CN102186983A - 酵母中提高的异源Fe-S酶活性 - Google Patents
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Abstract
酵母菌株被改造为具有提高的异源蛋白质活性,所述异源蛋白质的活性需要Fe-S簇的结合。所述酵母菌株具有降低的内源Fe-S蛋白质活性。异源的真菌或植物2Fe-2S二羟酸脱水酶和Fe-S丙二醇脱水酶再激活酶的活性被提高,以提高利用包含了这些酶的生物合成途径生成的产品的生产,所述产品为例如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、泛酸(维生素B5)、异丁醇、2-丁酮和2-丁醇。
Description
相关申请的交叉引用
本专利申请涉及并要求2008年9月29日提交的美国临时申请61/100,801和2008年9月29日提交的美国临时申请61/100,806的优先权。每一专利的全文均以引用方式并入本文。
发明领域
本发明涉及工业微生物学领域和其活性需要铁-硫簇的蛋白质的表达。更具体地讲,通过使特定宿主基因失活,提高了异源Fe-S(铁-硫)蛋白活性在酵母细胞中的表达。
背景技术
改造酵母以用于商业产品的发酵生产,是一个活跃的和正在成长中的领域。为了某些产品的生物合成而加以改造的酶途径,包括那些其活性需要铁-硫(Fe-S)簇的结合的酶。二羟酸脱水酶(DHAD)是一个例子。DHAD是生产缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和泛酸(维生素B5)的天然存在的生物合成途径的部分。对于增强的支链氨基酸或泛酸的微生物生产,提高DHAD活性的表达是合乎期望的。此外,2,3-二羟基异戊酸向α-酮异戊酸的DHAD催化的转化是共同未决的美国专利公布US 20070092957A1中所公开的多个异丁醇生物合成途径中的共同步骤。本文公开的是用于异丁醇生产的重组微生物的设计,异丁醇作为燃料添加剂是有用的,并且其使用可减少对石油化学燃料的需求。
在共同未决的美国专利公布US 2007-0292927A1中所公开的用于生产2-丁酮和2-丁醇的生物合成途径中,二醇脱水酶提供了酶活性。美国专利公布US20090155870公开的丁二醇脱水酶因其辅酶B-12非依赖性而对这一途径的表达是有用的。美国专利公布US20090155870还公开了不依赖B12的丁二醇脱水酶活性所必需的二醇脱水酶再激活酶,其中所述二醇脱水酶再激活酶是Fe-S簇蛋白质。2-丁酮,也叫甲基乙基酮(MEK),是广泛使用的溶剂、萃取剂和氧化反应的活化剂,也是2-丁醇化学合成的底物。2-丁醇作为燃料添加剂是有用的,其使用可减少对石油化学燃料的需求。
就包括了包含Fe-S簇的酶的途径中合成的化合物的生产改进而言,提供能在所关注的生产宿主中表达高水平的此种酶活性的宿主细胞是合乎期望的。虽然许多商品化的相关细菌和酵母能表达包含Fe-S簇的蛋白质的活性,但此类活性的水平远低于商业上可用于增强引入的生物合成途径的水平。因此,需要发现能够以高至足以增强引入的、具有Fe-S需求的途径的水平来表达包含Fe-S簇的蛋白质的活性的宿主细胞。由于对Fe-S簇的需求(这种需求涉及可用性和Fe-S簇向脱辅基蛋白中的正确装载),包含Fe-S簇的异源酶的功能性高表达的获得是成问题的。
发明概述
本文提供了包含至少一种异源Fe-S簇蛋白质的重组酵母宿主细胞,其中所述酵母宿主中至少一种内源Fe-S簇蛋白质的表达降低。
所述重组酵母细胞可在适当条件下生长,以生产包括异丁醇、2-丁醇和2-丁酮在内的产品。
在一个方面,所述重组酵母细胞在编码所述至少一种内源Fe-S簇蛋白质的基因中包含损坏。
在另一方面,所述内源Fe-S簇蛋白质选自二羟酸脱水酶、异丙基苹果酸脱水酶、亚硫酸盐还原酶、谷氨酸脱氢酶、生物素合酶、乌头酸酶、同型乌头酸酶、硫辛酸合酶、成熟铁氧化还原蛋白、NADH泛醌氧化还原酶、琥珀酸脱氢酶、泛醌醇-细胞色素-c还原酶、ABC蛋白Rli1、核苷三磷酸酶Nbp35和氢化酶样蛋白质。
在另一方面,所述酵母选自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)和毕赤酵母属(Pichia)。
在另一方面,所述内源Fe-S蛋白质在线粒体中表达,并且在另一个实施方案中,所述内源Fe-S簇蛋白质具有选自下列的活性:二羟酸脱水酶和异丙基苹果酸脱水酶活性。
在另一方面,所述宿主细胞属于表达编码多肽的基因的糖酵母属,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:114所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述至少一种异源Fe-S簇蛋白质选自真菌的2Fe-2S二羟酸脱水酶和植物的2Fe-2S二羟酸脱水酶。在一个实施方案中,所述异源的真菌或植物2Fe-2S簇二羟酸脱水酶在胞质溶胶中表达。在一个实施方案中,所述异源的真菌或植物2Fe-2S簇二羟酸脱水酶为多肽,所述多肽具有以<10-5的E值与表9的序型隐蔽马尔科夫模型(HMM)匹配的氨基酸序列,其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸,所述保守的半胱氨酸对应于变异链球菌(Streptococcus mutans)DHAD酶的氨基酸序列中的56、129和201位,所述DHAD酶氨基酸序列与对应于SEQ ID NO:179。在一个实施方案中,所述异源的真菌或植物2Fe-2S簇二羟酸脱水酶为多肽,所述多肽具有与选自下列的氨基酸序列有至少约95%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO 46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150和152。在一个实施方案中,所述异源的真菌或植物2Fe-2S簇二羟酸脱水酶为多肽,所述多肽具有采用Clustal W比对方法与SEQ ID NO:114有至少约90%同一性的氨基酸序列,其中所述比对采用空位罚分=10、空位长度罚分=0.1的默认参数和蛋白质序列全长上的Gonnet 250系列蛋白质权重矩阵。
在另一方面,提供了用于将2,3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的方法,所述方法包括:
a)提供(1)包含至少一种编码2Fe-2S二羟酸脱水酶的异源基因的重组酵母宿主细胞,其中所述重组酵母宿主细胞中至少一种内源Fe-S簇蛋白质的活性降低;和(2)2,3-二羟基异戊酸源;和
b)使(a)的重组宿主细胞在使2,3-二羟基异戊酸被所述宿主细胞转化为α-酮异戊酸的条件下,在所述2,3-二羟基异戊酸源的存在下生长。
在另一方面,提供了用于将2,3-丁二醇转化为2-丁酮的方法,所述方法包括:
a)提供(1)包含至少一种编码Fe-S丙二醇脱水酶再激活酶(reactivase)的异源基因的重组酵母宿主细胞,其中所述重组酵母宿主细胞中的至少一种内源Fe-S簇蛋白质的活性降低;和(2)2,3-丁二醇源;以及
b)使(a)的重组宿主细胞在使2,3-丁二醇被所述宿主细胞转化为2-丁酮的条件下,在所述2,3-丁二醇源的存在下生长。
还提供了用于生产异丁醇的方法,所述方法包括使本文所公开的重组酵母宿主细胞在产生异丁醇的条件下生长。
在其他实施方案中,所述至少一种异源Fe-S簇蛋白质具有Fe-S丙二醇脱水酶再激活酶活性。在一些实施方案中,所述具有Fe-S丙二醇脱水酶再激活酶活性的至少一种异源Fe-S簇蛋白质是丙二醇脱水酶再激活酶,所述丙二醇脱水酶再激活酶具有采用Clustal W比对方法与如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列有至少约90%同一性的氨基酸序列,其中所述比对采用空位罚分=10、空位长度罚分=0.1的默认参数和蛋白质序列全长上的Gonnet 250系列蛋白质权重矩阵。
在一些实施方案中,所述细胞产生2-丁醇,而在一些实施方案中,所述细胞产生2-丁酮。在一些实施方案中,所述细胞包含2-丁醇生物合成途径,而在一些实施方案中,所述细胞包含2-丁酮生物合成途径。
附图说明和序列描述
通过下面的具体实施方式、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明,这些详细描述、附图和序列描述形成了本专利申请的一部分。
图1显示用于异丁醇生产的生物合成途径。
图2显示用于2-丁酮和2-丁醇生产的生物合成途径。
表9是基于如实施例1中所述制备的、具有经过检验的功能的酶针对二羟酸脱水酶的HMM序型的表。表9以电子方式附于本文提交,并以引用方式并入本文。
下列序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”)并且符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)和EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis),以及行政性指示的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。
表1:靶标Fe-S蛋白质编码基因的失活
表2:除表1中的那些之外的真菌和植物的2Fe-2S DHAD
表3:表达基因
SEQ ID NO:17是合成的rdhtAB序列。
SEQ ID NOs:18-21和30-33是如本文的实施例中所述用于PCR、克隆或序列分析的引物。
SEQ ID NO:22是双终止子序列。
SEQ ID NO:23是啤酒糖酵母ADH终止子。
SEQ ID NO:24是啤酒糖酵母CYC1终止子。
SEQ ID NO:25是啤酒糖酵母FBA启动子。
SEQ ID NO:26是啤酒糖酵母GPM启动子。
SEQ ID NO:29是pNY13载体。
SEQ ID NO:34是啤酒糖酵母CUP1启动子。
SEQ ID NO:173是来自乳酸克鲁维酵母的ILV3 DHAD的经密码子优化的编码区。
表4:用于HMM序型的功能验证过的DHAD
发明详述
本文公开了当内源Fe-S包含蛋白被抑制或破坏时,酵母宿主细胞中引入的Fe-S包含蛋白具有高活性水平这一发现。本发明涉及经过改造以提供至少一种异源蛋白质的表达并且经过改造以降低至少一种内源Fe-S簇蛋白质的表达的重组酵母细胞,其中所述异源蛋白质是Fe-S簇蛋白质。在这些细胞中,所述异源Fe-S簇蛋白质的活性升高,使得在包括了所述酶活性的生物合成途径中制造的产品的生产获得改进。来自包括了Fe-S蛋白质的途径的商业上有用的产品的实例包括缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁醇、2-丁酮和2-丁醇。
以下缩写和定义将用于说明书和权利要求的理解。
如本文所用,术语“包含”、“由…组成”、“包括”、“涵盖”、“具有”、“含有”、“包容”或“容纳”或其任何其它变型旨在包括非排他的包含物。例如,包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素,而可以包括其它未明确列出的元素,或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外,除非有相反的明确说明,“或”是指包含性的“或”,而不是指排他性的“或”。例如,以下任何一种情况均满足条件A或B:A是真实的(或存在的)且B是虚假的(或不存在的),A是虚假的(或不存在的)且B是真实的(或存在的),以及A和B都是真实的(或存在的)。
同样,涉及元素或组分实例(即出现的事物)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此,应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个,并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代,除非有数字明显表示单数。
如本文所用,术语“发明”或“本发明”是非限制性术语,并且不旨在意指本发明的任何单独实施方案,而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施方案。
如本文所用,修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化:在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作;这些操作中非故意的误差;用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异;等等。术语“约”还包括由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰,权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中,术语“约”指在报告数值10%范围内,优选地在报告数值5%范围内。
术语“Fe-S簇蛋白质”是指与铁-硫簇结合,并且其活性需要与所述簇的结合的蛋白质。
