(配列番号1011、米国仮特許出願第61/290,639号明細書に記載される)で形質転換し、2%のグルコースが補充されたヒスチジンおよびウラシルを欠いた合成完全培地において30℃でプレーティングすることによって、KanMXマーカーを除去した。1%のガラクトースが補充されたYP中、30℃で約6時間、形質転換体を増殖させて、CreリコンビナーゼおよびKanMXマーカーの切除を誘発させ、回収のために30℃でYPD(2%のグルコース)プレートにプレーティングした。分離株をYPD中で一晩増殖させ、5−フルオロ−オロト酸(0.1%)を含有する合成完全培地に30℃でプレーティングして、URA3マーカーを失った分離株を選択した。pRS423::PGAL1−creプラスミドの除去のために、5−FOA耐性分離株をYPDにおいて増殖およびプレーティングした。YPD+G418プレート、ウラシルを欠いた合成完全培地プレート、およびヒスチジンを欠いた合成完全培地プレートにおける増殖をアッセイすることによって、Ka
nMXマーカー、URA3マーカー、およびpRS423::PGAL1−creプラスミドの損失について分離株を検査した。G418に対して感受性があり、ウラシルおよびヒスチジンに対して栄養要求性である正しい分離株を、株CEN.PK113−7DΔura3::loxPΔhis3として選択し、BP857と命名した。欠失およびマーカー除去は、Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen)により調製されたゲノムDNAを用いて、Δura3のためのプライマーoBP450(配列番号1001)およびoBP451(配列番号1002)、ならびにΔhis3のためのプライマーoBP460(配列番号999)およびoBP461(配列番号1000)によるPCRおよび配列決定によって確認した。
Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs)およびCEN.PK113−7DゲノムDNA(Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen)により調製)をテンプレートとして用いて、痕跡のないPDC6欠失のためのPCRカセットの4つの断片を増幅した。プライマーoBP440(配列番号1003)と、PDC6断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP441(配列番号1004)とを用いて、PDC6断片Aを増幅した。PDC6断片Aの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP442(配列番号1005)と、PDC6断片Uの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP443(配列番号1006)とを用いて、PDC6断片Bを増幅した。PDC6断片Bの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP444(配列番号1007)と、PDC6断片Cの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP445(配列番号1008)とを用いて、PDC6断片Uを増幅した。PDC6断片Uの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP446(配列番号1009)と、プライマーoBP447(配列番号1010)とを用いて、PDC6断片Cを増幅した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。PDC6断片AおよびPDC6断片Bを混合し、プライマーoBP440(配列番号1003)およびoBP443(配列番号1006)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC6断片ABを作成した。PDC6断片UおよびPDC6断片Cを混合し、プライマーoBP444(配列番号1007)およびoBP447(配列番号1010)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC6断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Gel Extractionキット(Qiagen)により精製した。PDC6断片ABおよびPDC6断片UCを混合し、プライマーoBP440(配列番号1003)およびoBP447(配列番号1010)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC6ABUCカセットを作成した。PCR産物をPCR
Purificationキット(Qiagen)により精製した。
PDC1遺伝子を欠失させ、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)ATCC#700610からのilvDコード領域で置換した。Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs)およびNYLA83(米国仮特許出願第61/246709号明細書に記載)ゲノムDNA(Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen)により調製)をテンプレートとして使用して、PDC1欠失−ilvDSm組込みのためのPCRカセットのためのA断片およびその後のストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)からのilvDコード領域を増幅した。プライマーoBP513(配列番号1016)と、PDC1断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP515(配列番号1017)とを用いて、PDC1断片A−ilvDSm(配列番号1053)を増幅した。Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs)およびCEN.PK113−7DゲノムDNA(Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen)により調製)をテンプレートとして用いて、PDC1欠失−ilvDSm組込みのためのPCRカセットのB、U、およびC断片を増幅した。PDC1断片A−ilvDSmの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP516(配列番号1018)と、PDC1断片Uの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP517(配列番号1019)とを用いて、PDC1断片を増幅した。PDC1断片Bの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP518(配列番号1020)と、PDC1断片Cの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP519(配列番号1021)とを用いて、PDC1断片Uを増幅した。PDC1断片Uの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP520(配列番号1022)と、プライマーoBP521(配列番号1023)とを用いて、PDC1断片Cを増幅した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。PDC1断片A−ilvDSmおよびPDC1断片Bを混合し、プライマーoBP513(配列番号1016)およびoBP517(配列番号1019)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC1断片A−ilvDSm−Bを作成した。PDC1断片UおよびPDC1断片Cを混合し、プライマーoBP518(配列番号1020)およびoBP521(配列番号1023)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC1断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Gel Extractionキット(Qiagen)により精製した。PDC1断片A−ilvDSm−BおよびPDC1断片UCを混合し、プライマーoBP513(配列番号1016)およびoBP521(配列番号1023)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC1A−ilvDSm−BUCカセット(配列番号1054)を作成した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。