术语“2Fe-2S DHAD”是指其活性需要结合的[2Fe-2S]2+簇的DHAD酶。
术语“Fe-S丙二醇脱水酶再激活酶”是指其活性需要结合的Fe-S簇的丙二醇脱水酶再激活酶。
术语“异丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。
术语“2-丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生2-丁醇的酶途径。
术语“2-丁酮生物合成途径”是指从丙酮酸产生2-丁酮的酶途径。
术语“二羟酸脱水酶”,亦缩写为DHAD,是指将2,3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的酶。
术语“丁二醇脱水酶”,也称为“二醇脱水酶”或“丙二醇脱水酶”,是指具有催化2,3-丁二醇转化为2-丁酮的酶活性的多肽(或多种多肽)。不利用辅因子腺苷钴胺素(也称为辅酶B12或维生素B12;尽管维生素B12也可指不是辅酶B12的其他形式的钴胺素)的丁二醇脱水酶是不依赖辅酶B12的二醇脱水酶,所述不依赖辅酶B12的二醇脱水酶需要与二醇脱水酶再激活酶相关联,其中所述二醇脱水酶再激活酶是Fe-S簇蛋白质。不依赖B12的二醇脱水酶的实例包括来自乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)(Hartmanis等人(1986)Arch.Biochem.Biophys.245:144-152)、丁酸梭菌(蛋白质SEQ ID NO:191;编码区SEQ ID NO:190;O’Brien等人(2004)Biochemistry 43:4635-4645)和Roseburia inulinivorans(编码:SEQ ID NO:15;蛋白质:SEQ ID NO:43;公开于共同未决的美国专利公布US20090155870中)的那些。
术语“丙二醇脱水酶再激活酶”,也称为“二醇脱水酶再激活酶”或“丁二醇脱水酶再激活酶”,是指二醇脱水酶的再激活因子,所述二醇脱水酶是在催化过程中发生自杀式失活的酶。与不依赖辅酶B12的二醇脱水酶相关联的二醇脱水酶再激活酶可以是Fe-S簇蛋白质。实例包括来自乙二醇梭菌(Hartmanis等人(1986)Arch.Biochem.Biophys.245:144-152)、丁酸梭菌(蛋白质SEQ ID NO:193;编码区SEQ ID NO:192;O’Brien等人(2004)Biochemistry 43:4635-4645)和Roseburia inulinivorans(编码:SEQ ID NO:16;蛋白质:SEQ ID NO:44;公开于共同拥有和共同未决的美国专利公布US20090155870)的那些。
术语“表达降低”当用于细胞宿主中蛋白质的表达时,将包括所述蛋白质的活性与其野生型形式相比被削弱(例如通过反义技术)或者通过基因中断、删除或灭活基本被除去的那些情况。
术语“碳底物”或“可发酵碳底物”指能够被本发明的宿主生物体代谢的碳源,特别是选自由下列的碳源:单糖、低聚糖、多糖和一碳底物或它们的混合物。
术语“基因”指能够被表达为特定蛋白的核酸片段,任选地包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”指与其自身调节序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因,包含非天然一起存在的调节序列和编码序列。因此,嵌合基因可包含得自不同来源的调节序列和编码序列,或者得自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调节序列和编码序列。“内源性基因”指在生物基因组中的天然位置的天然基因。“外来基因”或“异源基因”是指通常不存在于宿主生物中,但通过转基因被引入宿主生物中的基因。“异源基因”包括以不同于相应的天然基因的形式被引入源生物的天然的编码区或其部分。例如,异源基因可包括是被再引入至天然宿主的嵌合基因的一个部分的天然编码区,其中所述嵌合基因包括非天然的调控区。外来基因还可以包括插入到非天然生物内的天然基因,或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。
如本文所用,术语“编码区”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
术语“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲,编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因,或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成,或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解,不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中,或者在不同的发育阶段,或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到,由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全确定,因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联,使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如,当启动子能够影响编码序列的表达(即,该编码序列受到该启动子的转录控制)时,则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。
如本文所用,术语“表达”指源于本发明核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
如本文所用,术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体内,导致基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
如本文所用,术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件,并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状),其中多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中,该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起引入细胞中。
如本文所用,术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此,当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时,希望对基因进行设计,使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
术语“经密码子最优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下,改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体通常的密码子使用。
如本文所用,“分离的核酸片段”或“分离的核酸分子”将可以互换使用,并将指单链或双链的RNA或DNA聚合体,任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时,核酸片段“可杂交”至另一核酸片段,例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是众所周知的,并在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1989),尤其是在该文献第11章和表11.1(全文以引用方式并入本文)中进行了例示。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列),到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤可确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤,开始是6X SSC,0.5%SDS在室温洗涤15分钟,然后用2X SSC,0.5%SDS在45℃重复30分钟,然后用0.2X SSC,0.5%SDS在50℃重复洗涤两次,每次30分钟。一组较优选的严格性条件使用较高温度,其中洗涤步骤与上述那些步骤相同,不同的是最后两次用0.2X SSC,0.5%SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到60℃。另一组优选的高严格性条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1X SSC、0.1%SDS进行。例如,另一组严格性条件包括在0.1X SSC、0.1%SDS中于65℃下杂交,并用2X SSC、0.1%SDS洗涤,随后用0.1X SSC、0.1%SDS洗涤。
杂交需要两种核酸含有互补序列,但是取决于杂交的严格性,碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度,所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高,具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低:RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言,已经获得了计算Tm的方程式(参见Sambrook等人,同上,9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交,错配的位置变得更重要,而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人,同上,11.7-11.8)。在一个实施方案中,可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地,可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸;更优选至少约20个核苷酸;最优选长度为至少约30个核苷酸。此外,技术人员将认识到,可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分,该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因,所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成,或者可以利用诸如BLAST(Altschul,S.F.等人J.Biol.,215:403-410(1993))。一般来讲,为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源,需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外,对于核苷酸序列,包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外,12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物,以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此,核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书讲授了编码特定蛋白质的完整的氨基酸和核苷酸序列。具有如本文报道序列的有益效果,技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知的目的。因此,本发明包括在附随序列表中报道的完全序列,以及那些上述序列的主要部分。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如,对于DNA,腺嘌呤与胸腺嘧啶互补,而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
如本领域所熟知的,术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系,该关系通过对序列进行比较确定。本领域中,“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度,根据具体情况,通过此类线性序列的匹配情况进行测定。“同一性”和“相似性”能够通过已知方法容易地计算,所述方法包括但不限于下列文献中所述的那些方法:1.)Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,Ed.)Oxford University:NY(1988);2.)Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.,Ed.)Academic:NY(1993);3.)Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,Eds.)Humania:NJ(1994);4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,Ed.)Academic(1987);和5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.,Eds.)Stockton:NY(1991)。
设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和百分比同一性可使用LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.,Madison,WI)的MegAlignTM程序进行计算。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行,该方法涵盖若干个不同的算法,包括对应于称为Clustal V的比对方法的“Clustal V比对方法”,该方法描述于Higgins和Sharp,(CABIOS.5:151-153,1989);Higgins,D.G.等人(Comput.Appl.Biosci.,8:189-191,1992)并且存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlignTM程序中。就多重比对而言,默认值对应于空位罚分=10以及空位长度罚分=10。成对比对和使用Clustal方法的蛋白序列百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE=1,空位罚分=3,WINDOW=5,DIAGONALS SAVED=5。就核酸而言,这些参数为KTUPLE=2,空位罚分=5,WINDOW=4,DIAGONALS SAVED=4。在使用Clustal V程序的序列比对后,通过观看相同程序中的“序列距离”表获得“百分比同一性”是可能的。此外,也可以使用“Clustal W比对方法”,该方法相当于称为Clustal W的比对方法(描述于Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-153(1989);Higgins,D.G.等人,Comput.Appl.Biosci.,8:189-191,1992)并且存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlign v6.1程序中。用于多重比对的默认参数(缺口罚分=10、缺口长度罚分=0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(%)=30、DNA转换权重(DNA Transition Weight)=0.5、蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)=Gonnet系列和DNA权重矩阵(DNA Weight Matrix)=IUB)。在使采用Clustal W程序对序列进行比对之后,可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
本领域的技术人员非常清楚,多种程度的序列同一性可用于从其他物种中鉴定多肽,其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的有用实例包括但不限于:55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%,或者从55%至100%的任何整数百分比可用于描述本发明,例如55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。合适的核酸片段不但具有上述同源性,而且通常编码具有至少50个氨基酸,优选至少100个氨基酸,更优选至少150个氨基酸,更优选至少200个氨基酸,最优选至少250个氨基酸的多肽。
术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于:1)GCG程序软件包(Wisconsin Package Version 9.0,Genetics Computer Group(GCG),Madison,WI);2)BLASTP,BLASTN,BLASTX(Altschul等人,J.Biol.,215:403-410,1990);3)DNASTAR(DNASTAR,Inc.Madison,WI);4)Sequencher(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI);和5)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson,Comput.Methods Genome Res.,[Proc.Int.Symp.](1994),Meeting Date 1992,111-20.Editor(s):Suhai,Sandor.Plenum:New York,NY)。在本专利申请的上下文中应当理解,使用序列分析软件进行分析时,分析结果将基于所参考程序的“默认值”,除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述:Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)(下文称为“Maniatis”);以及Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1984);以及Ausubel,F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。所用的更多方法见于Methods in Enzymology,Volume 194、Guide to Yeast Genetics和Molecular and Cell Biology(Part A,2004,Christine Guthrie和Gerald R.Fink(Eds.),Elsevier Academic Press,San Diego,CA)。
酵母中提高的Fe-S簇蛋白质活性的发现
包含其活性所需的结合的铁-硫簇(Fe-S)的蛋白质,当被用于异源表达系统时,可能具有较低的活性。Fe-S簇的形成和它们向脱辅基蛋白的转移是多步骤的过程,涉及包括半胱氨酸脱硫酶、支架蛋白和分子伴侣在内的至少数种蛋白质。因此,异源Fe-S蛋白质可能不能被内源宿主系统有效地组装。申请人发现了提高作物异源蛋白质在酵母宿主细胞中表达的Fe-S蛋白质活性的方法。申请人发现,通过降低酵母宿主细胞中内源Fe-S蛋白质的生产,能够实现表达的异源Fe-S簇蛋白质活性的提高。当编码异丙基苹果酸脱水酶的内源基因(LEU1)或编码二羟酸脱水酶的内源基因(ILV3)在酵母宿主细胞中被失活时,异源的真菌或植物的2Fe-2S二羟酸脱水酶(DHAD)或Fe-S丙二醇脱水酶再激活酶(RdhtB)在所述酵母中的表达得到提高。
在编码内源Fe-S蛋白质的基因被失活的酵母宿主细胞中,与在Fe-S蛋白质编码基因未失活的酵母宿主细胞中的活性相比,所表达的异源Fe-S蛋白质的活性可被提高到至少约1.4倍。例如,与在不含删除的宿主中相比,乳酸克鲁维酵母DHAD在LEU1被删除的宿主中具有1.4倍的活性;如通过活化的RdhtA蛋白质活性(参见下文所述)所测量的,Roseburia inulinivorans RdhtB在LEU被删除的宿主中具有1.7倍的相对活性;胞质溶胶中表达的啤酒糖酵母DHAD在线粒体ILV3被删除的宿主中具有1.5倍的相对活性;以及,胞质溶胶中表达的乳酸克鲁维酵母DHAD在线粒体ILV3被删除的宿主中具有7.4倍的相对活性。
具有降低的内源Fe-S蛋白质表达的酵母宿主细胞
降低的内源Fe-S蛋白质表达可通过基因工程改造在可经受基因操作的任何酵母细胞中实现。实例包括糖酵母属、裂殖糖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属和毕赤酵母属的酵母。适合的菌株包括但不限于啤酒糖酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、光滑假丝酵母、白假丝酵母、树干毕赤酵母和解脂耶氏酵母。尤其适合的菌株是啤酒糖酵母。
在任何的这些酵母中,任何内源Fe-S蛋白质均可作为降低表达的靶标。酵母中可作为降低表达的靶标的Fe-S蛋白质包括,例如,下列蛋白质(通过编码基因):乌头酸酶(ACO1)、同型乌头酸酶(LYS4)、DHAD(ILV3)、硫辛酸合酶(LIP5)、生物素合酶(BIO2)、成熟铁氧化还原蛋白(YAH1)、NADH泛醌氧化还原酶(NDI1)、琥珀酸脱氢酶(SDH2)、泛醌醇-细胞色素-c还原酶(RIP1)、异丙基苹果酸异构酶(LEU1)、亚硫酸盐还原酶(ECM17)、谷氨酸脱氢酶(GLT1)、ABC蛋白Rli1(RLI1)、核苷三磷酸酶Nbp35(NBP35)和氢化酶样蛋白质(NARI1)。具有降低的特定Fe-S蛋白质表达的酵母细胞可能需要特殊的生长条件,例如向生长培养基中补充特定的营养物质,如本领域的技术人员所熟知的。例如,含有LEU 1破坏的菌株用亮氨酸补充,含有DHAD破坏的菌株用亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸补充,而含有LYS4破坏的菌株用赖氨酸补充。有些含有基因破坏的菌株的生长不需要进行补充。可作为降低表达的靶标的尤其适合的Fe-S蛋白质包括异丙基苹果酸异构酶(LEU1)、二羟酸脱水酶(ILV3)、亚硫酸盐还原酶(ECM17)、谷氨酸脱氢酶(GLT1)和生物素合酶(BIO2)。至少一种内源Fe-S蛋白质被改造为表达降低,并且两种或更多种内源Fe-S蛋白质可被降低。
LEU1编码异丙基苹果酸脱水酶,一种参与支链氨基酸生物合成,特别是亮氨酸的合成的属于EC 4.2.1.33的酶。任何编码异丙基苹果酸脱水酶的基因均可在本公开的酵母宿主细胞中被失活,其中所述异丙基苹果酸脱水酶是活性需要4Fe-4S簇的酶。酵母LEU1失活靶基因和它们所编码蛋白质的实例是来自啤酒糖酵母(编码SEQ ID NO:1;蛋白质SEQ ID NO:2)、粟酒裂殖酵母(编码SEQ ID NO:3;蛋白质SEQ ID NO:4)、光滑假丝酵母菌株CBS 138(编码SEQ ID NO:5;蛋白质SEQ ID NO:6)、白假丝酵母SC5314(编码SEQ ID NO:7;蛋白质SEQ ID NO:8)、乳酸克鲁维酵母(编码SEQ ID NO:;蛋白质SEQ ID NO:10)、解脂耶氏酵母(编码SEQ ID NO:11;蛋白质SEQ ID NO:12)和树干毕赤酵母(编码SEQ ID NO:13;蛋白质SEQ ID NO:14)的那些。
类似地,在本文所述的任何酵母宿主中,内源ILV3基因可被失活,以降低内源Fe-S蛋白质的表达。ILV3编码参与支链氨基酸生物合成的线粒体DHAD。线粒体DHAD被核基因编码,并且具有线粒体定位信号序列以使其被转运至并定位于线粒体中。任何ILV3基因均可在本公开的酵母宿主细胞中被失活。酵母ILV3失活靶基因和它们所编码蛋白质的实例是来自啤酒糖酵母YJM78(编码SEQ ID NO:111;蛋白质SEQ ID NO:112)、粟酒裂殖酵母(编码SEQ ID NO:93;蛋白质SEQ ID NO:94)、光滑假丝酵母菌株CBS 138(编码SEQ ID NO:107;蛋白质SEQ ID NO:108)、白假丝酵母SC5314(编码SEQ ID NO:101;蛋白质SEQ ID NO:102)、乳酸克鲁维酵母(编码SEQ ID NO:113;蛋白质SEQ ID NO:114)、解脂耶氏酵母(编码SEQ ID NO:105;蛋白质SEQ ID NO:106)和树干毕赤酵母CBS 6054(编码SEQ ID NO:103;蛋白质SEQ ID NO:104)的那些。
由于编码异丙基苹果酸脱水酶的基因和DHAD酶基因是人们所熟知的,并且由于基因组测序的普及,本领域的技术人员能够利用生物信息学方法,基于序列相似性容易地鉴定出这些酶的更多的适合种类。典型地,利用已知的异丙基苹果酸脱水酶氨基酸序列,例如本文所提供的那些,对可公开获得的数据库的BLAST(参见上文)检索被用于鉴定可在本文的菌株中作为失活的靶标的那些酶和它们的编码序列。例如,与任何SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14的异丙基苹果酸脱水酶蛋白和SEQ ID NO:94、102、104、106、108、112和114的DHAD蛋白具有至少约70-75%、75%-80%、80-85%、85%-90%、90%-95%或98%的氨基酸序列同一性的内源酵母异丙基苹果酸脱水酶和DHAD蛋白,可在本文的菌株中表达降低。同一性基于Clustal W比对方法,所述方法采用空位罚分=10、空位长度罚分=0.1的默认参数和Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵。