PDC5遺伝子を欠失させ、アクロモバクター・キシロスオキシダンス(Achromobacter xylosoxidans)からのsadBコード領域で置換した。PDC5欠失−sadB組込みのためのPCRカセットのセグメントをまずプラスミドpUC19−URA3MCSにクローン化した。
URA3MCSを作成した。ベクターは、プライマーoBP264(配列番号1031)およびoBP265(配列番号1032)によるPCRおよび配列決定によって確認した。
内因性GPD2コード領域を欠失させるために、loxP−URA3−loxPPCR(配列番号1052)をテンプレートDNAとして用いて、gpd2::loxP−URA3−loxPカセット(配列番号1057)をPCR増幅した。loxP−URA3−loxPは、loxPリコンビナーゼ部位に隣接される(ATCC♯77107)からのURA3マーカーを含有する。Phusion DNAポリメラーゼならびにプライマーLA512およびLA513(それぞれ、配列番号1029および1030)を用いてPCRを行った。loxP−URA3−loxPマーカーの組込みがGPD2コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのGPD2部分は、GPD2コード領域の上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域に由来した。PCR産物をBP913に形質転換し、形質転換体を1%のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地(グルコースなし)において選択した。形質転換体をスクリーニングして、プライマーoBP582およびAA270(それぞれ、配列番号1048および1049)を用いるPCRによって正しい組込みを検証した。
この実施例の目的は、イソブタノール経路中間体2,3−ジヒドロキシイソバレレート(DHIV)の蓄積に対する効果を示し、AFT1−L99A遺伝子の組込みコピーまたはFRA2欠失を有するイソブタノロゲン(isobutanologen)株におけるイソブタノール産生を親株と比較して示すことであった。イソブタノール経路プラスミドpYZ090(配列番号984、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願第61/368,436号明細書に記載)およびpLH468(配列番号985、参照によって本明細書中に援用される米国仮特許出願第61/246,844号明細書に記載)で菌株を形質転換した。またこれらのプラスミドは、以下のように、簡単に説明される。
Supplement(Clontech,Mountain View,CA))中で菌株を増殖させた。New Brunswick Scientific I24シェーカーにおいて30℃、225RPMで、125mLの通気孔付(vented)三角フラスコ内の15mLの培地中で一晩培養物を増殖させた。125mLの固くフタをした三角フラスコ中の18mlの培地を一晩培養物と共に、OD600が0.5になるまでインキュベートし、New Brunswick Scientific I24シェーカーにおいて、30℃、225RPMで6時間増殖させた。6時間後、グルコースを2.5%まで添加し、酵母抽出物を5g/Lまで添加し、ペプトンを10g/Lまで添加した(タイム0時間)。24時間および48時間後に、HPLC(参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第2007/0092957号明細書に記載される方法)およびLC/MSによって、培養物の上澄み(Spin−X遠心管フィルターユニット、Costar Cat.No.8169を用いて採取)を分析した。グルコースおよびイソブタノールの濃度は、HPLCにより決定した。Atlantis T3(パーツ#186003539)カラムを用いるWaters(Milford,MA)AcquityTQDシステムにおけるLC/MSによってDHIVを分離および定量した。カラムは30℃で保持し、流速は0.5mL/分であった。A移動相は水中0.1%のギ酸であり、B移動相はアセトニトリル中0.1%のギ酸であった。各ランは、99%のAで1分間、25
%のBまで1分間にわたる直線的な勾配の後、99%のAで1分間からなった。Waters ACQ_TQD(s/n QBA688)質量分析検出器により、コーン電圧32.5Vで、m/z=133(負のESI)におけるピークについてカラムの溶出をモニターした。DHIVは、通常、1.2分で出現した。ベースラインの分離を得て、1M水溶液ストックから作った標準溶液の分析を参照してDHIVのピーク面積をDHIV濃度μMに変換した。
Claims (4)
- 酵母宿主細胞におけるFe−Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法であって、
(a)Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップであって、ここで、Fe−Sクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、CCC1、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、ステップと、
(b)ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性を測定するステップと、
(c)ステップ(a)のポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性と、ステップ(a)のポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性とを比較するステップと
を含み、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性の増大が、上記Fe−Sクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す、上記方法。 - Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性の前記変化が、欠失、突然変異、置換、発現、上方制御、下方制御、細胞位置の変更、タンパク質の状態の変更、および/または補因子添加を含む、請求項1に記載の方法。
- ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する該ポリペプチドが、10-5よりも小さいE値で表12のプロファイルHMMとマッチするアミノ酸配列を有し、ポリペプチドがさらに、配列番号168に相当するストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)DHAD酵素のアミノ酸配列における位置56、129、および201に相当する3つの保存システイン全てを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、カンジダ属(Candida)、クルイベロミセス属(Kluyveromy
ces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、イサタケンキア属(Issatchenkia)、およびピキア属(Pichia)からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
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