此外,本文提供的LEU1编码区和ILV3的序列可被用于鉴定其他天然同源物。例如本文所述的每种编码区可被用于分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的实例包括但不限于:1.)核酸杂交方法;2.)DNA和RNA扩增方法,例如多种核酸扩增技术的使用[例如,聚合酶链反应(PCR),Mullis等人,美国专利公开4,683,202;连接酶链反应(LCR),Tabor,S.等人,Proc.Acad.Sci.USA 82:1074(1985);或链置换扩增(SDA),Walker等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:392(1992)];以及3.)文库构建和互补筛选方法。
例如,与本文提供的异丙基苹果酸脱水酶和DHAD编码基因编码相似的蛋白质或多肽的基因,可以用本领域的技术人员所熟知的方法,通过将本发明的核酸片段的全部或部分用作DNA杂交探针来筛选来自任何目标生物的文库而被直接分离。基于所公开的核酸序列的特异性寡核苷酸探针,可通过本领域已知的方法(Maniatis,同上)设计和合成。而且,整个序列可用于通过技术人员已知的方法(如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术)直接合成DNA探针,或使用可用的体外转录体系合成RNA探针。另外,可设计特异性引物并将其用于扩增部分(或全长)的本发明序列。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应后标记,并被用作探针,以通过在适当严格度的条件下的杂交分离全长的DNA片段。
通常,在PCR类型的扩增技术中,引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于所需的检测条件,应该设计引物序列以提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是本领域常见且熟知的(Thein和Wallace,Human Genetic Diseases:A Practical Approach中的“The use of oligonucleotides as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders”,K.e.Davis编辑,(1986)pp33-50,IRL:Herndon,VA;以及Rychlik,W.,Methods in Molecular Biology,White,B.(A.编辑,(1993)Vol.15,pp 31-39,PCR Protocols:Current Methods and Applications.Humania:Totowa,NJ)。
通常,可以将本文所述序列的两个短片段在聚合酶链反应规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。聚合酶链反应也可以用克隆的核酸片段的文库进行,其中一个引物的序列源自本文所述核酸片段,而另一个引物的序列利用编码微生物基因的mRNA前体的3′端的多腺苷酸片的存在。
备选地,第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如,技术人员能够按照RACE规程(Frohman等人,PNAS USA 85:8998(1988)),通过利用PCR扩增转录物中的一个单独位点和3′或5′末端之间的区域的拷贝,生成cDNA。以3′和5′方向取向的引物可用本发明的序列设计。使用可商购获得的3′RACE或5′RACE体系(例如BRL,Gaithersburg,MD),能够分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人,PNAS USA 86:5673(1989);Loh等人,Science 243:217(1989))。
作为另外一种选择,所提供的异丙基苹果酸脱水酶和DHAD编码序列可作为用于鉴定同源物的杂交试剂。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有目的基因或基因片段的样本及特定的杂交方法。探针通常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是“可杂交的”。探针长度可从5个碱基至数万个碱基不等,这将取决于具体待完成的测试。通常约15个碱基至约30个碱基的探针长度是合适的。只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外,探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生,结果是杂交区内的一定比率的碱基没有与正确的互补碱基配对。
杂交方法是有严格规定的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在正确浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间,使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交都可发生。混合物中的探针或标记的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高,所需的杂交孵育时间就越短。任选地,可以加入离液剂。离液剂通过抑制核酸酶活性来稳定核酸。此外,离液剂允许短的寡核苷酸探针在室温下进行灵敏和严格的杂交(Van Ness和Chen,Nucl.Acids Res.19:5143-5151,1991)。合适的离液剂包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯,等等。通常,离液剂将以约3M的终浓度存在。如果需要,技术人员可将甲酰胺加到杂交混合物中,通常为30-50%(v/v)。
可以采用多种杂交溶液。通常,这些杂交溶液包含约20%至60%体积,优选30%体积的极性有机溶剂。普通的杂交溶液采用约30-50%v/v甲酰胺、约0.15至1M氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(例如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2%去垢剂(例如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500kdal)、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500kdal)和血清白蛋白。一般的杂交溶液还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA),以及任选约0.5%至2%重量/体积的甘氨酸。还可以包含其他添加剂,例如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖)在内的体积排阻剂。
核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针,该探针未经标记并且与序列的一部分互补。
可在本发明的酵母细胞中作为活性降低的靶标的任何其他Fe-S蛋白的蛋白质和核酸编码序列,可利用本领域的技术人员所熟知的生物信息学和其他方法得到鉴定。例如,乌头酸酶序列通过在生物信息学数据库中的关键词检索得到鉴定。通过这一方法鉴定的若干序列是来自啤酒糖酵母(编码SEQ ID NO:153;蛋白质SEQ ID NO:154)、粟酒裂殖酵母染色体II上(编码SEQ ID NO:155;蛋白质SEQ ID NO:156)、粟酒裂殖酵母染色体I上(编码SEQ ID NO:157;蛋白质SEQ ID NO:158)、乳酸克鲁维酵母(编码SEQ ID NO:15;蛋白质SEQ ID NO:160)、白假丝酵母SC5314(编码SEQ ID NO:161;蛋白质SEQ ID NO:162)、解脂耶氏酵母(编码SEQ ID NO:163;蛋白质SEQ ID NO:164)、树干毕赤酵母CBS 6054(编码SEQ ID NO:165;蛋白质SEQ ID NO:166)、光滑假丝酵母CBS 138染色体F(编码SEQ ID NO:167;蛋白质SEQ ID NO:168)、光滑假丝酵母CBS 138染色体D(编码SEQ ID NO:169;蛋白质SEQ ID NO:170)和光滑假丝酵母CBS 138染色体K(编码SEQ ID NO:171;蛋白质SEQ ID NO:172)的那些。
编码Fe-S蛋白质的基因,例如LEU1、ILV3或ACO1,可在任何酵母细胞中通过遗传修饰被破坏。用于靶基因遗传修饰的许多方法是本领域的技术人员已知的,并可被用于产生本发明的酵母菌株。可被用于降低或除去靶蛋白的表达的修饰是包括但不限于下列的破坏:整个基因或所述基因的部分的删除;向基因中(在启动子或编码区)插入DNA片段,从而使蛋白质不被表达或以较低水平表达;向编码区中引入突变,突变的引入导致终止密码子的加入或移框,从而使功能性蛋白质不被表达;以及向编码区中引入一个或多个突变以改变氨基酸,从而表达无功能的或酶活性较低的蛋白质。此外,可通过表达反义RNA或干涉RNA从而阻止基因的表达,并且可导入导致共抑制的构建体。此外,转录物的合成或其稳定性可通过突变被降低。类似地,从mRNA翻译为蛋白质的效率也可通过突变受到调控。本领域的技术人员利用已知的或鉴定的编码序列,例如LEU1或ILV3,可以容易地实施所有这些方法。
在一些修饰方法中,围绕LEU1、ILV3或ACO1编码序列的DNA序列也是有用的,并可用于一些酵母,所述酵母例如在NCBI(美国国立生物技术信息中心,National Center for Biotechnology Information)部署的基因组计划中,全基因组序列以基因组计划(Genome Project)ID9518进行整合的啤酒糖酵母,其具有标识GOPID 13838。酵母基因组序列的更多实例包括解脂耶氏酵母GOPIC 13837,和被包括于GPID 10771、10701和16373的白假丝酵母的那些。更多的基因组已被完全地测序和注释,并且就下列酵母菌株而言是可公开获得的:光滑假丝酵母CBS 138、乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140、树干毕赤酵母CBS 6054和粟酒裂殖酵母972h-。
具体而言,围绕靶编码序列如LEU 1或ILV3的DNA序列,对利用同源重组的修饰方法是有用的。例如,在这样的方法中,旁侧序列被置于选择性标记基因的边界处,以介导同源重组,从而使所述标记基因置换靶基因。同样,部分的靶基因序列和位于选择性标记基因边界处的旁侧序列可被用于介导同源重组,从而使所述标记基因置换所述靶基因的一个部分。此外,所述选择性标记可以被位点特异性重组位点限定边界,如此在相应的位点特异性重组酶表达之后,抗性基因被从靶基因处切除,而不会使后者再活化。位点特异性的重组留下重组位点,重组位点破坏了靶基因所编码蛋白质的表达。也可以构建同源重组载体以在切除所述选择性标记后在靶基因中留下删除,如本领域的技术人员所熟知的。
删除可以利用有丝分裂重组产生,如Wach等人((1994)Yeast 10:1793-1808)所述。该方法涉及制备包含介于基因组区域之间的选择性标记的DNA片段,其中所述基因组区域可短至20bp并且限定了靶DNA序列的边界。这种DNA片段可通过对所述选择性标记基因的PCR扩增制备,扩增用与所述标记基因末端杂交的寡核苷酸作为引物并且包括能与酵母基因组重组的所述基因组区域。线性DNA片段能够被有效地转入酵母并与基因组重组,导致基因置换,包括伴随着靶基因序列的删除的置换(如Methods in Enzymology,v194,pp 281-301(1991)中所述)。
此外,启动子置换方法可被用于交换内源转录调控元件,所述方法允许了调控表达的其他途径,例如Mnaimneh等人((2004)Cell 118(1):31-44)和本文的实施例12中所述。
此外,任何酵母细胞中的靶基因可通过随机诱变被破坏,随机诱变之后通过筛选鉴定出具有降低的靶基因活性的菌株。使用这一类型的方法时,不需要知道例如LEU1、ILV3或影响靶Fe-S蛋白质表达的基因组的任何其他区域的DNA序列。
用于产生基因突变的方法是本领域中通用的和已知的,并可被用于制备突变体的应用中。常用的随机遗传修饰方法(综述于Methods in Yeast Genetics,2005,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)包括自发突变、增变基因导致的突变、化学诱变、UV或X-射线辐照或转座子诱变。
酵母的化学诱变通常涉及用下列DNA诱变剂之一处理酵母细胞:甲烷磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸、硫酸二乙酯或N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基-胍(MNNG)。这些诱变方法已被综述于Spencer等人(Mutagenesis in Yeast,1996,Yeast Protocols:Methods in Cell and Molecular Biology.Humana Press,Totowa,NJ)。使用EMS的化学诱变可如Methods in Yeast Genetics,2005,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY中所述进行。用紫外(UV)光或X-射线辐照也可被用于在酵母细胞中产生随机突变生成。通过UV辐照的诱变的主要效应是会破坏DNA复制保真性的嘧啶二聚体的形成。酵母UV-诱变的规程可见于Spencer等人(Mutagenesis in Yeast,1996,Yeast Protocols:Methods in Cell and Molecular Biology.Humana Press,Totowa,NJ)。增变表型的引入也可被用于在酵母中产生随机的染色体突变。常用的增变表型可通过对下列基因中的一个或多个的破坏而获得:PMS1、MAG1、RAD18或RAD51。非增变表型的恢复可通过插入野生型等位基因容易地实现。可以对从任何上述这些或其他已知的随机诱变方法产生的经修饰的细胞的集合,就降低的Fe-S蛋白质活性进行筛选。
异源Fe-S蛋白质
任何真菌的或植物的2Fe-2S簇二羟酸脱水酶(DHAD)和任何Fe-S丙二醇脱水酶再激活酶,可以在如本文所公开的经过改造以降低内源Fe-S簇蛋白质表达的酵母宿主细胞中,作为异源蛋白质被表达,并可获得提高的活性。异源蛋白质包括以不同于相应内源蛋白质的表达的方式表达的蛋白质。例如在酵母中,内源DHAD被细胞核中的ILV3编码,而表达的DHAD蛋白质具有线粒体定位信号序列,使得该蛋白质被定位在线粒体中。Fe-S簇在线粒体中被添加到DHAD蛋白质上,以实现其在支链氨基酸生物合成中的活性。在胞质溶胶中表达DHAD活性,以参与位于胞质溶胶中的生物合成途径,是合乎期望的。在酵母中,DHAD在胞质溶胶的表达是异源表达,因为天然蛋白质是定位在线粒体中的。例如,通过表达去除了线粒体定位信号的啤酒糖酵母DHAD编码区,从而使所述蛋白质保持在胞质溶胶中,获得了啤酒糖酵母DHAD在啤酒糖酵母中的异源表达。可用于本公开中的2Fe-2SDHAD包括来自真菌和植物的那些。代表性的真菌或植物的2Fe-2SDHAD列于表1和2中。出于列表的简洁起见,从分析中除去了具有95%或更高的氨基酸序列同一性的真菌或植物的2Fe-2S DHAD。然而,与任何这些序列具有95%或更高的氨基酸同一性的任何序列在本发明中是有用的。用以获得2Fe-2S DHAD的分析描述于共同拥有和共同未决的美国专利申请61/100792中,该专利以引用方式并入本文。所述分析如下:其中基于八种功能已证实的DHAD的氨基酸序列,制备了序型隐蔽马尔科夫模型(HMM)。这些DHAD来自欧洲亚硝化单胞菌(DNA SEQ ID NO:174;蛋白质SEQ ID NO:175)、集胞藻属未定名种PCC6803(DNA SEQ ID:176;蛋白质SEQ ID NO:177)、变异链球菌(DNA SEQ ID NO:178;蛋白质SEQ ID NO:179)、嗜热链球菌(DNA SEQ ID NO:180;蛋白质SEQ ID No:181)、抗重金属罗尔斯通氏菌(DNA SEQ ID NO:182;蛋白质SEQ ID NO:183)、富养罗尔斯通氏菌(DNA SEQ ID NO:184;蛋白质SEQ ID NO:185)和乳酸乳球菌(DNA SEQ ID NO:186;蛋白质SEQ ID NO:187)。此外,来自约氏黄杆菌的DHAD(DNA SEQ ID NO:188;蛋白质SEQ ID NO:189)被发现当在大肠杆菌中表达时具有二羟酸脱水酶活性,并被用于制备上述谱图。所述HMM序型使用HMMER软件包,按照可从HMMER(Janelia Farm Research Campus,Ashburn,VA)获得的用户指南制备(HMM序型背后的理论描述于R.Durbin,S.Eddy,A.Krogh和G.Mitchison,Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids,Cambridge University Press,1998;Krogh等人,1994;J.Biol.235:1501-1531中)。HMMER软件程序的输出结果是特征化所输入序列的序型隐蔽马尔科夫模型(HMM),如表9所示。
任何以E值<10-5与所述HMM序型匹配的蛋白质均是DHAD相关蛋白质,包括4Fe-4S DHAD、2Fe-2S DHAD、阿拉伯糖酸脱水酶和磷酸葡糖酸脱水酶。然后就三个保守的半胱氨酸的存在对符合HMM序型的序列进行了分析,所述保守的半胱氨酸对应于变异链球菌DHAD中的56、129和201位。全部三个保守的半胱氨酸的存在是具有[2Fe-2S]2+簇的蛋白质的特征。具有所述三个保守的半胱氨酸的蛋白质包括阿拉伯糖酸脱水酶和2Fe-2S DHAD。通过在对应于变异链球菌DHAD氨基酸序列下列位点的位点,就存在于2Fe-2S DHAD中或阿拉伯糖酸脱水酶中的保守的特征氨基酸进行分析,可将2Fe-2S DHAD与阿拉伯糖酸脱水酶加以区分。这些特征氨基酸在下列位点分别存在于2Fe-2S DHAD或阿拉伯糖酸脱水酶中(以高于90%的发生率):88天冬酰胺对谷氨酸;113不保守对谷氨酸;142精氨酸或天冬酰胺对不保守;165不保守对甘氨酸;208天冬酰胺对不保守;454亮氨酸对不保守;477苯丙氨酸或酪氨酸对不保守;以及487甘氨酸对不保守。
通过该方法鉴定的具有真菌或植物来源的蛋白质,例如SEQ ID NO:46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150和152,以及与任何这些序列具有至少约95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸同一性的任何蛋白质,可被用于本发明中。尤其适合的是来自乳酸克鲁维酵母的DHAD(SEQ ID NO:114)和采用Clustal W比对方法与SEQ ID NO:114具有至少约90%氨基酸序列同一性的DHAD,其中所述比对采用空位罚分=10、空位长度罚分=0.1的默认参数和蛋白质序列全长上的Gonnet 250系列蛋白质权重矩阵。
此外,可用于本发明中的真菌或植物的2Fe-2S DHAD,可通过它们在DHAD相关蛋白质的系统演化树的真菌或植物2Fe-2S DHAD分枝上的位置得到鉴定。此外可被使用的2Fe-2S DHAD可通过与本文提供了序列的任何真菌或植物的2Fe-2S DHAD的序列相比较而得到鉴定,其中序列同一性可以为至少约80%-85%、85%-90%、90%-95%或95%-99%。
此外,本文提供的真菌或植物的2Fe-2S DHAD的序列可被用于鉴定其他的天然同源物。例如,本文以SEQ ID NO:45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、11、121、123、125、127、129、131、133、135、137、13、141、143、145、147、149和151给出的每一DHAD编码核酸片段,可被用于针对LEU1编码区分离编码同源蛋白质的基因,如上文所述。
Roseburia inulinivorans的不依赖辅酶B-12的丙二醇脱水酶再激活酶是活性需要Fe-S簇的蛋白质。这种蛋白质,RdhtB,公开于共同未决的美国专利公布US20090155870中,该专利以引用方式并入本文。RdhtB再激活Roseburia inulinivorans的不依赖辅酶B-12的丙二醇脱水酶,所述不依赖辅酶B-12的丙二醇脱水酶称为RdhtA并且同样公开于共同未决的美国专利公布US20090155870中。由于RdhtB为RdhtA的活性所必需,RdhtB的活性可通过对RdhtA活性的分析得到评估。通过在本文所公开的具有降低的内源Fe-S蛋白质表达的酵母宿主中的表达,RdhtB的活性以及由此的RdhtA的活性得到提高。在具有降低的内源Fe-S蛋白质表达的酵母菌株中,其活性需要Fe-S簇的任何不依赖辅酶B12的丙二醇脱水酶再激活酶的异源表达可得到提高。通过在辅酶B12的存在或不存在下评估相关的丙二醇脱水酶的丙二醇脱水酶活性,本领域的技术人员可容易地鉴定不依赖辅酶B12的丙二醇脱水酶再激活酶。一个实例是丁酸梭菌(编码区SEQ ID NO:192;蛋白质SEQ ID NO:193)的二醇脱水酶再激活酶。
本领域的技术人员可通过对序列的生物信息学分析如与RdhtB SEQ ID NO:44的序列的比较,鉴定出其他可使用的不依赖辅酶B12的丙二醇脱水酶再激活酶。具有不依赖辅酶B12的丙二醇脱水酶再激活酶活性,并且与SEQ ID NO:44具有至少约80%-85%、85%-90%、90%-95%或95%-99%的序列同一性的蛋白质可被使用。尤其适合的是采用Clustal W比对方法与SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列具有至少约90%同一性的那些,其中所述比对采用空位罚分=10、空位长度罚分=0.1的默认参数和蛋白质序列全长上的Gonnet 250系列蛋白质权重矩阵。
此外,通过如上文所述的针对LEU1编码区的方法,其他不依赖辅酶B12的丙二醇脱水酶再激活酶同源物可利用RdhtB编码区(SEQ ID NO:16)得到鉴定。
异源Fe-S蛋白质的表达
通过用编码Fe-S蛋白质的序列进行转化,从而实现表达。待表达的编码区可以是针对目的宿主细胞经密码子优化的,如本领域的技术人员所熟知的。用于酵母中基因表达的方法是本领域已知的(例如,参见Methods in Enzymology,Volume 194,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology Part A,2004,Christine Guthrie和Gerald R Fink(Eds.),Elsevier Academic Press,San Diego,CA)。基因在酵母中的表达通常需要可操作地连接至所关注的编码区的启动子,和转录终止子。多种酵母启动子能被用于在酵母中构建基因的表达盒,包括但不限于来自下列基因的启动子:CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、CUP1、FBA、GPD、GPM、andAOX1。适合的转录终止子包括但不限于FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、GAL1t、CYC1、and ADH1。
适合的启动子、转录终止子和编码区可被克隆至大肠杆菌-酵母穿梭载体,并被转入酵母细胞。这些载体既允许在大肠杆菌菌株中也允许在酵母菌株中的增殖。所用载体通常包含选择性标记和在目标宿主中允许自主复制或染色体整合的序列。通常在酵母中使用的质粒是穿梭载体pRS423、pRS424、pRS425和pRS426(美国典型培养物保藏中心,Rockville,MD),它们包含大肠杆菌复制起点(例如pMB1)、酵母2μ复制起点和营养选择的标记。这四种载体的选择标记是His3(载体pRS423)、Trp1(载体pRS424)、Leu2(载体pRS425)和Ura3(载体pRS426)。携带编码所述Fe-S蛋白质编码区的嵌合基因的表达载体的构建,既可通过大肠杆菌中标准的分子克隆技术进行,也可通过酵母中的缺口修复重组方法进行。
缺口修复克隆方法利用了酵母中高效的同源重组。典型地,酵母载体DNA被消化(例如,在其多克隆位点),以在其序列中产生“缺口”。制备所关注的多种插入DNA,所述插入DNA在其5’和3’末端均包含≥21bp的序列,所述序列依次彼此重叠和与载体DNA的5’和3’末端重叠。例如,为了构建“基因X”的酵母表达载体,选择了用于表达盒的酵母启动子和酵母终止子。所述启动子和终止子扩增自酵母基因组DNA,而基因X通过PCR扩增自其源生物,或者从包含基因X序列的克隆载体获得。线性化载体的5’末端和启动子序列之间、启动子和基因X之间、基因X和终止子序列之间以及终止子和线性化载体的3’末端之间有至少21bp的重叠序列。然后将“带缺口”的载体和插入DNA共转入酵母菌株,并铺板于包含适当的化合物混合物的培养基上,所述混合物允许质粒上营养选择标记的互补作用。通过利用从选择的细胞制备的质粒DNA进行PCR作图,能够验证正确的插入组合的存在。然后可将从酵母分离的质粒DNA(通常浓度较低)转入大肠杆菌菌株,例如TOP10,然后通过小量抽提和限制性作图进一步验证质粒构建体。最后,所述构建体可通过序列分析得到验证。
与缺口修复技术类似,向酵母基因组的整合也利用了酵母中的同源重组系统。典型地,利用高保真DNA聚合酶和引物,包含编码区加上控制元件(启动子和终止子)和营养缺陷型标记的盒被PCR扩增,其中所述引物与所述盒杂交,并且包含与期望插入发生的基因组区域的5’和3’区域同源的40-70碱基对的序列。然后将PCR产物转入酵母,并铺板于包含适当的化合物混合物的培养基上,所述混合物允许对所整合的营养缺陷型标记的选择。例如,为了将“基因X”整合至染色体位置“Y”,从质粒DNA构建体PCR扩增了启动子-编码区X-终止子构建体,并通过SOE PCR或普通的限制性消化和克隆将其与营养缺陷型标记(例如URA3)相连接。利用引物PCR扩增了包含启动子-编码区X-终止子-URA3区域的完整的盒,其中所述引物包含与酵母染色体上“Y”位置的5’和3’区域同源的40-70bp序列。上述PCR产物被转入酵母,并在缺乏尿嘧啶的生长培养基上进行选择。转化体可通过克隆PCR或通过对染色体DNA的直接测序得到验证。
本文的酵母细胞中表达的任何编码区可以是针对在被改造的特异性宿主酵母细胞中的表达经过密码子优化的,如本领域的技术人员所熟知的。例如,在本文的实施例1中,啤酒糖酵母中的乳酸克鲁维酵母和树干毕赤酵母ILV3编码区,均为针对啤酒糖酵母的表达经过密码子优化的。
以提高的异源Fe-S蛋白质活性进行的产物生物合成
Fe-S蛋白质有助于其生物合成途径的任何产物的生产,可受益于本文所公开的在具有降低的内源Fe-S蛋白质表达的酵母细胞中异源表达的Fe-S蛋白质提高的活性。例如,DHAD提供了异丁醇生物合成途径中的一个步骤,而RdhtB有助于生产2-丁酮或2-丁醇的生物合成途径。
包含通过DHAD完成的步骤的用于合成异丁醇的生物合成途径,公开于共同拥有和共同未决的美国专利申请公布US 20070092957A1中,该专利以引用方式并入本文。图1中提供了所公开的异丁醇生物合成途径的图示。本文所公开的菌株中的异丁醇生产受益于提高的DHAD活性。如美国专利公布US20070092957A1中所述,在一个实施例中异丁醇生物合成途径的步骤包括下列转化:
-丙酮酸向乙酰乳酸(图1途径的步骤a),例如受乙酰乳酸合酶催化;
-乙酰乳酸向2,3-二羟基异戊酸(图1途径的步骤b),例如受乙酰羟酸异构还原酶催化;
-2,3-二羟基异戊酸向α-酮异戊酸(图1途径的步骤c),例如受乙酰羟酸脱水酶,也叫DHAD催化;
-α-酮异戊酸向异丁醛(图1途径的步骤d),例如受支链α-酮酸脱羧酶催化;和
-异丁醛向异丁醇(图1途径的步骤e),例如受支链醇脱氢酶催化。
就选择性途径的步骤f、g、h、l、j和k而言,将底物转化为产物以及这些反应中所涉及的酶描述于US 20070092957A1中。
就所述异丁醇途径而言,可被用于所述酶的表达的基因描述于US20070092957A1中,并且本领域的技术人员能够通过生物信息学或实验方法鉴定更多的可被使用的基因,如上文所述。在全部三条途径中,具有特别高活性的酮醇酸还原异构酶(KARI)优选的使用公开于共同拥有和共同未决的美国专利公布US20080261230中。该专利公开的高活性KARI的实例是来自霍乱弧菌(DNA:SEQ ID NO:35;蛋白质SEQ ID NO:36)、铜绿假单胞菌PAO1,(DNA:SEQ ID NO:37;蛋白质SEQ ID NO:38)和荧光假单胞菌PF5(DNA:SEQ ID NO:39;蛋白质SEQ ID NO:40)的那些。
对于利用所公开的生物合成途径的异丁醇生产,US 20070092957A1中还描述了嵌合基因的构建和酵母,例如啤酒糖酵母的基因工程。
用于2-丁酮和2-丁醇合成的包括丙二醇脱水酶的生物合成途径公开于共同拥有和共同未决的美国专利公布US20070292927A1中,该专利以引用方式并入本文。图2提供了所公开的2-丁酮和2-丁醇生物合成途径的图示。2-丁酮是当图示的最后步骤,将2-丁酮转化为2-丁醇被省去时的制得的产物。本文所公开的菌株中2-丁酮或2-丁醇的生产受益于提高的不依赖辅酶B-12的丙二醇脱水酶再激活酶活性。如美国专利公布US20070292927A1中所述,所公开的生物合成途径中的步骤包括下列转化:
-丙酮酸向乙酰乳酸(图2步骤a),例如受乙酰乳酸合酶催化;
-乙酰乳酸向乙偶姻(图2步骤b),例如受乙酰乳酸脱羧酶催化;
-乙偶姻向2,3-丁二醇(图2步骤i),例如受丁二醇脱氢酶催化;
-2,3-丁二醇向2-丁酮(图2步骤j),例如受二醇脱水酶、甘油脱水酶或丙二醇脱水酶催化;和
-2-丁酮向2-丁醇(图2步骤f),例如受丁醇脱氢酶催化。
可被用于表达这些酶的基因描述于美国专利公布US20070292927A1中。在酵母中,来自Roseburia inulinivorans的丁二醇脱水酶,RdhtA(蛋白质SEQ ID NO:43,编码区SEQ ID NO:15),在这一途径中的使用公开于共同拥有和共同未决的美国专利公布US20090155870中。该酶与来自Roseburia inulinivorans的丁二醇脱水酶再激活酶,RdhtB(蛋白质SEQ ID NO:44,编码区SEQ ID NO:16)协同使用。这种丁二醇脱水酶在许多宿主中是合乎期望的,因为它不需要辅酶B12。
对于利用US 20070292927A1公开的生物合成途径的2-丁醇生产,美国专利公布US20090155870中还描述了嵌合基因的构建和酵母的基因工程。
发酵培养基
本文所公开的酵母可生长在发酵培养基中,以生产以Fe-S蛋白质作为其生物合成途径的部分的产物。发酵培养基必须包含适当的碳底物。合适的底物可包括但不限于:单糖,例如葡萄糖和果糖;低聚糖,例如乳糖或蔗糖;多糖,例如淀粉、纤维素或它们的混合物;以及来自可再生原料的未纯化混合物,例如干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜及大麦麦芽。另外,碳底物也可以是已被证明可以被代谢转化为关键生化中间产物的诸如二氧化碳的一碳底物或甲醇。除了一碳和二碳底物之外,甲基营养生物体也已知可以利用多种其他含碳化合物,例如甲胺、葡糖胺及用于代谢活动的多种氨基酸。例如,甲基营养酵母已知可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人,Microb.Growth C1 Compd.,[Int.Symp.],7th(1993),415-32.编辑:Murrell,J.Collin;Kelly,Don P.Publisher:Intercept,Andover,UK)。类似地,假丝酵母属的多种物种将会代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人,Arch.Microbiol.153:485-489(1990))。因此,预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于生物体的选择。
尽管预期所有上述碳底物及它们的混合物都适用于本发明,但优选的碳底物为葡萄糖、果糖和蔗糖。
除了合适的碳源外,发酵培养基还必须含有本领域的技术人员已知的适合培养物生长和促进所期望的产物的生产所必需的酶途径的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂及其他组分。
培养条件
通常,使细胞在约20℃至约37℃的温度范围下在合适的培养基中生长。本发明中适当的生长培养基是普通的商品化制备的培养基,例如包含了酵母氮源、硫酸铵和作为碳/能源的右旋糖的肉汤,或者YPD培养基,蛋白胨、酵母提取物和右旋糖以大多数啤酒糖酵母菌株生长的最适比例的一种混合物。也可以使用其他确定的或合成的生长培养基,微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于具体微生物生长的合适培养基。
适于发酵的pH范围在pH 3.0到pH 7.5之间,其中pH 4.5.0至pH6.5优选作为起始条件。
发酵可以在有氧或厌氧条件下进行,其中厌氧或微氧条件是优选的。
发酵培养基中生产的丁醇的量可使用本领域已知的多种方法进行测定,例如高效液相色谱(HPLC)或气相色谱(GC)。
工业分批发酵和连续发酵
本发明的工艺采用分批发酵方法。经典的分批发酵是封闭系统,其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不进行人工改变。因此在发酵开始时,用所需生物体对培养基进行接种,在不向系统添加任何物质的情况下进行发酵。然而,通常来说,“分批”发酵是指碳源的添加是成批的,但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批发酵系统中,代谢产物和生物质组成持续改变直至发酵结束时。在分批培养物内,细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期,并最后达到稳定期,此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理,稳定期中的细胞将最终死亡。通常,对数期中的细胞负责产生大部分终产物或中间产物。
标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。补料分批发酵工艺也适用于本发明,并且包括典型的分批式系统,不同的是随着发酵进程递增地添加底物。在代谢产物容易抑制细胞的代谢作用以及期望培养基中具有有限量的底物时,补料分批式系统是有用的。补料分批式系统中的实际底物浓度难于测量并因而可根据一些可测量因素例如pH、溶解氧以及废气如CO2的分压进行评估。分批发酵和补料分批发酵在本领域内是常用的且众所周知,并且实例可见于如下文献:Thomas D.Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第二版,1989,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA.),或者Deshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227,(1992),该文献以引用方式并入本文。
尽管本发明是以分批模式进行,但预期该方法将可适用于连续发酵方法。连续发酵是一种开放式系统,其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中,并同时移出等量条件培养基用于加工。连续发酵一般使培养物维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高密度。
连续发酵允许调节一种因素或任意数目的因素,这些因素影响细胞生长或终产物浓度。例如,一种方法将以固定的速率维持限制性营养物质例如碳源或氮水平并且允许所有其他参数适度。在其他系统中,影响生长的许多因素可以连续改变,而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统力求维持稳态的生长条件,并因而在发酵过程中由于培养基被取出而导致的细胞损失必须与细胞的生长率保持平衡。用于调节连续发酵工艺中的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率保持最高水平的方法是工业微生物领域众所周知的,并且多种方法已由Brock(同上)详细描述。
本发明可以用分批、补料分批或连续方法实施,并且已知的发酵模式是适合的。另外,预期可以将细胞固定在底物上而作为完整的细胞催化剂并让其经受发酵条件以生产1-丁醇。
用于从发酵培养基中分离丁醇的方法
生物生产的丁醇可使用本领域已知的方法从发酵培养基分离。例如,可通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中移除固体。然后,可使用例如如蒸馏、液-液萃取、或膜分离的方法从发酵培养基分离丁醇,其中所述培养基已经如上所述经过处理以移除固体。因为丁醇与水形成低沸点的共沸混合物,蒸馏仅能被用于分离混合物直至其共沸组成。蒸馏可与其他分离方法组合使用以分离共沸物。可与蒸馏组合使用以分离并纯化丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液萃取、吸附和基于膜的技术。此外,可使用共沸蒸馏用夹带剂(参见例如Doherty和Malone,Conceptual Design of Distillation Systems,McGraw Hill,New York,2001)分离丁醇。
丁醇-水混合物形成非均相共沸物,如此可组合使用蒸馏和滗析以分离并纯化丁醇。在这种方法中,包含丁醇的发酵液被蒸馏至接近共沸组成。然后,冷凝共沸混合物,通过滗析从发酵培养基分离丁醇。滗析后的含水相可作为回流返回第一蒸馏塔。富含丁醇的滗析有机相可通过在第二蒸馏塔中蒸馏进一步被纯化。
也可从发酵培养基中组合使用液-液萃取和蒸馏分离丁醇。在这种方法中,使用液-液萃取用合适溶剂从发酵液中萃取丁醇。然后蒸馏包含丁醇的有机相以从溶剂中分离丁醇。
也可组合使用蒸馏和吸附以
从发酵培养基中分离丁醇。在这种方法中,蒸馏包含丁醇的发酵液使其接近共沸组成,然后使用吸附剂移除剩余的水,例如分子筛(Aden等人,Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover,Report NREL/TP-510-32438,National Renewable Energy Laboratory,June 2002)。
此外,可组合使用蒸馏和全蒸发以从发酵培养基中分离和纯化丁醇。在这种方法中,蒸馏包含丁醇的发酵液使其接近共沸组成,然后用蒸发通过亲水性膜移除剩余的水(Guo等人,J.Membr.Sci.245,199-210(2004))。
实施例
本发明将在下面的实施例中得到进一步阐述。应该理解,尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案,但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例,本领域的技术人员可确定本发明的必要特征,并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下,可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
一般方法
实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,NY(1989)(Maniatis)和T.J.Silhavy,M.L.Bennan,和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1984)和Ausubel,F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology,pub.Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987),以及Methods in Yeast Genetics,2005,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY。
适合细菌培养物的维持及生长的材料和方法在领域内是众所周知的。适用于下列实施例的技术可在见于Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt,R.G.e.Murray,Ralph N.Costilow,Eugene W.Nester,Willis A.Wood,Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips,eds),American Society for Microbiology,Washington,DC.(1994))或者Thomas D.Brock在Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第二版,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(1989)中。使用的用于微生物细胞生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料得自Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)、BD Diagnostic Systems(Sparks,MD)、Life Technologies(Rockville,MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis,MO),除非另外指明。除非另外指明,微生物菌株获取自美国典型培养物保藏中心(ATCC),Manassas,VA。所有的寡核苷酸引物由Sigma-Genosys(Woodlands,TX)或Integrated DNA Technologies(Coralsville,IA)合成。
完全合成培养基描述于Amberg,Burke和Strathern,2005,Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY中。
HPLC
对发酵副产物组成的分析是本领域的技术人员所熟知的。例如,一种使用Shodex SH-1011柱和Shodex SH-G保护柱(二者均可购自Waters Corporation,Milford,MA)并联合折射率(RI)检测的高效液相色谱(HPLC)方法。用0.01M H2SO4作为流动相,以0.5mL/min流量和50℃的柱温实现色谱分离。异丁醇保留时间为47.6分钟。
缩写的含义如下:“s”是指秒,“min”是指分钟,“h”是指小时,“psi”是指磅每平方英寸,“nm”是指纳米,“d”是指天,“μL”是指微升,“mL”是指毫升,“L”是指升,“mm”是指毫米,“nm”是指纳米,“mM”是指毫摩尔每升,“M”是指摩尔每升,“mmol”是指毫摩尔,“μmol”是指微摩尔”,“g”是指克,“μg”是指微克而“ng”是指纳克,“PCR”是指聚合酶链反应,“OD”是指光密度,“OD600”是指在600nm波长测量的光密度,“kDa”是指千道尔顿,“g”是指引力常数,“bp”是指碱基对,“kbp”是指千碱基对,“%w/v”是指重量/体积百分比,“%v/v”是指体积/体积百分比,“wt%”是指重量百分比,“HPLC”是指高效液相色谱,而“GC”是指气相色谱。术语“摩尔选择率”是指每摩尔被消耗的糖类底物产生的产物的摩尔数,以百分比形式给出。
实施例1
来自乳酸克鲁维酵母的DHAD在LEU1删除的啤酒糖酵母菌株中
的表达
酵母LEU1基因编码异丙基苹果酸脱水酶,一种其功能需要Fe-S簇的酶。在本实施例中,检测了LEU1删除对来自乳酸克鲁维酵母DHAD编码区的DHAD活性表达的影响。为了在酵母中的基因表达,使用了衍生自pRS423的穿梭载体pNY13(SEQ ID NO:29)。这种穿梭载体包含一个在大肠杆菌中共生所需的F1复制起点(1423至1879)和一个在酵母中复制所需的2微米起点(nt 7537至8881)。该载体含有一个FBA启动子(nt 2111至3110)和FBA终止子(nt 4316至5315)。此外,它还携带用于在酵母中进行选择的HIS3标记(nt 504至1163)和用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性标记(nt 6547至7404)。pNY9是以URA3标记替代了HIS3标记的相同载体。
合成了来自乳酸克鲁维酵母的DHAD的ILV3编码区,其中所述编码区为针对在啤酒糖酵母中的表达利用DNA 2.0(Menlo Park,CA)进行了密码子优化的。PCR扩增了克隆的合成序列。在扩增过程中,通过用ilv3(K)(0)-F(delet)作为正向引物、用ilv3(K)(o)-R作为反向引物,位于N端的DHAD的线粒体信号肽的部分被删除,得到用于胞质表达的编码区(SEQ ID NO:173)。此外,在正向引物中整合了SphI位点,而在反向引物中包括了NotI位点。PCR引物被克隆至穿梭载体pNY9和pNY13,使得ILV3编码区处于FBA启动子的控制下。PCR产物和每种载体(pNY9、pNY13)均被SphI和NotI消化。消化之后,所述组分被连接,连接混合物被转入TOP 10感受态细胞(Invitrogen)中。转化体在补充了100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上被选择。用上述正向和反向引物通过PCR筛选了阳性克隆。所得到的质粒被命名为pRS423::FBAp-ILV3(KL)和pRS426::FBAp-ILV3(KL),分别来源于质粒pNY13和pNY9。
为了研究来自乳酸克鲁维酵母的DHAD在啤酒糖酵母中的表达,表达载体pRS423::FBAp-ILV3(KL)与空载体pRS426一起被转入了菌株BY4743和BY4743 leu1::kanMX4(ATCC 4034377)中。感受态细胞的制备和转化基于来自Zymo Research的冷冻酵母转化盒(Frozen Yeast Transformation kit)。转化体在缺乏组氨酸和尿嘧啶的酵母合成培养基(Teknova)琼脂板上被选择。为了进行酶分析,携带表达构建体和空载体pRS426的菌株首先在5mL缺乏组氨酸和尿嘧啶的完全合成酵母培养基中生长过夜。上述5mL过夜培养物被转入装有100mL培养基的250mL烧瓶中。当培养物在600nm达到1至2O.D.时收集培养物。样品用10mL的20mM Tris(pH 7.5)洗涤,然后重悬于1mL的相同的Tris缓冲液中。样品被转入包含0.1mm二氧化硅(Lysing Matrix B,MP biomedicals)的2.0mL管中。然后在珠磨式研磨器(BIO101)中破碎细胞。在微量离心机中以13,000rpm在4℃离心30分钟,收集上清液。典型地,0.06至0.1mg的粗提蛋白质被用于DHAD分析中。粗提物中的蛋白质通过考马斯亮蓝染色用布拉德福德法测定。
二羟酸脱水酶的酶分析
体外的DHAD酶分析是在Flint等人所述方法(J.Biol.Chem.(1993)268:14732-14742.)基础上的变型。进行分析的总体积为1.6mL,由下列组成:800μl 2X缓冲液(100mM Tris pH 8.0,20mM MgCl2),160μL 10X底物substrate(15.6mg/mL二羟基异戊酸),粗提物(通常50-200μg蛋白质),和水。反应在37℃孵育。在0、30、60和90分钟时间间隔,350μL的反应等分试样被移出,并与350μL 1N HCl中的0.05%二硝基苯肼在25℃共孵育30分钟。350μL的4N氢氧化钠被加入反应混合物中,以使反应淬灭,以15,000×g离心反应混合物2分钟。上清液被转移至一次性塑料比色杯中,并在分光光度计中测量了在540nm的吸光度。通过将上述吸光度代入从a-酮异戊酸的标准曲线获得的线性回归公式,测定了所产生的a-酮异戊酸(KIV)的量。用在每一时间点产生的KIV的量进行作图,以确定生产的速率。然后用下列公式,利用线性回归的斜率计算特异性活性:
特异性活性计算值=(KIV生产的斜率/1000)/mg蛋白质每1.6mL反应=mmol/min*mg
当在酵母菌株BY4743(Δleu1)中表达时,来自乳酸克鲁维酵母的脱水酶具有0.2至0.35μmol min-1mg-1范围的特异性活性。相比之下,当在亲本酵母菌株BY4743中表达时,这种酶仅具有0.14mmol min-1mg-1范围内的特异性活性。包含空载体pRS423或pRS426的菌株BY4743(Δleu1)和野生型BY4743具有0.03至0.1μmol min-1mg-1范围的背景活性。
实施例2
二醇脱水酶在LEU1删除的啤酒糖酵母菌株中的表达
在共同拥有和共同未决的美国专利公布US20090155870中公开了不依赖辅酶B12的丙二醇脱水酶。编码这种不依赖辅酶B12的(S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖的)丙二醇脱水酶(SEQ ID NO:15)及其在细菌Roseburia inulinivorans[Scott等人(2006)J.Bacteriol.188:4340-9]中推定的相关再激活酶(SEQ ID NO:16)的序列,以下分别称为rdhtA和rdhtB,通过标准方法被合成为一条DNA片段(SEQ ID NO:17),并被克隆进大肠杆菌载体(通过DNA2.0,Inc.,Menlo Park,CA)。该克隆被用作PCR模板,以制备分别的RdhtA和RdhtB编码区片段。利用引物N695和N696(SEQ ID NOs:18和19),通过PCR扩增了二醇脱水酶的RdhtA编码区。利用引物N697和N698(SEQ ID NOs:20和21),通过PCR扩增了二醇脱水酶再激活酶的RdhtB编码区。利用SOE PCR(Horton等人,(1989)Gene 77:61-68),将这两种DNA片段与双重终止子DNA片段(SEQ ID NO:22)相联,所述双重终止子DNA片段具有以相反取向彼此相邻的一个ADH终止子(SEQ ID NO:23)和一个CYC1终止子(SEQ ID NO:24)。用PacI消化pRS426::FBA-ILV5+GPM-kivD(描述于共同拥有和共同未决的美国专利公布20070092957A1,实施例17中)之后,上述双重终止子片段作为0.6kb的片段被分离。所得到的4kb DNA片段在双重终止子两侧分别具有相反取向的RdhtA和RdhtB编码区,每一编码区的3’端与双重终止子序列相邻。然后,通过缺口修复方法(Ma等人(1987)Genetics 58:201-216)将该DNA片段克隆进通过用BbvCI消化以除去ILV5和kivD编码区和它们的3’端之间的双重终止子序列制备的啤酒糖酵母穿梭载体pRS426::FBA-ILV5+GPM-kivD。所得到的质粒,以下称为pRS426::RdhtAB,包含处于啤酒糖酵母FBA启动子(SEQ ID NO:25)控制下的RdhtA基因和处于啤酒糖酵母GPM启动子(SEQ ID NO:26)控制下的RdhtB基因。
质粒pRS426和pRS426::RdhtAB通过标准技术(Methods in Yeast Genetics,2005,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.201-202)被转入啤酒糖酵母菌株BY4743(ATCC 201390)和BY4743 leu1::kanMX4(ATCC 4034377)。细胞被铺板于缺乏尿嘧啶的完全合成培养基上,以选择转化体。利用如下所述的体内分析法就二醇脱水酶活性对转化体进行了检测。固体培养基上生长的接种的细胞被用于接种皮氏培养皿中的液体培养基(20mL)。所使用的培养基为无尿嘧啶的完全合成培养基,并且未加入5g/L 1,2-丙二醇(Aldrich目录号398039)。皮氏培养皿被转移至AnaeropackTM System jar(Mitsubishi Gas Chemical Co.目录号50-70)中进行电泳。利用Pack-Anaero产气袋(Mitsubishi Gas Chemical Co.目录号10-01)产生厌氧环境(<0.1%氧)。48小时之后,对培养上清液取样、过滤并通过HPLC分析,如一般方法部分所述。当培养基中提供了1,2-丙二醇时,在携带pRS426::RdhtAB的菌株的培养上清液中观察到了保留时间为38.8分钟的丙醇。表5中给出的结果显示,在还携带着LEU1删除的菌株的上清液中产生了比在不含LEU1删除的菌株中更多的丙醇。统计分析得出了小于0.0005的P值。
表5:在含有和不含LEU1敲除的酵母中伴随丙二醇脱水酶/再激 活酶的丙醇生产。
菌株 | 添加1,2-丙二醇 | 丙醇峰面积 |
BY4743Δleu1::kanMX4/pRS426::RdhtAB | 5g/L | 19472±1403(n=6) |
BY4743Δleu1::kanMX4/pRS426::RdhtAB | 0g/L | 2478(n=1) |
BY4743/pRS426::RdhtAB | 5g/L | 11830±1963(n=6) |
BY4743/pRS426::RdhtAB | 0g/L | 2369(n=1) |
BY4743Δleu1::kanMX4/pRS426 | 5g/L | 2633(n=1) |
BY4743/pRS426 | 5g/L | 2841(n=1) |
实施例3:
啤酒糖酵母中通过线粒体ILV3的破坏提高的胞质二羟酸脱水酶
(DHAD)活性
载体/宿主的构建
在啤酒糖酵母中,ILV3编码参与支链氨基酸生物合成的线粒体二羟酸脱水酶。为了在啤酒糖酵母的体外酶分析中降低来自内源ILV3表达的背景,利用SEQ ID NO分别为30和31的引物“ILV3::URA3 F”和“ILV3::URA3 R”,通过从pRS426(ATCC No.77107)对URA3标记的PCR扩增,构建了ilv3::URA3破坏盒。上述引物产生包含70bp 5’和3’延伸的1.4kb的URA3 PCR产物,所述延伸与ILV3染色体基因座的上游和下游序列一致,以进行同源重组。利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics,2005,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.201-202),将上述PCR产物转入了BY4741细胞(ATCC201388),并将所得到的转化体在30℃培养于缺乏尿嘧啶且补充了2%葡萄糖的完全合成培养基上。利用SEQ ID NO分别为32和33的引物“ILV3 F Check”和“URA3 REV Check”,通过PCR对转化体进行了筛选,以验证在正确位点的整合和内源ILV3基因座的破坏。正确的转化体具有基因型:BY4741 ilv3::URA3。
质粒pRS423::FBAp-ILV3(KL)和pRS426::FBAp-ILV3(KL)的构建描述于实施例1中。pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3的构建描述于共同拥有和共同未决的美国专利公布US20070092957A1,实施例17中,该专利以引用方式并入本文。pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3是与pRS423::CUP1p-alsS-FBAp-ILV3相同的质粒。该构建体包含啤酒糖酵母CUP1启动子(SEQ ID NO:34)、来自枯草芽孢杆菌的alsS编码区(SEQ ID NO:27)和CYC1终止子(SEQ ID NO:24)的嵌合基因;和包含啤酒糖酵母FBA启动子(SEQ ID NO:25)、来自啤酒糖酵母的缺少线粒体定位信号编码序列的ILV3编码区(SEQ ID NO:111)和ADH1终止子(SEQ ID NO:23)的嵌合基因。
样品的制备
使用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics,2005,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY),将质粒载体pRS423::CUP1p-alsS-FBAp-ILV3和pRS423::FBAp-ILV3(KL)转入了菌株BY4741 ilv3::URA3,并培养在缺乏组氨酸的完全合成培养基上。质粒载体pRS423::CUP1p-alsS-FBAp-ILV3和pRS426::FBAp-ILV3(KL)也被转入了菌株BY4741。在Innova4000培养箱中(New Brunswick Scientific,Edison,NJ),于30℃和225rpm,有氧培养物生长于包含200mL缺乏组氨酸并补充了2%葡萄糖的完全合成培养基的1000mL烧瓶中。当OD600测量值为1.0-2.0时收集培养物,并通过在6000×g离心10分钟使其沉淀。用pH 8.0的10mM Tris-HCl洗涤细胞沉淀物,并将沉淀物储存于-80℃直到用于检测活性。无细胞提取物利用1mL0.5mm小珠和1.5mL酵母细胞悬液,通过标注的蛋白珠法制备。提取物中的蛋白质浓度通过考马斯亮蓝染色用布拉德福德(Bradford)法测定。DHAD酶分析和特异性活性的计算如实施例1中所述进行。表6中给出的结果显示,在ILV3删除的细胞中比在不含ILV3删除的细胞中有更高的DHAD活性。
表6:在含有和不含ILV3删除的酵母中的DHAD活性。
通过HPLC检验α-酮异戊酸的形成
α-酮异戊酸从体外DHAD酶分析的形成利用HPLC和氨基脲衍生完成。进行DHAD酶分析的总体积为1.6mL,由下列组成:800μl 2X缓冲液(100mM Tris pH 8.0,20mM MgCl2),160μl 10X底物(15.6mg/mL二羟基异戊酸),粗提物(通常50-200μg蛋白质),和水。反应在37℃孵育。在0和90分钟的时间间隔,移出350μl的反应等分试样,转移至冰上,并于4℃以13,000×g离心2分钟以除去沉淀的蛋白质。上清液被转移至冰预冷的Microcon YM-10(Sigma)离心柱,于4℃以13,000×g离心20分钟以除去酶和可溶蛋白质。将透过与100μl衍生剂(1%盐酸氨基脲和1.5%三水醋酸钠)混合,并于室温孵育15分钟。于4℃以13,000×g离心5分钟,使反应通过CoStar离心过滤器(CoStar,0.22μm filter)以除去任何沉淀。透过被转移至HPLC小瓶用于分析。
对衍生的α-酮异戊酸的分析利用在Supelco LC-18柱和Superguard LC-18-DB保护柱(Supelco;25cm×4.6mm,5μm)上的反相色谱进行。注射体积为10μl。流动相为甲醇(A)和50mM NaOAc pH 7.2。梯度程序列于表7中,检测在250nm进行。
表7:用于衍生的α-酮异戊酸HPLC分析的梯度
氨基脲衍生的α-酮异戊酸的保留时间为11.5分钟。
与上文对特异性活性的直接分析中所检测的一样,表8中给出的结验证了KIV在所述细胞中的表达。在DHAD分析柱中列出的KIV的量,是上文所述的用于测定特异性活性的活性分析的90分钟样品中直接测定的量。这一KIV量与HPLC分析中测定的量有良好的相关性。
表8:在DHAD活性分析中和通过HPLC测定的KIV的比较。
Claims (24)
1.包含至少一种异源Fe-S簇蛋白质的重组酵母宿主细胞,其中所述酵母宿主中至少一种内源Fe-S簇蛋白质的表达降低。
2.权利要求1的重组酵母细胞,其在编码所述至少一种内源Fe-S簇蛋白质的基因中包含破坏。
3.权利要求1的重组酵母宿主细胞,其中所述内源Fe-S簇蛋白质选自二羟酸脱水酶、异丙基苹果酸脱水酶、亚硫酸盐还原酶、谷氨酸脱氢酶、生物素合酶、乌头酸酶、同型乌头酸酶、硫辛酸合酶、成熟铁氧化还原蛋白、NADH泛醌氧化还原酶、琥珀酸脱氢酶、泛醌醇-细胞色素-c还原酶、ABC蛋白Rli1、核苷三磷酸酶Nbp35和氢化酶样蛋白质。
4.权利要求1的重组酵母宿主细胞,其中所述酵母选自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)和毕赤酵母属(Pichia)。
5.权利要求1的重组酵母宿主细胞,其中所述内源Fe-S蛋白质在线粒体中表达。
6.权利要求1的重组酵母宿主细胞,其中所述内源Fe-S簇蛋白质具有选自下列的活性:二羟酸脱水酶和异丙基苹果酸脱水酶活性。
7.权利要求6的重组酵母宿主细胞,其中所述宿主细胞为糖酵母属,其表达编码具有如SEQ ID NO:114所示氨基酸序列的多肽的基因。
8.权利要求1的重组酵母宿主细胞,其中所述至少一种异源Fe-S簇蛋白质选自真菌的2Fe-2S二羟酸脱水酶和植物的2Fe-2S二羟酸脱水酶。
9.权利要求8的重组酵母宿主细胞,其中所述异源的真菌或植物2Fe-2S簇二羟酸脱水酶在胞质溶胶中表达。
10.权利要求8的重组酵母宿主细胞,其中所述异源的真菌或植物2Fe-2S簇二羟酸脱水酶是具有以<10-5的E值与表9的序型隐蔽马尔科夫模型匹配的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸,所述保守的半胱氨酸对应于变异链球菌(Streptococcus mutans)DHAD酶的氨基酸序列中的56、129和201位,所述DHAD酶氨基酸序列对应于SEQ ID NO:179。
11.权利要求8的重组酵母宿主细胞,其中所述异源的真菌或植物2Fe-2S簇二羟酸脱水酶是多肽,所述多肽具有与选自下列的氨基酸序列有至少约95%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO 46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150和152。
12.权利要求8的重组酵母宿主细胞,其中所述异源的真菌或植物2Fe-2S簇二羟酸脱水酶是多肽,所述多肽具有采用Clustal W比对方法与SEQ ID NO:114有至少约90%同一性的氨基酸序列,其中所述比对采用空位罚分=10、空位长度罚分=0.1的默认参数和蛋白质序列全长上的Gonnet 250系列蛋白质权重矩阵。
13.权利要求10至12中任一项的重组宿主细胞,其中所述细胞包含异丁醇生物合成途径。
14.权利要求13的重组宿主细胞,其中所述细胞生产异丁醇。
15.用于生产异丁醇的方法,所述方法包括使权利要求14的重组酵母宿主细胞在产生异丁醇的条件下生长。
16.权利要求1的重组酵母宿主细胞,其中所述至少一种异源Fe-S簇蛋白质具有Fe-S丙二醇脱水酶再激活酶活性。
17.权利要求16的重组宿主细胞,其中所述具有Fe-S丙二醇脱水酶再激活酶活性的至少一种异源Fe-S簇蛋白质是丙二醇脱水酶再激活酶,所述丙二醇脱水酶再激活酶具有采用Clustal W比对方法与如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列有至少约90%同一性的氨基酸序列,其中所述比对采用空位罚分=10、空位长度罚分=0.1的默认参数和蛋白质序列全长上的Gonnet 250系列蛋白质权重矩阵。
18.权利要求16或17的重组宿主细胞,其中所述细胞产生2-丁醇。
19.权利要求16或17的重组宿主细胞,其中所述细胞产生2-丁酮。
20.权利要求18的重组宿主细胞,其中所述细胞包含2-丁醇生物合成途径。
21.权利要求19的重组宿主细胞,其中所述细胞包含2-丁酮生物合成途径。
22.用于将2,3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的方法,所述方法包括:
a)提供(1)包含至少一种编码2Fe-2S二羟酸脱水酶的异源基因的重组酵母宿主细胞,其中所述重组酵母宿主细胞中至少一种内源Fe-S簇蛋白质的活性降低;和(2)2,3-二羟基异戊酸源;以及
b)使(a)的重组宿主细胞在使2,3-二羟基异戊酸被所述宿主细胞转化为α-酮异戊酸的条件下,在所述2,3-二羟基异戊酸源的存在下生长。
23.用于生产2-丁酮的方法,所述方法包括使权利要求21的重组酵母宿主细胞在产生2-丁酮的条件下生长。
24.用于将2,3-丁二醇转化为2-丁酮的方法,所述方法包括:
a)提供(1)包含至少一种编码Fe-S丙二醇脱水酶再激活酶的异源基因的重组酵母宿主细胞,其中所述重组酵母宿主细胞中至少一种内源Fe-S簇蛋白质的活性降低;和(2)2,3-丁二醇源;以及
b)使(a)的重组宿主细胞在使2,3-丁二醇被所述宿主细胞转化为2-丁酮的条件下,在所述2,3-丁二醇源的存在下生长。
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